Wichtige
technische Einsatzgebiete für
Enzyme sind unter anderem Wasch- und Reinigungsmittel und Kosmetika.
In diesen Bereichen stellen die Enzyme selbst die wirksamen Agentien
der Produkte dar. Auf den Gebieten der Textilherstellung und -Verarbeitung
oder der Lebensmittelherstellung dienen sie in erster Linie als
Hilfsmittel, um die Rohstoffe zum eigentlichen Produkt umzusetzen.
Technische Enzyme werden üblicherweise
je nach Art des für
sie beabsichtigten Einsatzes in flüssiger Form bereitgestellt
oder in die Form fester Granulate überführt.
Enzyme
werden meist durch Fermentation von Mikroorganismen produziert und
anschließend aus
den betreffenden Flüssigmedien
aufgereinigt. Reinigungs- oder Anreicherungsverfahren zur Gewinnung
konzentrierter Enzymlösungen
sind im Stand der Technik ausführlich
beschrieben. Zum Zweck der Reinigung kommen zumeist auf Filtration, Sedimentation
oder Ausfällung
beruhende Techniken zur Anwendung, wobei zunächst die Biomasse abgetrennt
wird und anschließend über zunehmend
sensitivere Methoden wie Separation, Mikrofiltration oder Ultrafiltration
das Enzymkonzentrat erhalten wird.
So
geht beispielsweise aus der Anmeldung WO 01/37628 A2 ein Verfahren
zur Gewinnung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus
Kultur- und/oder Fermenterlösungen
hervor, welches das Trennen der wasserunlöslichen Feststoffe von der
wäßrigen,
die Wertstoffe enthaltenden Lösung, anschließendes Filtrieren
der erhaltenen Lösung
und Aufkonzentrieren der wertstoffhaltigen Lösung mittels Ultrafiltration
umfaßt.
Es ist dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennten Feststoffe
einem Waschschritt unterzogen werden, wobei als Waschflüssigkeit
das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe verwendet wird.
Die
meisten Veredelungsmethoden sind nur in unzureichendem Maße geeignet,
aus einem von der Biomasse abgetrennten Enzymkonzentrat denaturierte
Proteine und farbige Verbindungen zu entfernen; oder sie entfernen
zusammen mit diesen auch einen Großteil an stabilisierenden Faktoren.
Die Folge davon ist in jedem Fall eine nicht zufriedenstellende
Produktqualität.
Denn entweder weist das Enzymkonzentrat Schlieren und/oder Schwebstoffe
bis hin zu ausgefällten
Stoffen auf oder es verfügt
bei klarer Lösung über eine
unzureichende Enzym-Stabilität. Diese
Nachteile wirken sich auch auf die Produkte aus, in welche das betreffende
Konzentrat eingearbeitet wird, insbesondere die hiervon abgeleiteten Enzymgranulate.
Im
Stand der Technik sind auch Verfahren zur Entfärbung und Desodorierung von
konzentrierten Enzymlösungen
beschrieben. Hierzu gehören Fällungsmethoden,
zum Beispiel mit organischen Lösungsmitteln
oder Polymeren, insbesondere aber das Aussalzen des interessierenden
Proteins mit Natriumsulfat (beschrieben in H.Ruttloff (1994): „Industrielle
Enzyme" Behr's Verlag, Hamburg,
Kapitel 6.3.3.6, Seiten 376 bis 379). Hierbei wird das Protein gefällt, wobei
die Begleitstoffe im Überstand
bleiben. Allerdings wird durch das Ausfällen und Resuspendieren ein
Teil des Proteins irreversibel denaturiert und insgesamt die Stabilität beeinträchtigt;
nicht zuletzt auch deshalb, weil auch stabilisierende Verbindungen
abgetrennt werden. Als zu erzielende Ausbeute werden in der Tabelle
auf Seite 378 dieses Lehrbuchs ca. 50% angegeben.
Eine
weitere Alternative besteht in der adsorptiven Reinigung der Enzyme,
beispielsweise über
ein Ionenaustausch-Harz (H.Ruttloff (1994): „Industrielle Enzyme" Behr's Verlag, Hamburg,
Kapitel 6.3.3.7 und 6.3.3.8, Seiten 379 bis 396). Hierbei binden
die interessierenden Proteine an ein Chromatographie-Material und
werden anschließend
mit einem anderen Medium eluiert. Allerdings werden hierdurch aufgrund
von Denaturierungs- und Faltungseffekten ebenfalls zumeist nur schlechte
Ausbeuten erzielt. So werden für
verschiedene Chromatographieverfahren (außer der Affinitätschromatographie)
in der Tabelle auf Seite 378 Ausbeutewerte von maximal ca. 60% angegeben.
Die spezifischen, insbesondere die Affinitätschromatographie-Materialien sind
im allgemeinen leistungsfähiger,
aber sehr empfindlich und aufwendig herzustellen. Letztere finden
daher überwiegend
in der Medizintechnik Anwendung, jedoch praktisch nicht in der großtechnischen
Enzymherstellung.
Der
umgekehrte Ansatz, gezielt die Verunreinigungen über ein Trägermaterial aus der flüssigen Lösung abzureichern,
ist bislang nur für
Nahrungsmittelrohstoffe gewählt
worden. So wird in dem Handbuch „DIAION®. Manual
of ion exchange resins and synthetic adsorbent, Band II" von der Firma Mitsubishi
Kasei Corp. (Tokyo, Japan), 2. Druck, 1.5.1993, auf den Seiten 93
bis 100 die Entfärbung
von Zucker unter anderem über
nacheinandergeschaltete, verschiedene Ionenaustauschchromatographie-Schritte
beschrieben. Durch diesen umgekehrten Ansatz ergeben sich grundsätzlich mehrere,
im einzelnen jeweils sehr selektive Aufreinigungsschritte, bei denen die
jeweils abtrennbare Verunreinigung auf dem entsprechenden Material
verbleibt.
Die
bislang unveröffentlichte
Anmeldung
DE 10304066 befaßt sich
ebenfalls mit dem Problem, Enzymkonzentrate von Feststoffen, insbesondere von
irreversibel denaturierten Proteinen zu befreien und gleichzeitig
so gezielt zu entfärben – das heißt von den
farbigen, meist braunen Verbindungen, die bei der der Fermentation
vorangegangenen Sterilisation der Medienbestandteile entstanden
sind, zu befreien – daß eine möglichst
hohe Lagerstabilität
der Konzentrate erhalten bleibt. Letzteres, möglichst ohne die Faktoren,
die die Stabilität
des interessierenden Proteins erhöhen, ebenfalls abzutrennen.
Als Lösung
dieser Aufgabe wurde demnach ein Verfahren zur Veredelung konzentrierter
Enzymlösungen entwickelt,
das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
- (a)
Herstellung einer konzentrierten Enzymlösung,
- (b) Abtrennung von Feststoffen, insbesondere von Fremdproteinen
und/oder inaktiven Enzymen und
- (c) starkbasische Anionenaustausch-Chromatographie.
Die
Weiterverarbeitung sieht gemäß dieser Anmeldung
unter anderem eine Mischung mit weiteren Lösungen, beispielsweise Stabilisatoren
vor. Eine Weiterverarbeitung zu festen Granulaten wird in dieser
Anmeldung jedoch nicht konkret beschrieben.
Auch
für die
Konfektionierungsmethode der Granulation besteht ein reichhaltiger
Stand der Technik. Die wichtigsten Methoden hierfür sind in
Lehrbüchern
wie beispielsweise dem „Handbuch
der Agglomerationstechnik" von
G. Heinze (1999, Verlag Wiley-VCH, Weinheim, Deutschland, ISBN 3-527-29788-X,
S. 65–170)
beschrieben.
Ein
großer
Teil der Patentliteratur befaßt
sich auch mit Beschichtungen (Coatings) für Enzymgranulate. In einigen
Schriften wird sogar vorgeschlagen, die Enzyme selbst als eine Schicht
unter mehreren aufzutragen. Dies erfüllt beispielsweise gemäß WO 93/07263
A2 einen mehrfachen Zweck, nämlich unter
anderem die betreffenden Enzyme zeitverzögert freizusetzen, sie gegen äußere Einflüsse zu schützen und
gleichzeitig das Maß an
Enzymstaub, der von diesen Partikeln ausgeht, geringzuhalten. Die
Eigenfärbung
oder der Geruch der eingebrachten Enzyme werden hier jedoch ebensowenig
diskutiert wie die eventuelle Aufgabe, diese zu überdecken. Die Anmeldung WO
93/07260 A1 diskutiert die eingebrachten Enzymkonzentrate lediglich
in Hinblick auf ihre biophysikalischen Eigenschaften und schlägt beispielsweise
vor, ihnen Binder oder Pulver zusetzen, um die weitere Verarbeitung
zu erleichtern.
Ein
Verfahren zur Herstellung von Enzymgranulaten aus Enzymlösungen geht
beispielsweise aus der Anmeldung WO 92/11347 A2 hervor. Demnach
wird die aufkonzentrierte Fermentationsbrühe mit einem Zuschlagsstoff
vermischt, der 10 bis 35 Gew.-% Getreidemehl (bezogen auf das fertige
Granulat) enthält.
Optional kann demgemäß auf derartige
Granulate zusätzlich
ein Überzug
mit einem wasserlöslichen,
filmbildenden Polymer aufgebracht werden, welcher Farbstoff oder
Pigment enthält,
um die Eigenfärbung
der Granulate zu überdecken.
Im Beispiel handelt es sich um eine Schicht aus Titandioxid und
Polyethylenglykol, die während
der Wirbelschichttrockung aufgebracht wird. Eine eventuelle Entfärbung oder
Desodorierung der eingebrachten Enzymkonzentrate wird nicht offenbart.
In
der Anmeldung WO 97/40128 A1 werden ähnliche Enzymgranulate offenbart,
die als Granulierhilfsmittel eine phophatierte Stärke enthalten.
Auch hier wird eine eventuelle Entfärbung oder Desodorierung der
eingebrachten Enzymkonzentrate nicht diskutiert. Stattdessen wird
wiederum vorgeschlagen, die auf das Enzymkonzentrat zurückzuführende Eigenfarbe
des Granulats mit Pigmenten zu überdecken.
Hierfür
wird im Beispiel wiederum Titandioxid verwendet, welches auf den
meist Polyethylenglykol enthaltenden Partikeln haftet.
Die
Anmeldung WO 95/02031 A1 nennt als Aufgabe unter anderem, die Eigenfärbung des
nicht umhüllten
Granulats zu überdecken
und einen eventuell störenden
Geruch durch Verhinderung der Diffusion der Geruchsstoffe zu unterdrücken. Als
Lösung hierfür offenbart
sie ein Umhüllungssystem,
das feinteiliges anorganisches Pigment, einen Alkohol oder ein Alkoholgemisch
mit einem Schmelzpunkt im Bereich von 45–65°C, einen Emulgator für den Alkohol, ein
Dispergiermittel für
das Pigment und Wasser enthält.
Mit
den Problemen, neben einer Erhöhung der
Lagerstabilität
die auf das Enzymkonzentrat zurückzuführende Eigenfarbe
sowie einen eventuell störenden
Geruch des Granulats zu überdecken,
befaßt
sich auch gezielt die Anmeldung WO 98/26037 A2. Hierfür stellt
sie ein Umhüllungssystem
zur Verfügung,
das feinteiliges, wasserunlösliches
Pigment (zum Beispiel Titandioxid), ein bei Raumtemperatur festes
wasserlösliches
organisches Material (zum Beispiel einen ethoxylierten Fettalkohol)
und optional einen Rieselfähigkeitsverbesserer
enthält.
Auch hier wird also wiederum ein Überdecken der unerwünschten
Eigenschaften vorgenommen und nicht eine Beseitigung der Verbindungen,
auf die diese Eigenschaften zurückzuführen sind.
Wie
aus den hier diskutierten Dokumenten hervorgeht, ist es einerseits
bekannt, bei der Aufarbeitung von Enzymkonzentraten, diese zu stabilisieren
und störende
Begleitstoffe abzutrennen. Andererseits werden flüssige Enzymkonzentrate
zu festen Granulaten weiterverarbeitet, bei denen es unter anderem
als wünschenswert
angesehen wird, Geruch und Farbe der enthaltenen Enzymkomponente
zu überdecken,
insbesondere über
Beschichtungen. Demgegenüber
ist jedoch bislang nicht angedacht worden, Farbe und Geruch von
Enzymgranulaten dadurch zu verbessern, daß bereits entsprechend aufgearbeitete
Enzymkonzentrate eingebracht werden. Möglicherweise stand dem auch
das niedrige Maß an Stabilität von jenen
Enzymkonzentraten entgegen, die auf herkömmliche Weise entfärbt und
desodoriert werden.
Bislang
existiert noch kein Stand der Technik, nach welchem besonders schonend
aufgearbeitete Enzymkonzentrate zu festen Granulaten verarbeitet
werden sollen. Insbesondere deren Weiterverarbeitung, etwa durch
Beschichtung, und die Eigenschaften solcher beschichteter Granulate
sind bislang noch nicht offenbart oder vorgeschlagen worden.
Es
stellte sich die Aufgabe, ein festes Enzymgranulat zur Verfügung zu
stellen, welches vergleichsweise lagerstabil ist, geruchsarm ist
und über eine
ansprechende Farbe verfügt.
Dieses Enzymgranulat sollte beschichtet werden können oder beschichtet sein,
wobei das erhaltene beschichtete Enzymgranulat eine ebenso helle
Farbe wie herkömmlich
beschichtete Enzymgranulate aufweisen, bei mechanischer Belastung
aber zu einer geringeren Staubbildung neigen sollte. Solch ein Enzymgranulat beziehungsweise
solch ein beschichtetes Enzymgranulat sollte insbesondere für die Einarbeitung
in Wasch- und Reinigungsmittel geeignet sein.
Zur
Lösung
dieser Aufgabe wurde ein Verfahren zur Herstellung eines Enzymgranulats
aus einer wäßrigen,
gereinigten Enzymlösung
erfunden, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
- (a) Ionenaustausch-Chromatographie,
- (b) Einstellung einer geeigneten Konzentration und
- (c) Granulation.
Die
Ionenaustausch-Chromatographie in Verfahrensschritt (a) bewirkt
eine schonende Entfärbung
und Desodorierung des Enzymkonzentrats, welches über die Schritte (b) und (c)
zu einem Enzymgranulat weiterverarbeitet wird. Solche Enzymkonzentrate
sind wie in der bislang unveröffentlichte Anmeldung
DE 10304066 dargestellt
ist, stabiler als auf eine andere Weise entfärbte und desodorierte Konzentrate.
Dadurch wird der vorliegenden Erfindung zufolge auch für das Granulat
eine höhere
Stabilität
erzielt. Gleichzeitig besitzen die Enzymkonzentrate über die
Entfärbung
eine hellere Farbe und schwächeren
Geruch als konventionell zubereitete Enzymkonzentrate. Dies kommt
den hiervon abgeleiteten Granulaten insofern zugute, als diese ebenfalls eine
ansprechendere, das heißt
helle Farbe und einen vermindeterten Geruch aufweisen.
Im
Falle einer anschließenden
Beschichtung dieser Granulate braucht ihnen aufgrund der helleren Eigenfarbe
weniger Pigment zugesetzt zu werden, so daß diese beschichteten Granulate
wiederum über weitere
vorteilhafte Eigenschaften verfügen.
Hierzu gehört
insbesondere eine verringerte Staubbildung bei mechanischer Belastung.
Deshalb eignen sich besonders solche Granulate zur Weiterverarbeitung, insbesondere
zur Einarbeitung in entsprechende Rezepturen wie etwa in Wasch-
oder Reinigungsmittel.
Gegenstände der
vorliegenden Erfindung sind somit Verfahren zur Herstellung von
Enzymgranulaten, die durch die genannten Schritte, insbesondere
die Ionenaustausch-Chromatographie
gekennzeichnet sind. Optional schließt sich als Schritt (d) eine
Beschichtung dieser Granulate an. Weitere Erfindungsgegenstände sind
die verfahrensgemäß erhaltenen
Granulate sowie Mittel, welche derartige Granulate enthalten, hierunter
insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel.
Diese
und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden im folgenden
detailliert ausgeführt.
Verfahren
zu der dem Verfahrensschritt (a) vorangehenden Herstellung einer
wäßrigen,
gereinigten Enzymlösung
sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt und werden allgemein
als Downstream-Processing bezeichnet, welches im Anschluß an die
Fermentierung erfolgt und der Konfektionierung vorangeht. Es dient
der Gewinnung von weitgehend biomassefreien, vorzugsweise angereicherten,
wäßrigen Enzymlösungen.
In der Regel umfaßt
es mehrere Teilschritte, wie Zellaufschluß, Entfernung der Zelltrümmer, insbesondere
durch Pelletieren, Dekantieren und Zentrifugationsschritte. Auch Separation,
Mikro-, Ultra- oder Steril-Filtrationen, Desodorierung und die Einkonzentrierung,
das heißt Entfernung
des Lösungsmittels
bis zu einem mittleren Konzentrationsbereich des Enzyms können bereits
an dieser Stelle zum Einsatz kommen oder als optionale Schritte
eingefügt
werden.
Der
optimale Arbeitsbereich muß dabei
für jedes
Enzym individuell ermittelt werden, und zwar nicht nur hinsichtlich
der Temperatur, dem pH-Wert und der Ionenstärke sondern insbesondere hinsichtlich
des vor Schritt (a) einzustellenden Enzym-Konzentrationsbereichs. Die Anreicherung
soll insbesondere durch rechtzeitigen Abbruch der Konzentrierung so
gesteuert werden, daß das
erhaltene Enzymkonzentrat gerade noch keine (quantitative) Proteinausfällung aufweist.
Gemäß der Anmeldung
DE 10304066 liegt der optimale
Konzentrationsbereich für
die darin untersuchte Protease aus Bacillus lentus bei 700.000 bis
800.000 HPE/g. Oberhalb dieses Bereichs steigt der Anteil an ausgefällten Feststoffen
in Abhängigkeit
von der Aktivität
bald überproportional an,
was durch Denaturierung und Ausfällung
mit einem drastisch steigenden Verlust an Gutprodukt einhergeht.
Für eine
vorangehende Einkonzentrierung können
beispielsweise ein handelsüblicher
Rotavapor oder ein handelsüblicher
Dünnschichtverdampfer eingesetzt
werden.
Vorteilhaft
ist ferner, die Enzymlösung
auf einen Schweb- oder Feststoffanteil von unter 1 Vol.-% einzustellen,
wie dies beispielsweise über
Zentrifugation mit einer eine Tischzentrifuge für 10 min bei 7.000 g überprüft werden
kann. Ansonsten steigen die Verluste in den nachfolgenden Schritten
unvorteilhaft stark an. Die Abtrennung insbesondere der durch die
Aufkonzentrierung entstandenen Ausfällungen (Feststoffe) betrifft
insbesondere Fremdproteine und/oder inaktive Enzyme, besonders in
der Nähe
des Löslichkeitsprodukts.
Dieser Schritt wird auch als Separation bezeichnet. Sie erfolgt
ebenfalls nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise über einen
Separator; auch Filtrationsschritte sind hierfür prinzipiell möglich. Auch
eine Ultrafiltration ist möglich;
das wird beispielsweise in WO 01/37628 A2 beschrieben. Man erhält dadurch
vergleichsweise reine, bereits auf einen mittleren Konzentrationswert angereicherte
Enzymlösungen
mit einem niedrigen Feststoffgehalt.
Die
Enzymlösung
sollte zudem auf einen pH-Wert eingestellt werden, der für das Enzym
verträglich
ist und bei dem es eine positive Ladung aufweist.
Schritt
(a) stellt mit der Entfärbung
der zuvor gereinigten Enzymlösung über einen
Anionenaustauscher (Adsorber) den Kern der Erfindung dar. Bei diesem
Schritt adsorbieren vor allem die farbigen Begleitstoffe, hierunter
insbesondere die Maillard-Verbindungen,
und die Geruchsstoffe an das Harz, während durch die stark positive
Ladung des Austauschers die unter entsprechend zu wählenden
Bedingungen ebenfalls positiv geladenen Proteine nicht auf dem Harz
gebunden, sondern mit dem Eluat in einer weitgehend klaren Lösung erhalten
werden. Schritt (a) stellt somit eine selektive Abtrennung der Farbstoffe
aus der konzentrierten Enzymlösung
dar, während
das interessierende Enzym und zumindest ein Teil der enzymstabilisierenden
Faktoren in Lösung
bleiben; bei letzteren handelt es sich chemisch gesehen zumeist
ebenfalls um Proteine.
Dabei
handelt es sich somit nicht um eine Chromatographie des Produkts,
weil nicht dieses Produkt sondern die abzutrennenden Begleitstoffe an
dem Chromatographiematerial adsorbieren. Man könnte deshalb auch von einer
Art Filtration sprechen. Da in der Tat aber ein echtes Chromatographiematerial
eingesetzt werden soll und dieses auch als Chromatographiematerial
wirkt, nämlich
indem es zunächst
Stoffe bindet und diese anschließend unter Regeneration des
Materials wieder eluiert werden, ist der Vorgang am treffendsten
mit dem Begriff Chromatographie zu beschreiben. Insbesondere 1 macht deutlich, daß der Durchfluß (das Eluat)
der Chromatographie in die nachfolgende Einkonzentrierung eingebracht
wird und damit das interessierende Gutprodukt darstellt, während mit
der Regeneration die unerwünschten
Begleitstoffe, insbesondere Farb- und Geruchsstoffe über das
Regenerat ausgewaschen werden.
Der
Vorteil dieses Verfahrens gegenüber
den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren besteht darin,
daß die
interessierenden Wertstoffe, das heißt die Enzymproteine in Lösung bleiben
und deshalb nicht denaturiert und renaturiert werden müssen, sondern
in ihrer räumlichen
Struktur unverändert
bleiben können.
Sie verbleiben damit auch in der weiter zu prozessierenden Phase
und werden nicht aus dem System ausgetragen. Dadurch konnten die oben
erwähnten
hohen Ausbeuten erreicht werden.
Die
an das Harz gebundenen Begleitstoffe werden, wie dies in 1 durch entsprechende dicke Pfeile
angedeutet ist, anschließend,
das heißt
nach Austritt der Wertstoff enthaltenden Phase (des Gutprodukts)
und gegebenenfalls einem Nachlauf in einem separaten Schritt eluiert.
Dies geschieht beispielsweise mit Lösungen mit hoher Ionenstärke, etwa
konzentrierte NaCl-Lösungen. Über entsprechende
Gegenionen, beispielsweise NaOH, ist das Anionenaustauscher-Material
regenerierbar. Je nach Chromatographie-Material können andere
einfache Salze besser geeignet sein. Daß dieses Material mit derartigen – zudem
kostengünstigen – Verbindungen behandelt
werden kann, führt
neben dem Reinigungseffekt zu einer Sterilisation. Das System ist
somit „CIP"-fähig (für „cleaning
in place").
Das
Flüssigenzym
ist im Anschluß an
den Verfahrenschritt (a) weitgehend frei von störenden Schlieren, Ausfällungen
und Farbstoffen. Es bleibt auch bei längerer Lagerung bei verschiedenen
Temperatur hell, klar und blank und weist gleichzeitig ein hohes
Maß an
Stabilität
auf. Diese veredelte konzentrierte Enzymlösung ist insbesondere hinsichtlich
der farbigen Verunreinigungen deutlich abgreichert, enthält jedoch
noch praktisch farblose Begleitstoffe, die aufgrund ihrer zum Teil
stabilisierenden Wirkung hochwillkommen sind und aus der konzentrierten
Enzymlösung
nicht abgetrennt zu werden brauchen/sollen.
Zusätzliche
Zwischenschritte können
je nach Trennproblem vorausgeschickt, eingefügt, angeschlossen oder zusammen
mit den genannten Schritten durchgeführt werden. So besteht eine
Möglichkeit beispielsweise
darin, durch einen oder mehrere zusätzliche Chromatographieschritte,
insbesondere über
andere Trägermaterialien
weitere Begleitstoffe aus der konzentrierten Enzymlösung gezielt
abzutrennen. Dies kann zu jedem im Einzelfall sinnvoll erscheinenden
Verfahrenszeitpunkt, vorteilhafterweise unmittelbar vor oder nach
dem unter (a) beschriebenen Chromatographieschritt erfolgen, gegebenenfalls
voneinander durch Zwischenschritte wie Filtrationen oder Umsolubilisierungen
getrennt.
Möglichkeiten
zur Einstellung einer geeigneten Konzentration gemäß Schritt
(b) sind dem Fachmann an sich bekannt. Hierfür gilt insbesondere das oben
für die
Ausgangs-Enzymlösung Gesagte.
Auch
Verfahren zur Überführung von
Enzymlösungen
in feste Granulate gemäß Schritt
(c) sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Sie beginnen
in der Regel mit der Mischung des Enzyms mit bestimmten Zuschlagsstoffen
und liefern Partikel. Hierzu gehören
beispielsweise die Methoden der Wirbelschichtgranulierung, der Mischgranulierung
in Vertikalmischern, Gegenstrompelletiermischern, Flexomix-Agglomeratoren, Pflugscharmischern
oder Rubergmischern, der Rollgranulierung, etwa in Granuliertrommeln
oder Granuliertellern, oder der Preßgranulierung, durchführbar beispielsweise
mit Pressen, Extrudern oder Wälzdruckmaschinen.
Diese Techniken sind in Lehrbüchern
wie beispielsweise dem „Handbuch
der Agglomerationstechnik" von
G. Heinze (1999, Verlag Wiley-VCH, Weinheim, Deutschland, ISBN 3-527-29788-X,
S. 65–170)
beschrieben.
Ein
bevorzugtes Verfahren geht beispielsweise aus der europäischen Patentschrift
EP 168526 B1 hervor,
wonach die Enzymgranulate in Wasser quellfähige Stärke, Zeolith und wasserlösliches
Granulierhilfsmittel enthalten. Das hierin vorgeschlagene Herstellungsverfahren
besteht im wesentlichen darin, die von unlöslichen Bestandteilen befreite
Fermenterlösung
aufzukonzentrieren, mit den genannten Zuschlagstoffen zu versetzten,
das entstandene Gemisch zu granulieren und gegebenenfalls das Granulat
mit filmbildenden Polymeren und Farbstoffen zu umhüllen. Gemäß WO 92/11347
A2 enthalten nach einem alternativen Verfahren hergestellte Enzymgranulate
mit günstigen
Eigenschaften für
den Einsatz in körnigen
Wasch- und Reinigungsmitteln Enzym, quellfähige Stärke, wasserlösliches
organisches Polymer als Granulierhilfsmittel, Getreidemehl und etwas
Wasser. Durch diese Zusammensetzung der Zuschlagsstoffe wird die
Enzymverarbeitung ohne größere Aktivitätsverluste
möglich.
Ein
günstiges
und somit ebenfalls bevorzugtes Extrusionsverfahren, welches ein
gutlösliches Enzymgranulat
liefert, wird beispielsweise in der Anmeldung WO 97/40128 A1 beschrieben,
wonach die Granulate neben Enzymen und Träger wie Polyethylenglykol und/oder
Polyethoxylat eine phophatidierte Stärke als Granulierhilfsmittel
enthalten können.
Weitere
günstige
Ausführungsformen
dieses Erfindungsgegenstands gehen aus den nachfolgenden Ausführungen
hervor.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich um Verfahren, die durch einen zusätzlichen
Schritt (d) Beschichtung (Coating) gekennzeichnet sind.
Grundsätzlich ist
eine Beschichtung auch eines weitgehend farblosen und geruchsneutralen
Enzymgranulats sinnvoll, um den Inhaltsstoff gegen widrige Einflüsse von
außen
zu schützen.
Hierzu zählen
insbesondere Feuchtigkeit, die das Partikel quellen und zerfallen
lassen und das im Partikel enthaltene Enzym aktivieren kann, sowie
der Einfluß von Luftsauerstoff,
der zur oxidativen Inaktivierung führen kann.
Es
sind prinzipiell alle Arten von Beschichtungen möglich, die im Stand der Technik
für Enzympartikel
beschrieben und dem Fachmann an sich bekannt sind. Günstigerweise
werden die nach (c) erhaltenen Granulate zunächst spheronisiert, beispielsweise
in einem Marumerizer, anschließend
der Wassergehalt verringert, etwa über einen Fließbettreaktor
und erst dann die Schutzschicht aufgetragen. Letzteres kann beispielsweise
in konventionellen Mischern, etwa von der Firma Lödige (Deutschland)
oder in der Wirbelschicht erfolgen.
Hierzu
gehören
beispielsweise Verfahren, nach denen eine Schutzschicht über ein
sogenanntes Schmelzcoating aufgebracht wird. Dabei wird ein Polymer,
beispielsweise ein polymerer Alkohol zusammen mit einem Emulgator
für dieses
Polymer aufgebracht, vorteilhafterweise zusammen mit einem Pigment,
welches den resultierenden beschichteten Partikeln seine Farbe verleiht.
Solch ein Verfahren wird beispielsweise in WO 95/02031 A1 insbesondere
für den
Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln beschrieben. Als Pigment
wird vorzugsweise das weiße
Titandioxid eingesetzt.
Ein
alternatives, bevorzugtes Verfahren, nach welchem kein Lösungsmittel
zugesetzt und nach dem Beschichten wieder entfernt werden muß, folgt
beispielsweise der Anmeldung WO 98/26037 A2. Hiernach wird feines,
anorganisches, wasserunlösliches
Pigments gegebenenfalls zusammen mit einem schüttfähigkeitsverbessernden Agens
und einer organischen Substanz mit einem Schmelzpunkt von 40–70°C aufgebracht.
Diese Beschichtung eignet sich ebenfalls besonders für Partikel,
die anschließend
in Wasch- und Reinigungsmittel
eingearbeitet werden.
Bevorzugte
Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a) eine Anionenaustausch-Chromatographie
durchgeführt
wird, vorzugsweise mit einem Material, das im pH-Bereich von 5 bis
11 und besonders bevorzugt von 6 bis 8 maximale Austauschkapazität aufweist.
Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen
diesen Zahlen liegenden Werte.
Es
handelt sich somit um eine eher basische bis starkbasische Anionenaustausch-Chromatographie,
die mit Schritt (a) den Kern des erfindungsgemäßen Verfahrens bildet. Unter
diesen Bedingungen adsorbieren die vor allem farbigen Begleitstoffe
an das Material, die gleichzeitig positiv geladenen Proteine jedoch
gerade nicht. Aufgrund der Tatsache, daß die meisten natürlichen
wasserlöslichen,
insbesondere sekretierten Proteine eher bei mittleren pH-Werten
wasserlöslich
sind, ist es besonders vorteilhaft, keinen extremen sondern nur
einen schwach basischen bis neutralen pH-Bereich auszuwählen.
Insbesondere
alkalische Proteine, wie beispielsweise die von alkaliphilen Mikroorganismen
sekretierten Enzyme, insbesondere Proteasen, weisen einen im alkalischen
Bereich liegenden isoelektrischen Punkt auf, sind deshalb in dem
bevorzugten pH-Bereich, in welchem der Ionenaustauscher optimal
arbeitet, positiv geladen und binden deshalb nicht an das betreffende
Material. Für
jedes Protein muß ein
für dieses
Verfahren idealer pH-Wert experimentell ermittelt und in Hinblick
auf diesen Schritt (a) eingestellt werden. In Beispiel 1 lag dieser
Wert für die
gewählte
alkalische Protease bei 7,5. Im Einzelfall wird also ein Anionenaustauscher
gewählt,
dessen maximale Austauschkapazität
mit dem IEP des interessierenden Enzyms übereinstimmt.
Bevorzugte
Anionenaustausch-Chromatographie-Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß der Anionenaustauscher
für Schritt
(a) als funktionelle Gruppen quartäre Ammoniumgruppen aufweist,
vorzugsweise substituiert mit mindestens zwei Alkylgruppen, besonders
bevorzugt mit mindestens zwei Alkylgruppen mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen, optional
zusätzlich
mit einer 1 oder 2 Kohlenstoffatomen aufweisenden Hydroxyalkylgruppe.
Denn
solche haben sich aufgrund ihrer chemischen Eigenchaften als besonders
geeignet für Schritt
(a) herausgestellt. Entscheidend, und im Einzelfall zu optimieren
ist das Bindevermögen
für die insbesondere
farbigen Begleitstoffe und das Nichtbinden der interessierenden
Enzyme.
Weiterhin
sind solche Anionenaustausch-Chromatographie-Verfahren bevorzugt,
die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Anionenaustauscher für Schritt
(a) als funktionelle Gruppen Trimethyl-ammonium- oder Dimethylethanol-ammonium-Gruppen
aufweist. Letzterer ist etwas schwächer basisch als der zuerst
genannte, so daß insbesondere über diese
Variation auf entsprechende Proteine optimiert werden kann.
Weiterhin
bevorzugte Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß die Anionenaustausch-Chromatographie
in einem pH-Bereich von 5 bis 9 vorzugsweise von 6 bis 8,5, besonders
bevorzugt von 7 bis 8 durchgeführt
wird. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen
jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte. Das richtet sich
entsprechend dem oben Gesagten nach dem isoelektrischen Punkt des
(vorzugsweise alkalischen; siehe unten) Enzyms und dem hierzu passend
ausgewählten
optimalen Arbeitsbereich des Ionenaustauschers.
Bevorzugte
Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenaustauscher für Schritt
(a) eine Austauschkapazität
von 0,7 bis 1,2 meq/ml vorzugsweise von 0,8 bis 1,1 meq/ml, und
besonders bevorzugt von 0,9 bis 1,0 meq/ml aufweist. Eingeschlossen
werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen
diesen Zahlen liegenden Werte.
Dieser
in Mol Äquivalent
pro Volumeneinheit angegebene Wert für die Austauschkapazität besagt, wie
dicht das Material mit den funktionellen Gruppen besetzt ist. Die
angegebenen Bereiche haben sich empirisch, insbesondere bei Beispiel
1 der vorliegenden Anmeldung als vorteilhaft herausgestellt und hängen davon
ab, wie hoch die Konzentration der quantitativ nur schwer bestimmbaren
Begleitstoffe in der Enzymlösung
ist. Geeignete Arbeitsbereiche müssen
im Einzelfall experimentell ermittelt werden und hängen insbesondere
davon ab, wieviele dieser Begleitstoffe durch die vorangegangenen
Schritte zusammen mit den höhermolekularen
Verbindungen bereits abgetrennt worden sind.
Bevorzugte
Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenaustauscher für Schritt
(a) effektive Porengrößen von
0,2 bis 0,7 mm, vorzugsweise von 0,3 bis 0,6 mm, besonders bevorzugt
von 0,4 bis 0,5 mm aufweist. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen
und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Auch
hierbei handelt es sich um einen empirisch ermittelten Bereich,
der insbesondere von der Größe des aufzureinigenden
Enzyms und der Reinheit der Enzymlösung abhängt.
Je
mehr höhermolekulare
Verbindungen noch enthalten sind, desto leichter verblockt die Säule und
desto eher sollte auf ein großporigeres
Material ausgewichen werden. Hingegen verstärkt sich die Trennschärfe bei
zunehmend kleineren Poren. Somit müssen auch hier geeignete Arbeitsbereiche
im Einzelfall experimentell ermittelt werden. Für die im Beispiel untersuchte
Protease mit einem Molekulargewicht von ca. 27 kD hat sich ein Chromatographiematerial
als brauchbar herausgestellt, dessen effektive Porengröße bei 0,45
mm liegt. Für
deutlich größere oder
kleinere Proteine sollten Chromatographie-Materialien mit entsprechend größeren oder
kleineren effektiven Porengrößen gewählt werden.
Bevorzugte
Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß das Material des Ionenaustauschers für Schritt
(a) eine Partikelgrößenverteilung
von 150 bis 3.000 μm,
vorzugsweise von 175 bis 1.500 μm, besonders
bevorzugt von 200 bis 800 μm
aufweist. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen
jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Auch
hierbei handelt es sich um einen gemäß Beispiel 1 empirisch ermittelten
Bereich, der im Einzelfall experimentell überprüft und gegebenenfalls angepaßt werden
muß.
Bevorzugte
Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenaustauscher für Schritt
(a) auf einem porösen
Kunststoffpolymer beruht, vorzugsweise einem Styrol-DVB-Copolymer.
Prinzipiell
sind als Träger
für erfindungsgemäß einzusetzende
starkbasische Anionenaustauscher alle im Stand der Technik hierfür beschriebenen
Materialien einsetzbar, beispielsweise auch gelförmige Träger. Demgegenüber sind
aufgrund ihrer technischen Eigenschaften solche starkbasischen Anionenaustauscher
für Schritt
(a) bevorzugt, die auf einem porösen
Kunststoffpolymer beruhen. Als besonders vorteilhaft haben sich
solche auf der Basis eines Styrol-DVB-Copolymers herausgestellt.
Denn solche Materialien sind inert, einem Angriff von begleitenden
Stoffen, etwa hydrolytischen Enzymen praktisch nicht zugänglich und
robust gegenüber
den nachfolgenden Regenerationsschritten, die beispielsweise mit
NaOH durchgeführt
werden können.
Chromatographiematerialien,
die die soeben diskutierten Eigenschaften aufweisen, sind im Stand der
Technik ausführlich
beschrieben. Solche aus den DIAION®-Serien
werden beipielsweise in dem Handbuch „DIAION®. Manual
of ion exchange resins and synthetic adsorbent, Band I" von der Firma Mitsubishi Kasei
Corp. (Tokyo, Japan), Juni 1995, auf den Seiten 104 bis 108 und
in der „Product
Line Brochure DIAION®", Stand 1.6.2001, auf den Seiten 4 bis
6 beschrieben, welche von dem Hersteller, beziehungsweise Summit
Chemicals Europe GmbH, Düsseldorf, Deutschland
erhältlich
ist. Als stark basische Anionenaustauscher werden dort die Serien
DIAION®SA, DIAION®PA
und DIAION®HPA
beschrieben. Ein Vertreter davon, nämlich DIAION®PA308L
wurde in Beispiel 1 zur vorliegenden Anmeldung erfolgreich eingesetzt.
Chemisch ähnliche,
brauchbare Materialien sind entsprechend den oben gemachten Angaben
zu bevorzugten Eigenschaften von entsprechenden Fachleuten herstellbar
oder auch von anderen kommerziellen Herstellern erhältlich und
charakterisieren ebenso bevorzugte Ausführungsformen. Vergleichbare
Ergebnisse werden beispielsweise mit den Materialien DOW MSA Marathon® von
der Firma Dow Chemicals und Amberlite®9000L
von der Firma Rohm & Haas
erzielt.
Neben
dem Material entscheiden auch die Durchführungsedingungen über den
Erfolg der erfindungsgemäßen Chromatographie.
Hierzu gehören insbesondere
ein gewisses Bettvolumen, wobei es sich um das Volumenverhältnis der
aufgetragenen Lösung
zu dem der Säule
handelt, und eine gewisse Verweilzeit, die über die Menge Enzym pro g des
Materials und Zeiteinheit angegeben wird.
So
sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß die
Chromatographie in Schritt (a) mit einem Bettvolumenverhältnis von
0,1 bis 100, vorzugsweise 0,5 bis 40, besonders bevorzugt 1 bis
4 durchgeführt
wird. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen
jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Hierbei
handelt es sich um das gemäß Beispiel
1 experimentell ermittelte Optimum, um das Filtrat möglichst
rein und gleichzeitig möglichst
konzentriert zu halten. Es muß abhängig von
den Eigenschaften des Materials und des zu reinigenden Enzyms im
Einzelfall individuell bestimmt werden.
Weiterhin
sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß die
Chromatographie in Schritt (a) bei einer durchschnittlichen Verweilzeit
von 0,01 bis 2 g, vorzugsweise 0,025 bis 0,1 g, besonders bevorzugt
0,04 bis 0,06 g und ganz besonders bevorzugt von 0,05 g Enzym pro
g Ionenaustauschermaterial und Minute erfolgt. Eingeschlossen werden
alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen
Zahlen liegenden Werte.
Dieser
thermodynasche Wert beschreibt den Trennprozeß und hat sich im Beispiel
1 als optimal herausgestellt. Er muß abhängig von den Eigenschaften
des Materials und des zu reinigenden Enzyms im Einzelfall individuell
bestimmt werden.
Besonders
geeignete Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß sie weitgehend
automatisch gesteuert sind.
Weiterhin
sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß die
Chromatographie in Schritt (a) über
die Leitfähigkeit
des Eluats gesteuert wird, hierbei insbesondere die Trennung zwischen
Vorlauf und Gutprodukt und/oder Gutprodukt und Nachlauf.
Denn
eine besonders leicht zu realisierende Steuerungsmöglichkeit
beruht darauf, daß die
Leitfähigkeit
(meßbar
als μS/cm)
eines prozessierten Guts an kritischen Stellen ermittelt und zur
Steuerung eingesetzt wird. So können
der Übergang
vom Vorlauf zum Gutprodukt und dessen Ende über entsprechende Leitfähigkeitsänderungen
detektiert werden. Eine entsprechende Steuerungseinheit leitet die
jeweiligen Flüssigkeitsströme dann
entsprechend weiter.
Weiterhin
sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß die
Chromatographie in Schritt (a) unter Rückführung wenigstens eines Teils
des Vor- und/oder
des Nachlaufs der Ionenaustausch-Chromatographie in die Enzymlösung vor
der Chromatographie erfolgt.
So
ist zur Ausbeutesteigerung bereits in der Anmeldung WO 01/37628
A2 vorgeschlagen worden, Filtrat für einen zusätzlichen Waschschritt einzusetzen.
Hierdurch wird eine zusätzliche
Anreicherung der betreffenden Fraktion mit solchen Enzymmolekülen erreicht,
die gegen Ende des Peaks noch nicht aus der Säule ausgewaschen worden sind.
Limitiert wird dieser Schritt prinzipiell durch die Verunreinigungen,
die von der Säule
möglicherweise
mitausgewaschen werden. Im Einzelfall ist zwischen erzielbarer Konzentration
und Produktqualität,
das heißt
Reinheit abzuwägen.
Bevorzugte
Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß die Einstellung einer geeigneten
Konzentration in Schritt (b) durch Einkonzentrierung der Enzymlösung erfolgt.
Denn
möglicherweise
ist die Enzymlösung nach
Schritt (a) sehr hoch konzentriert, so daß zur Einstellung einer geeigneten
Konzentration in Schritt (b) zusätzliches
Lösungsmittel
zugesetzt werden muß.
In der Regel wird die Lösung
jedoch eher zu stark verdünnt
sein, weil die Trennleistung der Chromatographie und die insgesamt
zu erzielende Ausbeute des Gutprodukts von einer optimalen Verdünnung abhängen. Somit
ist eine Einkonzentrierung der Enzymlösung bevorzugt. Hierbei handelt
es sich erfindungsgemäß jedoch
weniger um Ausfällen
und Wiederaufnahme in einem kleineren Volumen, weil dadurch wie
oben erläutert
auch die erwünschten
Begleitstoffe verlorengehen würden.
Vielmehr sind Verfahren bevorzugt, bei denen lediglich das Volumen des
nach der Chromatographie vorhandenen Lösungsmittels verringert wird.
Solche Verfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt
und wurden weiter oben als Vorbereitung für Schritt (a) bereits vorgestellt.
Auch an dieser Stellen können
beispielsweise ein handelsüblicher
Rotavapor oder ein handelsüblicher
Dünnschichtverdampfer
eingesetzt werden. Sie sind über
die jeweiligen Geräteparameter
und über
die jeweilige Reaktionsdauer steuerbar.
Hierunter
sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß die
Konzentrierung in Schritt (b) mit einem Einkonzentrierungsverhältnis von
1,01 bis 10, vorzugsweise von 1,1 bis 8, besonders bevorzugt von
1,2 bis 4 erfolgt, jeweils bezogen auf die zugehörigen Volumina. Eingeschlossen
werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen
diesen Zahlen liegenden Werte.
Dieses
die Konzentrierung beschreibende Maß errechnet sich aus dem Verhältnis des
Ausgangsvolumens der chromatographierten Lösung zu dem der einkonzentrierten
Lösung.
Dieser Schritt stellt gewissermaßen eine Vorbereitung der nachfolgenden
Granulation dar, in welcher weiter Wasser entzogen wird. Somit richten
sich das anzustrebende Endvolumen sowie alle nachfolgend aufgeführten Parameter
nicht nur nach der Konzentration der Enzymlösung nach der Chromatographie
sondern auch nach den Anforderungen des anschließenden Granulationsschritts
(c). Sie müssen
gegebenenfalls nach den Erfahrungen mit den betreffenden für die Granulation
eingesetzten Geräte
optimiert werden. Dies ist dem Fachmann geläufig.
Weiterhin
sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß der
Trockensubstanzgehalt beim Start der Einkonzentrierung in Schritt
(b) bei 0,1 bis 40 Gew.-%, vorzugsweise bei 0,5 bis 20 Gew.-%, besonders
bevorzugt bei 1 bis 15 Gew.-%
liegt. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen
jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Dieser
ebenfalls empirisch zu optimierende Wert hängt in erster Linie von der
Durchführung
der Chromatographie ab. Entscheidend ist, daß diese mit einer optimalen
Trennung erfolgt. Hieran ist der nachfolgende Schritt anzupassen.
Sollte der Trockensubstanzgehalt nahe der unteren Grenze oder deutlich darunter
liegen, kann man die Einkonzentrierung in zwei nacheinanderfolgenden
Schritten und ggff. über zwei
verschiedene Verfahren oder unterschiedlich arbeitende Geräte durchführen.
Weiterhin
sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß die
Einkonzentrierung thermisch erfolgt.
Weiterhin
sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß die
thermische Einkonzentrierung der Enzymlösung in Schritt (b) bei 5 bis
70°C, bevorzugt
bei 10 bis 60°C,
besonders bevorzugt bei 20 bis 40°C,
ganz besonders bevorzugt bei 35°C
erfolgt, jeweils bezogen auf den zugehörigen Dampfdruck. Eingeschlossen
werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen
diesen Zahlen liegenden Werte.
Dieser über die
jeweiligen Geräteeinstellungen
einfach einzustellende Wert richtet sich insbesondere nach den Eigenschaften
des konfektionierten Enzyms. Hohe Temperaturen beschleunigen den Prozeß, wirken
sich in der Regel aber schädlich
auf das Enzym aus. Ein optimaler Wert ist empirisch zu ermitteln.
Im Beispiel der vorliegenden Anmeldung haben sich ca. 35°C bei ca.
50 mbar als vorteilhaft für die
Konfektionierung eines Subtilisins herausgestellt.
Unter
den erfindungsgemäßen Verfahren sind
solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Trockensubstanzgehalt
am Ende der Einstellung der geeigneten Konzentration in Schritt (b)
bei 8 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise bei 9 bis 40 Gew.-%, besonders
bevorzugt bei 10 bis 35 Gew.-% liegt. Eingeschlossen werden alle
ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden
Werte.
Dieser
Wert bestimmt die biophysikalischen Eigenschaften des Enzymbreis,
beispielsweise die Viskosität
oder für
die Mischbarkeit mit den nachfolgend zugesetzten Verbindungen und
die hieraus gegebenenfalls resultierende Verdünnung und ist somit für den Erfolg
des nachfolgenden Granulationsschritt entscheidend. Die Wahl des
jeweiligen Granulationssystems bestimmt somit den optimalen Trockensubstanzgehalt
und ist im Einzelfall experimentell zu ermitteln. Variationsmöglichkeiten
ergeben sich auch durch die Wahl des Verfahrens, etwa Dünnschichtverdampfen
oder Ultrafiltration. Bei letzterer kann eine jeweils charakteristische
Obergrenze nicht überschritten
werden.
Unter
den erfindungsgemäßen Verfahren sind
solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das Konzentrat
in Schritt (b) auf eine Viskosität
von 1 bis 1.000 mPas eingestellt wird, vorzugsweise auf 1 bis 500
mPas, besonders bevorzugt auf 1 bis 200 mPas. Eingeschlossen werden
alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen
Zahlen liegenden Werte.
Entsprechend
dem oben Gesagten hängt dieser
Wert insbesondere von den Anforderungen der nachfolgenden Granulation
ab.
Unter
den erfindungsgemäßen Verfahren sind
solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich
um eine Protease handelt, deren Aktivität in Schritt (b) auf 200.000
bis 2.000.000 HPE pro g Konzentrat eingestellt wird, vorzugsweise
auf 500.000 bis 1.500.000 HPE pro g Konzentrat, besonders bevorzugt
auf 800.000 bis 1.200.000 HPE pro g Konzentrat. Eingeschlossen werden
alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen
liegenden Werte.
Bislang
wurde von Enzymen gesprochen, die erfindungsgemäß konfektioniert werden. Enzyme stellen
bevorzugte Ausführungsformen
dar, weil sie einerseits von besonderem technischem Interesse sind.
Nichtsdestoweniger ist dieses Verfahren auf alle wasserlöslichen
Proteine anwendbar, sofern sich zu diesen entsprechende Lösungsmittelsysteme
und Chromatographiematerialien finden und entsprechende Nachweisreaktionen
etablieren lassen. Beispielsweise gilt dies für Peptide, etwa Peptidhormone,
Oligopeptide mit pharmakologischer Bedeutung oder für Antikörper.
Antikörper kämen beispielsweise
auch für die
Detektion in Frage. All diese Proteine sollen im Sinne der vorliegenden
Erfindung als Enzyme verstanden werden.
Im
Mittelpunkt des Interesses stehen technisch einsetzbare Enzyme im
herkömmlichen
Sinne. Dabei handelt es sich vorzugsweise um eine Hydrolase oder
eine Oxidoreduktase, besonders bevorzugt um eine Protease, Amylase,
Cellulase, Hemicellulase, Lipase, Cutinase oder um eine Peroxidase.
Sie sind abhängig
von der Bedeutung ihrer jeweiligen Einsatzgebiete entsprechend bevorzugt,
sofern sie dem Anwendungszweck günstigerweise
in Form fester Granulate zugesetzt werden können. Hierzu gehören beispielsweise
Proteasen und Amylasen, wie sie etwa für die flüssige Anwendung in der Anmeldung
DE 10304066 beschrieben
sind. Hierunter sind Proteasen bevorzugt, weil es sich bei diesen
um die wichtigsten Enzyme für
Wasch- und Reinigungsmittel handelt. Außerdem ist in dem Beispiel
zur vorliegenden Anmeldung die erfolgreiche Herstellung eines Proteasegranulats
beschrieben.
Die
Konzentrationseinstellung hängt
davon ab, welche Aktivität
die durch Schritt (c) beziehungsweise (d) erhaltenen Granulate aufweisen
sollen. Für die
Anwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln hat sich eine Endaktivität von ca.
1.000.000 HPE/g als vorteilhaft erwiesen; auf diesen Gehalt wurde
auch gemäß Beispiel
1 einkonzentriert.
Insbesondere
im Zuge der Konzentrationseinstellung können der Enzympräparation
weitere Inhaltsstoffe zugesetzt werden. Da auch feste Enzympräparationen
während
der Lagerung dazu neigen, zu denaturieren und dadurch ihre Aktivität zu verlieren,
ist es vorteilhaft, insbesondere an dieser Stelle einen Stabilisator
oder ein Stabilisatorgemisch zuzusetzen. Solche Verbindungen sind
an sich aus dem Stand der Technik bekannt. Es handelt sich beispielsweise
um solche, die über
Regulation der Wasseraktivität
biophysikalisch, beispielsweise gegenüber Temperaturschwankungen
stabilisierend wirken, wie Polyole und hierunter bevorzugt Glycerin
oder besonders bevorzugt 1,2-Propandiol,
um solche, die Proteasen reversibel inaktivieren, insbesondere Bor- oder
Borsäure-haltige
Proteaseinhibitoren, oder solche, die Schutz gegen Oxidation darstellen.
Zu den zuletztgenannten Verbindungen zählen beispielsweise reduzierende
Agentien, Antioxidantien und Übergangsmetallverbindungen.
Sie werden vorteilhafterweise in flüssiger Form zugesetzt, um eine
Lösung und/oder
eine optimale Vermischung zu erzielen. Das Wasser kann zu einem
späteren
Zeitpunkt (siehe unten) wieder entzogen werden.
Es
können
vor der Granulation noch weitere Inhaltsstoffe zugesetzt werden,
wenn das beabsichtigte Einsatzgebiet dies angebracht erscheinen
läßt. Hierzu
gehören
beispielsweise für
den Einsatz der Granulate in Wasch- und Reinigungsmitteln Tenside, Builder,
Parfum oder weitere Inhaltsstoffe. So ist es beispielsweise in Anwendung
der WO 98/50511 A1 auch vorteilhaft, Cyclodextrin, dessen Vorläufer oder Derivate
als Farbübertragunsinhibitoren
bereits in das Granulat einzuarbeiten.
Unter
den erfindungsgemäßen Verfahren sind
solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Granulation
in Schritt (c) durch Extrusion erfolgt. Dieses Verfahren mit vorteilhaft
hierfür
einsetzbaren Geräten
ist oben bereits ausgeführt
worden. Besonders vorteilhaft und mit dem Beispiel der vorliegenden
Anmeldung belegt ist der Einsatz eines Zweiwellenextruders. Das
erhaltene, in der Regel noch feuchte Extrudat kann anschließend zum
Trocknen beispielsweise in einen Wirbelschichttrockner überführt werden
(siehe unten). Wird von vornherein in einem solchen Wirbelschichttrockner
granuliert, so erspart man sich diese Überführung. Durch die Extrusion
werden Granulate erhalten, die lagerstabil sind und gleichzeitig
ein günstiges
Lösungsverhalten
zeigen, was insbesondere dem Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln
zugute kommt.
Unter
den erfindungsgemäßen Verfahren sind
solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Granulation
in Schritt (c) so gesteuert wird, daß eine durchschnittliche Partikelgröße von 100
bis 10.000 μm,
vorzugsweise von 200 bis 5.000 μm,
besonders bevorzugt von 400 bis 1.000 μm erzielt wird, bei der Extrusion
insbesondere über
die Größe der Lochplatten
oder die Geschwindigkeit des Messers. Eingeschlossen werden alle
ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen
liegenden Werte.
Die
Größe der erhaltenen
Partikel richtet sich insbesondere nach dem Einsatzgebiet. So müssen beispielsweise
bei dem in Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln insbesondere
die Anforderungen an eine mechanische Stabilität und an eine möglichst
rasche Auflösung
in der Waschflotte bedacht werden. Optimale Größen müssen experimentell werden und können über die
dem Fachmann an sich bekannten Regulationssysteme der Granulation
erhalten werden.
Unter
den erfindungsgemäßen Verfahren sind
solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Granulation
in Schritt (c) unter Vermischung des Enzymkonzentrats aus Schritt
(b) mit einem oder mehreren Inhaltsstoffen, ausgewählt aus der
Gruppe Getreidemehl, Stärke,
Stärkederivate, Cellulose,
Cellulosederivate, Gleitmittel (Weichmacher), Zucker und Enzym-Stabilisatoren
erfolgt.
Die
erfindungsgemäß bevorzugten
Mischungen zur Granulation sind unter Verweis auf entsprechende
Schriften bereits oben ausgeführt
worden. Die Zusammensetzung der Inhaltsstoffe entscheidet über die
physikalischen Eigenschaften der erhaltenen Granulate beziehungsweise
beschichteten Partikel. Dazu gehören
die mechanische Stabilität
und die Auflösungsgeschwindigkeit,
welche entscheidend davon abhängt,
wie rasch Wasser in die Kapillaren der Partikel eindringen und hierdurch
dessen Zerfall auslösen
kann. Dies wird beispielsweise über
quellbare und/oder lösliche
Verbindungen gesteuert. All diese Inhaltsstoffe sind an sich aus
dem Stand der Technik bekannt. Als Gleitmittel (Weichmacher) dienen
insbesondere Polyole wie beispielsweise Polyethylenglykol oder Polyvinylalkohol.
Optional können noch
Lösungsmittel
für diese
Gleitmittel zugesetzt werden, die vorteilhafterweise bei der nachfolgenden Trocknung
entfernt werden. Unter Zuckern sind in erster Linie Mono- oder Oligosaccharide
oder deren Gemische zu verstehen; im Beispiel zur vorliegenden Anmeldung
wird hierfür
Saccharose eingesetzt.
Unter
den erfindungsgemäßen Verfahren sind
solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die durch
Schritt (c) erhaltenen Granulate getrocknet werden.
Dies
kann wie oben erwähnt
unter Überführung in
ein anderes Gerät
oder wenn möglich
im selben Gerät
durchgeführt
werden, in dem auch die Granulation stattgefunden hat. Der Zweck
besteht darin, daß eine
Enzymzubereitung, insbesondere eine von hydrolytischen Enzymen im
allgemeinen umso stabiler ist, je weniger Wasser zugegen ist. Andererseits beschleunigt
enthaltenes Wasser einen später
während
des Einsatzes beabsichtigten Auflösungsprozeß der Partikel.
Zum
optionalen Schritt (d) sind bereits oben einige vorteilhafte Ausführungsformen
beschrieben worden.
Besonders
vorteilhaft und entsprechend bevorzugt sind solche Verfahren mit
Schritt (d), die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Beschichtung in Schritt
(d) mit
0 bis 30 Gew.-% Pigment,
0 bis 30 Gew.-% Weichmacher,
5
bis 97,5 Gew.-% Filmbildner (Fließmittel) und
optional
weiteren Bestandteilen erfolgt.
Der
vorliegenden Erfindung zufolge, und wie auch in Beispiel 1 experimentell
belegt ist, weisen die nach (c) erhaltenen Granulate eine hellere
Farbe und einen geringeren Geruch als herkömmliche Granulate auf. Deshalb
kann auf eine Beschichtung in einzelnen Fällen ganz verzichtet werden;
ansonsten reicht i.d.R. eine dünnere
Beschichtung, insbesondere eine mit weniger Pigment. Das gilt insbesondere
für eine Beschichtung
mit einem weißen
Pigment. Hierdurch werden die Eigenschaften der Partikel wie die
Elastizität,
insbesondere die Oberflächeneigenschaften wie
die Staubrate mehr durch die übrigen
Beschichtungskomponenten bestimmt. Vorteilhafterweise bilden Granulate
mit weniger Pigment weniger Abrieb und stellen somit eine geringere
Staubbelastung dar. Hinzu kommt ein finanzieller Effekt, weil weniger Rohstoff
benötigt
wird.
Besonders
vorteilhaft hat sich dem Beispiel der vorliegenden Anmeldung zufolge
eine Beschichtung aus Polyethylenglykol 20.000 und 6 bis 20 Gew.-%
Titandioxid herausgestellt. Hierfür können handelsübliche zu
diesem Zweck bekannte Geräte eingesetzt
werden, im betreffenden Beispiel ist das ein Topspray-Wirbelschicht-Coater.
Als
optionale Inhaltsstoffe können
auch an dieser Stelle die bereits oben ausgeführten Stabilisatoren zugesetzt
werden. Ferner ist es vorteilhaft und somit entsprechend bevorzugt,
wenn weitere Stoffe zugesetzt werden, die dem späteren Einsatzzweck der Granulate
zugute kommen. Hierzu gehören
wie oben erwähnt
für den
Einsatz in Wasch- und
Reinigungsmitteln beispielsweise Tenside oder Builder. Ein weiteres
Beispiel hierfür
ist etwa gemäß WO 95/17493
A1 die Zugabe von Silber-Korrosionsinhibitoren, Bleichmitteln und/oder
Bleichaktivatoren, insbesondere für den späteren Einsatz in maschinellen Geschirrspülmitteln.
Weiterhin
sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß die
Beschichtung 2,5 bis 27,5 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 25 Gew.-% Pigment
enthält.
Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils
zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Diese
Bereiche werden insbesondere durch das Beispiel der vorliegenden
Anmeldung für
ein weißes
Pigment belegt.
Weiterhin
sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß die
Beschichtung 0,5 bis 15 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-% Weichmacher
enthält.
Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen
diesen Zahlen liegenden Werte.
Dieser
Wert hängt
insbesondere von der Fließfähigkeit
des Filmbildners bei den eingestellten Bedingungen ab. Er ist erfindungsgemäß aber deshalb
geringer als im Stand der Technik üblich, weil die Fließfähigkeit
bei einem geringeren Anteil an sprödem, trockenen Pigment automatisch
zunimmt.
Weiterhin
sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß die
Beschichtung 7,5 bis 95 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 90 Gew.-%, besonders
bevorzugt 20 bis 80 Gew.-% Filmbildner enthält. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen
und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Hierunter
sind ferner solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet
sind, daß die Dicke
der Beschichtung 1 bis 150 μm,
vorzugsweise 5 bis 50 μm,
besonders bevorzugt 10 bis 30 μm
beträgt.
Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils
zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Im
allgemeinen kann die Schichtdicke somit erfindungsgemäß unter
den bislang üblichen
Werten liegen, weil auf einen beträchtlichen Anteil an Pigment
verzichtet werden kann. So weist die in Beispiel 1 beschriebene
Beschichtung aus ca. 80 Gew.-% PEG und ca. 20 Gew.-% Titandioxid
eine durchschnittliche Schichtdicke von ca. 20 μm auf.
Entsprechend
dem oben Gesagten sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet
sind, daß in
Schritt (a) ein technisch einsetzbares Enzym eingebracht wird, vorzugsweise
eine Protease, besonders bevorzugt eine alkalische Protease.
Entsprechend
dem oben Gesagten sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet
sind, daß durch
Schritt (d) erhaltene Granulat insbesondere über die Steuerung der Granulation
in Schritt (c) eine durchschnittliche Partikelgröße von 110 bis 5.000 μm, vorzugsweise
von 200 bis 2.000 μm,
besonders bevorzugt von 400 bis 1.200 μm erhält. Eingeschlossen werden alle
ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden
Werte.
Diese
Werte liegen etwas oberhalb von denen, die nach (c) erhalten worden
sind, sollen insgesamt aber nach den Anforderungen an das Granulat eingestellt
werden. Hierbei ist zu bedenken, daß auch die Beschichtung einen
Beitrag zur Elastizität liefert
und einen Schutz der Inhaltsstoffe darstellt.
Entsprechend
dem oben Gesagten sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet
sind, daß in
Schritt (a) eine Protease eingebracht wird und das durch Schritt
(c) oder (d) erhaltene Granulat insbesondere über die Einstellung der Konzentration
in Schritt (b) eine durchschnittliche Aktivität von 50.000 bis 500.000 HPE/g,
vorzugsweise von 100.000 bis 450.000 HPE/g, besonders bevorzugt von
140.000 bis 380.000 HPE/g erhält.
Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils
zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Denn
diese Werte sind beispielsweise für die jeweilige Einstellung
der Proteasekonzentration in verschiedenen Waschmittelrezepturen
günstig.
Einen
eigenen Erfindungsgegenstand stellt ein Enzymgranulat dar, das durch
eines der zuvor beschriebenen Verfahren erhalten worden ist und
die dementsprechend günstigen
Eigenschaften aufweist.
Einen
weiteren eigenen Erfindungsgegenstand stellt ein Mittel dar, enthaltend
ein solches Enzymgranulat.
Unter
einem Mittel ist erfindungsgemäß jede Rezeptur
oder Formulierung zu verstehen, die als wirksame Komponente solch
ein Granulat enthält. Dessen übrige Zusammensetzung
bestimmt sich nach dem Einsatzgebiet des Mittels. Hierbei ist es deshalb
besonders vorteilhaft, erfindungsgemäße beschichtete Granulate einzusetzen,
weil in solchen Rezepturen weitere Inhaltsstoffe zugegen sind, die die
erfindungsgemäßen Granulate
oder die enthaltenen Enzym hinsichtlich ihrer Stabilität gefährden könnten.
Hierunter
sind alle jeweils zweckmäßigen, dem
Stand der Technik entsprechenden Rezepturen oder Formulierungen
zu verstehen, beispielsweise flüssige,
vorzugsweise wasserfreie Formulierungen, in denen entsprechend beschichtete
erfindungsgemäße Granulate
stabil sind. Das läßt sich
insbesondere über
die Ionenstärke
und die Anwesenheit wasserentziehender Mittel und/oder Gelbildnern
steuern.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich dabei jedoch um Mittel in insgesamt fester Form,
vorzugsweise in Pulverform oder kompaktiert, hierunter besonders
bevorzugt zu Tabletten kompaktiert.
Denn
bei diesen ist die Stabilität
gegenüber Auflösungsvorgängen weniger
kritisch als bei flüssigen
Formulierungen. Ihre Herstellung ist im Stand der Technik hinlänglich bekannt.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich um ein Waschmittel oder um ein Reinigungsmittel.
Dazu
zählen
alle denkbaren Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch
unverdünnt anzuwendende
Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine
oder bei der Hand-Wäsche,
beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel
für Textilien, Teppiche
oder Naturfasern, für
die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel
verwendet wird. Dazu gehören
beispielsweise auch Geschirrspülmittel
für Geschirrspülmaschinen
oder manuelle Geschirrspülmittel
oder Reiniger für
harte Oberflächen
wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte
Oberflächen,
Kunststoffe, Holz oder Leder; für
solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel
verwendet. Jegliche Wasch- oder Reinigungsmittelart stellt eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung dar, sofern sie um ein erfindungsgemäß hergestelltes
Enzymgranulat bereichert ist.
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung umfassen alle nach den Stand der Technik
etablierten und/oder alle zweckmäßigen Darreichungsformen
der erfindungsgemäßen Wasch-
oder Reinigungsmittel. Dazu zählen
entsprechend dem oben gesagten insbesondere feste, pulverförmige, Mittel, gegebenenfalls
auch aus mehreren Phasen, komprimiert oder nicht komprimiert; ferner
gehören
beispielsweise dazu: Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches,
sowohl in Großgebinden
als auch portionsweise abgepackt. Auch flüssige, pastöse oder gelförmige Ausführungsformen
sind eingeschlossen, sofern für
diese das erfindungsgemäß aufgearbeitete Enzymgranulat
darin stabil erhalten werden kann.
Ferner
fallen hierunter sowohl Wasch- und Reinigungsmittel für die kommerzielle
Anwendung als auch solche, die insbesondere über die Darreichungsform und
die Auswahl der Inhaltsstoffe für
den Endverbraucher konzipiert sind.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
enthalten die erfindungsgemäßen Wasch-
oder Reinigungsmittel aktive Enzyme in einer Menge von 2 μg bis 20
mg, vorzugsweise von 5 μg
bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg, ganz besonders
bevorzugt von 50 μg
bis 10 mg pro Gramm des Mittels. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und
nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Neben
einem erfindungsgemäß hergestellten
Enzymgranulat und möglicherweise
weiteren Enzymen enthält
ein erfindungsgemäßes Wasch-
oder Reinigungsmittel gegebenenfalls weitere aus dem Stand der Technik
bekannte Inhaltsstoffe wie beispielsweise Enzymstabilisatoren, Tenside,
zum Beispiel nichtionische, anionische und/oder amphotere Tenside,
Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Bleichkatalysatoren, Builder, Lösungsmittel,
Verdicker und gegebenenfalls als weitere übliche Inhaltsstoffe Sequestrierungsmittel,
Elektrolyte, optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Farbübertragungsinhibitoren,
Schauminhibitoren, Farb- und/oder Duftstoffe, antimikrobielle Wirkstoffe
und/oder UV-Absorbenzien, um nur die wichtigsten Stoffklassen aufzuführen. Entsprechende
Rezepturen sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung
eines Proteasegranulats
Schritt 0: Herstellung
einer einer wäßrigen,
gereinigten Enzymlösung
Zunächst wurde
durch Aufarbeitung aus einem Fermentationsüberstand von Proteasebildenden
und -sekretierenden grampositiven Bakterien eine konzentrierte Proteaselösung hergestellt.
Dabei wurde der Reihe nach den in Beispiel 1 der Anmeldung
DE 10304066 beschriebenen
Punkten „Abtrennung
der Biomasse", „Bestimmung
des optimalen Arbeitsbereichs", „Schritt
(a): Konzentrierung der Enzymlösung
bis zum Arbeitsbereich" und „Schritt
(b): Separation der entstandenen Ausfällungen (Feststoffe)" gefolgt. Hierdurch
wurden 10 l einer Proteaselösung
mit einer Aktivität
von 750.000 HPE/g und einem Trockensubstanzgehalt von 25 Gew.-%
erhalten. Deren Erscheinungsbild wies in der international gebräuchlichen
CIE-LAB-Farbskala, definiert in DIN 5033-3 und DIN 6174 einen L-Wert
(Helligkeit) von 60, einen a*-Wert (rot-grün) von 3,0 und einen b*-Wert (gelb-blau)
von 60 auf.
Schritt (a): Ionenaustausch-Chromatographie
Nun
folgte eine starkbasische Anionenaustausch-Chromatographie, durchgeführt bei
einem pH-Wert von 7,5. Sie erfolgte im Festbett mittels des starkbasischen
Anionenaustauschers vom Typ DIAION® Pa
308L, erhältlich
von der Firma Mitsubishi, Tokyo, Japan, beziehungsweise Mitsubishi
Chemical Europe GmbH, Düsseldorf,
Deutschland. Hiervon wurden 2,5 l in einer Glaskolonne mit Siebboden
bereitgestellt; die Betthöhe
lag bei 300 mm; als treibende Kraft diente die geostatische Höhe. Die
Chromatographie erfolgte mit Rücksicht
auf das Bettvolumenverhältnis
(BV; Volumenverhältnis
des Enzymkonzentrats zum Harz) und die Verweilzeit. Konkret wurden
ein Verhältnis
von 2 bis 5 BV und eine Dosierung von 0,1 l Enzymlösung pro
kg Harz und min eingestellt. Hierfür wurde über die Gravitation gesteuert.
Das
Trennprinzip beruht darauf, daß das
Enzym vom Trägermaterial
abgestoßen,
und somit im Flüssigkeitsstrom
mitgeführt
wird, während
die Begleitstoffe am immobilen Träger adsorbiert werden. Ein
Teil des Nachlaufs wurde zur Erhöhung
der Ausbeute erneut über
die Säule
geführt.
Anschließend wurden
durch Spülen
mit NaCl- und NaOH- Lösungen die
an die Säule
adsorbierten Verbindungen (vor allem Farb- und Geruchsstoffe) ausgewaschen
und auf diese Weise das Festbett regeneriert.
Dadurch
wurden 15 l eines schwach gefärbten
Protease-Konzentrats erhalten. Dessen Aktivität betrug 490.000 HPE/g (Ausbeute
98 %, bezogen auf die eingesetzte Aktivität). Als CIE-Farbwerte wurden L
= 92, a* = 1,5 und b* = 20 ermittelt.
Schritt (b): Einstellung
einer geeigneten Konzentration
Zur
Konzentrationseinstellung des über Schritt
(a) erhaltenen Protease-Konzentrats wurde die Technik der thermischen
Aufkonzentrierung gewählt.
Dafür wurde
die Enzymlösung
mit Hilfe eines handelsüblichen
Rotationsverdampfers (Rotavapor, Fa. Büchi, Schweiz) bei ca. 35°C und ca.
50 mbar auf eine Endaktivität
von ca. 1.000.000 HPE/g einkonzentriert.
Schritt (c): Granulation
Die
Granulation erfolgte über
die Technik der Extrusion. Hierzu wurde die nach Schritt (b) konzentrierte
Proteaselösung
in einem Batchmischer (Fa. Lödige)
mit folgenden handelsüblichen
Zuschlagsstoffen versetzt: Maisstärke, Weizenmehl, PEG 2.000
(Fa. BASF, Deutschland), Cellulose, Saccharose.
Dieses
Gemisch wurde sogleich in einem handelsüblichen gegenläufigen Zweiwellenextruder (Fa.
Lihotzki, Deutschland) extrudiert und das erhaltene, noch feuchte
Extrudat anschließend
in einem Wirbelschichttrockner (WSG 5, Fa. Glatt, Deutschland) schonend,
das heißt
unterhalb von 40°C
getrocknet.
Das
hierdurch erhaltene Granulat ist sehr hell und weist praktisch nur
noch die Eigenfärbung der
Festrohstoffe auf. Als CIE-Farbwerte wurden L = 81, a* = 2 und b*
= 15 ermittelt, während
ein nicht Schritt (a) unterzogenes sondern auf herkömmliche Weise
desodoriertes, ansonsten aber gleich behandeltes Vergleichsgranulat
Werte von L = 67, a* = 4 und b* = 18 aufwies.
Schritt (d): Beschichtung
(Coating)
Das
aus Schritt (c) erhaltene Granulat wurde anschließend mit
einer wäßrigen Suspension
aus PEG 20.000 (Fa. BASF) und Titandioxid vom Rutil-Typ (Fa. Huntsman, Großbritannien)
beschichtet. Hierfür
wurde ein handelsüblicher
Topspray-Wirbelschicht-Coater
(WSG 5, Fa. Glatt) eingesetzt und eine Temperatur von weniger als
40°C eingehalten. Die
erhaltene Beschichtung bestand zu ca. 80 Gew.-% aus PEG und zu ca.
20 Gew.-% aus Titandioxid und wies eine durchschnittliche Schichtdicke von
ca. 20 μm
auf.
Als
CIE-Farbwerte wurden für
das hierdurch erhaltene beschichtete Granulat L = 82, a* = 1 und
b* = 8 ermittelt, während
das in Schritt (c) bereits zum Vergleich herangezogene und anschließend genauso
Schritt (d) unterzogene Vergleichsgranulat Werte von L = 76, a*
= 2 und b* = 8 aufwies.
In
Wiederholungen des Versuchs konnte der Titandioxid-Gehalt der Beschichtung
erfindungsgemäßer Granulate
auf bis zu ca. 6 Gew.-% gesenkt werden, wobei Farbwerte erhalten
wurden, die immer noch nicht schlechter waren als die des Vergleichgranulats.
Beschreibung
der Figuren
1: Blockfließschema
zur erfindungsgemäßen Herstellung
eines Enzymgranulats, einschließlich
des optionalen Beschichtungs-Schritts.
Dargestellt
sind folgende Schritte, die sich an an die Herstellung einer wäßrigen,
gereinigten Enzymlösung
anschließen:
- (a) Ionenaustausch-Chromatographie über einen Ionenaustauscher,
unter Durchfluß eines
Regenerationsmediums zur Abtrennung von Farb- und Geruchsstoffen,
optional unter Rückführung eines Teils
des Vor- oder Nachlaufs der Chromatographie (Regenerat),
- (b) Einstellung einer geeigneten Konzentration über Einkonzentrierung,
- (c) Granulation unter Zugabe von Feststoffen zum Endprodukt
und
- (d) als optionaler Schritt: Beschichtung (Coating) über Zugabe
der Schicht in Form einer Coating-Suspension zum Endprodukt.
Das
Endprodukt nach Schritt (c) ist ein erfindungsgemäßes Enzymgranulat
beziehungsweise nach Schritt (d) ein erfindungsgemäßes, beschichtetes
Enzymgranulat.