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Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Extraktion von bioaktiven Lignanen aus Sesamöl mit hoher Ausbeute und Reinheit.
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Hintergrund der Erfindung
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Sesamum indicum L ist ein domestiziertes Getreide und der älteste Ölsamen, der aus vedischen Zeiten bekannt ist. Er wird hauptsächlich in den tropischen und einer subtropischen Region der Welt angebaut. Die weltweite Produktion an Sesam-Samen beträgt ungefähr 3 Millionen metrische Tonnen (MMT) und die Verfügbarkeit an Sesamöl beträgt ungefähr 0,75 MMT. Die hauptsächlichen Hersteller und Verarbeiter von Sesam-Samen sind Indien und China (jeweils 25%), Myanmar (10–13%), Sudan (10–12%), Japan (ungefähr 3%) etc.. Obwohl Japan kein Hersteller ist, ist es ein hauptsächlicher Importeur (25%) und Konsument, gefolgt von europäischen Ländern, den USA und Kanada. Indien und China sind bekannt für die Herstellung, Verwendung und den Export von Sesam-Samen und dessen Produkten. Das traditionelle Verfahren der Sesamölextraktion in Indien erfolgte durch „ghani”, aber die kommerzielle Extraktion verwendet nun Expeller-, Rotations-, hydraulische Presse und Lösungsmittelextraktion des Ölkuchens. Von der Gesamtproduktion des Sesamöls (0,2 MMT) werden ungefähr 75% für Nahrungsmittelzwecke verwendet, 5% für die Vanaspathy-Industrie und ungefähr 4% für die industrielle Verwendung als Farben, Seifen, Parfums etc.. Es ist seit vielen Jahren bekannt, dass Sesamöl im Vergleich zu anderen essbaren Ölen hochgradig resistent gegen oxidative Zerstörung ist. Dies wird dem Vorhandensein von biologisch aktiven Verbindungen, nämlich den Lignanen und den Lignan-Glukosiden zugeschrieben. Lignane sind eine Gruppe von Naturstoffen mit Phenylpropanoid-Herkunft. Die hauptsächlichen Lignane in Sesamöl sind Sesamin und Sesamolin. Verschiedene Nahrungsmittel-, industrielle und pharmazeutische Verwendungen wurden für diese Lignane berichtet. Studien haben gezeigt, dass Sesamin, die Hauptverbindung in Sesam, die Cholesterin-Absorption und -Synthese in Ratten hemmt. Sowohl für Sesamin als auch für Sesamolin wurde berichtet, dass sie die hepatische mitochondriale und peroxisomale Fettsäureoxidationsgeschwindigkeit erhöhen [J. B. Moriss in: Food, Industrial, Nutraceutical and Pharmaceutical Uses of Sesame Genetic Resources, Trends in New Crops and New Uses; S. 153–156, J. Janick und A. Whipkey (Herausg.) ASHS Press; Alexandria, VA (2002)]. Für Sesamin ist auch bekannt, dass es die PUFA-Pfade moduliert durch Hemmung der delta.sup.5-Desaturase, so dass weniger entzündliche Mediatoren hergestellt werden (Dachtler, M., Vande Put, F. H. M., Stijn, F. V., Beindorff, C. M. und Fritsche, J. Eur. J. Lipid. Sci. Technol. 105, 488–496, 2003). Andere Vorteile umfassen Senkung der Serum-Triglyceride, Reduktion von Bluthochdruck, Vorbeugung von allergischen Reaktionen, Verbesserung der Vitamin E-Aktivität, Krebsvorbeugung etc..
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Für Lignane in Sesamöl wird auch berichtet, dass diese antioxidative Eigenschaften besitzen. Produkte der Lipidoxidation sind als Gesundheitsgefährdungen bekannt, da sie mit Alterung, Membranschädigung, Herzkrankheit und Krebs verbunden sind (Cosgrove, J. P., Church, D. F. und Pryor, W. A., Lipids, 22, 299–304, 1987). Die Lipidoxidation senkt die Qualität und den Nährwert von Nahrung. Die Zugabe von Antioxidantien ist wirksam zur Verlangsamung der Oxidation von Lipiden und Lipid-enthaltenden Nahrungsmitteln. Synthetische Antioxidantien wie z. B. butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT) und tertiäres Butylhydroxychinon (TBHQ) werden in der Nahrungsmittelindustrie weithin verwendet, weil sie wirksam und weniger teuer als natürliche Antioxidantien sind [Pin-Der, Duh und Gow-Chin, Yen, JAOCS, 74(6) 745–748, 1997]. Ihre Sicherheit wurde in Frage gestellt (Chang et al.,
US 5 043 100 A ). Dies rechtfertigt die Herstellung und Auswertung von natürlichen Antioxidantien, die für den Nahrungsmittel- und Pflanzenölschutz geeignet sind.
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Die antioxidative Aktivität in Sesamkuchen-Extrakt wurde von verschiedenen Kräften detailliert untersucht (Suja, K. P., John, T. A., Selvam, N. T., Jayalekshmi, A. und Arumughan, C., Food Chemistry, 84, 393–400, 2004; Suja, K. P., Jayaleksmi, A. und Arumughan, C., Food Chemistry, 91, 213–219, 2005). Es wurde herausgefunden, dass der antioxidative Extrakt von Sesamkuchen in sehr niedriger Konzentration durch synthetische Antioxidantien wie BHT ersetzt werden kann (Suja, K. P., Jayaleksmi, A. und Arumughan, C., J. Agric. Fd. Chem., 52, 912–915, 2004; Suja, K. P., Jayaleksmi, A. und Arumughan, C., J. Sci. Fd. Agric, 85, 1779–1783, 2005).
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Lignan in Sesamöl wird berichtet, in einem Bereich von 1 bis 2% zu liegen [Hemalatha, S. und Ghafoorunissa, JAOCS, 81(5), 467–470, 2004]. Berücksichtigt man die oben zitierte Bioaktivität, könnten Sesam-Lignane als nutrazeutische Produkte verwendet werden. Ein effizientes Verfahren für die kommerzielle Herstellung wurde jedoch noch nicht berichtet. Der Stand der Technik in der Lignan-Extraktion aus Sesamöl ist hauptsächlich patentbezogen. Shinmen et al. (
US 5 211 953 A ) entwickelten einen Leberfunktionsverbesserer umfassend als einen wirksamen Inhaltsstoff ein Dioxabicyclo[3.3.0]oktan-Derivat wie Sesamin und verwandte Verbindungen in einem Nahrungsmittel oder Getränk enthaltend dieses Derivat mit einer Leberfuntions-verbesserenden Wirkung, einer den Cholesterinspiegel senkenden Wirkung und/oder einer den Neutralfettspiegel-senkenden Wirkung. Ein Extrakt, der hauptsächlich aus diesen Verbindungen bestand, wurde aus Sesamöl erhalten durch Extraktion mit einem unvermischbaren organischen Lösungsmittel. Die Prozent-Ausbeute des Extrakts, die für die methanolische Extraktion von Öl berichtet wurde, betrug 2 bis 3% basierend auf Ausgangsmaterial. Die Dispersion des Methanolextrakts in Aceton, Kühlen, Filtration und Evaporation ergab einen Verbindungs-spezifischen Extrakt mit nur 0,62% Ausbeute bezogen auf Ausgangsmaterial. Sie erhielten einen Lignan-Gehalt von nur 32,23% in diesem Extrakt basierend auf den Gesamtlignanen im Öl, dem Ausgangsmaterial. Alternativ haben sie die superkritische Extraktion von Öl und auch verschiedene chromatographische Techniken für die Isolation des gewünschten Lignans aus dem Extrakt ausprobiert. Die Ausbeute und Reinheit dieser Verbindungen über diese Techniken wurden jedoch in diesem Verfahren nicht berichtet. Namiki et al. (
US 6 278 005 B1 ) berichteten über ein Verfahren zur Herstellung von Sesam-Lignanen und/oder Sesam-Aromen enthalten in Sesamöl in höherer Reinheit und Ausbeute. In diesem Verfahren wurde das Sesamöl einer superkritischen CO
2-Extraktion unterzogen und die berichtete Prozent-Ausbeute der Extrakte lag im Bereich von 21–24%. Der Lignangehalt in dem Extrakt betrug nur 1,5–3,5%. Eine Zusammensetzung zur Inhibition von delta.sup.5-Desaturase bestehend aus Lignan-Verbindungen, hergestellt für Biopotenz-Studien durch Extraktion von Sesam-Samen oder Sesamöl unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln wie Aceton, Methylethylketon, Diethylketon, Methanol und Ethanol wurde durch Akimoto et al. patentiert (
US 5 336 496 A ). Verabreicht an Tiere zeigte diese Zusammensetzung inhibitorische Effekte, die in der Behandlung von Entzündung, Thrombose oder Bluthochdruck resultierten. Die Ausbeute und Reinheit der Zusammensetzung bezogen auf den Lignangehalt wurde in diesem Verfahren jedoch nicht offenbart. Die Extraktion von Sesam-Lignanen aus Sesamöl durch Flüssigextraktion mit organischem Lösungsmittel gefolgt von Verseifung und Fällung des Extrakts bei 4°C, um Lignane zu erhalten, wurde von Dachtler et al. berichtet (Euro. J. Lipid Sci. Technol., 105, 488–496, 2003). Die Ausbeute der Extraktion war jedoch sehr gering. Studien zur Verwendung von unverseifbaren Sesamöl-Materialien (USM) als einem natürlichen Antioxidationsmittel zeigten, dass USM antioxidative Eigenschaften mit weiten Nahrungsmittel-Anwendungsmöglichkeiten besitzt [Mohammed, H. M. A. und Awatif, I. I., Food Chemistry, 62(3), 269–276, 1978]. Sie fanden heraus, dass eine Kombination einer Anzahl von geringfügigen Bestandteilen wie z. B. Tocopherol, Sesamol, Squalen und Antipolymerisations-Sterolen in den USM eine synergistische Rolle in der Zunahme der Oxidationsstabilität von Sesamöl besitzen könnte.
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Die meisten soweit eingereichten Patente beziehen sich auf die Herstellung von Lignan-Konzentrat aus Sesamöl zur Durchführung von Studien für die biologische Auswertung in Tiermodellen und Menschen. Die kommerzielle und ökonomische Umsetzbarkeit in Bezug auf Ausbeute und Reinheit wurde in diesen Patenten nicht angesprochen. Das vorliegende, hier berichtete Verfahren beschreibt die ökonomischste Methode zur Herstellung von Lignanen mit hoher Ausbeute und Reinheit, so dass das Verfahren im internationalen Markt kommerziell wettbewerbsfähig ist.
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US 2 837 534 A beschreibt ein Verfahren zum Extrahieren von Pyrethrinsynergisten aus Sesamöl.
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US 2 467 903 A betrifft ein Verfahren zum Reinigen und Aufkonzentrieren von Sesamextrakten.
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Ziele der Erfindung
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Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens für die Extraktion und Isolation von bioaktiven Lignanen aus Sesamöl mit hoher Ausbeute und Reinheit.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens für die Produktion von bioaktiven Lignan-Kristallen mit 50–60% Ausbeute und 90–95% Reinheit.
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Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Lignan-Kristallen mit Lignan-Bestandteilen umfassend Sesamin von 70–85% und Sesamolin von 15–30%.
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Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Aufbewahrung des Ausgangsmaterials (> 90%), d. h. Sesamöl, so dass das so aufbewahrte Öl für Nahrungs-/Nicht-Nahrungs-Zwecke verwendet werden könnte.
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Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die restlichen Lignane aus dem Kristall-entfernten methanolischen Konzentrat zurückzugewinnen durch Verseifung und anschließendes Waschen der unverseifbaren Sesamöl-Materialien (USM) mit Petrolether, um gereinigte USM mit 40–50% Ausbeute und 55–65% Reinheit zu erhalten.
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Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von USM mit Lignan-Bestandteilen umfassend Sesamin von 45–50% und Sesamolin von 50–55%.
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Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines bioaktiven Lignan-Produkts mit einer Produktausbeute von 93–98% und mit einer Reinheit von 75–80%.
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Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist Flexibilität zu schaffen zur Herstellung einer Reihe von Produkten mit variierendem Lignan-Gehalt durch Formulierung der genannten Lignan-Produkte.
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Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Lignan-Produkten mit anderen bioaktiven Bestandteilen wie Phytosterol.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit für die Extraktion von bioaktiven Lignanen aus Sesamöl mit hoher Ausbeute und Reinheit und das genannte Verfahren umfassend die Schritte:
- (a) Behandeln des Sesamöls in einer sequentiellen, bis zu 6–10-maligen Extraktion mit Methanol in einem 1:1 bis 1:1,2 Verhältnis (w/v) bei einer Temperatur im Bereich von 60 bis 80°C für eine Dauer von 60 bis 100 Minuten, wobei jede Extraktion 9 bis 10 Minuten dauert und die erste und die folgende Ölphase mit frischem Methanol extrahiert wird und die Ölphase nach der letzten Extraktion separat aufbewahrt wird,
- (b) Konzentrieren der abgetrennten Methanolphase, die aus den oben genannten sequentiellen Extraktionen erhalten wurde, unter Vakuum und deren Dispersion in Petrolether in einem Verhältnis von 1:0,4 bis 1:0,6 (v/v),
- (c) Kühlen der oben genannten Dispersionsmischung bei einer Temperatur von 4 bis 10°C für eine Dauer von 24 bis 48 Stunden, anschließende Filtration und Waschen der resultierenden Kristalle mit gekühltem Petrolether, bis diese frei von Öl sind, und separates Aufbewahren des Filtrats,
- (d) Trocknen der oben genannten resultierenden Öl-freien Kristalle bei einer Temperatur kleiner als 50°C unter Vakuum für eine Dauer von 30 bis 60 Minuten, um die gewünschten reinen bioaktiven Lignan-Kristalle zu erhalten,
- (e) Entfernen des Lösungsmittels (desolventizing) aus dem in Schritt (c) erhaltenen Filtrat unter vermindertem Druck, um den Petrolether zu entfernen und Behandeln der resultierenden Methanolphase in einer Verseifung mit 1:1 bis 1:1,2 (v/v) einer wässrigen Kaliumhydroxid-Lösung (60:40, w/v) und 1:1 bis 1:1,2 (v/v) Methanol oder Ethanol für eine Dauer von 1 bis 1,5 Stunden in einem siedenden Wasserbad, Hinzufügen von Wasser zu der oben genannten resultierenden verseiften Mischung in einem Verhältnis von 1:3 bis 1:4 (v/v), anschließend mindestens 6–8-malige Extraktion mit Petrolether in einem Verhältnis von 1:9 bis 1:11 (v/v), wobei jedes Mal die Petroletherphase abgetrennt wird,
- (f) Waschen des in Schritt (e) erhaltenen, abgetrennten Petroletherextrakts mit 10 bis 12% Methanol oder Ethanol, bis dieser frei von Base ist, Konzentrieren des resultierenden Extrakts unter vermindertem Druck, anschließendes Trocknen bei einer Temperatur von weniger als 60°C, um die unverseifbaren Sesamöl-Materialien (USM) zu erhalten,
- (g) 8 bis 10-maliges Waschen der oben genannten resultierenden USM mit Petrolether in einem Verhältnis von 1:0,6 bis 1:0,7 (v/v), um Verunreinigungen zu entfernen, anschließendes Trocknen unter Vakuum bei einer Temperatur weniger als 60°C für 30 bis 60 Minuten, um die gereinigten USM zu erhalten,
- (h) Vermischen der in Schritt (g) erhaltenen oben genannten gereinigten USM mit in Schritt (d) erhaltenen reinen Lignan-Kristallen, um das gewünschte bioaktive Lignan-angereicherte Produkt zu erhalten.
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In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die bei jeder Extraktion abgetrennte Ölphase anschließend mit frischem Methanol extrahiert.
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In noch einer anderen Ausführungsform beträgt die Ausbeute an extrahiertem Lignan-Gehalt im methanolischen Konzentrat in Schritt (a) 75–90% des eingesetzten Lignans in Sesamöl.
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In noch einer anderen Ausführungsform beträgt der Verlust des in Schritt (a) aufbewahrten Sesamöls nach anschließender methanolischer Extraktion 17–12%.
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In noch einer anderen Ausführungsform beträgt das Verhältnis an methanolischem Extrakt zu Petrolether in einem Dispersionsmedium in Schritt (b) vorzugsweise 1:0,5 (w/v).
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In noch einer anderen Ausführungsform liegt die Ausbeute an in Schritt (d) erhaltenen bioaktiven Lignan-Kristallen im Bereich von 50 bis 60% der eingesetzten Lignane in Sesamöl.
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In noch einer anderen Ausführungsform beträgt die Reinheit der in Schritt (d) erhaltenen bioaktiven Lignan-Kristalle 90 bis 95%.
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In noch einer anderen Ausführungsform umfassen die in Schritt (d) erhaltenen Lignan-Kristalle 70–85% Sesamin und 15–30% Sesamolin.
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In noch einer anderen Ausführungsform liegt die Ausbeute des Lignan-Gehalts der Sesamöl-USM im Bereich von 40 bis 50% der eingesetzten Lignane in Sesamöl.
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In noch einer anderen Ausführungsform liegt die Reinheit des Lignan-Gehalts der Sesamöl-USM im Bereich von 55–65% der eingesetzten Lignane in Sesamöl.
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In noch einer anderen Ausführungsform beträgt die Ausbeute des in Schritt (h) erhaltenen angereicherten bioaktiven Lignan-Produkts 93 bis 98% der gesamten eingesetzten Lignane in Sesamöl.
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In noch einer anderen Ausführungsform beträgt die Reinheit des in Schritt (h) erhaltenen angereicherten bioaktiven Lignan-Produkts 75 bis 80%.
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In noch einer anderen Ausführungsform liegt der Phytosterolgehalt der Sesamöl-USM im Bereich von 10 bis 30% der Sesamöl-USM.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Das folgende Verfahren wurde entwickelt für die Extraktion und Isolierung von bioaktiven Lignanen aus Sesamöl durch sequentielle Extraktion, Kristallisation und Verseifung. Die sequentielle Extraktion wird durchgeführt in einem Dreihalskolben ausgestattet mit einem Motor-getriebenen Rührer, Rückflusskühler und Thermometerausstattung. Sesamöl wird in den Kolben gefüllt und Methanol wird in der angegebenen Menge hinzugefügt. Die obige Mischung wird für die angegebene Zeitdauer bei der ausgewählten Temperatur unter Rückfluss gerührt. Nach der angegebenen Extraktionszeit wird der Mischung erlaubt, sich für die Phasentrennung zu setzen. Die Methanol-Phase und die Öl-Phase werden separat gesammelt und die Öl-Phase wird der weiteren sequentiellen Extraktion unter den gewählten Temperatur- und Zeitbedingungen unterwerfen. Es hat sich gezeigt, dass Zeit, Temperatur, Lösungsmittelverhältnis und Anzahl der Extraktionen die Lignan-Extraktion aus dem Öl während des sequentiellen Schritts beeinflussen. Die Lignan-Gewinnung nahm bei allen Temperaturen mit der Extraktionszeit zu, mit maximalem Gewinn bei 70°C. Durch Änderung des Volumens des Lösungsmittelverhältnisses, d. h. 1:2 und 1:0,5 (w/v), wurde keine merkliche Änderung in der Lignan-Extraktion verglichen mit der bei 1:1 bemerkt. Deshalb wurde das Lösungsmittelverhältnis festgelegt als 1:1 bei einer Temperatur von 70°C.
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Der abgetrennte, zusammengegebene methanolische Extrakt aus der sequentiellen Extraktion durchgeführt bei 70°C, 1:1 Lösungsmittelverhältnis wird konzentriert und in Petrolether dispergiert in einem Verhältnis 1:0,5, um die Kristallisation zu erleichtern. Das Dispersionsvolumen von Petrolether unter und über dem 0,5-Gehalt zeigte sich als die Kristallausbeute nachteilig beeinflussend. Die Kristalle werden von der Mischung durch Vakuumfiltration abgetrennt und anschließend mit gekühltem Petrolether gewaschen, bis sie ölfrei sind und weiter in einem Vakuumofen bei weniger als 60°C getrocknet, dies ergab reine Lignan-Kristalle. Die bedeutendste Erkenntnis ist, dass durch den Kristallisationsschritt des methanolischen Extrakts 50–60% der Lignane in dem Öl mit hoher Reinheit abgetrennt werden können, wobei die Lignanbestandteile gemäß der HPLC-Analyse Sesamin von 70–85% und Sesamolin von 15–30% umfassen. Auch das resultierende restliche Öl wird durch Entfernen des Lösungsmittels (desolventization) aufbewahrt, um das Ausgangsmaterial, d. h. Sesamöl bis zum Betrag von 90% zu erhalten. Analytische Ergebnisse haben gezeigt, dass das resultierende Öl einen restlichen Lignan-Gehalt von 0,1 bis 0,3% aufweist, wobei der Großteil des Lignans im Ausgangsöl durch Methanol extrahiert wird. Verseifungsstudien mit dem Kristall-entfernten Lösungsmittel-entfernten methanolischen Konzentrat für verschiedene Zeitdauern offenbaren, dass eine Stunde Verseifung für eine vollständige Reaktion ausreichend ist. Es stellte sich heraus, dass das Waschen der USM mit gekühltem Petrolether den Lignan-Gehalt in den USM erhöht. Die HPLC-Analyse des gereinigten USM offenbart, dass die Verteilung von Sesamin und Sesamolin im Bereich von 45–50% bzw. 50–55% liegt im Gegensatz zu der beobachtet in dem reinen Kristall. Alternativ zeigen Studien zu der direkten Verseifung des methanolischen Konzentrats der sequentiellen Extraktion ohne den vorgenannten Kristallisationsschritt, dass ebenfalls USM mit einem Lignan-Gehalt von 70–75% gemäß der HPLC-Analyse erhalten wird. Die HPLC-Analyse zeigte, dass USM zusätzlich zu Lignanen Phytosterole im Bereich von 20–30% enthielt; und die Lignan-Produkte erhalten durch Vermischen 10–15% Phytosterole enthalten und der Rest sind Lignane.
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Die folgenden Beispiele werden zur Illustration gegeben und sollten daher nicht als den Umfang der Erfindung einschränkend verstanden werden.
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Beispiel 1
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In einem Dreihalskolben ausgestattet mit Motor-getriebenem Rührer, Rückflusskühler und Thermometeraufbau werden 100 g kommerzielles Sesamöl auf die folgende Art mit 100 ml Methanol (w/v) sequentiell extrahiert. Die Extraktionstemperatur wird bei 60°C gehalten. Die Mischung wird für 10 Minuten kontinuierlich bei dieser Temperatur gerührt und es wird ihr gestattet, sich zu setzen. Die abgetrennten methanolischen und Öl-Phasen werden gesammelt und die restliche Öl-Phase, die so von der ersten sequentiellen Extraktion abgetrennt wurde, wird der zweiten sequentiellen Extraktion von 10 Minuten Dauer mit einer frischen Ladung Methanol im 1:1 Verhältnis (w/v) unterworfen. Die methanolischen und Öl-Phasen von der zweiten sequentiellen Extraktion werden abgetrennt und die sequentielle Extraktion wird gleichermaßen fortgesetzt für bis zu 100 Min. und die abgetrennten methanolischen Phasen werden vereinigt. Der vereinigte methanolische Extrakt wird in einem Schnellverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert und unter Vakuum bei einer Temperatur kleiner als 60°C getrocknet. Das methanolische Extrakt-Konzentrat wog 11,91 g und das restliche Öl wog 87,2 g.
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Beispiel 2
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Die HPLC-Analyse des methanolischen Konzentrats auf Lignane durch Umkehrphase und Quantifizierung der abgetrennten Peaks wird folgendermaßen durchgeführt. In einem tatsächlichen Experiment wird eine von Shimadzu hergestellte LC-10AD analytische HPLC ausgestattet mit Rheodyne Injektor ausgerüstet mit 20 μl Probe-Loop, einem UV-sichtbaren Detektor und C-R7Ae Modell Datenanalysator verwendet. Die verwendete Säule ist Luna 5 μ C18 (2) (250 × 4,6 mm) und das verwendete Lösungsmittelsystem ist Methanol: Wasser (70:30 v/v) bei einer Flussrate von 1 ml/min. Der UV-Detektor wird auf 290 nm eingestellt. Die Quantifizierung der abgetrennten Peaks erfolgt durch Kalibration mit dem Standard Sesamin (Sigma-Aldrich Co., USA). Die bei RT-12,9 Min. identifizierten Peaks werden als Sesamin bestätigt durch Co-Injektion des Standards und der bei RT 17,1 min. wird als Sesamolin bestätigt basierend auf früheren Berichten und wird quantifiziert unter Verwendung des Ansprechfaktors von Sesamin. Bei der HPLC-Analyse zeigte der Extrakt einen Gesamt-Lignan-Gehalt von 0,91 g, wobei das hauptsächliche Lignan Sesamin mit 0,64 g ist und Sesamolin mit 0,27 g.
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Beispiel 3
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In einem Dreihalskolben ausgestattet mit Motor-getriebenem Rührer, Rückflusskühler und Thermometeraufbau werden 100 g kommerzielles Sesamöl mit 100 ml Methanol (w/v) auf die folgende Art sequentiell extrahiert. Die Extraktionstemperatur wird bei 70°C gehalten. Die Mischung wird für 10 Minuten kontinuierlich bei dieser Temperatur gerührt und es wird ihr erlaubt, sich zu setzen. Die abgetrennten methanolischen und Öl-Phasen werden gesammelt und die restliche Öl-Phase, die so von der ersten sequentiellen Extraktion abgetrennt wurde, wird der zweiten sequentiellen Extraktion von 10 Minuten Dauer mit einer frischen Menge Methanol im 1:1 Verhältnis (w/v) unterworfen. Die methanolischen und die Öl-Phasen von der zweiten sequentiellen Extraktion werden abgetrennt und die sequentielle Extraktion wird gleichermaßen für bis zu 100 Min. fortgeführt und die abgetrennten methanolischen Phasen werden vereinigt. Der vereinigte methanolische Extrakt wird in einem Schnellverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert und unter Vakuum bei einer Temperatur kleiner als 60°C getrocknet. Das methanolische Extrakt-Konzentrat wog 10,09 g und das restliche Öl wog 89,2 g.
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Beispiel 4
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Die HPLC-Analyse des methanolischen Konzentrats auf Lignane wird durchgeführt wird in Beispiel 2 beschrieben. Bei der HPLC-Analyse zeigte der Extrakt einen Gesamt-Lignan-Gehalt von 0,94 g, wobei die Lignan-Zusammensetzung 0,66 g Sesamin und 0,28 g Sesamolin enthält.
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Beispiel 5
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In einem Dreihalskolben ausgestattet mit Motor-getriebenem Rührer, Rückflusskühler und Thermometeraufbau werden 100 g kommerzielles Sesamöl auf die folgende Art mit 100 ml Methanol (w/v) sequentiell extrahiert. Die Extraktionstemperatur wird bei 80°C gehalten. Die Mischung wird für 10 Min. kontinuierlich bei dieser Temperatur gerührt und es wird ihr erlaubt, sich zu setzen. Die getrennten methanolischen und Öl-Phasen werden gesammelt und die restliche Öl-Phase, die so von der ersten sequentiellen Extraktion abgetrennt wurde, wird der zweiten sequentiellen Extraktion von 10 Minuten Dauer mit einer frischen Menge an Methanol im 1:1 Verhältnis (w/v) unterworfen. Die methanolischen und Öl-Phasen von der zweiten sequentiellen Extraktion werden abgetrennt und die sequentielle Extraktion wird gleichermaßen für bis zu 100 Min. fortgeführt und die abgetrennten methanolischen Phasen werden vereinigt. Der vereinigte methanolische Extrakt wird in einem Schnellverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert und unter Vakuum bei einer Temperatur kleiner als 60°C getrocknet. Das methanolische Extrakt-Konzentrat wog 9,65 g und das restliche Öl wog 90,2 g.
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Beispiel 6
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Die HPLC-Analyse des methanolischen Konzentrats auf Lignane wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Bei der HPLC-Analyse zeigte der Extrakt einen Gesamt-Lignan-Gehalt von 0,85 g, wobei die Lignan-Zusammensetzung 0,60 g Sesamin und 0,25 g Sesamolin enthält.
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Beispiel 7
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Die obigen Beispiele zeigten, dass die maximale Gesamt-Lignan-Extraktion bei einer Extraktionstemperatur von 70°C erreicht wird.
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Beispiel 8
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In einem Dreihalskolben ausgestattet mit einem Motor-getriebenen Rührer, Rückflusskühler und Thermometeraufbau werden 1000 g kommerzielles Sesamöl auf die folgende Art mit 1000 ml Methanol (w/v) sequentiell extrahiert. Die Extraktionstemperatur wird bei 70°C gehalten. Die Mischung wird für 10 Minuten kontinuierlich bei dieser Temperatur gerührt, und es wird ihr erlaubt, sich zu setzen. Die abgetrennten methanolischen und Öl-Phasen werden gesammelt und die restliche Öl-Phase, die so von der ersten sequentiellen Extraktion abgetrennt wurde, wird der zweiten sequentiellen Extraktion von 10 Min. Dauer mit einer frischen Menge an Methanol im 1:1 Verhältnis (w/v) unterworfen. Die methanolischen und Öl-Phasen von der zweiten sequentiellen Extraktion werden abgetrennt und die sequentielle Extraktion wird gleichermaßen für bis zu 100 Min. fortgeführt, und die abgetrennten methanolischen Phasen werden vereinigt. Der vereinigte methanolische Extrakt wird in einem Schnellverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert und unter Vakuum bei einer Temperatur weniger als 60°C getrocknet. Das methanolische Extrakt-Konzentrat wog 117,88 g und das restliche Öl wog 880,0 g.
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Beispiel 9
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Die HPLC-Analyse des methanolischen Konzentrats auf Lignane wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Bei der HPLC-Analyse zeigte der Extrakt einen Gesamt-Lignan-Gehalt von 9,79 g, wobei die Lignan-Zusammensetzung 6,85 g Sesamin und 2,94 g Sesamolin enthielt.
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Beispiel 10
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Das methanolische Extrakt-Konzentrat (117,88 g) wie in Beispiel 8 beschrieben wird in 59 ml Petrolether (1:0,5 w/v) dispergiert und die Mischung wird für 24 bis 48 Std. bei niedriger Temperatur von 4 bis 10°C gehalten, um die Kristallisation der Lignane zu erleichtern. Die Kristalle werden von der Mischung durch Vakuumfiltration abgetrennt, mit gekühltem Petrolether gewaschen, bis sie ölfrei sind, in einem Vakuumofen bei einer Temperatur kleiner als 60°C für 30 Min. bis 1 Std. getrocknet. Die bioaktiven Lignan-Kristalle wogen 5,52 g.
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Beispiel 11
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Die HPLC-Analyse der Kristalle zeigte 94,36% Reinheit, wobei die Lignan-Zusammensetzung 4,63 g Sesamin und 0,89 g Sesamolin in der Kristallmischung enthielt.
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Beispiel 12
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Das Filtrat aus Beispiel 10 wird nach der Kristall-Entfernung durch Schnellverdampfung unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit, um den Petrolether zu entfernen. Der resultierende, Lösungsmittel-freie methanolische Extrakt wog 109,2 g. Dieser Lösungsmittel-freie methanolische Extrakt wird einer Verseifung unterworfen durch Hinzufügen von 109,2 ml (1:1 w/v) Kaliumhydroxid (KOH) in Wasser (60:40 w/v) und 650 ml Ethanol (1:6 v/v) in einem siedenden Wasserbad für eine Stunde. Nach Abschluss der Verseifung werden 440 ml Wasser (1:4 v/v) zu der Mischung hinzugefügt und anschließend 6 mal mit 1100 ml Petrolether (1:10 v/v) extrahiert, wobei jedes Mal die Petrolether-Phase abgetrennt wird. Die abgetrennten Petrolether-Fraktionen aus den 6 Extraktionen werden vereinigt und dann mit 10% Ethanol gewaschen, bis sie Base-frei sind. Die kombinierten Base-freien Petrolether-Extrakte werden unter vermindertem Druck schnellverdampft und dann im Vakuumofen bei einer Temperatur kleiner als 60°C für 30 min. bis 1 Std. getrocknet, um die USM zu erhalten. Die USM wogen 6,04 g.
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Beispiel 13
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Die HPLC-Analyse der USM aus Beispiel 12 auf den Lignan-Gehalt wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Bei der HPLC-Analyse zeigten die USM 58,3% Reinheit, wobei die Lignan-Zusammensetzung 1,63 g Sesamin, 1,89 g Sesamolin im Produkt enthielt.
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Beispiel 14
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Die HPLC-Analyse der USM aus Beispiel 12 auf den Sterol-Gehalt wurde mit Umkehr-Phase durchgeführt und die Quantifizierung der abgetrennten Peaks wurde folgendermaßen durchgeführt. In einem tatsächlichen Experiment wird eine von Shimadzu hergestellte LC-10AD analytische HPLC ausgestattet mit Rheodyne-Injektor ausgerüstet mit 20 μl Proben-Loop, einem UV-sichtbaren Detektor und C-R7Ae Modell Datenanalysator verwendet. Die verwendete Säule ist Zorbax ODS 5 μ (250 × 4,6 mm) und das verwendete Lösungsmittelsystem ist Methanol: Wasser (96,5:3,5 v/v) bei einer Flussrate von 1,2 ml/min. Der UV-Detektor wird auf 206 nm eingestellt. Die Quantifizierung der abgetrennten Peaks erfolgt durch Kalibration mit Standard-Sterolen (Stigmasterol, Campesterol, β-Sitosterol; Sigma-Aldrich Co., USA). Die festgestellten Peaks bei RT 30 min., 31 min. und 34 min. werden als Stigmasterol, Campesterol bzw. β-Sitosterol bestätigt durch Co-Injektion der Standards und werden durch Verwendung der Ansprechfaktoren der jeweiligen Sterole quantifiziert. Der Gesamt-Phytosterol-Gehalt der USM beträgt gemäß HPLC-Analyse 28,04%.
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Beispiel 15
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Die USM (6,04 g) aus Beispiel 12 werden mit 4 ml Petrolether (1:0,7 w/v) 10 mal gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen. Das Petrolether-gewaschene USM wird in einem Vakuumofen bei weniger als 60°C für 30 min. bis 1 Std. getrocknet. Die getrockneten USM wogen 5,49 g.
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Beispiel 16
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Die HPLC-Analyse der USM auf Lignane wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Bei der HPLC-Analyse zeigten die USM 63% Reinheit, wobei die Lignan-Zusammensetzung 2,53 g Sesamin und 2,97 g Sesamolin in dem Produkt enthielt.
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Beispiel 17
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Die in Beispiel 10 erhaltenen reinen bioaktiven Lignan-Kristalle (5,52 g) werden mit den von Verunreinigungen befreiten USM aus Beispiel 15 (5,49 g) kombiniert, um das bioaktive angereicherte Lignan-Produkt zu erhalten. Das angereicherte Produkt wog 11,01 g.
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Beispiel 18
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Die HPLC-Analyse des angereicherten Lignan-Produkts zeigte eine Reinheit von 78–80% mit 93–98% Produktausbeute bezüglich des Lignan-Gehalts des Sesamöls.
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Beispiel 19
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Das methanolische Konzentrat (10,09 g) aus Beispiel 3 wird einer Verseifung wie in Beispiel 12 beschrieben unterworfen. Die USM wogen 0,93 g.
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Beispiel 20
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Die HPLC-Analyse der USM (Beispiel 19) auf den Lignan-Gehalt wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Bei der HPLC-Analyse zeigten die USM 73% Reinheit, wobei die Lignan-Zusammensetzung 80% Sesamin und 20% Sesamolin enthielt.
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Beispiel 21
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Die HPLC-Analyse der USM (Beispiel 19) auf den Sterol-Gehalt wird wie in Beispiel 14 beschrieben durchgeführt. Der Gesamt-Phytosterol-Gehalt der USM beträgt 18,2% gemäß der HPLC-Analyse.
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Vorteile:
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Die hauptsächlichen Vorteile der vorliegenden Erfindung sind:
- 1. Die Entwicklung eines Verfahrens für die Extraktion von bioaktivem Lignan aus Sesamöl durch sequentielle Extraktion mit organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen, wobei ein 10-facher Anstieg des Lignan-Gehalts im Methanol-Konzentrat verglichen zu dem Ausgangsmaterial-Sesamöl bewirkt wird.
- 2. Nach der Extraktion der bioaktiven Lignane aus dem Öl wird das Ausgangsmaterial mit einem Verlust von nur 10% aufbewahrt und das so bewahrte Sesamöl (90%) könnte als Speiseöl verwendet werden, um die Herstellungskosten deutlich zu senken.
- 3. Durch die Behandlung des methanolischen Extrakts bei tiefer Temperatur werden reine bioaktive Lignan-Kristalle mit einer Ausbeute von 50 bis 60% und einer Reinheit von 90 bis 95%, angereichert mit Sesamin (70–80%) erhalten.
- 4. Ein einfacher Schritt wie die Verseifung kann für die weitere Rückgewinnung der restlichen Lignane aus dem Kristall-befreiten methanolischen Konzentrat verwendet werden, um eine Ausbeute von 40 bis 50% USM mit 55 bis 65% Reinheit und mit einem unterschiedlichen Verteilungsprofil der Lignan-Bestandteile, d. h. Sesamin und Sesamolin zu erhalten.
- 5. Die Vermischung der Kristalle mit USM kann zu einem weiteren optionalen angereicherten Lignan-Produkt mit 93 bis 98% Ausbeute und einer Reinheit von 75 bis 80% führen.
- 6. Das Verfahren verwendet einfache und weniger umständliche Methoden unter Verwendung von Extraktions- und Kristallisations-Techniken, wobei die Verseifung nur einen zusätzlichen Schritt darstellt, der das Verfahren möglichst ökonomisch und wirksam macht.
- 7. Die direkte Verseifung des methanolischen Konzentrats nach der sequentiellen Extraktion stellt ein weiteres vielseitiges Lignan-angereichertes Produkt mit 70 bis 75% Lignan-Gehalt bereit.
- 8. Das Verfahren kann für die Extraktion und Isolierung von bioaktiven Lignanen aus Ölen von verschiedenen Sesamsorten verwendet werden.
- 9. Das Verfahren schafft Flexibilität zur Herstellung einer Reihe von Produkten mit variierenden Lignan-Gehalten durch Formulierungen.
- 10. Die durch dieses Verfahren erhaltenen USM enthalten auch bioaktive Phytosterole.