DE10340395A1 - Verfahren zur Erkennung akuter generalisierter entzündlicher Zustände (SIRS) - Google Patents

Verfahren zur Erkennung akuter generalisierter entzündlicher Zustände (SIRS) Download PDF

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Abstract

Verfahren zur in vitro Erkennung von akuten generalisierten entzündlichen Zuständen (SIRS), wobei es folgende Schritte umfaßt: DOLLAR A a) Isolieren von Proben-RNA aus einer aus einem Säuger stammenden Probe; DOLLAR A b) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein für SIRS spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker; DOLLAR A c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen; DOLLAR A d) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle für nicht-pathologische Zustände darstellt, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein für SIRS spezifisches Gen oder Genfragment ist; DOLLAR A e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA; DOLLAR A f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für SIRS spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erkennung akuter generalisierter entzündlicher Zustände (SIRS) gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 26, sowie die Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten Nukleinsäuresequenzen oder davon abgeleiteten Peptidsequenzen gemäß Anspruch 49.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Genaktivitätsmarker für die Diagnose und Therapieoptimierung von akuten generalisierten entzündlichen Zuständen (SIRS). Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Erkennung akuter generalisierter entzündlicher Zustände (SIRS) ebenso wie zur entsprechenden Therapieoptimierung bei akuten generalisierten entzündlichen Zuständen (SIRS).
  • Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue Diagnosemöglichkeiten, die sich aus experimentell abgesicherten Erkenntnissen im Zusammenhang mit dem Auftreten von Änderungen der Genaktivitäten (Transkription und nachfolgende Proteinexpression) bei Patienten mit akuten generalisierten entzündlichen Zuständen (SIRS) ableiten lassen.
  • Trotz Fortschritte im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Intensivpatienten sind SIRS, definiert entsprechend der ACCP/SCCM Konsensuskonferenz aus dem Jahre 1992 [1] und in dieser Patentanmeldung auch als „akute generalisierte entzündliche Zustände" übersetzt, eine bei Patienten auf Intensivstationen sehr häufig auftretende und erheblich zur Sterblichkeit beitragende Erkrankung [2–5].
  • Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)" aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des SIRS-Begriffs durchgesetzt [1].
  • Entsprechend dieser Definition wird SIRS (in diesem Patent als „akute generalisierte entzündliche Zustände" übersetzt) als die systemische Antwort des inflammatorischen Systems auf einen nichtinfektiösen Reiz definiert. Dazu müssen mindestens zwei der folgenden klinischen Kriterien erfüllt sein: Fieber >38°C oder Hypothermie <36°C, eine Leukozytose >12G/l oder eine Leukopenie <4G/l bzw. eine Linksverschiebung im Differentialblutbild, eine Herzfrequenz von über 90/min, eine Tachypnoe >20 Atemzüge/min oder ein PaCO2 <4,3 kPa.
  • Die Sterblichkeit des SIRS beträgt ca. 20 % und steigt bei Entwicklung stärkerer Organfunktionsstörungen weiter an [6]. Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag von SIRS ist dabei von fachübergreifender Bedeutung. Dadurch werden in zunehmenden Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten oder experimentellen Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z.B. Herzchirurgie, Traumatologie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie) gefährdet, da diesen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Risikos zur Ausbildung akuter generalisierter entzündlicher Zustände immanent ist. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung von akuten generalisierten entzündlichen Zuständen gebunden.
  • SIRS ist ein Ergebnis von komplexen und stark heterogenen molekularen Vorgängen, die gekennzeichnet sind durch eine Einbeziehung von vielen Komponenten und deren Wechselwirkungen auf jeder organisatorischen Ebene des menschlichen Körpers: Gene, Zellen, Gewebe, Organe. Die Komplexität der zugrundeliegenden biologischen und immunologischen Prozesse haben viele Arten von Forschungsstudien hervorgerufen, die einen weiten Bereich klinischer Aspekte umfassen. Eines der hieraus zu erkennenden Ergebnisse war, dass die Bewertung neuerer Therapien durch die heute verwendete relativ unspezifische, klinisch-basierte Definition, welche die molekularen Mechanismen in nicht ausreichender Weise wiederspiegeln, erschwert wird [7]. Daher ist ein dringender Bedarf für innovative diagnostische Mittel entstanden, welche die Fähigkeit des Fachmanns verbessern sollen, Patienten mit SIRS frühzeitig zu diagnostizieren, die Schwere einer SIRS auf molekularer Ebene messbar zu machen und im klinischem Verlauf vergleichbar zu gestalten, und bezüglich der individuellen Prognose und dem Ansprechen auf spezifische Behandlungen Aussagen abzuleiten.
  • Technologische Fortschritte, insbesondere die Entwicklung der Mikroarray-Technologie, versetzen den Fachmann nun in die Lage, 10 000 oder mehr Gene und deren Genprodukte gleichzeitig zu vergleichen. Die Anwendung solcher Mikroarray-Technologien kann nun Hinweise auf den Status von Gesundheit, Regulationsmechanismen, biochemischer Wechselwirkungen und Signalisierungsnetzwerken geben. Das Verbessern des Verständnisses darüber, wie ein Organismus auf Infektionen reagiert, sollte die Entwicklung von verstärkten Erkennungs-, Diagnose- und Behandlungsmodalitäten für systemische Erkrankungen erleichtern.
  • Mikroarrays stammen vom „Southern blotting" [8] ab, was die erste Herangehensweise darstellt, DNA-Moleküle in einer räumlich ansprechbaren Art und Weise auf einer festen Matrix zu immobilisieren. Die ersten Mikroarrays bestanden aus DNA-Fragmenten, oft mit unbekannter Sequenz, und wurden auf eine poröse Membran (normalerweise Nylon) punktweise aufgebracht. Routinegemäß wurden cDNA, genomische DNA oder Plasmid-Bilbliotheken verwendet, und das hybridisierte Material wurde mit einer radioaktiven Gruppe markiert [9–11].
  • Kürzlich hat es die Verwendung von Glas als Substrat und Fluoreszenz zur Detektion zusammen mit der Entwicklung neuer Technologien für die Synthese und für das Aufbringen der Nukleinsäuren in sehr hohen Dichten erlaubt, die Nukleinsäurearrays zu miniaturisieren bei gleichzeitiger Erhöhung des experimentellen Durchsatzes und des Informationsgehaltes [12–14].
  • Weiterhin ist aus WO 03/002763 bekannt, dass Mikroarrays grundsätzlich für die Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen verwendet werden können.
  • Eine Begründung für die Anwendbarkeit der Mikroarray-Technologie wurde zunächst durch klinische Untersuchungen auf dem Gebiet der Krebsforschung geliefert. Hier haben Expressionsprofile ihre Nützlichkeit bei der Identifizierung von Aktivitäten einzelner Gene oder Gengruppen gezeigt, die mit bestimmten klinischen Phänotypen korrelieren [15]. Durch die Analyse vieler Proben, die von Individuen mit oder ohne akute Leukämie oder diffuse Lymphome großer B-Zellen stammten, wurden Genexpressionsmarker (RNA) gefunden und auf die Klassifizierung dieser Krebsarten angewandt [15,16]. Golub et al. haben herausgefunden, daß verläßliche Vorhersagen nicht aufgrund von irgendeinem einzelnen Gen gemacht werden können, aber daß Vorhersagen, die auf den Expressionsspiegeln von 53 Genen (ausgewählt aus über 6000 Genen, die auf den Arrays vertreten waren) basieren, sehr genau sind [15].
  • Alisadeh et al. [16] untersuchten große B-Zell Lymphome (DLBCL). Die Autoren erarbeiteten Expressionsprofile mit einem „Lymphochip", einem Mikroarray, der 18 000 Klone komplementärer DNA trug und entwickelt worden war, um Gene zu überwachen, die in normale und abnormale Lymphozytenentwicklung involviert sind. Unter Verwendung von Cluster-Analyse waren sie in der Lage, DILBCL in zwei Kategorien einzuteilen, welche starke Unterschiede bezüglich der Überlebenschancen der Patienten aufzeigten. Die Genexpressionsprofile dieser Untergruppen entsprachen zwei bedeutsamer Stadien der B-Zelldifferenzierung.
  • Besonders wertvoll hat sich die Bestimmung von Genexpressionsprofilen zur differentialdiagnostischen Unterscheidung von Krankheitserscheinungen, die auf systemische mikrobielle Infektionen zurückzuführen sind, von anderen Krankheitserscheinungen nichtinfektiöser Ätiologie erwiesen, die aufgrund ihres klinischen Erscheinungsbildes auf eine Sepsis hindeuten könnten, jedoch in Wirklichkeit nicht auf eine systemische mikrobielle Infektion zurückzuführen sind, z.B. von Krankheitserscheinungen, die auf nicht-infektiöse Entzündungen einzelner Organe zurückzuführen sind [18–20]. Die Messung von Genexpressionprofilen zur Diagnose von SIRS aus Körperflüssigkeiten wurde noch nicht beschrieben.
  • Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarten Erfindung ist die Erkenntnis, daß vor der Diagnose von SIRS in biologischen Proben eines Individuums sich von normalen Werten unterscheidende RNA-Spiegel, bzw. sich davon ableitbare Peptid- und Teilpeptid-Spiegel in einem Serum oder Plasma eines Patienten, bei dem ein SIRS-Risiko besteht bzw. bei dem SIRS-typische Krankheitserscheinungen festgestellt werden, feststellbar sind.
    •
  • Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Erkennung, die Beurteilung des Schweregrads und/oder die therapiebegleitende Verlaufsbeurteilung von SIRS, ermöglicht.
  • Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 oder 26 gelöst.
  • Weiterhin liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Verwendungsmöglichkeit von Markern in einem Verfahren gemäß Anspruch 1–48 zur Verfügung zu stellen.
  • Diese Aufgabe wird durch die Verwendung gemäß Anspruch 49 gelöst.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit eines Individuums die Aktivität eines oder mehrerer Markergene bestimmt und aus der festgestellten Anwesenheit und/oder Menge des bestimmten Genprodukts SIRS und/oder den Erfolg einer therapeutischen Behandlung ableiten kann.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur in vitro Erkennung von SIRS, dadurch gekennzeichnet ist, daß es folgende Schritte umfaßt:
    • a) Isolieren von Proben-RNA aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;
    • b) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein für SIRS spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker;
    • c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen;
    • d) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle für nicht-pathologische Zustände darstellt, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein für SIRS spezifisches Gen oder Genfragment ist;
    • e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA;
    • f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für SIRS spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Kontroll-RNA vor dem Messen der Proben-RNA mit der DNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfaßt und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als Proben-RNA mRNA verwendet wird.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des therapeutischen Verlaufs, zur Risikoabschätzung für Patienten sowie zur post mortem Diagnose von SIRS eingesetzt wird.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Säuger um einen Menschen handelt.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das für SIRS spezifische Gen oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 4168, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5–2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden.
  • Diese Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 4168 sind durch den Umfang der vorliegenden Erfindung mit umfaßt und sind dem angefügten 581-seitigen, 4168 Sequenzen umfassenden, Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen offenbart. Dieses Sequenzprotokoll beinhaltet zudem eine Zuordnung der einzelnen Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 4168 zu deren GenBank Accession Nr. (Internet-Zugang über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Sonden markiert werden. Für diese Ausführungsform finden selbstkomplementäre Oligonukleotide, so genannte Molecular beacons, als Sonden Verwendung. Sie tragen an ihren Enden ein Fluorophor/Quencher-Paar, so daß sie in Abwesenheit einer komplementären Sequenz in einer gefalteten Haarnadelstruktur vorliegen und erst mit einer entsprechenden Probensequenz ein Fluoreszenzsignal liefern. Die Haarnadelstruktur der Molecular Beacons ist so lange stabil, bis die Probe an der spezifischen Fängersequenzsequenz hybridisiert, was zu einer Konformationsänderung und damit auch Freisetzung der Reporterfluoreszenz führt.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die als cDNA von den in Anspruch 10 aufgelisteten Genen ersetzt wird durch synthetische Analoga, sowie Peptidonukleinsäuren.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die synthetische Analoga der Gene 5–100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere 32P, 14C, 125I, 155Ep, 33P oder 3H verwendet wird.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA dieselbe Markierung tragen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA unterschiedliche Markierungen tragen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle mittels elektrostatischer- und/oder Dipol-Dipo- und/oder hydrophobische Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:
    • a) Isolieren von Proben-Peptiden aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;
    • b) Markieren der Proben-Peptide mit einem detektierbaren Marker;
    • c) In-Kontakt-Bringen der markierten Proben-Peptide mit wenigstens einem Antikörper oder dessen bindendem Fragment, wobei der Antikörper ein für SIRS spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet;
    • d) In-Kontakt-Bringen von markierten Kontroll-Peptiden, welche aus gesunden Probanden stammen, mit wenigstens einem, in Form eines Microarray auf einem Träger immobilisierten Antikörper oder dessen bindendes Fragment, wobei der Antikörper ein für SIRS spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet;
    • e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der Proben-Peptide und der Kontroll-Peptide;
    • f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für SIRS spezifisches Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper auf einem Träger in Form eines Microarrays immobilisiert ist.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es als Immunoassay ausgebildet ist.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des therapeutischen Verlaufs, zur Risikoabschätzung für Patienten sowie zur post mortem Diagnose von SIRS eingesetzt wird.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Gewebe- oder Zellproben gegebenenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Säuger um einen Menschen handelt.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das für SIRS spezifische Peptid ein Expressionsprodukt eines Gen oder Genfragmentes ist, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 4168 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5–2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere 32P, 14C, 125I, 155Ep, 33P oder 3H verwendet wird.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Far- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker und/oder quantum dots oder ein elektrische messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide dieselbe Markierung tragen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide unterschiedliche Markierungen tragen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels Adsorption an das Trägermaterial immobilisiert werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels monoklonaler Antikörper oder deren bindenden Fragmenten erkannt werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmen einzelner Peptide mittels Immunoassay, oder Präzipitationsassay unter Verwendung monoklonaler Antikörper durchgeführt wird.
  • Eine weiter Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, für SIRS spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen oder davon abgeleiteten Protein-/Peptidsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in SIRS-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von SIRS.
  • Es ist dem Fachmann klar, daß die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.
  • Als Markergene im Sinne der Erfindung werden alle abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetischen Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren, PNA) verstanden. Weiterhin werden im Sinne der Erfindung alle von den Markergenen kodierten Proteine, Peptide bzw. Partialsequenzen oder synthetische Peptidomimetica verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
  • Die auf Blut bezogene Beschreibung der Erfindung stellt nur eine beispielhafte Anwendung der Erfindung dar. Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten des Menschen verstanden.
  • Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Messung der differentiellen Genexpression bei SIRS. Hierzu wird die RNA aus dem Vollblut von entsprechenden Patienten und eine Kontrollprobe eines gesunden Probanden oder eines nicht an SIRS erkrankten Patienten isoliert. Die RNA wird anschließend markiert, beispielsweise radioaktiv mit 32P oder mit Farbstoffmolekülen (Fluoreszenz). Als Markierungsmoleküle können alle im Stand der Technik zu diesem Zwecke bekannten Moleküle und/oder Detektionssignale eingesetzt werden. Entsprechende Moleküle und/oder Verfahren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.
  • Die so markierte RNA wird anschließend mit auf einem Microarray immobilisierten cDNA-Molekülen hybridisiert. Die auf dem Microarray immobilisierten cDNA-Moleküle stellen eine spezifische Auswahl der Gene gemäß Anspruch 10 dieser Erfindung für die Messung von SIRS dar.
  • Die Intensitätssignale der hybridisierten Moleküle werden im Anschluss durch geeignete Messgeräte (Phosporimager, Microarray-Scanner) gemessen und durch weitere softwaregestützte Auswertungen analysiert. Aus den gemessenen Signalintensitäten werden die Expressionsverhältnisse zwischen der Patientenprobe und der Kontrolle bestimmt. Aus den Expressionsverhältnissen der unter- und/oder überregulierten Gene lassen sich, wie in den nachstehend dargestellten Experimenten, Rückschlüsse auf das Vorhandensein von SIRS ziehen.
  • Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung der differentiellen Genexpression für die therapiebegleitende Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, daß Patienten auf die geplante Therapie ansprechen werden, und/oder für die Bestimmung des Ansprechens auf eine spezialisierte Therapie und/oder auf die Festlegung des Therapieendes im Sinne eines „drug monitoring" bei Patienten mit SIRS. Hierzu wird aus den in zeitlichen Abständen gesammelten Blutproben des Patienten die RNA (Proben-RNA) isoliert. Die verschiedenen RNA-Proben werden zusammen mit der Kontrollprobe markiert und mit ausgewählten Genen gemäß dem Anspruch 10, welche auf einem Microarray immobilisiert sind, hybridisiert. Aus den jeweiligen Expressionsverhältnissen läßt sich somit beurteilen, welche Wahrscheinlichkeit besteht, daß Patienten auf die geplante Therapie ansprechen werden und/oder ob die begonnene Therapie wirksam ist und/oder wie lange die Patienten noch entsprechend therapiert werden müssen und/oder ob der maximale Therapieeffekt mit der verwendeten Dosis und Dauer schon erreicht worden ist.
  • Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung des Bindungsgrades von Proteinen, beispielsweise monoklonaler Antikörper, mittels der Verwendung von Immunoassays, Protein- oder Peptidarrays oder Präpitationsassays. Durch die Bestimmung der Konzentration der von den Sequenzen der in Anwendungsbeispiel 1 aufgeführten Nukleinsäuren entsprechenden Proteine oder Peptide kann auf ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung einer SIRS geschlossen werden. Weiterhin ermöglicht diese Verfahrenweise die differentialdiagnostische Erkennung bei Patienten mit SIRS.
  • Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung des Ausführungsbeispiels.
    •
  • Ausführungsbeispiel 1:
  • Untersuchungen zur differentiellen Genexpression bei SIRS-erkrankten Patienten.
  • Für die Messung der differentiellen Genexpression bei SIRS wurden Untersuchungen von Vollblutproben von Patienten, welche auf einer operativen Intensivstation behandelt wurden, durchgeführt.
  • Als Kontrollproben dienten Vollblutproben der Patienten, welche unmittelbar vor der Operation entnommen wurden. Keiner dieser Patienten wies zu diesem Zeitpunkt oder vor der stationären Behandlung eine Infektion und/oder wies klinische Zeichen einer SIRS (definiert entsprechend SIRS-Kriterien [1]) auf.
  • Zusätzlich wurden Vollblutproben der gleichen operativ behandelten Patienten vier Stunden nach der Operation (Patientenproben) entnommen. Jeder dieser Patienten entwickelte nach der Operation eine SIRS. Ausgewählte Charakteristika der Patienten mit SIRS sind in Tabelle 1 dargestellt. Dabei werden Angaben zum Alter, Geschlecht, Diagnose sowie die Dauer der extrakorporalen Behandlung angegeben. Tabelle 1: Daten der Patientengruppe
    Figure 00140001
  • Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA unter Anwendungen des PAXGene Blood RNA Kit gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert. Im Anschluss wurde aus der totalen RNA die cDNA mittels reverser Transkrition mittels Superscript II RT (Invitrogen) nach dem Protokoll des Herstellers synthetisiert, mit Aminoallyl-dUTP und Succinimidylester von der Fluoreszenzfarbstoffe Cy3 und Cy5 (Amersham) markiert und hydrolisiert.
  • Für die Hybridisierung wurden die Microarrays (Lab-Arraytor human 500-1 cDNA) der Firma SIRS-Lab GmbH verwendet. Diese Microarrays sind mit 340 humanen cDNA-Molekülen bestückt. Die 340 humanen cDNA-Moleküle sind auf jedem Microarray 3-fach in drei Subarrays immobilisiert.
  • Die vorbereiteten und markierten Proben wurden mit den Microarrays entsprechend den Anweisungen des Herstellers hybridisiert und im Anschluss gewaschen. Die Fluoreszenzsignale der hybridisierten Moleküle wurden mittels eines Auslesegerätes (AXON 4000B) gemessen.
  • Auswertung
  • Die Auswertung eines Experiments erfolgte aufgrund von eingescannten Bildern der Mikroarrays nach der Hybridisierung. Der mittlere Intensitätswert der detektierten Spots wurde als der gemessene Expressionswert des zugehörigen Gens definiert. In einer Bildanalyse wurden Spots automatisch erkannt und ihre Homogenität überprüft. Die Analyse wurde manuell kontrolliert. Die ermittelten Signale beinhalteten neben der gewünschten Information, nämlich der Menge gebundener Nukleinsäuren aber auch Hintergrundsignale, welche durch unspezifische Bindungen an der Membranoberfläche verursacht wurden. Die Definition des Hintergrundbereichs ermöglichte eine optimale Unterscheidung zwischen Spots und der Chipoberfläche, welche ebenfalls Farbeffekte aufwies. In der Auswertung der Microarrays wurden leere Spots als Hintergrund gewählt. Der mittlere Expressionswert ausgewählter leeren Spots innerhalb eines Blocks (von 14 mal 14 Spots) wurde von Expressionswerten der Gene-Spots (im entsprechenden Block) subtrahiert.
  • Punktuelle Signale, die nicht durch Bindung von Nukleinsäuren sondern durch Staubpartikel oder sonstige Störungen auf dem Filter verursacht wurden, konnten von realen Spots durch ihre Unregelmäßigkeit der Form unterschieden werden und wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.
  • Um die Werte zwischen den 3 Subarrays und zwischen verschiedenen Microarrays miteinander vergleichbar zu machen, wurde anschließend eine Normalisierung der Daten notwendig. Wegen der hohen Anzahl der Spots auf dem Microarray wurde als Normalisierungsreferenz der Mittelwert aller Expressionswerte festgelegt. Für die Berechnung der mittleren Expression pro Gen wurden die zwei (aus drei) Wiederholungen gewählt, welche am nächsten zueinander lagen.
  • Aus den Signalintensitäten wurden mittels der Software AIDA Array Evaluation die Expressionsverhältnisse zwischen Kontroll- und Patientenproben Probe berechnet. Die Höhe des Expressionsverhältnisses jedes Gens stellte das Kriterium für eine Sortierung der untersuchten Gene dar. Von Interesse waren die Gene, die in den Patientenproben gegenüber Kontrollproben am meisten überexprimiert bzw. unterexprimiert wurden.
  • Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass 57 Gene der Patientenprobe gefunden wurden, die gegenüber der Kontrollprobe signifikant überexprimiert waren. Weiterhin wird aus Tabelle 3 deutlich, dass 16 Gene der Patientenprobe signifikant unterexprimiert gegenüber der Kontrollprobe waren. Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die in Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführten Gene mit dem Auftreten von SIRS korrelieren. Somit stellen die aufgeführten Genaktivitäten der Gene Marker für eine Diagnose von SIRS dar. Tabelle 2: Signifikant gesteigerte Transkriptionsaktivitäten und deren relatives Verhältnis zur Kontrollprobe bei SIRS
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    Tabelle 3: Signifikant reduzierte Transkriptionsaktivitäten und deren relatives Verhältnis zur Kontrollprobe bei SIRS
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  • Diese charakteristischen Veränderungen sind für das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 26 ausnutzbar.
  • Die in den Tabellen 2 und 3 aufgeführten GenBank Accession Nummern (Internet-Zugang Über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) der einzelnen Sequenzen sind in dem dieser Anmeldung angefügten 581-seitigen Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen jeweils einer Sequenz ID (Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 4168) zugeordnet. Dieses Sequenzprotokoll ist Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Ausführungsbeispiel 2:
  • Untersuchung zur Genexpression zwischen drei Patienten mit SIRS und einer Kontrollprobe.
  • Es wurde die Genexpression bei Patienten mit SIRS und einer Kontrollprobe gemessen. Alle Patienten entwickelten eine SIRS entsprechend den Kriterien nach [1]. Die Kontrollprobe wurde aus einem Patienten gewonnen, der operativ behandelt wurde, jedoch während der gesamten stationären Behandlung keine SIRS aufwiesen. Die Daten der Patienten mit SIRS und der Kontrolle sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4: Charakteristika der Patienten- und Kontrollproben
    Figure 00190001
  • Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA unter Anwendungen des RNAeasy-Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert. Im Anschluss wurde aus der totalen RNA die cDNA mittels reverser Transkrition mittels Superscript II RT (Invitrogen) nach dem Protokoll des Herstellers synthetisiert, mit 33P radioaktiv markiert und hydrolisiert.
  • Für die Hybridisierung wurden Filtermembranen der Deutschen Ressourcenzentrum für Genomforschung gGmbH (RZPD) verwendet. Diese Filtermembran war mit ca. 70.000 humanen cDNA-Molekülen bestückt.
  • Die vorbereiteten und markierten Proben wurden mit der Filtermembran entsprechend den Anweisungen des RZPD hybridisiert und im Anschluss gewaschen. Nach einer 24-stündigen Exposition im Phosphorimager wurden die radioaktiven Signale ausgewertet.
  • Auswertung
  • Die Auswertung der Genexpressionsdaten aus den radioaktiv markierten Filtern beruht auf der Messung der Färbungsintensitäten im digitalisierten Bild. Dazu werden über allen 57600 Spotpositionen kreisförmige Flächen definiert, innerhalb derer die Pixelintensitäten integriert werden. Die möglichst exakte Positionierung der Flächen über die Spots erfolgt automatisch durch die Analysesoftware (AIDA Array Evaluation, raytest Isotopenmessgeräte GmbH).
  • Die ermittelten Signale beinhalten neben der gewünschten Information, nämlich der Menge gebundener Nukleinsäuren aber auch Hintergrundsignale, welche durch unspezifische Bindungen an der Membranoberfläche verursacht werden. Um diese Einflüsse zu eliminieren, werden die Hintergrundsignale in 4608 leeren Flächen des Filters bestimmt und als Grundrauschen von den Hybridisierungssignalen subtrahiert.
  • Um die Werte verschiedener Filter miteinander vergleichbar zu machen, ist anschließend eine Normalisierung der Daten notwendig. Wegen der hohen Anzahl der Spots auf dem Filter wird als Normalisierungsreferenz der Mittelwert aller Expressionswerte festgelegt. Weiterhin ist der Ausschluss niedriger Spotsignale (unterhalb 10% des durchschnittlichen Expressionssignals) notwendig, da diese einem prozentual großen Fehler unterliegen und bei den späteren Berechnungen zu starken Schwankungen der Ergebnisse führen würden.
  • Die Selektion der SIRS-relevanten Gene basiert auf dem Vergleich der Genexpressionswerte bei einer Kontrollperson ohne SIRS gegenüber den Patienten mit SIRS. Die Höhe des Expressionsverhältnisses jedes Gens stellt das Kriterium für eine Sortierung der untersuchten Gene dar. Von Interesse sind die Gene, die in den Patienten gegenüber der Kontrolle signifikant überexprimiert bzw. unterexprimiert wurden.
  • Aus Tabelle 5 ist ersichtlich, dass 24 Gene der Patientenprobe gefunden wurden, die gegenüber der Kontrollprobe signifikant überexprimiert waren. Weiterhin wird aus Tabelle 6 deutlich, dass 24 Gene der Patientenprobe signifikant unterexprimiert gegenüber der Kontrollprobe waren. Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die in Tabelle 5 und Tabelle 6 aufgeführten Gene mit dem Auftreten von SIRS korrelieren. Somit stellen die aufgeführten Gene Markergene für die Diagnose von SIRS dar. Tabelle 5: Signifikant gesteigerte Transkriptionsaktivitäten und deren relatives Verhältnis zur Kontrollprobe bei SIRS
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    Tabelle 6: Signifikant reduzierte Transkriptionsaktivitäten und deren relatives Verhältnis zur Kontrollprobe bei SIRS
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  • Diese charakteristischen Veränderungen sind für das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 26 ausnutzbar.
  • Die in den Tabellen 5 und 6 aufgeführten GeneBank Accession Nummern (Internet-Zugang über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) der einzelnen Sequenzen sind in dem dieser Anmeldung angefügten 581-seitigen Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen jeweils einer Sequenz ID (Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 4168) zugeordnet. Dieses Sequenzprotokoll ist Teil der vorliegenden Erfindung.
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Claims (49)

  1. Verfahren zur in vitro Erkennung von akuten generalisierten entzündlichen Zuständen (SIRS), dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt: a) Isolieren von Proben-RNA aus einer aus einem Säuger stammenden Probe; b) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein für SIRS spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker; c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen; d) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle für nichtpathologische Zustände darstellt, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein für SIRS spezifisches Gen oder Genfragment ist; e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA; f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für SIRS spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kontroll-RNA vor dem Messen der Proben-RNA mit der DNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfaßt und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß nicht veränderte Gene aus der Proben- und/oder Kontroll-RNA als Bezugsgene für die Quantifizierung genutzt werden.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Proben-RNA mRNA verwendet wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des klinischen Verlaufs, zur individuellen Risikoabschätzung für Patienten, zur Abschätzung des wahrscheinlichen Ansprechens auf eine spezifische Behandlung sowie zur post mortem Diagnose von SIRS eingesetzt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Säuger um einen Menschen handelt.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 dadurch gekennzeichnet, daß das für SIRS spezifische Gen oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 4168, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5–2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 dadurch gekennzeichnet, daß die als cDNA von den in Anspruch 6 aufgelisteten Genen ersetzt wird durch synthetische Analoga, sowie Peptidonukleinsäuren.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet daß die synthetische Analoga der Gene 5–100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere 32P, 14C, 125I, 155Ep, 33P oder 3N verwendet wird.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA dieselbe Markierung tragen.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA unterschiedliche Markierungen tragen.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–19, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Sonden eine Markierung tragen.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22 dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle mittels elektrostatischer- und/oder Dipol-Dipol- und/oder hydrophobe Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.
  26. Verfahren zur in vitro Erkennung von SIRS, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt: a) Isolieren von Proben-Peptiden aus einer aus einem Säuger stammenden Probe; b) Markieren der Proben-Peptide mit einem detektierbaren Marker; c) In-Kontakt-Bringen der markierten Proben-Peptide mit wenigstens einem Antikörper oder dessen bindendem Fragment, wobei der Antikörper ein für SIRS spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet; d) In-Kontakt-Bringen von markierten Kontroll-Peptiden, welche aus gesunden Probanden stammen, mit wenigstens einem, in Form eines Microarray auf einem Träger immobilisierten Antikörper oder dessen bindendes Fragment, wobei der Antikörper ein für SIRS spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet; e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der Proben-Peptide und der Kontroll-Peptide; f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für SIRS spezifisches Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper auf einem Träger in Form eines Microarrays immobilisiert ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß es als Immunoassay ausgebildet ist.
  29. Verfahren nach Anspruch 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des therapeutischen Verlaufs, zur Risikoabschätzung für Patienten sowie zur post mortem Diagnose von SIRS und/oder Infektionen eingesetzt wird.
  30. Verfahren nach Anspruch 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.
  31. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
  32. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Säuger um einen Menschen handelt.
  33. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 32 dadurch gekennzeichnet, daß das für SIRS spezifische Peptid ein Exdpressionsprodukt eines Gen oder Genfragmentes ist, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 4168, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5–2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden.
  34. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
  35. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
  36. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
  37. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
  38. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 37 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
  39. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere 32P, 14C, 125I, 155Ep, 33P oder 3H verwendet wird.
  40. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.
  41. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide dieselbe Markierung tragen.
  42. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide unterschiedliche Markierungen tragen.
  43. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass die als Sonden Peptide verwendet werden, welche mit Antikörpern markiert sind und eine Signaländerung bei Bindung erfolgt.
  44. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 43 dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.
  45. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
  46. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle elektrostatischer- und/oder Dipol-Dipo- und/oder hydrophobische Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.
  47. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels monoklonaler Antikörper oder deren bindenden Fragmenten erkannt werden.
  48. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 47 dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmen einzelner Peptide mittels Immunoassay, oder Präzipitationsassay unter Verwendung monoklonaler Antikörper durchgeführt wird.
  49. Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, für SIRS spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen oder davon abgeleiteten Protein-/Peptidsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in SIRS-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von SIRS.
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