DE1185768B

DE1185768B - Verfahren zum Stabilisieren waessriger Trypsinloesungen

Info

Publication number: DE1185768B
Application number: DEA34951A
Authority: DE
Inventors: Charles William F Damaskus; Paul Ellis Bradford
Original assignee: Armour Pharmaceutical Co
Current assignee: Armour Pharmaceutical Co
Priority date: 1960-06-23
Filing date: 1960-06-23
Publication date: 1965-01-21

Description

Verfahren zum Stabilisieren wäßriger Trypsinlösungen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren wäßriger, Calciumionen enthaltender Trypsinlösungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung in einem pH-Bereich von ungefähr 3,5 bis ungefähr 7,2 ungefähr 0,5 bis ungefähr 20 Gewichtsprozent einer Aminosäure, die keine Sulfhydryl- und Disulfidgruppen enthält, zugegeben werden. Vorzugsweise wird als Aminosäure 1-Glutamin, Glycin,1-Leucin oder 1-Lysin oder ein Gemisch dieser Säuren verwendet.
Es ist seit langem bekannt, daß Trypsin dazu neigt, unstabil und nach und nach inaktiv zu werden, wenn es in wäßrigen Lösungen gelöst wird. Eine solche Inaktivierung tritt sowohl in gekühltem Zustand als auch bei Raumtemperatur schnell ein, und aus diesem Grunde ist es bisher nicht möglich gewesen, Trypsin in Form einer wäßrigen Lösung herzustellen und im Handel zu vertreiben. Derartige wäßrige Lösungen bieten jedoch bestimmte Vorteile sowohl bei lokaler als auch bei parenteraler Anwendung, und zwar dadurch, daß sie wesentlich wohlfeiler und viel einfacher zu verabfolgen sind als die bisher gebräuchlichen kristallisierten, lyophil gemachten oder in Form einer Ölsuspension vorliegenden Trypsinpräparate.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden nun stabilisierte wäßrige Trypsinlösungen erhalten, die sowohl billiger herzustellen als auch leichter anzuwenden sind.
In dem älteren Patent 1 121 769 ist ein Verfahren zur Herstellung von stabilen wäßrigen Chymotrypsinlösungen geschützt, bei welchem zu der Chymotrypsinlösung sulfhydryl- bzw. disulfidfreie Aminosäuren zugesetzt werden. Chymotrypsin und Trypsin sind verschiedene Substanzen, Chymotrypsin ist eines der eiweißabbauenden Enzyme der Bauchspeicheldrüse, das im Gegensatz zum Trypsin Labwirkung besitzt, und das Pankreas-Ferment »Chymotrypsinogen« wird schon durch Spuren von Trypsin zu dem proteolytisch sehr wirksamen Chymotrypsin aktiviert.
Unter den Aminosäuren, welche gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, seien genannt 1-Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, 1-Arginin, 1-Alanin, 1-Leucin, d,1-Isoleucin, 1-Lysin, d,1-Methionin, d,1-Phenylalanin, 1-Prolin, Hydroxy-1-prolin, d,l-Serin, d,1-Threonin und d,l-Valin. Die technisch günstigste Aminosäure-Konzentration schwankt je nach der besonderen Art der verwendeten Aminosäure. So hat z. B. die Anwendung von 1-Glutamin in einer Konzentration von etwa 1,0 bis etwa 5,0 Gewichtsprozent zu sehr befriedigenden Ergebnissen geführt. Im Falle des 1-Leucins hat sich eine Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 5,0 Gewichtsprozent als in gleicher Weise wünschenswert erwiesen. Unter den Calciumsalzen, die bei den vorliegenden stabilisierten wäßrigen Trypsinlösungen Anwendung finden können, sind zu nennen Calciumacetat, Calciumcitrat, Calciumchlorid, Calciumglycerophosphat, Calciumglucoheptanat, Calciumgluconat, Calciumlactat, Calciumlactobionat, Calciumlactophosphat, Calciumsuccinat, Calciumpanthothenat und Calciumlävulinat. Um den Zwecken der vorliegenden Erfindung zu genügen, versteht es sich von selbst, daß das verwendete Calciumsalz wasserlöslich und nicht toxisch ist, es ist in der Trypsinlösung in Mengen von ungefähr 0,3 bis ungefähr 5 Gewichtsprozent enthalten.
Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise ein im wesentlichen reines Trypsin als Ausgangsmaterial benutzt, d. h., ein kristallines oder lyophil gemachtes Trypsin von einer über 95°/oigen Reinheit. Das Trypsin kann wie in dem Werk von N o r t h r o p und anderen, »Crystalline Enzymes«, 2. Auflage, 1948, beschrieben, hergestellt werden. Die Konzentration des Trypsins in der wäßrigen Lösung ist nicht besonders kritisch, doch liegt sie in den meisten Fällen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung innerhalb des Bereiches von 1 bis 10 mg Trypsin je Kubikzentimeter Wasser. Bevorzugte Ansätze enthalten etwa 1 bis etwa 5 mg/ccm. Die Proteolytische Wirksamkeit des Trypsins kann nach der Hämoglobin-Substrat-Methode bestimmt werden, und wenn sie in dieser Weise ermittelt wird, dann liegt sie im Durchschnitt bei wenigstens 1000 Armour-Einheiten (AU) pro Milligramm und kann bis zu 9000 Armour-Einheiten (AU) pro Milligramm betragen.
Die nach dieser Methode ermittelte Standardwirksamkeit wird in »Armour-Einheiten« (AU) ausgedrückt; hierbei handelt es sich um eine Modifikation der Methode von A n s o n , die in »Journal of General Physiology«, Bd.22, S.79 (1938), beschrieben ist. In Übereinstimmung mit dieser heute allgemein anerkannten Methode kann das in den Lösungen der vorliegenden Erfindung verwendete Trypsin eine Wirksamkeit von etwa 2500 AU/mg bis zu etwa 5000 AU/mg aufweisen, und die Ansätze können eine Konzentration von etwa 5000 AU/ccm bis etwa 25 000 AU/ccm Wasser besitzen, wobei zu den bevorzugten Konzentrationen diejenigen von etwa 5000 AU/ccm bis zu etwa 10 000 AU/ccm gehören.
Bei der Herstellung der wäßrigen Trypsinlösung ist es wünschenswert, pyrogenfreies destilliertes Wasser zu verwenden, da die fertigen Präparate für ihre pharmazeutische Anwendung steril und von irgendwelchen toxischen Verunreinigungen frei sein sollen. Um die technisch günstigsten Ergebnisse der vorliegenden Erfindung zu erzielen, soll der pH-Wert der Lösung vorzugsweise auf der sauren Seite liegen. Im allgemeinen ist ein pH-Wert von etwa 3,5 bis etwa 7,2 für parVteral anzuwendende Präparate geeignet. Jedoch ist die Einstellung eines pH-Wertes im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 6,5 besonders vorteilhaft, wobei die optimalen Ergebnisse bei einem pH-Wert von etwa 5,5 erhalten werden. Um die notwendige pH-Einstellung zu bewerkstelligen, können zahlreiche nicht toxische Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure u. dgl., verwendet werden. Wie gefunden wurde, ist Essigsäure besonders brauchbar, weil sie nicht nur den pH-Wert auf die gewünschte Höhe einstellt, sondern auch zusätzliche Acetationen liefert.
Die bevorzugten stabilisierten wäßrigen Trypsinlösungen gemäß der vorliegenden Erfindung können vorteilhaft mit einem Zusatzstoff; wie Polyäthylenglykol, Glycerin oder Propylenglykol, versetzt werden. Am besten eignet sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Polyäthylenglykol, das im Handel unter der Typenbezeichnung 100 bis 800 erhältlich ist, wobei die Aufwärtsstufung bei der Nummernbezeichnung einen niedrigeren Schmelzpunkt für das Produkt angibt. Die Konzentration des Zusatzstoffes kann zwischen 15 und 45 Gewichtsprozent liegen. Der bevorzugte Bereich liegt bei etwa 20 bis etwa 40 Gewichtsprozent pro Volumen der Lösung.
Die Trypsinlösung kann auch ein Konservierungsmittel enthalten, z. B. Natrium-äthyl-mercuri-thiosalicylat (»merthiolate«), p-Hydroxybenzoesäuremethylester (»methylparaben«) oder p-Hydroxybenzoesäurepropylester (»propylparaben«). Die beiden letztgenannten Konservierungsmittel können entweder allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Die Anwendung eines derartigen Konservierungsmittels erfolgt nach der bei der Herstellung von pharmazeutischen Präparaten üblichen Praxis und gehört nicht zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden spezifischen Beispiele näher erläutert.
Beispiel l Pharmazeutisch anwendbare Trypsinlösungen wurden aus reinem Trypsin gemäß den folgenden Versuchsansätzen hergestellt: Ansatz 1 Trypsin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 000 AU/ccm Polyäthylenglykol 200 . . . . . . . . . . . 300/, 1-Glutamin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30/0 Calciumacetat .................. 10/0 Merthiolat ..................... 0,010/0 P. F. destilliertes Wasser . . . . . . . . . q. s. pH ............................ 5,5 Ansatz 2 Trypsin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 10 000 AU/ccm Glycin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,001, Calciumacetat .................. 1,00/0 Polyäthylenglykol 200 . . . . . . . . . . . 300/0 Merthiolat ..................... 0,010/0 Wasser......................... q. s.
PH ............................ 5,5 Ansatz 3 Trypsin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 000 AU/ccm 0 Calciumacetat . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00/, Polyäthylenglykol 200 . . . . . . . . . . . 300/, Merthiolat ..................... 0,010/0 Wasser......................... q. s.
PH ............................ 5,5 Ansatz 4 Trypsin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 000 AU/ccm 1-Glutamin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,00/, Calciumacetat .................. 1,00/0 Polyäthylenglykol 300 . . . . . . . . . . . 300/0 Merthiolat ..................... 0,010/0 Wasser......................... q. s.
pH ............................ 5,5 Ansatz 5 Trypsin ........................ 10 000 AU/ccm 1-Glutamin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,00/, Calciumacetat .................. 1,750/0 Polyäthylenglykol 200 . . . . . . . . . . . 300/, Merthiolat ..................... 0,010/0 Wasser......................... q. s.
PH ........ . ................... 5,5 Ansatz 6 Trypsin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 000 AU/ccm 1-Glutamin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,00/0 Calciumlävulinat . . . . .. . . . . . . . . .. 1,750/0 Polyäthylenglykol 200 . . . . . . . . . . . 3001, Merthiolat ..................... 0,010/0 Wasser......................... q. s.
PH ............................ 5,5 Ansatz 7 Trypsin ........................ 20 000 AU/ccm 1-Glutamin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,00/, Calciumacetat .....:............ 1,00/0 Polyäthylenglykol 200 . . . . . . . . . . . 3010 Merthiolat ..................... 0,010% Wasser......................... q. s.
pH ............................ 5,5 Ansatz 8 Trypsin ........................ 10 000 AU/ccm 1-Glutamin ..................... 3,00/0 Calciumacetat .................. 1,0°/a Polyäthylenglykol 200 . . . . . . . . . . . 300/, Merthiolat ..................... 0,0l0/0 Wasser......................... q. s.
pH ............................ 5,2 Ansatz 9 Trypsin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 10 000 AU/ccm 1-Glutamin ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0-/, Calciumacetat .................. 1,00/0 Polyäthylenglykol 200 . . . . . . . . . . . 300/, Merthiolat ..................... 0,010/0 Wasser......................... q. s.
PH ............................ 5,8 Nach der Herstellung der Lösungen gemäß den vorstehend angegebenen Rezepten wurden die Lösungen steril filtriert und aseptisch in Ampullen von 5 ccm Inhalt gefüllt, mit einem Stopfen verschlossen und abgedichtet. Die Ampullen wurden dann einem Test auf Lagerbeständigkeit bei Zimmertemperatur und bei 37°C unterworfen. Die Ergebnisse dieser Teste sind weiter unten zusammengestellt.

Es wurden die folgenden Stabilitätsdaten ermittelt, alle Werte sind in Armour-Einheiten pro Kubikzentimeter angegeben.

Anfangs- 37'C 37° C Zimmer-

wirksamkeit 1 Woche 2 Wochen temperatur

4 Wochen

Ansatz 1 10850 8 130 6300 10100

Ansatz 2 10760 10160 9760 11000

Ansatz 3 10920 11220 10260 11490

Ansatz 4 11270 9040 7520 10425

Ansatz 5 11700 9440 7120 10260

Ansatz 6 11440 9300 7270 10425

Ansatz 7 22700 15500 13285 19300

Ansatz 8 11760 9 175 7450 10920

Ansatz 9 10020 9240 7770 11080

Beispiel Il

Es wurden weitere Untersuchungen, wie im Bei-

spiel I beschrieben, durchgeführt mit der Abweichung,

daß die Trypsinlösungen gemäß den folgenden

Rezepten hergestellt wurden:

Ansatz 1

Trypsin ........................ 10 000 AU/ccm

Merthiolat ............. ..... 0,0l0/0

Glutamin ...................... 3,00/0

Calciumacetat .................. 1,00/0

Polyäthylenglykol 200 15,00/,

Wasser......................... q. s.

pH ............................ 5,5

Ansatz 2

Trypsin ........................ 10 000 AU/ccm

Merthiolat ..................... 0,010/0

Glutamin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,00/,

Caleiumacetat .................. 1,00%

Polyäthylenglykol 200 . . . . . . . . . . . 45,00/,

Wasser......................... q. s.

PH ............................ 5,5

Die bei der Prüfung auf Lagerbeständigkeit bei Zimmertemperatur und 37°C innerhalb eines Zeitraumes bis zu 6 Wochen ermittelten Ergebnisse sind unten zusammengestellt. Alle Werte sind in Armour-Einheiten pro Kubikzentimeter angegeben.

Anfangs- 37°C 37°C 37°C Zimmer- Zimmer- Zimmer- Zimmer- Zimmer-

wirksamkeit 1 Woche 2 Wochen 3 Wochen temperatur temperatur temperatur temperatur temperatur

1 Woche 2 Wochen 3 Wochen I 4 Wochen 6 Wochen

Ansatz 1 10830 5600 3930 3840 11200 11460 11450 10500 10600

Ansatz 2 10 260 6570 4390 4770 11800 11 620 12 360 10 500

11000

Die vorstehenden Beispiele zeigen die Lagerbeständigkeit der erfindungsgemäß hergestellten Trypsinlösungen. Im folgenden wird gezeigt, daß die Lagerbeständigkeit von Trypsinlösungen, die Calciuminonen enthalten, durch Zugabe der Aminosäure verbessert wird. Es wurden folgende Versuche durchgeführt: 1. Es wurde eine Standardlösung von Trypsin verwendet.

2a bis 2c.
Trypsinlösungen mit einer bekannten Menge von Calciumacetat wurden verwendet. 3. Es wurde eine Trypsinlösung mit Caleiumacetat und Glycin versetzt.
Alle Lösungen hatten einen pH-Wert von 5,5. Dabei ergaben sich folgende Werte: 1. Trypsin - Kontrolle - Kein Calciumacetat hinzugefügt.
5500 A U/ml = Armour-Einheiten, bei 32°C nach einer Woche: 175 Armour-Einheiten pro Milliliter.
2a. Calciumacetat 1,2%, 5500 A U/ml, bei 32°C nach einer Woche: 2410 Armour-Einheiten pro Milliliter. 2b. Calciumacetat 1.20/" 5500 AU/ml, bei 32-C nach einer Woche: 2565 Armour-Einheiten pro Milliliter.
2e. Calciumacetat 1,2°/a, 5500 AI/ml, bei 32'C nach einer Woche: 1926 Armour-Einheiten pro Milliliter; bei Zimmertemperatur nach einer Woche: 4160 Armour-Einheiten pro Milliliter; im Kühlschrank nach einer Woche: 5785 Armour-Einheiten pro Milliliter; Stabilität von Trypsin mit Calciumacetat (10/0) und Glycin bei pH 5,5.

3. 11850 AU/ml, bei 32'C nach einer Woche: 7900 Armour-Einheiten pro Milliliter; bei Zimmertemperatur nach 6 Monaten: 4650 Armour-Einheiten pro Milliliter; im Kühlschrank nach 6 Monaten: 11830 Armour-Einheiten pro Milliliter; im Kühlschrank nach 12 Monaten: 12 210 Armour-Einheiten pro Milliliter; im Kühlschrank nach 18 Monaten: 10 900 Armour-Einheiten pro Milliliter; im KühIschrank nach 24 Monaten: 10 355 Armour-Einheiten pro Milliliter.

Diese Ergebnisse zeigen folgendes:

Versuchslösung Gebliebenen

Aktivität in /o

1. Kontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,1%

2a. Calciumacetat allein (1,2°/0) ..... 44,0°/o

2b. Calciumacetat allein (I,2°%) ..... 47,0°/o

2c. Calciumacetat allein (1,2°/0) ..... 35,0°/o

3. Calciumacetat und Glycin . . . . . . . . 66,0-/,

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zum Stabilisieren wäßriger Calciumionen enthaltender Trypsinlösungen, d a -durch gekennzeichnet, daß der Lösung in einem pH-Bereich von ungefähr 3,5 bis ungefähr 7,2 ungefähr 0,5 bis ungefähr 20 Gewichtsprozent einer Aminosäure, die keine Sulfhydryl- und Disulfidgruppen enthält, zugegeben werden.
2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Aminosäure 1-Glutamin, Glycin, 1-Leucin oder 1-Lysin oder ein Gemisch dieser Säuren verwendet wird. In Betracht gezogene Druckschriften Hoffmann-Ostenhoff , Enzymologie, 1954, S. 313, 314; A b d e r h a 1 d e n , Vitamine, Hormone, Fermente, 1953, S. 236; Chemisches Zentralblatt, 1956, S. 4515, M a n s -feld und Neuwirthovä.