Die
herkömmlichen
Methoden zur Methylierungsanalyse arbeiten im wesentlichen nach
zwei unterschiedlichen Prinzipien. Zum einen werden methylierungsspezifische
Restriktionsenzyme benutzt, zum anderen erfolgt eine selektive chemische
Umwandlung von nicht-methylierten Cytosinen in Uracil (sog.: Bisulfit-Behandlung,
siehe etwa:
DE 101
54 317 A1 ;
DE
100 29 915 A1 ). Die enzymatisch oder chemisch vorbehandelte
DNA wird dann meist amplifiziert und kann auf unterschiedliche Weise
analysiert werden (zur Übersicht:
WO 02/072880 S. 1 ff; Fraga and Esteller: DNA Methylation: A Profile
of Methods and Applications. Biotechniques 33: 632–649, Sept.
2002).
Da
die Behandlung mit methylierungsspezifischen Restriktionsenzymen
durch die Sequenzspezifität
der Enzyme auf bestimmte Sequenzen beschränkt ist, wird für die meisten
Anwendungen eine Bisulfit-Behandlung durchgeführt (zur Übersicht
DE 100 29 915 A1 S. 2,
Zeilen 35–46).
Die
Bisulfitbehandlung erfolgt klassischerweise in folgenden Schritten:
Die genomische DNA wird isoliert, durch Scherung oder durch Behandlung mit
Restriktionsenzymen fragmentiert, mit Natriumhydroxid denaturiert,
mit einer konzentrierten Bisulfit-Lösung für mehrere Stunden umgesetzt
und anschließend
desulfoniert und entsalzen (siehe: Frommer et al.: A genomic sequencing
protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues
in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Mar 1; 89(5):
1827–31).
In
der letzten Zeit wurden mehrere technische Verbesserungen dieser
Methode entwickelt. So wird die zu untersuchende DNA bei dem sog.
Agarose-Bead-Verfahren in einer Agarose-Matrix eingeschlossen. Hierdurch
werden Diffusion und Renaturierung der DNA verhindert. Alle Fällungs-
und Reinigungsschritte werden anschließend durch ein schnelle Dialyse
ersetzt. Mit dieser Methode ist es möglich, den Methylierungsstatus
einzelner Zellen zu untersuchen. Allerdings gibt es Schwierigkeiten
bei sehr kleinen Fragmenten, die durch Diffusion verloren gehen
(Olek et al.: A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 5064–6.). In
der Patentanmeldung
DE
100 29 915 A1 (WO 01/98528) ist ein Bisulfit-Verfahren
beschrieben, bei dem eine DNA-Probe mit einer Bisulfit-Lösung im
Konzentrationsbereich von 0,1 mol/l bis 6 mol/l in Anwesen heit eines
denaturienden Reagenzes und/oder Lösemittel sowie mindestens eines
Radikalfängers
inkubiert wird. Dabei sind in dieser Patentanmeldung viele unterschiedliche
geeignete denaturierende Stoffe und Radikalfänger beschrieben. In der Patentanmeldung
DE 101 54 317 (WO 03/038121)
ist ein Verfahren offenbart, bei dem die zu untersuchende DNA während der
Bisulfit-Behandlung an eine Oberfläche gebunden wird, wodurch Aufreinigungs-
und Waschschritte vereinfacht werden.
Ein
grundsätzliches
Problem der Bisulfit-Behandlung besteht allerdings darin, dass lange
Reaktionszeiten erforderlich sind, um eine vollständige Umwandlung
sicherzustellen und so beispielsweise falsch-positive Resultate
auszuschließen.
Gleichzeitig aber kommt es durch die langen Reaktionszeiten zu einer
Degradation der DNA. Dabei führen
höhere Reaktionstemperaturen
zwar zu einer höheren
Umwandlungsrate, aber auch zu einem stärkeren Abbau der DNA. Die Wechselwirkungen
zwischen Temperatur, Reaktionsdauer, Umwandlungs- und Abbaurate wurden
kürzlich
systematisch untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, daß die höchsten Konversionsraten
bei Temperaturen von 55°C
(bei Reaktionszeiten zwischen 4 und 18 Stunden) sowie bei 95°C (bei einer
Reaktionszeit von einer Stunde) erreicht werden. Ein großes Problem
besteht allerdings in der Degradation der DNA. So werden bei einer
Reaktionstemperatur von 55°C
84–96
% der DNA abgebaut. Bei 95°C
ist die Degradation sogar noch höher (Grunau
et al.: Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of
critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001 Jul 1;
29(13): E65-5). Dementsprechend verwenden die meisten Autoren Reaktionstemperaturen
von etwa 50°C
(vgl.: Frommer et al. a.a.o. 1992, S. 1827; Olek et al., a.a.o. 1996,
S. 5065; Raizis et al: A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes
template degradation. Anal Biochem. 1995 Mar 20; 226(1): 161–6, 162).
Neben der hohen Abbaurate der DNA besteht ein weiteres Problem der
herkömmlichen
Bisulfitverfahren darin, dass eine schlagkräftige Aufreinigungsmethode
der umgewandelten DNA bisher nicht beschrieben ist. So benutzen
viele Autoren Fällungen
(Vgl.: Grunau et al. a.a.o Auch eine Aufreinigung über DNA-bindende
Oberflächen
ist beschrieben (Vgl.: Kawakami et al.: Hypermethylated APC DNA
in plasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma
Journal of the National Cancer Institute, Vol 92, No. 22, 2000,
pp. 1805–11). Die
Ausbeute dieser Aufreinigungen ist aber begrenzt.
Durch
die hohen Verluste der herkömmlichen
Bisulfitbehandlung ist es problematisch, diese Verfahren für Untersuchungen
einzusetzen, in denen die Menge der zu analysierenden DNA limitiert
ist. Ein besonders interessantes Anwendungsgebiet der Methylierungsanalyse
liegt jedoch gerade darin, mittels DNA aus Körperflüssigkeiten, etwa aus Blut oder Urin,
Krebserkrankungen oder andere mit einer Veränderung des Methylierungsstatus
assoziierte Krankheiten zu diagnostizieren. In Körperflüssigkeiten kommt die DNA jedoch
nur in geringen Konzentrationen vor, so daß die Anwendbarkeit der Methylierungsanalyse
durch die geringe Ausbeute der herkömmlichen Bisulfitbehandlung
beschränkt
ist.
Aufgrund
der besonderen Bedeutung der Cytosinmethylierung und aufgrund der
erwähnten Nachteile
der konventionellen Methodik besteht ein großen technisches Bedürfnis an
verbesserten Verfahren zur Bisulfitumwandlung.
Es
wurde nun überraschend
gefunden, dass der Zusatz von Diethylenglykoldimethylether (DME) oder
anderer n-Alkylenglykol-Verbindungen
die Umwandlungsrate der Bisulfitreaktion unerwartet deutlich erhöht, während gleichzeitig
die erforderliche Reaktionsdauer und damit auch die Degradationsrate der
DNA unerwartet deutlich verringert wird. Zwar ist die Verwendung
denaturierender Lösemittel
in der Bisulfitreaktion bereits bekannt (
DE 100 29 915 ). Einen derart starken
Effekt, wie er hier zum ersten Mal für DME und andere n-Alkylenglykol-Verbindungen
beschrieben wird, konnte der Fachmann jedoch nicht erwarten. Neben
der deutlich erhöhten
Umwandlungsrate und der verringerten Degradation der DNA hat die
Verwendung von n-Alkylenglykolverbindungen weitere wichtige Vorteile.
Denn die konventionellen Bisulfit-Umwandlungen werden oft in Gegenwart hoher
Konzentrationen von Bisulfit durchgeführt. So empfehlen etwa Fraga
and Estelle eine finale Konzentration von 5 mol/l (a.a.o. S. 642,
linke Spalte, 2. Absatz). Eine solche hohe Salzkonzentration führt jedoch
vermehrt zu Nebenreaktionen und zu Schwierigkeiten bei der Aufreinigung
und bei der nachfolgenden Amplifikation der umgewandelten DNA. Das erfindungsgemäße Verfahren
kommt dagegen mit deutlich geringeren Bisulfit-Konzentrationen aus und ermöglicht daher
eine effektivere Umwandlung, Aufreinigung und Amplifikation. Ein
weiterer Vorteil der Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber bereits
beschriebenen denaturierenden Lösemitteln
liegt in der hohen Wasserlöslichkeit.
Es kommt zu keiner Phasenbildung in der Reaktionslösung, so
dass die erfindungsgemäßen Verbindungen variabler
einsetzbar sind. Zudem sind zur Vermeidung von Nebenreaktionen zugesetzte
Radikalfänger
besser in der Reaktionsmischung löslich. Wird der Einsatz der
erfindungsgemäßen Verbindungen mit
optimierten Reaktionsbedingungen und Aufreinigungsmethoden kombiniert,
so lässt
sich die Effizienz der Bisulfit-Umsetzung
zusätzlich
deutlich steigern. Eine sensitive Methylierungsanalyse aus Gewebe
oder aus Körperflüssigkeiten
isolierter DNA ist möglich.
Beschreibung
Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Bisulfit-Umwandlung von DNA ist dadurch gekennzeichnet, dass
die Reaktion in Gegenwart von Verbindungen der nachfolgenden Formel
erfolgt:
wobei
n = 1–35000
m
= 1–3
R1
= H, Me, Et, Pr, Bu
R2 = H, Me, Et, Pr, Bu
ist.
Besonders
bevorzugt sind dabei n-Alkylenglykol-Verbindungen, inbesondere deren Dialkylether, insbesondere
wiederum Diethylenglykoldimethylether (DME).
Die
zu untersuchende DNA kann je nach diagnostischer oder wissenschaftlicher
Fragestellung aus unterschiedlichen Quellen stammen. Für diagnostische
Untersuchungen dienen als Ausgangsmaterial bevorzugt Gewebeproben,
aber auch Körperflüssigkeiten,
insbesondere Serum. Möglich
ist auch, die DNA aus Sputum, Stuhl, Urin oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit
zu verwenden. Bevorzugt wird die DNA aus den biologischen Proben
isoliert. Die DNA-Extraktion
erfolgt nach Standardmethoden, aus Blut etwa unter Verwendung des
Qiagen UltraSens DNA Extraktions-Kits.
Andere Methoden zur Aufreinigung von DNA sind dem Fachmann bekannt.
Anschließend kann
die isolierte DNA etwa durch Umsatz mit Restriktionsenzymen fragmentiert werden.
Die Reaktionsbe dingungen und die in Frage kommenden Enzyme sind
dem Fachmann bekannt und ergeben sich etwa aus den von den Herstellern mitgelieferten
Protokollen.
Die
Bisulfit-Umwandlung kann ausgehend von den bekannten, oben angegebenen
Protokollen erfolgen. Dabei kann die Umsetzung sowohl in Lösung wie
auch an einer festen Phase stattfinden (Vgl.:
DE 100 29 915 ;
DE 101 54 317 ).
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in unterschiedlichen Konzentration eingesetzt werden. DME wird bevorzugt
in Konzentrationen zwischen 1–35s
eingesetzt. Bevorzugt sind zwischen 5 und 25%, besonders bevorzugt
10% DME.
Als
Bisulfit-Reagenz wird bevorzugt Natriumdisulfit (Natriumbisulfit/Natriummetabisulfit)
verwendet, da es über
eine höhere
Wasserlöslichkeit
als Natriumsulfit verfügt.
Das Disulfitsalz disproportioniert in wässriger Lösung zu den für die Cytosin-Umwandlung
benötigten
Hydrogensulfitanionen. Wird im folgenden von Bisulfitkonzentration
gesprochen, so bezieht sich dies auf die Konzentration der Hydrogensulfit-
und Sulfitanionen in der Reaktionslösung. Für das erfindungsgemäße Verfahren
sind Konzentrationsbereiche von 0,1 bis 6 mol/l möglich (Vgl.:
DE 100 29 915 ). Bei der
Wahl der Bisulfit-Konzentration ist zu berücksichtigen, dass eine hohe
Konzentration an Bisulfit zu einer hohen Konversion, aber aufgrund
des niedrigeren pH-Wertes auch zu einer hohen Abbaurate führt. Bevorzugt
liegt die Bisulfit-Konzentration zwischen 1 und 6 mol/l, besonders
bevorzugt zwischen 2 und 4 mol/l.
Vorzugsweise
wird zusätzlich
mindestens ein Radikalfänger
verwendet. Einsetzbare Radikalfänger
sind dem Fachmann bekannt (Vgl.:
DE 100 29 915 A1 ). Besonders bevorzugt werden
Chroman-Derivate benutzt, etwa 6-Hydroxy-2,5,7,8,-tetramethylchroman-2-carbonsäure.
Die
Bisulfitumwandlung kann in einem weiten Temperaturspektrum von 0
bis 95 °C
durchgeführt
werden (s.o.). Dabei ist zu berücksichtigen, dass
bei höheren
Temperaturen mit der Umwandlungs- auch die Abbaurate der DNA steigt.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt die Reaktionstemperatur
daher zwischen 30–70°C. Besonders
bevorzugt ist ein Bereich zwischen 45–60°C; ganz besonders bevorzugt
sind 50–55°C. Die optimale
Reaktionszeit der Bisulfitbewandlung hängt von der Reaktionstemperatur
ab. Die Reaktionszeit beträgt
normalerweise zwischen 1 und 18 Stunden (Vgl.: Grunau et al. 2001
a.a.o.). Für eine
Reaktionstemperatur von 50°C
liegt die Reaktionszeit gewöhnlich
bei 4–6
Stunden.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahren
wird die Bisulfitumwandlung bei milden Reaktionstemperaturen durchgeführt, wobei
im Laufe der Umsetzung die Reaktionstemperatur dann mindestens einmal kurzzeitig
deutlich erhöht
wird. Hierdurch läßt sich
die Effektivität
der Bisulfitumwandlung überraschend deutlich
erhöhen.
Die kurzzeitigen Temperaturerhöhungen
werden im folgenden „Thermospikes" genannt. Die „normale" Reaktionstemperatur
außerhalb der
Thermospikes wird als Reaktionsgrundtemperatur bezeichnet. Die Reaktionsgrundtemperatur
beträgt
wie oben beschrieben zwischen 0 und 80°C, bevorzugt zwischen 30–70°C, besonders
bevorzugt 45°–55°C. Die Reaktionstemperatur
wird durch mindestens einen Thermospike auf über 85°C erhöht. Die optimale Anzahl der
Thermospikes steht in Abhängigkeit
von der Reaktionsgrundtemperatur. Dabei ist die optimale Anzahl
der Thermospikes umso höher,
je niedriger die Reaktionsgrundtemperatur ist. Erforderlich ist
in jedem Falle zumindest ein Thermospike. Auf der anderen Seite
sind prinzipiell beliebig viele Thermospikes denkbar. Zu berücksichtigen
ist allerdings, dass bei einer großen Anzahl von Temperaturerhöhungen auch
die Abbaurate der DNA steigt, und somit eine optimale Umsetzung
nicht mehr gewährleistet
ist. Die bevorzugte Anzahl der Thermospikes liegt daher je nach
Reaktionsgrundtemperatur zwischen 1 und 10 Thermospikes. Besonders
bevorzugt sind dabei 2 bis 5 Thermospikes. Die Thermospikes erhöhen die
Reaktionstemperatur bevorzugt auf 85 bis 100°C, besonders bevorzugt auf 90–98°C, ganz besonders
bevorzugt auf 94°C–96°C.
Die
Zeitdauer der Temperaturerhöhungen hängt auch
von den Volumina der Reaktionsansätze ab. Es muss gewährleistet
werden, dass die Temperatur gleichmäßig in der gesamten Reaktionslösung erhöht ist.
Dabei sind bei Verwendung eines Thermocyclers für einen 20 μl Reaktionsansatz 30 Sekunden Temperaturerhöhung ausreichend.
Bei einem Volumina von 100 μl
sind 1,5 Minuten und bei 600 μl
3 Minuten Temperaturerhöhung
erforderlich.
Nach
Abschluß der
Bisulfit-Umwandlung erfolgt eine Desulfonierung und eine Aufreinigung
der DNA. Hierzu sind unterschiedliche Verfahren bekannt (siehe etwa:
DE 101 54 317 A1 ;
DE 100 29 915 A1 ;
Grunau et al. 2001, a.a.o.). Normalerweise wird die Reaktionslösung zunächst mit
Natronlauge behandelt. Anschließend
erfolgt eine Neutralisation und eine Alkoholfällung der DNA.
Erfindungsgemäß bevorzugt
geschieht die Aufreinigung mittels einer Gelfiltration, etwa mit
Sephadex-G25-Säulen. Hiermit
kann das Bisulfitsalz sehr effektiv entfernt werden, ohne daß weitere Waschschritte
erforderlich wären.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Aufreinigung über DNA-bindende
Oberflächen,
etwa über das
Wizard DNA Aufreinigungsharz von Promega (Vgl.: Kawakami et al a.a.o).
Angaben zur Aufreinigung von Nukleinsäuren über Gelfiltration oder DNA-bindende
Oberflächen
sind dem Fachmann bekannt und ergeben sich etwa aus den Herstellerangaben.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Aufreinigung über Ultrafiltration.
Eine solche Vorgehensweise hat mehrere technische Vorteile und führt zu einer überraschend
effektiven Aufreinigung. So ist die Wiederfindungsrate der umgewandelten
DNA sehr hoch (>85%).
Dies gilt sowohl für
hochmolekulare DNA wie auch für
fragmentierte DNA, wie sie etwa in Körperflüssigkeiten auftritt. Die herkömmlichen
Verfahren zur Isolierung bisulfit-behandelter DNA führen dagegen
nur zu einer Wiederfindungsrate von etwa 25 %. Die Ultrafiltration
hat zudem weitere Vorteile. So ist die Aufreinigung bezüglich der
Volumina der einzusetzenden Proben sehr flexibel. Außerdem können die
Bisulfitsalze nahezu vollständig
entfernt werden. Nicht zuletzt ist eine Desulfonierung auf der Filtermembran
möglich,
was zusätzlich
zu einer Zeitersparnis führt.
Dem
Fachmann sind unterschiedliche kommerziell erhältliche Ultrafiltrationssysteme
bekannt, die für
das erfindungsgemäße Verfahren
verwendet werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Microcon-Säulen
von Millipore verwendet. Die Aufreinigung kann dabei nach einem modifizierten
Herstellerprotokoll erfolgen. Dazu wird die Bisulfit-Reaktionslösung mit
Wasser versetzt und auf die Ultrafiltrationsmembran gegeben. Anschließend wird
die Reaktionslösung
für etwa
15 Minuten abzentrifugiert und anschließend mit 1 × TE-Puffer gewaschen. Die
DNA bleibt bei dieser Behandlung auf der Membran. Anschließend erfolgt
die Desulfonierung. Hierzu wird 0,2 mol/l NaOH zugesetzt und für 10 min
inkubiert. Anschließend
erfolgt eine weitere Zentrifugation (10 min) und ein Waschschritt
mit 1 × TE-Puffer.
Anschließend
wird die DNA eluiert. Hierzu wird die Membran für 10 Minuten mit 50 μl warmen 1 × TE-Puffer
(50°C) versetzt.
Die Membran wird nach Herstellerangaben gewendet und es erfolgt eine
erneute Zentrifugation, mit der die DNA von der Membran entfernt
wird. Das Eluat kann direkt für
die Nachweisreaktionen eingesetzt werden. Dem Fachmann ist bekannt,
daß bei
anderen Ultrafiltrationsystemen anderer Vorgehensweisen angezeigt
sein können,
und daß eine
gute Ausbeute auch bei Variation der oben angegebenen Bedingungen
erzielt werden kann. Die entsprechenden Ausführungsformen sind ebenfalls
Teil dieser Erfindung.
In
einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Aufreinigung
mit Hilfe magnetischer Partikel, etwa mit Hilfe des Magna-Pure-Verfahrens.
Diese Aufreinigungsmethode führt
in Kombination mit den erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere
mit DME, zu besonders guten Ergebnissen. Die Aufreinigung erfolgt
dabei nach Herstellerangaben. Dem Fachmann ist bekannt, dass bei Variation
der Herstellerangaben durch Standardversuche eine erhöhte Ausbeute
erzielbar sein kann. Entsprechend optimierte Protokolle sind ebenfalls Teil
dieser Erfindung.
Die
umgewandelte und aufgereinigte DNA kann über unterschiedliche Wege analysiert
werden. Besonders bevorzugt ist es, die DNA zunächst mittels einer Polymerasekettenreaktion
zu amplifizieren. Über
unterschiedliche Verfahren läßt sich
dabei eine selektive Amplifikation der ursprünglich methylierten bzw. unmethylierten
DNA sicherstellen, etwa über
die sog. „Heavy-Methyl"-Methode (zur Übersicht:
WO 02/072880) oder die sog. „methylierungssensitive PCR" ("MSP"; vgl.: Herman et
al.: Methylationspecific PCR: a novel PCR assay for methylation
Status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Sep 3; 93(18):
9821–6).
Die Detektion der Amplifikate kann über herkömmliche Verfahren erfolgen,
etwa über Primer-Extension-Reaktionen
("MsSNuPE"; siehe etwa:
DE 100 10 280) oder über Hybridisierung
an Oligomer-Arrays (Siehe etwa: Adorjan et al., Tumour class prediction
and discovery by microarray-based DNA methylation analysis. Nucleic
Acids Res. 2002 Mar 1; 30(5): e21). In einer anderen besonders bevorzugten
Ausführungsform
werden die Amplifikate unter Verwendung von PCR-Real-Time-Varianten analysiert
(vgl.:
US 6,331,393 „Methyl-Light"). Bevorzugte Varianten
sind dabei das „Taqman"- und das „Lightcycler"-Verfahren).
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Verwendung aller erfindungsgemäßen Ausführungsformen.
Werden krankheitsspezifische Cytosinpositionen untersucht, so eignet
sich das erfindungsgemäße Verfahren
insbesondere zur Diagnose oder Prognose von Krebserkrankungen oder
anderen mit einer Veränderung
des Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten. Hierzu gehören u.a.
CNS-Fehlfunktionen,
Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische
und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und
Persönlichkeitsstörungen;
Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit,
Fehlfunktion und Schädigung;
Fehlfunktion, Schädigung
oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit
des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder
Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als
Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder
Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine
und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen
oder sexuelle Fehlfunktion. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich au ßerdem besonders
zur Vorhersage von unerwünschten
Arzneimittelwirkungen und zur Unterscheidung von Zelltypen oder
Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Erfindungsgemäß ist auch
die Verwendung der unter die oben gezeigte Strukturformel fallenden Verbindungen,
insbesondere die Verwendung von n-Alkylenglykol-Verbindungen und
von deren Dialkylether sowie von DME zur Bisulfitumwandlung von DNA.
Erfindungsgemäß ist schließlich auch
ein Kit, der eine Bisulfitreagenz und eine unter die oben gezeigte
Strukturformel fallende Verbindung, insbesondere eine n-Alkylenglykol-Verbindung,
einen ihrer Dialkylether oder DME enthält. Weitere Bestandteile können ein
Radikalfänger,
Ultrafiltrationsröhrchen, Primer,
eine Polymerase und weitere für
eine Bisulfitumwandlung, Aufreinigung oder Amplifikation erforderliche
Reagenzien sein.
Es
soll gezeigt werden, dass das optimierte Bisulfitverfahren eine
sensitive Methylierungsanalyse von aus Körperflüssigkeiten gewonnener DNA ermöglicht.
Hierzu wurde 1 ml humanes Plasma mit einer bestimmten Menge humaner
DNA versetzt. Die DNA wurde aus den Plasmaproben über das
Magna Pure-Verfahren (Roche) nach Herstellerangaben isoliert. Die
aus der Aufreinigung resultierenden 100 μl Eluat wurden vollständig in
die folgende Bisulfit-Reaktion eingesetzt. Dabei erfolgte als Kontrolle
die Umsetzung nach einem Standardverfahren (Frommer et al. a.a.o).
Für das
erfindungsgemäße Verfahren
wurde wie folgt vorgegangen: Das Eluat wurde mit 354 μl Bisulfit-Lösung (5,89
mol/l) und 46 μl
DME (einschließlich
Radikalfänger
(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure, 98,6
mg in 787 μl DME)
versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für 3 min bei 99°C denaturiert
und anschließend
bei folgendem Temperaturprogramm für insgesamt 5 h inkubiert:
30 min 50°C;
ein Thermospike (99,9°C)
für 3 min;
1,5 h 50°C;
ein Thermospike (99,9°C)
für 3 min; 3
h 50°C.
Die Reaktionsgemische sowohl der Kontrolle wie auch des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden
anschließend
per Ultrafiltration mittels einer Millipore-Microcon-Säule aufgereinigt.
Die Aufreinigung erfolgte im wesentlichen nach Herstellerangaben.
Dazu wurde das Reaktionsgemisch mit 300 μl Wasser versetzt, auf die Ultafiltrationsmembran
gegeben, für
15 min abzentrifugiert und anschließend mit 1 × TE-Puffer gewaschen. Die
DNA bleibt bei dieser Behandlung auf der Membran. Anschließend erfolgt
die Desulfonierung. Hierzu wurde 0,2 mol/l NaOH zugesetzt und für 10 min
inkubiert. Anschließend
erfolgte eine Zentrifugation (10 min) und ein Waschschritt mit 1 × TE-Puffer.
Danach wurde die DNA eluiert. Hierzu wurde die Membran für 10 Minuten
mit 50 μl
warmen 1 × TE-Puffer
(50°C) versetzt. Die
Membran wurde nach Herstellerangaben gewendet. Anschließend erfolgte
eine erneute Zentrifugation, mit der die DNA von der Membran entfernt
wurde. 10 μl
des Eluats wurden für
die folgenden Lightcycler-Real-Time-PCR eingesetzt. Hierbei erfolgte
die Amplifikation mittels eines bisulfitspezifischen Assays. Die
von der Lightcycler-Software berechneten Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Die linken Kurven entsprechen dem optimierten Verfahren, die rechten Kurven
dem herkömmlichen
Verfahren. Es zeigt sich, daß das
optimierte Verfahren bereits bei geringer Zyklenzahl ein signifikantes
Fluoreszenzsignal erzeugt. Die DNA-Ausbeute ist daher höher als bei dem herkömmlichen
Verfahren. Durch einen Vergleich mit Eichkurven läßt sich
die Menge der umgewandelten DNA quantifizieren. Für das optimierte
Verfahren ergab sich dabei eine DNA-Konzentration von 133,27 ng/100 μl, während das
herkömmliche
Verfahren zu einer Konzentration von 41,03 ng/100 μl führte. Das erfindungsgemäße Verfahren
ermöglichte
daher eine dreifach höhere
Ausbeute als das herkömmliche
Verfahren.
