DE10353806A1

DE10353806A1 - Verwendung von Aminosäure- und Zucker-Amphiphilen zur Inaktivierung von lipidumhüllten Viren

Info

Publication number: DE10353806A1
Application number: DE2003153806
Authority: DE
Inventors: Georg Prof. Dr. Pauli; Joachim Dr. Vater; Maren Kracht; Evgeny Dr. Vulfson
Original assignee: Bundesrepublik Deutschland; Robert Koch Institute; Bundesministerium fuer Gesundheit
Current assignee: Bundesrepublik Deutschland; Robert Koch Institute; Bundesministerium fuer Gesundheit
Priority date: 2003-11-14
Filing date: 2003-11-14
Publication date: 2005-07-07
Also published as: WO2005049098A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von synthetischen Aminosäure- und Zucker-haltigen Amphiphilen zur Inaktivierung von lipidumhüllten Viren in Blutprodukten, in rekombinant hergestellten Therapeutika und Diagnostika sowie in Zellkulturen. DOLLAR A Erfindungsgemäße Anwendung finden sowohl die Monoester und -amide als auch die komplexeren Bola- und Gemini-Amphiphile. Bola-Amphiphile enthalten zwei polare Kopfgruppen, die durch ein hydrophobes Verbindungsstück miteinander verknüpft sind, und Gemini-Amphiphile bestehen aus zwei Molekülen monomerer Amphiphile, die über einen flexiblen Linker (Spacer) gekoppelt sind.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von synthetischen Aminosäure- und Zucker-haltigen Amphiphilen zur Inaktivierung von lipidumhüllten Viren in Blutprodukten, in rekombinant hergestellten Therapeutika und Diagnostika sowie in Zellkulturen.

Zellkulturen, Blutprodukte sowie Therapeutika und Diagnostika, welche rekombinant hergestellte Wirkstoffe natürlicher Produkte aufweisen, sind wichtige Erzeugnisse, die in der medizinischen Diagnostik und zur Behandlung des Menschen eingesetzt werden. Dazu gehören Isolate aus Säugern, wie z.B. aus Blut isolierte Produkte. Rekombinant hergestellte Wirkstoffe sind zahlreich bekannt und gewinnen in der Therapie, Prophylaxe und Diagnostik zunehmend an Bedeutung.

Diese Produkte (z.B. Impfstoffe, monoklonale Antikörper, Hormone und rekombinante Proteine) müssen frei von jeglicher viraler und mikrobieller Kontamination sein. Es sei in diesem Zusammenhang auf einige Skandale verwiesen, die in verschiedenen europäischen Ländern aufgetreten sind, wobei durch HIV-Kontaminationen oder Hepatitis C-Viren in Blutprodukten zahlreiche Infektionen hervorgerufen wurden. Einer ständigen intensiven Kontrolle auf Viruskontaminationen der Produkte ist demzufolge oberste Priorität einzuräumen. Es sind in den letzten 10–15 Jahren zahlreiche Techniken zur Virusinaktivierung entwickelt worden, die jedoch nicht ausreichen, um sämtliche Restrisiken einer Virusübertragung durch entsprechende Produkte auszuschließen.

Zur Virusinaktivierung werden bei strukturell einfachen und stabilen Produkten häufig chromatographische Methoden, pH-„shift", Extraktion und Fraktionierung mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln, Salzpräzipitation, Hitzebehandlung und Filtrationstechniken angewandt. Empfindliche und komplexe biologische Materialien werden dagegen häufig mit antiviral wirkenden Substanzen behandelt. Eine Übersicht über moderne Virusinaktivierungs- und Validisierungsmethoden geben H.-J. Henzler und K. Kaiser in Nature Biotechnology, 16, 1077–1079 (1998). Vielversprechende neue Inaktivierungstechniken sind z.B. Ultrakurzzeit-Hochtemperaturbehandlung und UV-Bestrahlungsverfahren, photochemische Methoden sowie Immun-Affinitätschromatographie von Viren.

Virale Inaktivierungsverfahren für Blutprodukte, vorzugsweise von humanem Blutplasma, sind auch in der Patentliteratur beschrieben. So ist in US-A 4,591,505 ein Verfahren zur Inaktivierung von Hepatitis B-Viren dargestellt, bei dem den Blutprodukten Alkohol und ein nichtionisches Detergenz und/oder Ether zugesetzt wird, wobei als nichtionische Detergentien Polyoxyethylenderivate oder Sulfobetaine verwendet werden. US-A 4,841,023 und US-A 4,613,501 ist die Inaktivierung lipidumhüllter Viren in Blutprodukten durch Fettsäuren bzw. durch Alkyl-Oleinsäure zu entnehmen. Desweiteren ist aus EP-A1 0 050 061 ein Verfahren zur Verminderung unerwünschter Aktivitäten, wie Pyrogenität, Hepatitis-Infektiösität und Aggregation in biologischen und pharmazeutischen Produkten bekannt, wobei die Produkte mit nicht-denaturierenden Verbindungen, wie z.B. nicht-ionischen Substanzen (z.B. Tween 80) behandelt werden.

Aufgrund hoher Toxizitäten in Zellkulturen, die insbesondere die eingesetzten Lösungsmittel und synthetischen Verbindungen kennzeichnen, ist jedoch der Einsatz vorhandener Virusinaktivierungsmittel mit einem hohen Risiko behaftet. Keines der genannten Inaktivierungsverfahren ist zudem in der Lage, mit Sicherheit alle Viren zu inaktivieren bzw. zu eliminieren.

Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, geeignete Substanzen für die Virusinaktivierung zu suchen, die kostengünstig herstellbar und einfach anwendbar sind, geringe Zytotoxizität aufweisen und eine hohe Rate der Virusinaktivierung in den Produkten gewährleisten.

Überraschend wurde gefunden, dass an sich bekannte, leicht zugängliche synthetische Aminosäure-haltige und Zuckerhaltige Amphiphile ein hohes Virusinaktivierungspotential besitzen und sich nur durch eine geringe Zytotoxizität auszeichnen. Die Aufgabe der Erfindung konnte durch den Einsatz solcher Substanzen gelöst werden.

Diese synthetischen Aminosäure- und Zucker-haltigen Amphiphile sind an sich bekannt. Sie können aus relativ kostengünstigen Ausgangsstoffen mit guten Ausbeuten und in exzellenter Reinheit in industriellem Maßstab gewonnen werden. Insbesondere handelt es sich um monomere und dimere (Gemini) Amphiphile sowie Bola-Amphiphile.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Verwendung von synthetischen Aminosäure- und Zucker-haltigen Amphiphilen der allgemeinen Formel I zur Inaktivierung von lipidumhüllten Viren in Blutprodukten, in rekombinant hergestellten Therapeutika und Diagnostika sowie in Zellkulturen.

Unter Blutprodukten werden gemäß vorliegender Erfindung Blut oder aus Blut isolierte Plasmaprodukte verstanden. Plasmaprodukte sind isolierte und gereinigte Proteinfraktionen, wie z.B. Gerinnungsfaktoren (u.a. Faktor VIII), Immunglobuline oder Serumalbumin.

Rekombinant hergestellte Therapeutika sind Erzeugnisse, die im Sinne der Erfindung sowohl zur Behandlung als auch zur Prophylaxe angewendet werden können. Zu den Therapeutika gehören z.B. Humanproteine, wie z.B. von hGH, TNF, t-PA, EPO, Plasmaproteine (z.B. Albumin), Transportproteine, (z.B. Hämoglobin-Präparate, Zytochrome), Alloantigene, (z.B. Blutgruppenantigene) oder Blutgerinnungsfaktoren, wie z.B. Faktor II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII. Auch Antikörper-basierte Therapeutika sind bekannt. Diagnostika sind z.B. Immundiagnostika in Form von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern.

Zellkulturen bzw. Zelllinien tierischen und menschlichen Ursprungs werden zur Herstellung dieser rekombinanten Erzeugnisse häufig eingesetzt. Da auch in solchen Zellen häufig Infektionen durch endogene Viren sowie latente Virusinfektionen nicht vollständig ausgeschlossen werden können, ist ein Virusinaktivierungsschritt im Produkt unerlässlich.

Die erfindungsgemäß eingesetzten synthetischen Amphiphile besitzen die Formel: (F¹)_l-(X¹)_m-(F²)_n-(X²)_o-(F³)_p (I)wobei
F¹, F³ unabhängig voneinander einen mittel- bis langkettigen linearen oder verzweigten hydrophoben Carbonsäurerest mit 8 bis 30 C-Atomen bedeuten, und die Kohlenstoffkette gesättigt oder ungesättigt sein kann,
F² einen hydrophoben Diol-, Diamin- oder Dicarbonsäure-Linker mit 4 bis 20 C-Atomen darstellt,
X¹, X² unabhängig voneinander je einen Aminosäurerest -HN-AS-CO- oder -OC-AS-NH- bedeuten und wenn 1 und/oder p = 0 ist, den Aminosäurerest NH₂-AS-CO- oder HOOC-AS-NH- bedeuten oder
unabhängig voneinander je eine Zucker- oder Disaccharideinheit darstellen sowie
l, m, n, o, p unabhängig voneinander 0 oder 1 bedeuten.

Bevorzugt werden Amphiphile eingesetzt, in denen die Reste F¹ und F³ Fettsäurereste darstellen, die 10 bis 20 Kohlenstoffatome umfassen. Besonders bevorzugt sind Carbonsäurereste mit 10 bis 14 C-Atomen.

Die hydrophoben Verbindungsglieder F² stellen vorzugsweise solche Diol-, Diamin- oder Dicarbonsäurereste dar, die eine Kettenlänge von 6 bis 18 Kohlenstoffatomen umfasssen. Besonders bevorzugt sind geradkettige Verbindungen, wobei F² dann bevorzugt eine Diolgruppe mit der Struktur -O-C₆H₁₂-O- bis -O-C₁₈H₃₆-O-; eine Dicarbonsäuregruppe mit der Struktur -OC-C₆H₁₂-CO- bis -OC-C₁₈H₃₆-CO- oder eine Diamingruppe mit der Struktur -HN-C₆H₁₂-NH- bis -HN-C₁₈H₃₆-NH- ist.

Bevorzugte Aminosäurereste für X¹ und X² leiten sich von Glycin, L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Tryptophan, L-Serin oder L-Glutaminsäure ab. Bevorzugte Zuckerreste X¹ und X² sind Mono- oder Disaccharidreste, vorzugsweise Glucose, Methyl-Glucose, Galactose, Lactose und Xylose.

Erfindungsgemäße Anwendung finden sowohl die Monoester und -amide als auch die komplexeren Bola- und Gemini Amphiphile. Bola-Amphiphile enthalten 2 polare Kopfgruppen, die durch ein hydrophobes Verbindungsstück miteinander verknüpft sind und Gemini-Amphiphile bestehen aus zwei Monomeren, die über einen flexiblen Linker (Spacer) gekoppelt sind.

Werden monomere Verbindungen eingesetzt, so handelt es sich um Verbindungen, in denen in der allgemeinen Formel I l, m und n = 0 sind sowie o und p = 1 bedeuten oder in denen n, o und p = 0 sind sowie l und m = 1 bedeuten.

Erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte monomere Amphiphile sind Ester von Aminosäuren mit längerkettigen Alkoholen, Fettsäureamide oder Glycolipide. Besonders bevorzugt verwendete Monomere sind Esterverbindungen mit C10- bis C20-Ketten, insbesondere mit C10- bis C14-Resten. Ganz besonders bevorzugt sind die Dodecylester einsetzbar. Als besonders geeignet haben sich die Dodecylester von den Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Tryptophan erwiesen und von den Glykolipiden (Zuckerverbindungen) die Dodecylester von Glucose und Lactose. Weiter bevorzugte monomere Verbindungen sind 1-O-L-Phenylalanyl-3-O-myristoylglycerol und 1-O-L-Tyrosyl-3-O-myristoylglycerol.

Bola-Amphiphile gemäß der allgemeinen Formel I sind Verbindungen, in denen 1 und p = 0 sind und m, n und o = 1 bedeuten. Dimere Verbindungen (Gemini) sind Verbindungen der allgemeinen Formel I in denen l, m, n, o und p = 1 ist. Besonders bevorzugt sind im Sinne der Erfindung die Verbindungen C12-Glc-C6-Glc-C12 und C12-Lac-C10-Lac-C12.

Erfindungsgemäß kommen die Amphiphile in den Zellkulturen, Therapeutika, Diagnostika und Blutprodukten in Konzentrationen ≤ 500 μM zur Anwendung, besonders bevorzugt in Konzentrationen von ≤ 200 μM. Darüber hinaus sind die Verbindungen auch in kleinen Konzentrationen von ≤ 50 μM oder sogar ≤ 20 μM einsetzbar; sie wirken in den Produkten viruszerstörend.

Die Aminosäure- und Zucker-haltigen Amphiphile werden gemäß der Erfindung zur Inaktivierung von lipidumhüllten humanen, animalen oder pflanzlichen Viren eingesetzt. Vorzugsweise werden Retroviren (Immundefizienz-Viren), wie z.B. die Humanen Immunodefizienz Viren HIV-1 und HIV-2, oder das Affen Immunodefizienz Virus SIV, Herpes-Viren, z.B. HSV-1, HSV-2, BHV-1 und SHV-1; sowie das vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) und das Semliki Forest-Virus (SFV) inaktiviert.

Die Inaktivierung von Viren kann entweder direkt oder indirekt erfolgen. Von direkter Inaktivierung spricht man, wenn das Virus abgetötet wird, wie z.B. bei umhüllten Viren durch Desintegration ihrer Lipoproteinhüllmembran. Die indirekte Inaktivierung erfolgt durch Substanzen, welche z.B. entweder das Viruswachstum hemmen oder die Vervielfältigung eines Virus verhindern.

Die erfindungsgemäße Verwendung zur Inaktivierung von lipidumhüllten Viren erfolgt durch die hier beschriebenen synthetischen Amphiphile direkt, wobei mindestens ein Amphiphil der allgemeinen Formel I den Produkten (Blutprodukten, rekombinant hergestellten Therapeutika und Diagnostika sowie Zellkulturen) zugesetzt wird. Die Einwirkungszeit richtet sich nach der Temperatur, die bevorzugt zwischen 15 bis 65°C liegt.

In einer Ausführungsvariante erfolgt der Einsatz der Verbindungen bei Raumtemperatur im Bereich von 18 bis 25°C, wobei die Einwirkungszeit vorzugsweise bis zu 2 Stunden beträgt. Das Arbeiten bei Raum- bzw. Umgebungstemperatur hat den großen Vorteil, dass die zu virus-inaktivierenden Produkte schonend behandelt werden und keine zusätzlichen Maßnahmen erforderlich sind.

Da die erfindungsgemäß eingesetzten synthetischen Amphiphile thermisch stabil sind, kann die Viren-Inaktivierung je nach der thermischen Stabilität der zu behandelnden Produkte alternativ auch bei höheren Temperaturen durchgeführt werden, vorzugsweise bei 30–60°C, wobei sich die Einwirkungszeit der Amphiphile auf die Produkte verkürzt. Sie liegt in der Regel bei ca. 0,5 bis max. 2 Stunden.

Neben dem Vorteil einer wesentlich geringeren in vivo-Toxizität, besitzen die erfindungsgemäß eingesetzten synthetischen Aminosäure- und Zucker-haltigen Amphiphile überraschenderweise ein um mehrere Größenordnungen höheres Inaktivierungspotential für lipidumhüllte Viren als herkömmliche, häufig verwendete Verbindungen, wie z.B. Triton oder Tween. Darüber hinaus sind sie umweltfreundlich und leicht biologisch abbaubar. Sie sind als eine neue Klasse von Wirkstoffen zur Inaktivierung von lipidumhüllten Viren, wie z.B. Herpes- und Retroviren, anzusehen. Ihre Virusinaktivierung beruht auf den Membran-desintegrierenden Eigenschaften dieser Substanzen. Sie eignen sich daher hervorragend für die schonende Virusinaktivierung in empfindlichen Produkten.

Sie bewirken eine nahezu vollständige Inaktivierung der Viren. So steht z.B. in den Richtlinien der Europäischen Agentur für die Beurteilung von Arzneimitteln (EMEA – CPMP/BWP/268/95), dass eine klare Virus-Inaktivierung vorliegt, wenn die Restinfektiosität um 4log₁₀-Stufen durch das eingesetzte Verfahren absinkt. Zur Beurteilung der Effektivität muss auch noch die Inaktivierungskinetik beachtet werden. Diese ist abhängig von der Konzentration des eingesetzten Inaktivierungsmittels, von der Inkubationstemperatur und der Zeit der Behandlung. In den Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine schnelle Inaktivierung durch die eingesetzten Substanzen erfolgt.

Die verwendeten synthetischen Amphiphile (sowohl Aminosäure-haltige als auch Zucker-haltige Amphiphile) zeichnen sich bei gleichzeitiger hoher Virusinaktivierung durch eine nur geringe zytotoxische Wirkung aus. Bei der bevorzugten Anwendung in Konzentrationen < 50 μM liegt praktisch keine Zytotoxizität vor oder sie ist nur gering. Bei Konzentrationen < 20 μM beobachtet man keine Zytotoxizität. Diese Eigenschaft ist von besonderem Vorteil für die Entwicklung möglichst schonender Virusinaktivierungsverfahren. Es ist daher z.B. möglich, diese Wirkstoffe in Konzentrationen in den Produkten zu belassen.

Besonders hohe viruszerstörende Wirkungen werden mit den monomeren amphiphilen Verbindungen erzielt. Insbesondere eignen sich für die Virusinaktivierung Ester von Aminosäuren mit langkettigen Alkoholen bzw. Fettsäureamide, die an der NH₂-Gruppe acyliert sind.

Bevorzugt sind Verbindungen, die eine hohe Hydrophobizität aufweisen, wobei mit steigender Hydrophobizität eine starke Zunahme der Virusinaktivierung zu verzeichnen ist. Untersuchungen von Struktur-Wirkungs-Beziehungen ergaben, dass für die Virusinaktivierung praktisch alle Strukturelemente der Verbindungen, d.h. die polaren Bausteine gleichermaßen wie die hydrophoben Kohlenwasserstoffseitenketten und Verbindungsglieder (Spacer) zwischen den polaren Kopfgruppen, von Bedeutung sind. So zeigt z.B. eine Verbindung mit Glucose als polarem Strukturanteil eine höhere viruszerstörende Aktivität als eine Verbindung mit dem Disaccharid Lactose als polarem Strukturbaustein. Umgekehrt ist die Inaktivierung von Viren durch eine Lactose-haltige Verbindung deutlich höher als im Falle von Xylose als Zuckerkomponente. Die Virusinaktivierung nimmt offensichtlich mit wachsender Kettenlänge wieder ab, d. h. eine C12-Verbindung weist im Vergleich zu der entsprechenden C16- bzw. C18-Verbindung einen höheren Inaktivierungseffekt gegen Viren auf.

Erfindungsgemäß ist es daher möglich, durch gezielte Variation der Strukturbausteine Amphiphile mit optimaler viruszerstörender Aktivität und gleichzeitig möglichst niedriger Zytotoxizität herzustellen.

Die erfindungsgemäß eingesetzten synthetischen Amphiphile können nach bereits beschriebenen und dem Fachmann bekannten Verfahren leicht hergestellt werden. Sowohl die Synthese von Aminosäure- als auch von Zucker-haltigen Amphiphilen erfolgt nach chemischen, enzymatischen und chemoenzymatischen Verfahren. Bei den letzteren werden immobilisierte Enzyme eingesetzt. Bevorzugte Verwendung finden verschiedene Lipasen, die stereoselektive Biokatalysatoren darstellen. Insbesondere eignen sich hierfür immobilisierte Lipasen aus Rhizomucor miehei und Candida antarctica.

A) Herstellung von Aminosäure-haltigen Amphiphilen der allgemeinen Formel I

Wie bereits ausgeführt sind chemische, enzymatische und chemoenzymatische Verfahren zur Synthese von Aminosäurehaltigen Amphiphilen, wie z.B. von Aminosäuremonoestern und -amiden sowie von komplexeren Bola- und Gemini-Amphiphilen, literaturbekannt (Valivety, R. et al. (1997), J.Am.Oil Chem.Soc. 74, 879–886; Valivety, R. et al. (1998) J.Surf.Derterg. 1, 177–185; Vulfson, E.N. (1998), K.Holmberg (Ed.), pp. 279–300. M.Dekker, Inc., New York-Basel-Hong Kong). So werden durch regioselektive Synthesen mit immobilisierten Lipasen aus Rhizomucor miehei und Candida antarctica z.B. aus Glycerinestern von N-geschützten Aminosäurederivaten mit freien Carbonsäuren (Fettsäuren) die monomeren Amphiphile hergestellt. Da dieselben Lipasen auch eine Vielzahl von N-geschützten Aminosäuren als Acyldonor-Moleküle akzeptieren, können sie mit langkettigen Alkoholen problemlos verestert werden. So werden z.B. aus äquimolaren Mischungen von N-Carbobenzyloxy(Cbz)-Aminosäuren, wie z.B. den N-Cbz-Derivaten von Glycin, L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Tryptophan, L-Serin, L-Glutaminsäure bzw. L-Asparaginsäure u.a. mit Dodecanol in 24 h in einer fast quantitativen Umwandlung die entsprechenden Dodecylester hergestellt. Die enzymatischen Reaktionen werden z.B. in offenen Reaktionsgefäßen bei ca. 60°C durchgeführt, um das Gleichgewicht in Richtung der Esterbildung zu verschieben. Die monomeren Amphiphile werden durch Chromatographie i.d.R. an Aluminiumoxid-Säulen isoliert und durch katalytische Hydrierung von den Schutzgruppen befreit. Analog werden Aminosäure-haltige Bola- und Gemini-Amphiphile hergestellt. Der Einsatz von langkettigen α,ω-Diol- und Diamin-Verbindungen führt zur Bildung von Alkandiyl-α,ω-bis-(N-geschützten Aminosäure)-Derivaten. So werden z.B. mit guten Ausbeuten α,ω-Diester und Diamide von Glycin, L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Tryptophan, L-Serin oder L-Glutaminsäure bzw. L-Lysin u.a. Aminosäuren hergestellt. Die Entfernung der Schutzgruppen liefert die Bola-Verbindung, die durch weitere Modifizierung in entsprechende Gemini-Amphiphile umgesetzt werden, wie z.B. durch Acylierung mit Myristoylchlorid u.a..

B) Herstellung von Zucker-haltigen Am hiphilen der allgemeinen Formel I

Auch die Herstellung von Zucker-haltigen Amphiphilen ist literaturbekannt (Fregapane, G. et al. (1994), Biocatalysis 11, 9–18; Gao, C. et al. (1999), Enzyme Microb. Technol. 25, 264–270; Gao, C. et al. (1999), J.Surf.Deterg. 2, 293–302). So werden Mono- und Disaccharide regioselektiv mit Hilfe von Lipasen (z.B. immobilisierte Lipasen aus Rhizomucor miehei und Candida antarctica) acyliert. Anschließend werden die gebildeten Produkte unter Anwendung konventioneller chemischer Methoden gekoppelt, wobei in guter Ausbeute dimere (Gemini)-Amphiphile entstehen. Im ersten Schritt erfolgt eine direkte Veresterung der Zuckersubstrate in geeigneten organischen Lösungsmitteln. Bevorzugt basieren die Acylierungen auf dem Einsatz von Isopropyliden-Derivaten von Mono- und Disacchariden, mit denen hohe Ausbeuten erreicht werden und die den Vorteil besitzen, dass auf diese Weise einzelne OH-Gruppen für die weitere chemische Modifikation zur Verfügung stehen. Bevorzugt werden die Lipasen für die regioselektive Einführung von Fettsäureketten in partiell geschützte Isopropyliden-Zucker-Derivate und die Modifikation von α,ω-Alkan-bis-Glucosiden genutzt. Alle weiteren Verfahrensschritte erfolgen nach an sich bekannten Methoden. So führte die enzymatische Veresterung z.B. von 1,2-Isopropyliden-Xylose und Lactose-tetraacetal spezifisch zur Bildung von 5- und 6'-Monomeren, die über die 3- bzw. 2'-OH-Gruppe mit Decan- oder Hexandioyldichlorid zu Dimeren gekoppelt werden.

Insbesondere mit Hilfe chemoenzymatischer Verfahren ist es möglich, in hoher Ausbeute eine Vielzahl von monomeren und dimeren amphiphilen Strukturen mit unterschiedlicher Länge der Fettsäureseitenketten und Brückenglieder zu synthetisieren bzw. die Verknüpfung an verschiedenen Hydroxylgruppen der Zuckerkomponenten vorzunehmen.

An Ausführungsbeispielen wird die Erfindung näher erläutert, ohne dass sie darauf beschränkt werden soll.
Beipiel 1
Virusinaktivierung mit Hilfe Aminosäure-haltiger Amphiphile bei Raumtemperatur zwischen 18 und 25 °C
Folgende Aminosäure-haltigen Amphiphile wurden analog zu Valivety, R. et al., 1997; Valivety, R. et al., 1998 und Vulfson, E.N. et al., 1998 hergestellt.
Monomere Amphiphile:
Dodecylester von Glycin, L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Tryptophan sowie N-Lauroyl-L-phenylalanin, 3-O-Myristoyl-L-serin, 1-O-Glycyl-3-O-myristoylglycerol, 1-O-L-Phenylalanyl-3-O-myristoylglycerol, 1-O-L-Tyrosyl-3-O-myristoylglycerol,
Bola-Amphiphile:
Decandiyl-1,10-bis-(L-phenylalanin),
Gemini-Amphiphile:
Decandiyl-1,10-bis-(3-O-myristoyl-L-serin), Decandiamid-1,10-bis-(N-myristoyl-L-glutaminsäure-γ-ethylester)
Tabelle 1 zeigt die viruszerstörende Wirkung auf das Vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) und das Semliki Forest Virus (SFV) als Modellviren sowie Ergebnisse über Zytotoxizität auf die Zelllinien BHK21, Hep2, RD von folgenden Verbindungen:
Dodecylester von L-Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan 1-O-L-Phenylalanyl-3-O-myristoylglycerol 1-O-L-Tyrosyl-3-O-myristoylglycerol.
Die lyophilisierten amphiphilen Substanzen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und Vorratslösungen in Konzentrationen zwischen 1 und 10 mM hergestellt. Zur Ermittlung der viruszerstörenden Wirkung der synthetisch hergestellten Verbindungen wurde die Virusinaktivierung in virushaltigem Kulturmedium ohne Zusatz von hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FKS) (GIBCO) durch Bestimmung des infektiösen Virustiters durchgeführt. Hierzu wurden 1 ml Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) (ICN) mit 100 bzw. 10 μl einer Virusstammlösung versetzt. Durch Zugabe eines Amphiphilen in variabler Endkonzentration wurde die Inaktivierung gestartet. Der Versuchsansatz wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann pro Ansatz ein Aliquot entnommen, sofort 1:3, 1:5 bzw. 1:10 mit Kulturmedium weiterverdünnt und der Virustiter bestimmt. Die während der Inaktivierung entnommenen Aliquots wurden je nach dem erwarteten Virustiter seriell entweder 1:10, 1:5 oder 1:3 mit serumhaltigem DMEM weiterverdünnt.
In Zellkulturen wurde die Vermehrungsfähigkeit und damit der Inaktivierungsgrad gemessen. Die Kavitäten einer 96-Loch-Flachbodenmikrotiterplatte wurden mit je 100 μl der jeweiligen Wirtszellsuspension mit 5 × 10⁴ bis 5 × 10⁵ Zellen/ml beschickt. Danach wurden von jeder Virus-Verdünnungsstufe 100 μl in je acht Kavitäten gefüllt. Die Platten wurden 2–4 Tage bei 37°C im CO₂-begasten Brutschrank inkubiert. Nach dieser Zeit waren die Zellen in den Kontrollansätzen ohne Virus dicht gewachsen. Die Auswertung der Platten erfolgte nach Fixierung mit 4% Formaldehyd und Anfärbung mit Giemsa-Lösung lichtmikroskopisch, wobei jede Kultur mit einem Anzeichen eines zytopathischen Effekts als positiv gewertet wurde. Die Berechnung des Virustiters als TCID₅₀ wurde nach der Vorschrift von Spearman und Kärber durchgeführt und auf 1 ml des Versuchsansatzes bezogen.
Tab. 1
Virussuspensionen wurden über 60 min bei Raumtemperatur mit den angegebenenen Substanzen bei einer Konzentration von 50 μM behandelt und anschließend wie beschrieben zur Titerbestimmung eingesetzt. Die Zytotoxizität der Substanzen wurde bestimmt, indem die Kulturen über mehrere Tage in Gegenwart der Substanzen wachsen gelassen wurden (Konzentration 50 μM).
Zytotoxizität über mehrere Tage:
+: zytotoxisch (Absterben der Zellen), (+): geringe Zytotoxizität (eingeschränktes Wachstum der Zellen), -:kein Einfluss, n.b.: nicht bestimmt
In 1 ist die Inaktivierung von VSV und SFV als Funktion der Konzentration dargestellt. Tabelle 1 sowie die Abbildungen belegen, dass sich die Aminosäure-haltigen synthetischen Amphiphilen hervorragend für die Inaktivierung von Lipid-umhüllten Viren eignen.
Aus den Abbildungen ist ersichtlich, dass in Gegenwart entsprechender Fettsäureester bereits im Mikromolarbereich Inaktivierungseffekte von bis zu 7 Log-Stufen erzielt werden können. Ein wichtiger Faktor für die viruszerstörende Wirkung dieser Verbindungen ist offensichtlich ihre Hydrophobizität, wobei Aminosäure- und Fettsäureanteil gleichermaßen von Bedeutung sind. Die Zunahme der Virusinaktivierung mit steigender Hydrophobizität wird durch den Vergleich der viruszerstörenden Effekte der Verbindungen 1–3 besonders deutlich. So nimmt der viruszerstörende Effekt mit steigender Hydrophobizität von Phe über Tyr bis Trp um mehrere Größenordnungen zu.
Beispiel 2
Virusinaktivierung mit Hilfe Zucker-haltiger Amphiphile bei Raumtemperatur
Folgende Zucker-haltigen Amphiphile wurden analog zu Fregapane, G. et al., 1994 und Gao, C. et al., 1999 hergestellt.
Monomere Amphiphile:
Dodecylester von Glucose und Lactose
Dimere Amphiphile (Gemini) von Glucose, Lactose
Tabelle 2 zeigt Inaktivierungseffekte einiger Zuckerhaltiger Amphiphile (Glycolipide) auf VSV und SFV sowie ihre Zytotoxität auf die Zelllinie BHK21.
Tab. 2
Inkubation über 60 Minuten bei Raumtemperatur, < NWG = unter der Nachweisgrenze. Diese lag bei 0,0003 %-Restinfektiösität); n.b. = nicht bestimmt; +: zytotoxisch (Absterben der Zellen), (+): geringe Zytotoxizität (eingeschränktes Wachstum der Zellen), -: kein Einfluss
Die Wirkstoffe wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und Vorratslösungen in Konzentrationen zwischen 1–10 mM hergestellt. Die Virusinaktivierungsexperimente wurden analog Beispiel 1 durchgeführt. In der Tabelle 2 ist die viruszerstörende Wirkung der getesteten Zucker-haltigen Amphiphile auf SFV und VSV bei Konzentrationen in den Inaktivierungsansätzen von 50 und 500 μM dargestellt. Die Inkubationsdauer betrug 60 min bei Raumtemperatur. Die Inaktivierungseffekte sind in %-Restinfektiösität angegeben. In 2a ist die Inaktivierung von SFV als Funktion der Konzentration für die obigen Glycolipide 2 und 3 dargestellt in 2b von VSV als Funktion der Konzentration für das Glycolipid 3. Für die Wirkstoffe wurde bei 500 μM eine Restinfektiösität von mindestens 0.001% erreicht, entsprechend einer Virusinaktivierung um ca. 5 Log-Stufen.
Beispiel 3
Untersuchung der Zytotoxizität von synthetischen Aminosäure- und Zucker-haltigen amphiphilen Substanzen auf die verwendeten Wirtszellen
Für diese Untersuchungen wurden 96-Loch-Platten pro Kavität mit je 100 μl der eingesetzten Zellsuspension (Hep 2, BHK 21, RD) beschickt. Nach kurzer Inkubation (2–3 h) bei 37°C zum Anwachsen der Zellen wurden je 8 Kavitäten pro Substanz mit der jeweiligen Lösung (100 μl) bestückt. Hierbei wurden verschiedene Konzentrationen bis zu 50 μM bzw. bis zu 500 μM getestet. Als Kontrollwerte wurden Zellen mit DMSO in verschiedener Verdünnung inkubiert, um eine Hemmung des Zellwachstums durch DMSO auszuschließen. Die Beurteilung des Zellwachstums erfolgte nach wenigen Tagen, wenn die Kontrollzellen dicht gewachsen waren. Es wurde visuell mit dem Lichtmikroskop beurteilt, ob die Zellen noch zur Proliferation fähig bzw. abgestorben waren. Zytotoxizitätsuntersuchungen wurden mit den synthetischen Amphiphilen durchgeführt. Die erhaltenen Resultate sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt.

Claims

Verwendung von synthetischen Amphiphilen der allgemeinen Formel I, (F¹)_l-(X¹)_m-(F²)_n-(x²)_o-(F³)_p (I)in der F¹, F³ unabhängig voneinander einen mittel- bis langkettigen linearen oder verzweigten hydrophoben Carbonsäurerest mit 8 bis 30 C-Atomen bedeuten, wobei die Kohlenstoffkette gesättigt oder ungesättigt ist, F² einen hydrophoben Diol-, Diamin- oder Dicarbonsäure-Linker mit 4 bis 20 C-Atomen darstellt, X¹, X² unabhängig voneinander je einen Aminosäurerest -HN-AS-CO- oder -OC-AS-NH- bedeuten und für den Fall, dass l oder p = 0 ist, den Aminosäurerest NH₂-AS-CO- oder HOOC-AS-NH- bedeuten oder unabhängig voneinander je eine Zucker- oder Disaccharideinheit darstellen sowie l, m, n, o, p unabhängig voneinander 0 oder 1 bedeuten. zur Inaktivierung von lipidumhüllten Viren in Blutprodukten, in rekombinant hergestellten Therapeutika und Diagnostika sowie in Zellkulturen.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reste F¹ und F³ Fettsäurereste mit 10 bis 20 Kohlenwasserstoffresten sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass der hydrophobe Linker F² einen Kohlenwaserstoffrest mit einer Kettenlänge von 6 bis 18 C-Atomen umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Aminosäurerest X¹ oder X² von Glycin, L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Tryptophan, L-Serin oder L-Glutaminsäure abgeleitet ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Zuckerrest X¹ oder X² ein Mono- oder Disaccharidrest ist, vorzugsweise abgeleitet von Glucose, Methyl-Glucose, Galactose, Lactose und Xylose.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Amphiphile monomere Verbindungen eingesetzt werden, wobei l, m und n = 0 sowie o und p = 1 sind oder n, o und p = 0 sowie 1 und m = 1 sind und F¹ oder F³ 10 bis 20 C-Atome aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen mit 10 bis 14 C-Atomen eingesetzt werden, vorzugsweise die Dodecylester.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Dodecylester von L-Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Dodecylester von Glucose und Lactose eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass 1-O-L-Phenylalanyl-3-O-myristoylglycerol und 1-O-L-Tyrosyl-3-O-myristoylglycerol eingesetzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Amphiphile Bola-Amphiphile eingesetzt werden, wobei l und p = 0 sind sowie m, n und o = 1.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Amphiphile dimere Verbindungen (Gemini-Amphiphile) eingesetzt werden, wobei l, m, n, o und p = 1 sind.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass C12-Glc-C6-Glc-C12 und C12-Lac-C10-Lac-C12 eingesetzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Blutprodukte Blut und aus Blut isolierte Produkte eingesetzt werden, vorzugsweise Plasmaderivate.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als rekombinant hergestellte Therapeutika und Diagnostika Humanproteine oder Gerinnungsfaktoren eingesetzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Amphiphile der allgemeinen Formel 1, zur Inaktivierung von lipidumhüllten humanen, animalen oder pflanzlichen Viren eingesetzt werden.
Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur Inaktivierung von Herpes-Viren, vorzugsweise von HSV-1, HSV-2, BHV-1 und SHV-1; von Retroviren (Immundefizienz-Viren), vorzugsweise HIV-1, HIV-2 und SIV sowie zur Inaktivierung vom vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) und des Semliki Forest-Virus (SFV) eingesetzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zur Inaktivierung der lipidumhüllten Viren den Blutprodukten, Therapeutika, Diagnostika und Zellkulturen mindestens ein Amphiphil der allgemeinen Formel I bei Temperaturen zwischen 15 und 65°C eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Einsatz bei Umgebungstemperatur zwischen 18 und 25°C erfolgt und die Einwirkungszeit maximal 2 Stunden beträgt.
Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Einsatz bei Temperaturen zwischen 30 bis 60°C erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass zur Inaktivierung der lipidumhüllten Viren den Blutprodukten, Therapeutika, Diagnostika und Zellkulturen mindestens eine amphiphile Substanz der allgemeinen Formel I in einer Konzentration von < 500 μM zugesetzt wird.