WO2005049098A1 - Verwendung von aminosäure- und zucker-amphiphilen zur inaktivierung von lipidumhüllten viren - Google Patents

Verwendung von aminosäure- und zucker-amphiphilen zur inaktivierung von lipidumhüllten viren Download PDF

Info

Publication number
WO2005049098A1
WO2005049098A1 PCT/EP2004/012696 EP2004012696W WO2005049098A1 WO 2005049098 A1 WO2005049098 A1 WO 2005049098A1 EP 2004012696 W EP2004012696 W EP 2004012696W WO 2005049098 A1 WO2005049098 A1 WO 2005049098A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
use according
amphiphiles
viruses
virus
sugar
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/012696
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Georg Pauli
Joachim Vater
Maren Kracht
E. N. Vulfson
Original Assignee
Brd, Vertreten Durch Das Bundesministerium Für Gesundheit Und Soziale Sicherung, Letztvertreten Durch Den Präsidenten Des Robert-Koch-Institutes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Brd, Vertreten Durch Das Bundesministerium Für Gesundheit Und Soziale Sicherung, Letztvertreten Durch Den Präsidenten Des Robert-Koch-Institutes filed Critical Brd, Vertreten Durch Das Bundesministerium Für Gesundheit Und Soziale Sicherung, Letztvertreten Durch Den Präsidenten Des Robert-Koch-Institutes
Publication of WO2005049098A1 publication Critical patent/WO2005049098A1/de

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0082—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using chemical substances

Definitions

  • the invention relates to the use of synthetic amino acid and sugar-containing amphiphiles for inactivating lipid-enveloped viruses in blood products, in recombinantly produced therapeutics and diagnostics and in cell cultures.
  • Cell cultures, blood products, as well as therapeutics and diagnostics, which contain recombinantly produced active ingredients from natural products, are important products that are used in medical diagnostics and for the treatment of humans. These include isolates from mammals, such as products isolated from blood. Recombinantly manufactured active ingredients are widely known and are becoming increasingly important in therapy, prophylaxis and diagnostics.
  • Sensitive and complex biological materials are often treated with antiviral substances.
  • An overview of modern virus inactivation and validation methods geoen H.-J. Henzler and K. Kaiser in Nature Biotechnology, 16, 1077-1079 (1998).
  • Promising new inactivation techniques are, for example, ultra-short-term high-temperature treatment and UV radiation methods, photocnemic methods and immunoaffinity chromatography of viruses.
  • EP 0 050 061 A2 has disclosed a process for reducing undesirable activities, such as pyrogenicity, hepatitis infectivity and aggregation in biological and pharmaceutical products, the products containing non-denaturing compounds, such as, for example, non-ionic substances (for example Tween 80) are treated.
  • non-denaturing compounds such as, for example, non-ionic substances (for example Tween 80)
  • the use of existing virus inactivating agents is at high risk.
  • none of the inactivation methods mentioned is able to safely inactivate or eliminate all viruses.
  • the object of the invention was to search for suitable substances for virus inactivation, which can be produced inexpensively and are simple to use, have low cytotoxicity and ensure a high rate of virus inactivation in the products.
  • amphiphiles containing amino acids and sugar are known per se. They can be obtained from relatively inexpensive raw materials with good yields and excellent purity on an industrial scale. In particular, they are monomeric and di (gemini) amphiphiles and bola amphiphiles.
  • the invention is therefore the use of synthetic amino acid and sugar-containing amphiphile of the formula I v for the inactivation of viruses in blood products lipidumhuUten, recombinantly produced in therapeutics and diagnostics, and in cell cultures.
  • blood products are understood to mean blood or plasma products isolated from blood.
  • Plasma products are isolated and purified protein fractions, such as coagulation factors (including factor VIII), immunoglobulins or serum albumin.
  • Therapeutics produced recombinantly are products which can be used for the purposes of the invention both for treatment and for prophylaxis.
  • Therapeutics include e.g. Human proteins, e.g. of hGH, TNF, t-PA, EPO, plasma proteins (e.g. albumin), transport proteins (e.g. hemoglobin preparations, cytochromes), alloantigens (e.g. Blu group antigens) or blood coagulation factors, e.g. Factor II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII.
  • Antibody-based therapeutics are also known. Diagnostics are e.g. Immunodiagnostics in the form of monoclonal and polyclonal antibodies.
  • the synthetic amphiphiles used according to the invention have the formula:
  • F 1 , F 3 independently of one another are medium- to long-chain linear or branched hydrophobic Carboxylic acid residue with 8 to 30 C- Mean atoms, and the carbon chain can be saturated or unsaturated
  • F 2 is a hydrophobic diol, diamine or dicarboxylic acid link (linker) with 4 to 20 C atoms
  • Amphiphiles are preferably used in which the radicals F 1 and F 3 represent fatty acid radicals which comprise 10 to 20 carbon atoms. Carboxylic acid residues with 10 to 14 carbon atoms are particularly preferred.
  • the hydrophobic connecting members F 2 preferably represent those diol, diamine or dicarboxylic acid residues which have a chain length of 6 to 18 carbon atoms.
  • Straight-chain compounds are particularly preferred, in which case F 2 is preferably a diol group with the structure -0-C 6 H 12 -O- to -0-C 18 H 36 -0-; a dicarboxylic acid group with the structure -OC-C 6 H 12 -CO- to -OC-C 18 H 36 -CO- or a diamine group with the structure -HN-C 6 H 12 -NH- to -HN-C 18 H 36 - NH- is.
  • Preferred amino acid residues for X 1 and X 2 are derived from glycine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-serine or L-glutamic acid.
  • Preferred sugar residues X 1 and X 2 are mono- or disaccharide residues, preferably glucose, methyl-glucose, galactose, lactose and xylose.
  • Bola amphiphiles contain 2 polar head groups, which are linked by a hydrophobic connecting piece, and Gemini amphiphiles consist of two monomers, which are coupled via a flexible link (linker or spacer).
  • Monomeric amphiphiles preferably used according to the invention are esters of amino acids with longer-chain alcohols, fatty acid amides or glycolipids.
  • Monomers used with particular preference are ester compounds with CIO to C20 chains, in particular with CIO to C14 radicals.
  • the dodecyl esters can be used with very particular preference.
  • the dodecyl esters of the amino acids L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan and the glycolipids (sugar compounds) the dodecyl esters of glucose and lactose have proven to be particularly suitable.
  • Further preferred monomeric compounds are l-O-L-phenylalanyl-3-O-myristoylglycerol and l-O-L-tyrosyl-3-O-myristoylglycerol.
  • the compounds C12-Glc-C6-Glc-C12 and C12-Lac-C10-Lac-C12 are particularly preferred.
  • the amphiphiles are used in cell cultures, therapeutics, diagnostics and blood products in concentrations ⁇ 500 ⁇ M, particularly preferably in concentrations of ⁇ 200 ⁇ M.
  • the compounds can also be used in small concentrations of ⁇ 50 ⁇ M or even ⁇ 20 ⁇ M; they have a virus-destroying effect in the products.
  • the amino acid and sugar-containing amphiphiles are used according to the invention for the inactivation of lipidumhuUten human, animal or plant viruses.
  • Retroviruses immunodeficiency viruses
  • HIV-1 and HIV-2 or the monkey immunodeficiency virus SIV
  • herpes viruses e.g. HSV-1, HSV-2, BHV-1 and SHV-1
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • SFV Semliki Forest virus
  • Viruses can be deactivated either directly or indirectly.
  • Indirect inactivation is carried out by substances which e.g. either inhibit virus growth or prevent the replication of a virus.
  • the use according to the invention for inactivating lipid-enveloped viruses is carried out directly by the synthetic amphiphiles described here, at least one amphiphile of the general formula I being added to the products (blood products, recombinantly produced therapeutics and diagnostics and cell cultures).
  • the exposure time depends on the temperature, which is preferably between 15 and 65 ° C. In one embodiment, the compounds are used at room temperature in the range from 18 to 25 ° C., the exposure time preferably being up to 2 hours. Working at room or ambient temperature has the great advantage that the products to be virus-inactivated are treated gently and no additional measures are required.
  • the virus inactivation can alternatively also be carried out at higher temperatures, preferably at 30 ° -60 ° C., the time of action of the amphiphiles on the products being shortened. It is usually around 0.5 to max. 2 hours.
  • the synthetic amino acid and sugar-containing amphiphiles used according to the invention surprisingly have an inactivation potential for lipid-enveloped viruses that is several orders of magnitude higher than conventional, frequently used compounds, such as e.g. Triton or Tween.
  • they are environmentally friendly and easily biodegradable. They are a new class of active ingredients for inactivating lipid virus viruses, such as Herpes and retro viruses to look at. Their virus inactivation is based on the membrane-disintegrating properties of these substances. They are therefore ideal for gentle virus inactivation in sensitive products.
  • the synthetic amphiphiles used are characterized by only a low cytotoxic effect with simultaneous high virus inactivation. In the preferred application in concentrations ⁇ 50 ⁇ M, there is practically no cytotoxicity or it is only slight. No cytotoxicity is observed at concentrations ⁇ 20 ⁇ M. This property is of particular advantage for the development of virus inactivation methods that are as gentle as possible. It is therefore e.g. possible to leave these active substances in concentrations in the products.
  • Particularly high virus-destroying effects are achieved with the monomeric amphiphilic compounds.
  • Particularly suitable for virus inactivation are esters of amino acids with long-chain alcohols or fatty acid amides which are acylated on the NH 2 group.
  • Studies of structure-activity relationships showed that virtually all structural elements of the compounds, ie the polar building blocks as well as the hydrophobic hydrocarbons, are used for virus inactivation.
  • Fabric side chains and connecting links (spacers) between the polar head groups are important.
  • a compound with glucose as a polar structural component shows a higher virus-destroying activity than a compound with the disaccharide lactose as a polar structural component.
  • the inactivation of viruses by a lactose-containing compound is significantly higher than in the case of xylose as a sugar component.
  • Virus inactivation obviously decreases with increasing chain length, ie a Cl2 compound has a higher inactivating effect against viruses than the corresponding C16 or Cl8 compound.
  • amphiphiles with optimal virus-destroying activity and at the same time the lowest possible cytotoxicity by targeted variation of the structural components.
  • the synthetic amphiphiles used in accordance with the invention can easily be prepared by processes already described and known to the person skilled in the art. Both amino acid and sugar-containing amphiphiles are synthesized using chemical, enzymatic and chemoenzymatic processes. The latter use immobilized enzymes. Various lipases which are stereoselective biocatalysts are preferred. Immobilized lipases from Rhizomucor miehei and Candida antarctzica are particularly suitable for this.
  • N-carbobenzyloxy (Cbz) amino acids such as the N-Cbz derivatives of glycine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-serine, L-glutamic acid or L-Aspartic acid produced the corresponding dodecyl esters with dodecanol in 24 h in an almost quantitative conversion.
  • the enzymatic reactions are carried out, for example, in open reaction vessels at approx. 60 ° C. in order to shift the equilibrium in the direction of the ester formation.
  • the monomeric amphiphiles are usually isolated by chromatography on aluminum oxide columns and freed from the protective groups by catalytic hydrogenation.
  • amino acid-containing bola and gemini amphiphiles are produced.
  • the use of long-chain ⁇ , ⁇ -diol and diamine compounds leads to the formation of alkanediyl- ⁇ , ⁇ -bis (N-protected amino acid) derivatives.
  • alkanediyl- ⁇ , ⁇ -bis (N-protected amino acid) derivatives For example, ⁇ , ⁇ -diesters and diamides of glycine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-serine or L-glutamic acid or L-lysine and other amino acids are produced with good yields. Removal of the protective groups provides the bola compound, which is converted into corresponding gemini amphiphiles by further modification are, such as by acylation with myristoyl chloride and others.
  • sugar-containing amphiphiles are also known from the literature (Fregapane, G. et al. (1994), Biocatalysis 11, 9-18; Gao, C. et al. (1999), Enzyme Microb. Technol. 25, 264-270 ; Gao, C. et al. (1999), J. Surf. Deterg. 2, 293-302).
  • mono- and disaccharides are regioselectively acylated with the help of lipases (eg immobilized lipases from Rhxzomucor miehei and Candida antarctica).
  • lipases eg immobilized lipases from Rhxzomucor miehei and Candida antarctica.
  • the products formed are then coupled using conventional chemical methods, giving dimer (gemini) amphiphiles in good yield.
  • the sugar substrates are directly esterified in suitable organic solvents.
  • the acylations are preferably based on the use of isopropylidene derivatives of mono- and disaccharides, with which high yields are achieved and which have the advantage that individual OH groups are available for further chemical modification in this way.
  • the lipases are preferably used for the regioselective introduction of fatty acid chains into partially protected isopropylidene-sugar derivatives and the modification of ⁇ , ⁇ -alkane-bis-glucosides. All further process steps take place according to methods known per se.
  • the enzymatic esterification of, for example, 1,2-isopropylidene-xylose and lactose-tetraacetal specifically led to the formation of 5- and 6 ⁇ - monomers, which via the 3- or. 2 ⁇ -OH group with Eecan- or Hexandioyldichlorid to be coupled to dimers.
  • chemoenzymatic processes it is possible to synthesize in high yield a large number of monomeric and dimeric amphiphilic structures with different lengths of the fatty acid side chains and bridging links or to link them to different hydroxyl groups of the sugar components.
  • Table 1 shows the virus-destroying effect on the Vesicular Stomatitis Virus (VSV) and the Semliki Forest Virus (SFV) as model viruses as well as results on Cytotoxicity on the BHK21, Hep2, RD cell lines of the following compounds:
  • Dodecyl ester of L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan l -O-L-Phenylala.nyl - 3 -O-myristoylglycerol l-O-L-tyrosyl-3 -O-myristoylglycerol.
  • the lyophilized amphiphilic substances were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and stock solutions were prepared in concentrations between 1 and 10 mM.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the virus inactivation in virus-containing culture medium was carried out without the addition of heat-inactivated fetal calf serum (FCS) (GIBCO) by determining the infectious virus titer.
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • ICN Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • test batch was incubated for 60 minutes at room temperature and then an aliquot was taken from each batch, immediately further diluted 1: 3, 1: 5 or 1:10 with culture medium and the virus titer was determined. The aliquots taken during the inactivation were serially diluted either 1:10, 1: 5 or 1: 3 with DMEM containing serum, depending on the expected virus titer.
  • the reproductive capacity and thus the degree of inactivation were measured in cell cultures.
  • the wells of a 96-well flat-bottom microtiter plate were each loaded with 100 ⁇ l of the respective host cell suspension with 5 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 5 cells / ml. Then 100 ⁇ l of each virus dilution stage were filled into eight wells.
  • the plates were incubated for 2-4 days at 37 ° C in a C0 2 incubator -begasten. After this time, the cells in the control batches had grown densely without a virus.
  • the plates were evaluated after fixation with 4% formaldehyde and staining with Giemsa solution under light microscopy, whereby each culture with a sign of a cytopathic effect was assessed as positive.
  • the virus titer was calculated as TCID S0 in accordance with the " specification by Spearman and Kärber and related to 1 ml of the test batch.
  • Virus suspensions were treated with the specified substances at a concentration of 50 ⁇ M for 60 min at room temperature and then used as described for the titer determination.
  • the cytotoxicity of the substances was determined by growing the cultures for several days in the presence of the substances (concentration 50 ⁇ M). Cytotoxicity over several days: +: cytotoxic (cell death), (+): low cytotoxicity (restricted cell growth), -: no influence, n.b .: not determined
  • Fig. 1 shows the inactivation of VSV and SFV as a function of concentration.
  • Table 1 and the figures show that the synthetic amphiphiles containing amino acids are ideal for the inactivation of lipid-enveloped viruses.
  • the figures show that in the presence of appropriate fatty acid esters, inactivation effects of up to 7 log levels can be achieved in the micromolar range.
  • An important factor for the virus-destroying action of these compounds is obviously their hydrophobicity, whereby amino acid and fatty acid contents are equally important.
  • the increase in virus inactivation with increasing hydrophobicity is particularly evident when comparing the virus-destroying effects of compounds 1-3.
  • the virus-destroying effect increases by several orders of magnitude with increasing hydrophobicity from Phe to Tyr to Trp.
  • Table 2 shows the inactivation effects of some sugar-containing amphiphiles (glycolipids) on VSV and SFV and their cytotoxicity on the BHK21 cell line.
  • the active ingredients were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and stock solutions were prepared in concentrations between 1-10 mM.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Table 2 shows the virus-destroying effect of the tested sugar-containing amphiphiles on SFV and VSV at concentrations in the inactivation batches of 50 and 500 ⁇ M. The incubation period was 60 min at room temperature. The inactivation effects are given in% residual infectiousness.
  • Fig. 2a the inactivation of SFV as a function of the concentration for the above glycolipids 2 and 3 is shown in Fig. 2b of VSV as a function of the concentration for the glycolipid 3.
  • a residual infectivity of at least 0.001% was achieved at 500 ⁇ M , corresponding to a virus inactivation by approx. 5 log levels.
  • Example 3 Investigation of the cytotoxicity of synthetic amino acid and sugar-containing amphiphilic substances on the host cells used For these investigations, 96-well plates per cavity were loaded with 100 ⁇ l of the cell suspension used (Hep 2, BHK 21, RD). After a short incubation (2-3 h) at 37 ° C to grow the cells, 8 wells per substance were filled with the respective solution (100 ⁇ l). Various concentrations up to 50 ⁇ M and up to 500 ⁇ M were tested. As control values, cells were incubated with DMSO in various dilutions in order to rule out an inhibition of cell growth by DMSO. The cell growth was assessed after a few days when the control cells had grown densely. It was assessed visually with the light microscope whether the cells were still capable of proliferation or whether they had died. Cytotoxicity studies were carried out on the synthetic amphiphiles. The results obtained are shown in Tables 1 and 2.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von synthetischen Aminosäure- und Zucker-haltigen Amphiphilen zur Inaktivierung von lipidumhüllten Viren in Blutprodukten, in rekombinant hergestellten Therapeutika und Diagnostika sowie in Zellkulturen. Erfindungsgemäße Anwendung finden sowohl die Monoester und -amide als auch die komplexeren Bola-und Gemini Amphiphile. Bola-Amphiphile enthalten 2 polare Kopfgruppen, die durch ein hydrophobes Verbindungsstück miteinander verknüpft sind und Gemini-Amphiphile bestehen aus zwei Molekülen monomerer Amphiphile, die über ein flexibles Bindeglied gekoppelt sind.

Description

Verwendung von Aminosäure- und Zucker-Amp iphilen zur Inaktivierung von lipidumhuUten Viren
Die Erfindung betrifft die Verwendung von synthetischen Aminosäure- und Zucker-haltigen Amphiphilen zur Inaktivierung von lipidumhuUten Viren in Blutprodukten, in rekombinant hergestellten Therapeutika und Diagnostika sowie in Zellkulturen.
Zellkulturen, Blutprodukte sowie Therapeutika und Diagnostika, welche rekombinant hergestellte Wirkstoffe natürlicher Produkte aufweisen, sind wichtige Erzeugnisse, die in der medizinischen Diagnostik und zur Behandlung des Menschen eingesetzt werden. Dazu gehören Isolate aus Säugern, wie z.B. aus Blut isolierte Produkte. Rekombinant hergestellte Wirkstoffe sind zahlreich bekannt und gewinnen in der Therapie, Prophylaxe und Diagnostik zunehmend an Bedeutung .
Diese Produkte (z.B. Impfstoffe, monoklonale Antikörper, Hormone und reko binante Proteine) müssen frei von jeglicher viraler und mikrobieller Kontamination sein. Es sei in diesem Zusammenhang auf einige Skandale verwiesen, die in verschiedenen europäischen Ländern aufgetreten sind, wobei durch HIV-Kontaminationen oder Hepatitis C-Viren in Blutprodukten zahlreiche Infektionen hervorgerufen wurden. Einer ständigen intensiven Kontrolle auf Viruskontaminationen der Produkte ist demzufolge oberste Priorität einzuräumen. Es sind in den letzten 10-15 Jahren zahlreiche Techniken zur Virusinaktivierung entwickelt wordeii, die jedoch nicht ausreichen, um sämtliche Restrisiken einer Virusübertragung durch entsprechende Produkte auszuschließen. Zur Virusinaktivierung werden bei strukturell einfachen und stabilen Produkten häufig chromatographische Methoden, pH- Änderung, Extraktion und Fraktionierung mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln, Salzpräzipitation, Hitzebehandlung und Filtrationstechniken angewandt . Empfindliche und komplexe biologische Materialien werden dagegen häufig mit antivirral wirkenden Substanzen behandelt . Eine Übersicht über moderne Virusinaktivierungs- und Validisierungsmetho- den geoen H.-J. Henzler und K. Kaiser in Nature Biotechno- logy, 16, 1077-1079 (1998) . Vielversprechende neue Inaktivierungstechniken sind z.B. Ultrakurzzeit- Hochtemperaturbehandlung und UV-Bestrahlungsverfahren, photocnemische Methoden sowie Immun- AffinitatsChromatographie von Viren.
Virale Inaktivierungsverfahren für Blutprodukte, vorzugsweise von humanem Blutplasma, sind auch in der Patent!.iteratur beschrieben. So ist in US-A 4,591,505 ein Verfahren zur Inaktivierung von Hepatitis B-Viren dargestellt, bei dem den Blutprodukten Alkohol und ein nichtionisches Detergenz und/oder Ether zugesetzt wird, wobei als nichtionische Detergentien Polyoxyethylenderivate oder Siαlfobetaine verwendet werden. US-A 4,841,023 und US-A 4, 613, SOI ist die Inaktivierung lipidumhüllter Viren in Blutprodukten durch Fettsäuren bzw. durch Alkyl-Oleinsäure zu entnehmen. Desweiteren ist aus EP 0 050 061 A2 ein Verfahrren zur Verminderung unerwünschter Aktivitäten, wie Pyrogenität, Hepatitis-Infektiösität und Aggregation in biologischen und pharmazeutischen Produkten bekannt, wobei die Produkte mit nicht-denaturierenden Verbindungen, wie z.B. n±cht-ionischen Substanzen (z.B. Tween 80) behandelt werden. ' Aufgrund hoher Toxizitäten in Zellkulturen, die insbesondere die eingesetzten Lösungsmittel und synthetischen Verbindungen kennzeichnen, ist jedoch der Einsatz vorhandener Virusinaktivierungsmittel mit einem hohen Risiko behaftet. Keines der genannten Inaktivierungs- ve ahren ist zudem in der Lage, mit Sicherheit alle Viren zu inaktivieren bzw. zu eliminieren.
Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, geeignete Substanzen für die Virusinaktivierung zu suchen, die kostengünstig herstellbar und einfach anwendbar sind, geringe Zytotoxizität aufweisen und eine hohe Rate der Virusinaktivierung in den Produkten gewährleisten.
Überraschend wurde gefunden, dass an sich bekannte, leicht zugängliche synthetische Aminosäure-haltige und Zuckerhaltige Amphiphile ein hohes Virusinaktivierungspotential besitzen und sich nur durch eine geringe Zytotoxizität auszeichnen. Die Aufgabe der Erfindung konnte durch den Einsatz solcher Substanzen gelöst werden.
Diese synthetischen Aminosäure- und Zucker-haltigen Amphiphile sind an sich bekannt . Sie können aus relativ kostengünstigen Ausgangsstoffen mit guten Ausbeuten und in exzellenter Reinheit in industriellem Maßstab gewonnen werden. Insbesondere handelt es sich um monomere und di ere (Gemini) Amphiphile sowie Bola-Amphiphile .
Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Verwendung von synthetischen Aminosäure- und Zucker-haltigen Amphiphilen der allgemeinen Formel I zur Inaktivierung von lipidumhuUten Viren in Blutprodukten, in rekombinant hergestellten Therapeutika v und Diagnostika sowie in Zellkulturen. Unter Blutprodukten werden gemäß vorliegender Erfindung Blut oder aus Blut isolierte Plasmaprodukte verstanden. PlasmaprocTukte sind isolierte und gereinigte Proteinfraktionen, wie z.B. Gerinnungsfaktoren (u.a. Faktor VIII) , Immunglobuline oder Serumalbumin.
Rekombinant hergestellte Therapeutika sind Erzeugnisse, die im Sinne der Erfindung sowohl zur Behandlung als auch zur Prophylaxe angewendet werden können. Zu den Therapeutika gehören z.B. Humanproteine, wie z.B. von hGH, TNF, t-PA, EPO, Plasmaproteine (z.B. Albumin), Transportproteine, (z.B. Hämoglobin-Präparate, Zytochrome) , Alloantigene, (z.B. Blu gruppenantigene) oder Blutgerinnungsfaktoren, wie z.B. Faktor II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII. Auch Antikörper-basierte Therapeutika sind bekannt. Diagnostika sind z.B. Immundiagnostika in Form von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern.
Zellkulturen bzw. Zelllinien tierischen und menschlichen Ursprungs werden zur Herstellung dieser rekombinanten Erzeugnisse häufig eingesetzt . Da auch in solchen Zellen häufig Infektionen durch endogene Viren sowie latente Virusinfektionen nicht vollständig ausgeschlossen werden können, ist ein Virusinaktivierungsschritt im Produkt unerlässlich.
Die erfindungsgemäß eingesetzten synthetischen Amphiphile besitzen die Formel:
(F1) 1 - (X1)m -(F2)n - (X2)0 - (F3)p (I) wobei 1 F1, F3 unabhängig voneinander einen ittel- bis langkettigen linearen oder verzweigten hydrophoben Carbonsäurerest mit 8 bis 30 C- Atomen bedeuten, und die Kohlenstoffkette gesättigt oder ungesättigt sein kann, F2 ein hydrophobes Diol-, Diamin- oder Dicarbonsäure-Bindeglied (Linker) mit 4 bis 20 C-Atomen darstellt, X1, X2 unabhängig voneinander je einen Aminosäurerest -HN-AS-CO- oder -OC-AS-NH- bedeuten und wenn 1 und/oder p =0 ist, den Aminosäurerest NH2-AS-CO- oder HOOC-AS-NH- bedeuten oder unabhängig voneinander je eine Zucker- oder Disaccharideinheit darstellen sowie l , m, τι , o,p unabhängig voneinander 0 oder 1 bedeuten, wobei 0 + p = 1 und l,m,n = 0, 1 + m = 1 und n, o,p = 0 , 1 + p = 0 und m,n,o = 1 oder l,m,n,o + p = 1 sein können.
Bevorzugt werden Amphiphile eingesetzt, in denen die Reste F1 und F3 Fettsäurereste darstellen, die 10 bis 20 Kohlenstoffatome umfassen. Besonders bevorzugt sind Carbonsäuxereste mit 10 bis 14 C-Atomen.
Die hydrophoben Verbindungsglieder F2 stellen vorzugsweise solche Diol-, Diamin- oder Dicarbonsäurereste dar, die eine Kettenlänge von 6 bis 18 Kohlenstoffatomen umfasssen. Besonders bevorzugt sind geradkettige Verbindungen, wobei F2 dann bevorzugt eine Diolgruppe mit der Struktur -0-C6H12~ O- bis -0-C18H36-0- ; eine Dicarbonsäuregruppe mit der Struktur -OC-C6H12-CO- bis -OC-C18H36-CO- oder eine Diamingruppe mit der Struktur -HN-C6H12-NH- bis -HN-C18H36- NH- ist. Bevorzugte Aminosäurereste für X1 und X2 leiten sich von Glycin, L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Tryptophan, L-Serin oder L-Glutaminsäure ab. Bevorzugte Zuckerreste X1 und X2 sind Mono- oder Disaccharidreste, vorzugsweise Glucose, Methyl-Glucose, Galactose, Lactose und Xylose .
Erfindungsgemäße Anwendung finden sowohl die Monoester und -amide als auch die komplexeren Bola-und Gemini Amphiphile. Bola-Amphiphile enthalten 2 polare Kopfgruppen, die durch ein hydrophobes Verbindungsstück miteinander verknüpft sind und Gemini-Amphiphile bestehen aus zwei Monomeren, die über ein flexibles Bindeglied (Linker bzw. Spacer) gekoppelt sind.
Werden monomere Verbindungen eingesetzt, so handelt es sich um Verbindungen, in denen in der allgemeinen Formel I I, m und n = 0 sind sowie o und p = 1 bedeuten oder in denen n, o und p = 0 sind sowie 1 und m = 1 bedeuten.
Erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte monomere Amphiphile sind Ester von Aminosäuren mit längerkettigen Alkoholen, Fettsäureamide oder Glycolipide. Besonders bevorzugt verwendete Monomere sind Esterverbindungen mit CIO- bis C20-Ketten, insbesondere mit CIO- bis C14-Resten. Ganz besonders bevorzugt sind die Dodecylester einsetzbar. Als besonders geeignet haben sich die Dodecylester von den Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Tryptophan erwiesen und von den Glykolipiden (Zuckerverbindungen) die Dodecylester von Glucose und Lactose . Weiter bevorzugte monomere Verbindungen sind l-O-L-Phenylalanyl-3-O- myristoylglycerol und l-O-L-Tyrosyl-3-O-myristoylglycerol .
Bola-Ämptilphlle gemäß der allgemeinen Formel I sind Verbindungen, in denen 1 und p = 0 sind und m, n und o = 1 bedeuten. Dimere Verbindungen (Gemini) sind Verbindungen der allgemeinen Formel I in denen 1, m, n, o und p = 1 ist. Besonders bevorzugt sind im Sinne der Erfindung die Verbindungen C12-Glc-C6-Glc-C12 und C12-Lac-C10-Lac-C12.
Erfindungsgemäß kommen die Amphiphile in den Zellkulturen, Therapeutika, Diagnostika und Blutprodukten in Konzentrationen <^ 500 μM zur Anwendung, besonders bevorzugt in Konzentrationen von < 200 μM. Darüber hinaus sind die Verbindungen auch in kleinen Konzentrationen von < 50 μM oder sogar < 20 μM einsetzbar; sie wirken in den Produkten viruszerstörend .
Die Aminosäure- und Zucker-haltigen Amphiphile werden gemäß der Erfindung zur Inaktivierung von lipidumhuUten humanen, animalen oder pflanzlichen Viren eingesetzt. Vorzugsweise werden Retroviren (Immundefizienz-Viren) , wie z.B. die Humanen Immunoclefizienz Viren HIV-1 und HIV-2, oder das Affen Immunodefizienz Virus SIV, Herpes-Viren, z.B. HSV-1, HSV-2, BHV-1 und SHV-1; sowie das vesikuläre Stomatitis- Virus (VSV) und das Semliki Forest-Virus (SFV) inaktiviert.
Die Inaktivierung von Viren kann entweder direkt oder indirekt erfolgen. Von direkter Inaktivierung spricht man, wenn das Virus abgetötet wird, wie z.B. bei umhüllten Viren durch Desintegration ihrer Lipoproteinhüllmembran. Die indirekte Inaktivierung erfolgt durch Substanzen, welche z.B. entweder das Viruswachstum hemmen oder die Vervielfältigung eines Virus verhindern.
Die erfindungsgemäße Verwendung zur Inaktivierung von lipidumhuUten Viren erfolgt durch die hier beschriebenen synthetischen Amphiphile direkt, wobei mindestens ein Amphiphil der allgemeinen Formel I den Produkten (Blutprodukten, rekombinant hergestellten Therapeutika und Diagnostika sowie Zellkulturen) zugesetzt wird. Die Einwirkungszeit richtet sich nach der Temperatur, die bevorzugt zwischen 15 bis 65 °C liegt. In einer Ausführungsvariante erfolgt der Einsatz der Verbindungen bei Raumtemperatur im Bereich von 18 bis 25 °C, wobei die Einwirkungszeit vorzugsweise bis zu 2 Stunden beträgt. Das Arbeiten bei Raum- bzw. Umgebungstemperatur hat den großen Vorteil, dass die zu virus-inaktivierenden Produkte schonend behandelt werden und keine zusätzlichen Maßnahmen erforderlich sind.
Da die erfindungsgemäß eingesetzten synthetischen Amphiphile thermisch stabil sind, kann die Viren- Inaktivierung je nach der thermischen Stabilität der zu behandelnden Produkte alternativ auch bei höheren Temperaturen durchgeführt werden, vorzugsweise bei 30 60°C, wobei sich die Einwirkungszeit der Amphiphile auf die Produkte verkürzt. Sie liegt in der Regel bei ca. 0,5 bis max. 2 Stunden.
Neben dem Vorteil einer wesentlich geringeren in vivo- Toxizität, besitzen die erfindungsgemäß eingesetzten synthetischen Aminosäure- und Zucker-haltigen Amphiphile überraschenderweise ein um mehrere Größenordnungen höheres Inaktivierungspotential für lipidumhüllte Viren als herkömmliche, häufig verwendete Verbindungen, wie z.B. Triton oder Tween. Darüber hinaus sind sie umweltfreundlich und leicht biologisch abbaubar. Sie sind als eine neue Klasse von Wirkstoffen zur Inaktivierung von lipidumhuUten Viren, wie z.B. Herpes- und Retroviren, anzusehen. Ihre Virusinaktivierung beruht auf den Membran-desintegrierenden Eigenschaften dieser Substanzen. Sie eignen sich daher hervorragend für die schonende Virusinaktivierung in empfindlichen Produkten.
Sie bewirken eine nahezu vollständige Inaktivierung der Viren. So steht z.B. in den Richtlinien der Europäischen Agentur für die Beurteilung von Arzneimitteln (EMEA - CPMP/BWP/268/95) , dass eine klare Virus-Inaktivierung vorliegt, wenn die Restinfektiosität um 4log10-Stufen durch das eingesetzte Verfahren absinkt. Zur Beurteilung der Effektivität muss auch noch die Inaktivierungskinetik beachtet werden. Diese ist abhängig von der Konzentration des eingesetzten Inaktivierungsmittels, von der Inkubationstemperatur und der Zeit der Behandlung. In den Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine schnelle Inaktivierung durch die eingesetzten Substanzen erfolgt.
Die verwendeten synthetischen Amphiphile (sowohl Aminosäure-haltige als auch Zucker-haltige Amphiphile) zeichnen sich bei gleichzeitiger hoher Virusinaktivierung durch eine nur geringe zytotoxische Wirkung aus. Bei der bevorzugten Anwendung in Konzentrationen < 50 μM liegt praktisch keine Zytotoxizität vor oder sie ist nur gering. Bei Konzentrationen < 20 μM beobachtet man keine Zytotoxizität. Diese Eigenschaft ist von besonderem Vorteil für die Entwicklung möglichst schonender Virusinaktivierungsverfahren. Es ist daher z.B. möglich, diese Wirkstoffe in Konzentrationen in den Produkten zu belassen.
Besonders hohe viruszerstörende Wirkungen werden mit den monomeren amphiphilen Verbindungen erzielt. Insbesondere eignen sich für die Virusinaktivierung Ester von Aminosäuren mit lan kettigen Alkoholen bzw. Fettsäureamide, die an der NH2-Gruppe acyliert sind.
Bevorzugt sind Verbindungen, die eine hohe Hydrophobizität aufweisen, wobei mit steigender Hydrophobizität eine starke Zunahme der Virusinaktivierung zu verzeichnen ist. Untersuchungen von Struktur-Wirkungs-Beziehungen ergaben, dass für die Virusinaktivierung praktisch alle Strukturelemente der Verbindungen, d.h. die polaren Bausteine gleichermaßen wie die hydrophoben Kohlenwasser- Stoffseitenketten und Verbindungsglieder (Spacer) zwischen den polaren Kopfgruppen, von Bedeutung sind. So zeigt z.B. eine Verbindung mit Glucose als polarem Strukturanteil eine höhere viruszerstörende Aktivität als eine Verbindung mit dem Disaccharid Lactose als polarem Strukturbaustein. Umgekehrt ist die Inaktivierung von Viren durch eine Lactose-haltige Verbindung deutlich höher als im Falle von Xylose als Zuckerkomponente. Die Virusinaktivierung nimmt offensichtlich mit wachsender Kettenlänge wieder ab, d. h. eine Cl2-Verbindung weist im Vergleich zu der entsprechenden C16- bzw. Cl8-Verbindung einen höheren Inaktivierungseffekt gegen Viren auf.
Erfindungsgemäß ist es daher möglich, durch gezielte Variation der Strukturbausteine Amphiphile mit optimaler viruszerstörender Aktivität und gleichzeitig möglichst niedriger Zytotoxizität herzustellen.
Die erfindungsgemäß eingesetzten synthetischen Amphiphile können nach bereits beschriebenen und dem Fachmann bekannten Verfahren leicht hergestellt werden. Sowohl die Synthese von Aminosäure- als auch von Zucker-haltigen Amphiphilen erfolgt nach chemischen, enzymatischen und chemoenzymatischen Verfahren. Bei den letzteren werden immobilisierte Enzyme eingesetzt. Bevorzugte Verwendung finden verschiedene Lipasen, die stereoselektive Biokatalysatoren darstellen. Insbesondere eignen sich hierfür immobilisierte Lipasen aus Rhizomucor miehei und Candida antarctzica .
A) Herstellung von Aminosäure-haltigen Amphiphilen der allgemeinen Formel I I
Wie bereits ausgeführt sind chemische , enzymatische und chemoenzymatische Verfahren zur Synthese von Aminosäure- haltigen Amphiphilen, wie z . B . von Aminosäuremonoestern und -amiden sowie von komplexeren Bola- und Gemini-Amphiphilen, literaturbekannt (Valivety, R. et al . (1997), J.Am.Oil Chem.Soc. 74, 879-886; Valivety, R. et al . (1998) J. Surf .Derterg. 1, 177-185; Vulfson, E.N. (1998), Novel Surfactants : preparation, applications and biodegradability, ed. by Krister Holmberg, New York: Dekker, pp . 279-300). So werden durch regioselektive Synthesen mit immobilisierten Lipasen aus Rhizomucor miehel und Candida. antarctica z.B. aus Glycerinestern von N- geschützten Aminosäurederivaten mit freien Carbonsäuren (Fettsäuren) die monomeren Amphiphile hergestellt. Da dieselben Lipasen auch eine Vielzahl von N-geschützten Aminosäuren als Acyldonor-Moleküle akzeptieren, können sie mit langkettigen Alkoholen problemlos verestert werden. So werden z.B. aus äquimolaren Mischungen von N-Carbobenzyl- oxy(Cbz) -Aminosäuren, wie z.B. den N-Cbz-Derivaten von Glycin, L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Tryptophan, L-Serin, L-Glutaminsäure bzw. L-Asparaginsäure u.a. mit Dodecanol in 24 h in einer fast quantitativen Umwandlung die entsprechenden Dodecylester hergestellt. Die enzymatischen Reaktionen werden z.B. in offenen Reaktionsgefäßen bei ca. 60°C durchgeführt, um das Gleichgewicht in Richtung der Esterbildung zu verschieben. Die monomeren Amphiphile werden durch Chromatographie i.d.R. an Aluminiumoxid-Säulen isoliert und durch katalytische Hydrierung von den Schutzgruppen befreit . Analog werden Aminosäure-haltige Bola- und Gemini-Amphiphile hergestellt. Der Einsatz von langkettigen α,ω-Diol- und Diamin-Verbindungen führt zur Bildung von Alkandiyl-α, ω-bis- (N-geschützten Aminosäure) - Derivaten. So werden z.B. mit guten Ausbeuten α,ω-Diester und Diamide von Glycin, L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L- Tryptophan, L-Serin oder L-Glutaminsäure bzw. L-Lysin u.a. Aminosäuren hergestellt. Die Entfernung der Schut'zgruppen liefert die Bola-Verbindung, die durch weitere Modifizierung in entsprechende Gemini-Amphiphile umgesetzt werden, wie z.B. durch Acylierung mit Myristoylchlorid u.a..
B) Herstellung von Zucker-haltigen Amphiphilen der allgemeinen Formel I
Auch die Herstellung von Zucker-haltigen Amphiphilen ist literaturbekannt (Fregapane, G. et al . (1994), Biocatalysis 11, 9-18; Gao, C. et al . (1999), Enzyme Microb. Technol . 25, 264-270; Gao, C. et al . (1999), J.Surf .Deterg. 2, 293- 302) . So werden Mono- und Disaccharide regioselektiv mit Hilfe von Lipasen (z.B. immobilisierte Lipasen aus Rhxzomucor miehei und Candida antarctica) acyliert. Anschließend werden die gebildeten Produkte unter Anwendung konventioneller chemischer Methoden gekoppelt, wobei in guter Ausbeute dimere (Gemini) -Amphiphile entstehen. Im ersten Schritt erfolgt eine direkte Veresterung der Zuckersubstrate in geeigneten organischen Lösungsmitteln. Bevorzugt basieren die Acylierungen auf dem Einsatz von Isopropyliden-Derivaten von Mono- und Disacchariden, mit denen hohe Ausbeuten erreicht werden und die den Vorteil besitzen, dass auf diese Weise einzelne OH-Gruppen für die weitere chemische Modifikation zur Verfügung stehen. Bevorzugt werden die Lipasen für die regioselektive Einführung von Fettsäureketten in partiell geschützte Isopropyliden-Zucker-Derivate und die Modifikation von α,ω-Alkan-bis-Glucosiden genutzt. Alle weiteren Verfahrensschritte erfolgen nach an sich bekannten Methoden. So führte die enzymatische Veresterung z.B. von 1, 2-Isopropyliden-Xylose und Lactose-tetraacetal spezifisch zur Bildung von 5- und 6 λ -Monomeren, die über die 3-bzw. 2 Λ -OH-Gruppe mit Eecan- oder Hexandioyldichlorid zu Dimeren gekoppelt werden. Insbesondere mit Hilfe chemoenzymatischer Verfahren ist es möglich, in hoher Ausbeute eine Vielzahl von monomeren und dimeren amphiphilen Strukturen mit unterschiedlicher Länge der Fettsäureseitenketten und Brückenglieder zu synthetisieren bzw. die Verknüpfung an verschiedenen Hydroxylgruppen der Zuckerkomponenten vorzunehmen.
An Ausführungsbeispielen wird die Erfindung näher erläutert, ohne dass sie darauf beschränkt werden soll.
Beipiel 1
Virusinaktivierung mit Hilfe Aminosäure-haltiger Amphiphile bei Raumtemperatur zwischen 18 und 25 °C
Folgende Aminosäure-haltigen Amphiphile wurden analog zu Valivety, R. et al . , 1997; Valivety, R. et al . , 1998 und Vulfson, E.N. et al . , 1998 hergestellt.
Monomere Amphiphile :
Dodecylester von Glycin, L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-
Tryptophan sowie N-Lauroyl-L-phenylalanin, 3-O-Myristoyl-L- serin, l-O-Glycyl-3-O-myristoylglycerol, 1-O-L-
Phenylalanyl-3-O-myristoylglycerol, 1-O-L-Tyrosyl-3-O- myristoylglycerol ,
Bola-Amphiphile :
Decandiyl-1, 10-bis- (L-phenylalanin) ,
Gemini-Amphiphile :
Decandiyl-1, 10-bis- (3-O-myristoyl-L-serin) , Decandiamid-
1, 10-bis- (N-myristoyl-L-glutaminsäure-γ-ethylester)
Tabelle 1 zeigt die viruszerstörende Wirkung auf das Vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) und das Semliki Forest Virus (SFV) als Modellviren sowie Ergebnisse über Zytotoxizität auf die Zelllinien BHK21 , Hep2 , RD von folgenden Verbindungen :
Dodecylester von L- Phenyl alanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan l -O-L- Phenylala.nyl - 3 -O-myristoylglycerol l-O-L-Tyrosyl-3 -O-myristoylglycerol .
Die lyophilisierten amphiphilen Substanzen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und Vorratslösungen in Konzentrationen zwischen 1 und 10 mM hergestellt. Zur Ermittlung der viruszerstörenden Wirkung der synthetisch hergestellten Verbindungen wurde die Virusinaktivierung in virushaltigem Kulturmedium ohne Zusatz von hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FKS) (GIBCO) durch Bestimmung des infektiösen Virustiters durchgeführt. Hierzu wurden 1 ml Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) (ICN) mit 100 bzw. 10 μl einer VirusStammlösung versetzt. Durch Zugabe eines Amphiphilen in variabler Endkonzentration wurde die Inaktivierung gestartet . Der Versuchsansatz wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann pro Ansatz ein Aliquot entnommen, sofort 1:3, 1:5 bzw. 1:10 mit Kulturmedium weiterverdünnt und der Virustiter bestimmt. Die während der Inaktivierung entnommenen Aliquots wurden je nach dem erwarteten Virustiter seriell entweder 1:10, 1:5 oder 1:3 mit serumhaltigem DMEM weiterverdünnt .
In Zellkulturen wurde die Vermehrungsfähigkeit und damit der Inaktivierungsgrad gemessen. Die Kavitäten einer 96- Loch-Flachbodenmikrotiterplatte wurden mit je 100 μl der jeweiligen Wirtszellsuspension mit 5xl04 bis 5xl05 Zellen/ml beschickt. Danach wurden von jeder Virus-Verdünnungsstufe 100 μl in je acht Kavitäten gefüllt. Die Platten wurden 2-4 Tage bei 37 °C im C02-begasten Brutschrank inkubiert. Nach dieser Zeit waren die Zellen in den Kontrollansätzen ohne Virus dicht gewachsen. Die Auswertung der Platten erfolgte nach Fixierung mit 4% Formaldehyd und Anfärbung mit Giemsa- Lösung lichtmikroskopisch, wobei jede Kultur mit einem Anzeichen eines zytopathischen Effekts als positiv gewertet wurde. Die Berechnung des Virustiters als TCIDS0 wurde nach der "Vorschrift von Spearman und Kärber durchgeführt und auf 1 ml des Versuchsansatzes bezogen.
Tab. 1 Virussuspensionen wurden über 60 min bei Raumtemperatur mit den angegebenenen Substanzen bei einer Konzentration von 50 μM behandelt und anschließend wie beschrieben zur Titerbestimmung eingesetzt. Die Zytotoxizität der Substanzen wurde bestimmt, indem die Kulturen über mehrere Tage in Gegenwart der Substanzen wachsen gelassen wurden (Konzentration 50 μM) . Zytotoxizität über mehrere Tage: +: zytotoxisch (Absterben der Zellen), (+) : geringe Zytotoxizität (eingeschränktes Wachstum der Zellen), -:kein Einfluss, n.b.: nicht bestimmt
Figure imgf000016_0001
In Abb. 1 ist die Inaktivierung von VSV und SFV als Funktion der Konzentration dargestellt. Tabelle 1 sowie die Abbildungen belegen, dass sich die Aminosäure-haltigen synthetischen Amphiphilen hervorragend für die Inaktivierung von Lipid-umhüllten Viren eignen. Aus den Abbildungen ist ersichtlich, dass in Gegenwart entsprechender Fettsäureester bereits im Mikromolarbereich Inaktivierungseffekte von bis zu 7 Log-Stufen erzielt werden können. Ein wichtiger Faktor für die viruszerstörende Wirkung dieser Verbindungen ist offensichtlich ihre Hydrophobizität, wobei Aminosäure- und Fettsäureanteil gleichermaßen von Bedeutung sind. Die Zunahme der Virusinaktivierung mit steigender Hydrophobizität wird durch den Vergleich der viruszerstδrenden Effekte der Verbindungen 1-3 besonders deutlich. So nimmt der viruszerstörende Effekt mit steigender Hydrophobizität von Phe über Tyr bis Trp um mehrere Größenordnungen zu .
Beispiel 2
Virusinaktivierung mit Hilfe Zucker-haltiger Amphiphile bei Raumtemperatur
Folgende Zucker-haltigen Amphiphile wurden analog zu Fregapane, G. et al . , 1994 und Gao, C. et al . , 1999 hergestellt .
Monomere Amphiphile :
Dodecylester von Glucose und Lactose
Dimere Amphiphile (Gemini) von Glucose, Lactose
Tabelle 2 zeigt Inaktivierungseffekte einiger Zuckerhaltiger Amphiphile (Glycolipide) auf VSV und SFV sowie ihre Zytotoxität auf die Zelllinie BHK21.
Tab. 2
Inkubation über 60 Minuten bei Raumtemperatur, < NWG = unter der Nachweisgrenze . Diese lag bei 0 , 0003 %- Restinfektiösität) ; n . b . = nicht bestimmt ; + : zytotoxisch (Absterben der Zellen) , (+) : geringe Zytotoxizität (eingeschränktes Wachstum der Zellen), -:kein Einfluss
Figure imgf000018_0001
Die Wirkstoffe wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und Vorratslösuhgen in Konzentrationen zwischen 1 - 10 mM hergestellt. Die Virusinaktivierungsexperimente wurden analog Beispiel 1 durchgeführt . In der Tabelle 2 ist die viruszerstörende Wirkung der getesteten Zucker-haltigen Amphiphile auf SFV und VSV bei Konzentrationen in den Inaktivierungsansätzen von 50 und 500 μM dargestellt. Die Inkubationsdauer betrug 60 min bei Raumtemperatur. Die Inaktivierungseffekte sind in %-Restinfektiösität angegeben. In Abb. 2a ist die Inaktivierung von SFV als Funktion der Konzentration für die obigen Glycolipide 2 und 3 dargestellt in Abb. 2b von VSV als Funktion der Konzentration für das Glycolipid 3. Für die Wirkstoffe wurde bei 500 μM eine Restinfektiosität von mindestens 0.001% erreicht, entsprechend einer Virusinaktivierung um ca. 5 Log-Stufen.
Beispiel 3 Untersuchung der Zytotoxizität von synthetischen Aminosäure- und Zucker-haltigen amphiphilen Substanzen auf die verwendeten Wirtszellen Für diese Untersuchungen wurden 96-Loch-Platten pro Kavität mit je 100 μl der eingesetzten Zellsuspension (Hep 2, BHK 21, RD) beschickt. Nach kurzer Inkubation (2-3 h) bei 37 °C zum Anwachsen der Zellen wurden je 8 Kavitäten pro Substanz mit der jeweiligen Lösung (100 μl) bestückt. Hierbei wurden verschiedene Konzentrationen bis zu 50 μM bzw. bis zu 500 μM getestet. Als Kontrollwerte wurden Zellen mit DMSO in verschiedener Verdünnung inkubiert, um eine Hemmung des Zellwachstums durch DMSO auszuschließen. Die Beurteilung des Zellwachstums erfolgte nach wenigen Tagen, wenn die Kontrollzellen dicht gewachsen waren. Es wurde visuell mit dem Lichtmikroskop beurteilt, ob die Zellen noch zur Proliferation fähig bzw. abgestorben waren. Zytotoxizitätsuntersuchungen wurden mit den synthetischen Amphiphilen durchgeführt . Die erhaltenen Resultate sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt.

Claims

Patentansprüche
1 . Verwendung von synthetischen Amphiphilen der allgemeinen Formel I ,
(F1) 1 - (X1) ,, - (F2) n - (X2) 0 - (F3) p (I) in der
F1, F3 unabhängig voneinander einen mittel- bis langkettigen linearen oder verzweigten hydrophoben Carbonsäurerest mit 8 bis 30 C- Atomen bedeuten, wobei die Kohlenstoffkette gesättigt oder ungesättigt ist, F2 ein hydrophobes Diol-, Diamin- oder Dicarbonsäure-Bindeglied mit 4 bis 20 C- Atomen darstellt, X1, X2 unabhängig voneinander je einen Aminosäurerest -HN-AS-CO- oder -OC-AS-NH- bedeuten und für den Fall, dass 1 oder p =0 ist, den Aminosäurerest NH2-AS-CO- oder HOOC-AS-NH- bedeuten oder unabhängig voneinander je eine Zucker- oder Disaccharideinheit darstellen sowie l,m,n,o,p unabhängig voneinander 0 oder 1 bedeuten, wobei 0 + p = 1 und l,m,n = 0, 1 + m = 1 und n,o,p = 0, 1 + p = 0 und m,n,o = 1 oder l,m,n,o + p = 1 sein können, zur Inaktivierung von lipidumhuUten Viren in Blutprodukten, in rekombinant hergestellten Therapeutika und Diagnostika sowie in Zellkulturen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Reste F1 und F3 Fettsäurereste mit 10 bis 20 Kohlenwasserstoffresten sind.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Bindeglied F2 einen Kohlenwaserstoffrest mit einer Kettenlänge von 6 bis 18 C-Atomen umfasst.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass der Aminosäurerest X1 oder X2 von Glycin, L- Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Tryptophan, L-Serin oder L- Glutaminsäure abgeleitet ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Zuckerrest X1 oder X2 ein Mono- oder Disaccharidrest ist, vorzugsweise abgeleitet von Glucose, Methyl- Glucose, Galactose, Lactose und Xylose.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Amphiphile monomere Verbindungen eingesetzt werden, wobei 1, m und n = 0 sowie o und p = 1 sind oder n, o und p = 0 sowie 1 und m = 1 sind und F1 oder F3 10 bis 20 C-Atome aufweisen.
7. Verwendung nach Anspruch 6 , dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen mit 10 bis 14 C-Atomen eingesetzt werden, vorzugsweise die Dodecylester.
8. Verwendung nach Anspruch 7 , dadurch gekennzeichnet, dass der Dodecylester von L- Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan eingesetzt wird.
9. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Dodecylester von Glucose und Lactose eingesetzt wird.
10. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass l-O-L-Phenylalanyl-3-O-myristoylglycerol und 1-O-L- Tyrosyl-3-O-myristoylglycerol eingesetzt werden.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Amphiphile Bola-Amphiphile eingesetzt werden, wobei 1 und p = 0 sind sowie m, n und o = 1.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Amphiphile dimere Verbindungen (Gemini-Amphiphile) eingesetzt werden, wobei 1, m, n, o und p = 1 sind.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass C12-Glc-C6-Glc-C12 und C12-Lac-C10-Lac-C12 eingesetzt werden.
14. Verwendung nach einem der Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Blutprodukte Blut und aus Blut isolierte Produkte eingesetzt werden, vorzugsweise Plasmaderivate.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als rekombinant hergestellte Therapeutika und Diagnostika Humanproteine oder Gerinnungsfaktoren eingesetzt werden.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Amphiphile der allgemeinen Formel 1, zur Inaktivierung von lipidumhuUten humanen, animalen oder pflanzlichen Viren eingesetzt werden.
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur Inaktivierung von Herpes-Viren, vorzugsweise von HSV-1, HSV-2, BHV-1 und SHV-1; von Retroviren (Immundefizienz-Viren) , vorzugsweise HIV-1, HIV-2 und SIV sowie zur Inaktivierung vom vesikulären Stomatitis- Virus (VSV) und des Semliki Forest-Virus (SFV) eingesetzt werden.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zur Inaktivierung der lipidumhuUten Viren den Blutprodukten, Therapeutika, Diagnostika und Zellkulturen mindestens ein Amphiphil der allgemeinen Formel I bei Temperaturen zwischen 15 und 65°C eingesetzt wird.
19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Einsatz bei Umgebungstemperatur zwischen 18 und 25 °C erfolgt und die Einwirkungszeit maximal 2 Stunden beträgt.
20. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Einsatz bei Temperaturen zwischen 30 bis 60°C erfolgt .
21. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass zur Inaktivierung der lipidumhuUten Viren den Blutprodukten, Therapeutika, Diagnostika und Zellkulturen mindestens eine amphiphile Substanz der allgemeinen Formel I in einer Konzentration von < 500 μM zugesetzt wird.
PCT/EP2004/012696 2003-11-14 2004-11-05 Verwendung von aminosäure- und zucker-amphiphilen zur inaktivierung von lipidumhüllten viren WO2005049098A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2003153806 DE10353806A1 (de) 2003-11-14 2003-11-14 Verwendung von Aminosäure- und Zucker-Amphiphilen zur Inaktivierung von lipidumhüllten Viren
DE10353806.2 2003-11-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005049098A1 true WO2005049098A1 (de) 2005-06-02

Family

ID=34609079

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2004/012696 WO2005049098A1 (de) 2003-11-14 2004-11-05 Verwendung von aminosäure- und zucker-amphiphilen zur inaktivierung von lipidumhüllten viren

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE10353806A1 (de)
WO (1) WO2005049098A1 (de)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6479113A (en) * 1987-05-21 1989-03-24 Shozo Shoji Virus multiplication inhibitor comprising myristyl compound
EP0443891A1 (de) * 1990-01-25 1991-08-28 Adir Et Compagnie Verwendung von N-Myristoyl-(S)-Phenylalanin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten mittels Hemmung der Myristoylierung

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030133829A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-17 Baxter Healthcare Corporation Process for inactivating pathogens in a biological material

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6479113A (en) * 1987-05-21 1989-03-24 Shozo Shoji Virus multiplication inhibitor comprising myristyl compound
EP0443891A1 (de) * 1990-01-25 1991-08-28 Adir Et Compagnie Verwendung von N-Myristoyl-(S)-Phenylalanin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten mittels Hemmung der Myristoylierung

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE WPI Section Ch Week 198918, Derwent World Patents Index; Class B05, AN 1989-134278, XP002321836 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE10353806A1 (de) 2005-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69326069T2 (de) Zusammensetzungen die die hiv replikation inhibieren
DE69329108T2 (de) Verfahren zur inaktivierung von viren
DE3750906T2 (de) Chemisch modifizierte Proteine und deren Herstellung.
DE69732407T3 (de) Verfahren für die Replikation von Influenza in Zellkultur und die bei diesem Verfahren hergestellten Influenza-Viren
EP0530173B2 (de) Verfahren zur Inaktivierung von Prionen
EP2011862B1 (de) Verfahren zur Herstellung eines aktiven Bestandteils eines Arznei- oder Diagnosemittels im MDCK-Zell-Suspensionskultur
DE69311427T2 (de) Synthetische Polypeptide als Inhibitoren von HIV-1
EP0531911B1 (de) Kultivierung von Vero-Zellen
DE3805459A1 (de) Verfahren zur sterilisation von blut, plasma, blut- und plasmaderivaten, zellsuspensionen oder dgl.
DE69430321T2 (de) Verbindung geeignet zur einführung von wenigstens einem molekül in eine zelle
EP0674531A1 (de) Verfahren zur herstellung eines virussicheren biologischen präparates
EP0722344B1 (de) Verfahren zur virusinaktivierung in gegenwart eines polyethers und eines agens
EP0509008B1 (de) Biomasse zur produktion von virus/virusantigen
DE69733778T2 (de) Langkettige alkohole, alkane, fettsäuren und amide als vireninhibitoren
EP0019218B2 (de) Influenzavirus-Vaccine, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren
DE3888571T2 (de) Stabilisierung von biologischen und pharmazeutischen Produkten während der Inaktivierung von viralen und bakteriellen Keimen.
WO2005049098A1 (de) Verwendung von aminosäure- und zucker-amphiphilen zur inaktivierung von lipidumhüllten viren
AT393356B (de) Verfahren zur herstellung von fsme-virus-antigen
EP0918793B1 (de) Verfahren zur inaktivierung von lipidumhüllten viren mit lipopeptiden und neue antivirale lipopeptide
EP0222974B1 (de) Verfahren zur Herstellung eines Tollwutimpfstoffes und nach diesem Verfahren erhaltener Impfstoff
DE68912582T2 (de) Anti-hiv-mittel.
DE60025036T2 (de) Verfahren zur züchtung von haftenden tierischen zellen
DE68926162T2 (de) Glycerophospholipidzubereitung mit erhöhter Netzmittelwirkung
DE60118175T2 (de) Methode zur herstellung einer immunotropischen antiviralen zusammensetzung
DE69434564T2 (de) Pharmazeutische zusammensetzungen und deren verwendung insbesondere in der behandlung von neurodegenerativen krankheiten

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase