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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrolle von Microarrays und/oder Überwachung
von Experimenten unter Verwendung von Microarrays.
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Eine
Aufgabe der Molekularbiologie und der Chemie besteht darin, Bindungsereignisse
verschiedener Makromoleküle,
z. B. DNA-Fragmenten, quantitativ und qualitativ zu bestimmen. Dabei
bedient man sich u.a. sogenannter Microarrays, bei denen eine Sorte
von Makromolekülen
auf einer Festkörperoberfläche gebunden
und eine zweite Sorte von Makromolekülen in Lösung miteinander in Kontakt gebracht
werden („DNA-Microarrays", Herausgeber M.
Schena, Oxford University Press, 2000). Die auf der Festkörperoberfläche gebundenen
Moleküle
werden dabei meist in Form einer zweidimensionalen Matrix (Array)
angeordnet, wobei typischerweise bestimmte Muster verwendet werden,
die eine optimale Herstellung der Arrays gestatten. Zur Auswertung der
Experimente werden Markierungstechniken angewandt, die Bindungsereignisse
z. B. durch Fluoreszenzsignale anzeigen. Auch radioaktive oder elektrochemische
Markierungstechniken sind bekannt.
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Um
wertvolles Probenmaterial zu sparen, verwendet man in der Microarraytechnologie
meist ein Verfahren, bei dem eine gewisse Anzahl von Spots (bis
zu mehreren 10.000) auf einer Festkörperoberfläche – meist einem funktionalisierten
Glasträger,
wie z. B. einem Objektträger – mittels
sogenannter Spotter aufgebracht oder auch auf der Oberfläche synthetisiert
werden. Darauf wird dann ein kleines Flüssigkeitsprobenvolumen gegeben,
das die zu untersuchenden Probenmoleküle in meist unbekannter Konzentration
enthält.
Damit der gespottete Bereich des Microarrays komplett mit der Probenflüssigkeit
bedeckt wird, verwendet man einen zweiten Festkörper, meist ein Mikroskopdeckgläschen, das die
Probenflüssigkeit
bedeckt und so einen dünnen (Kapillar-)Spalt
definiert. Eine entsprechende Anordnung ist in 4 schematisch dargestellt. Die Spots 105 des
Microarrays sind auf die Oberfläche 103 des Substrates 101 aufgebracht.
Mit Hilfe eines zweiten Festkörpers 130 wird
der Spalt 115 definiert, in dem sich die Probenflüssigkeit 113 befindet.
Nach einer gewissen Reaktionszeit wird eine Meßgröße der Spots 105 untersucht,
die Auskunft darüber
gibt, ob und in welchem Maße
eine Hybridisierung der in den Spots 105 enthaltenen Makromoleküle mit Makromolekülen in der
Flüssigkeit
stattgefunden hat. Das Deckgläschen 130 stellt
also eine mechanische Barriere dar, die den Flüssigkeitsfilm 113 begrenzt
und über
das Microarray ausbreiten soll. Die Höhe des Flüssigkeitsfilmes beträgt meist
etwa 30 μm
bis 500 μm.
Die Dynamik der Moleküle
in der Flüssigkeit
bzw. die Reaktionskinetik wird im wesentlichen durch Diffusion bestimmt.
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Es
ist kaum festlegbar, wann ein Hybridisierungsexperiment den Gleichgewichtszustand
erreicht hat, da die Reaktionskinetik der Bindung von Molekülen in Lösung und
derjenigen auf den Spots eines Microarrays in ausgesprochen komplexer
Art und Weise von vielen Parametern abhängt, die im allgemeinen nicht
oder nur näherungsweise
bekannt sind. Dies sind u.a. die Konzentration der Moleküle in der
festen und flüssigen
Phase, konkurrierende Reaktionen, wie z. B. unspezifische Bindungen
an der Substratoberfläche,
die Größe der Moleküle und die Zusammensetzung
des Hybridisierungspuffers. Meist wird die Hybridisierung von DNA-Microarrays daher
als „Endpunkt-Experiment" durchgeführt, der Zeitpunkt
des Abbruchs jedoch wird meist willkürlich gewählt. Typisch ist eine Hybridisierungsdauer
z. B. über
Nacht.
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Im
allgemeinen ist es nicht möglich,
die Entwicklung der Signalintensität während der Hybridisierung als
Funktion der Zeit zu beobachten, so daß eine Aussage über das
Erreichen eines Gleichgewichtszustandes nicht möglich ist. Ist der Gleichgewichtszustand
bei der Auswertung noch nicht erreicht, wird die Reproduzierbarkeit
der Ergebnisse negativ beeinflußt.
Auch der Vergleich z. B. der ausgewerteten Fluoreszenzintensität von nominell
identischen Spots sagt nur relativ wenig über das Erreichen des Gleichgewichtszustandes
aus, da im allgemeinen von Vornherein nicht gesagt werden kann,
in welchem Maße
zwei nominell identische Spots tatsächlich identisch sind. Variationen
können
z. B. auf mangelnder Reproduzierbarkeit des Spotprozesses beruhen
und durchaus beträchtlich
sein. Ebenso ist nicht bekannt, mit welcher Qualität und Reproduzierbarkeit
die Festkörperoberfläche mit
den Spots belegt werden kann. Somit ist es schwierig, mangelnde Reproduzierbarkeit
der Hybridisierungsergebnisse bzw. Inhomogenitäten auf der Festkörperoberfläche entweder
auf eine schlechte Hybridisierung oder auf ein mangelhaftes Spotten
zurückzuführen.
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Um
eine gewisse Kontrolle über
die Reproduzierbarkeit derartiger Experimente zu gewährleisten,
werden bei bekannten Verfahren auf dem Microarray oft Repliken nominell
identischer Spots, die in geeigneter Weise auf dem Array verteilt
sind, aufgebracht. Durch einen Vergleich z. B. der Fluoreszenzintensität dieser
Spots lassen sich dann Rückschlüsse auf
die Homogenität
bzw. die Reproduzierbarkeit der Experimente ziehen. Zu diesem Zweck sind
Verfahren bekannt, die mit Bezug zu 5 erläutert werden,
die eine schematische Querschnittsansicht einer Anordnung zur Durchführung solcher bekannter
Verfahren zeigt. Auf der Festkörperoberfläche 103 des
Substrates 101 befinden sich die Spots 105 des
Microarrays, dessen Hybridisierungsverhalten mit Makromolekülen 132 in
der Flüssigkeit 113 untersucht
werden soll. Der Probenlösung 113 sind
zusätzlich
Testmoleküle 134 in
bekannter Konzentration zugegeben, die Idealerweise keine Kreuzreaktion
mit den zu untersuchenden Makromolekülen der Spots 105 des
Microarravs eingehen. Auf dem Microarray sind Testspots 107 in
bekannter Anordnung verteilt, die wiederum nur mit den Testmolekülen 134 hybridisieren.
Die Testmoleküle 134 sollen Idealerweise
nur spezifische Bindungen mit den speziellen Testspots 107 auf
dem Microarray eingehen. Dadurch ist es möglich, parallel zum eigentlichen
Hybridisierungsexperiment ein Kontrollexperiment mit vorzugsweise
bekanntem Ausgang durchzuführen und
daraus Rückschlüsse auf
das eigentliche Experiment zu ziehen.
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Für eine solche
Verfahrensführung
ist es notwendig, daß Testspots
auf das eigentliche Microarray aufgebracht werden. Die dabei gewählte geometrische
Anordnung, die Spotdichte und -größe etc. können im allgemeinen nicht frei
gewählt
werden, da die Spoteinrichtungen die Flüssigkeit in der Regel in einem
bestimmten Raster aus Mikro-Titerplatten aufnehmen und das Spotten
der Testspots und des Arrays in einem Durchgang erfolgten sollte.
Das führt im
allgemeinen zu regelmäßigen Anordnungen
solcher Testspots auf dem Array. Eine solche regelmäßige Anordnung
verringert den statistischen Wert der Auswertung der Reaktionen
der Testmoleküle
an den Testspots. Die Auswertung der Testspots erfolgt entweder
händisch
oder mit Hilfe elektronischer Datenverarbeitung. In letzterem Fall
müssen
Makros geschrieben werden, die z. B. eine kleine Anzahl von 100
Testspots in einem Array von oftmals einigen 10.000 Testspots auf
eine bestimmte Art und Weise miteinander vergleichen und auswerten.
Dabei ergibt sich die Schwierigkeit, die Position der Testspots
auf dem Array genau zu erkennen, da sich aufgrund der Toleranzen
bei dem Spotprozess Verschiebungen ergeben können. Auch bei dem beschriebenen
Verfahren unter Verwendung von Testmolekülen und Testspots können die
Einflüsse
des Spotprozesses selbst und der Hybridisierung auf Homogenität und Reproduzierbarkeit
der Ergebnisse nicht voneinander getrennt werden.
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Kontrolle
von Microarrays bzw. zur Überwachung
von Experimenten unter Verwendung von Microarrays anzugeben, das
möglichst genaue
Information über
die Homogenität
und Reproduzierbarkeit des Spotherstellungsprozesses und/oder des
Reaktionsgleichgewichtes geben kann.
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Diese
Aufgabe wird mit einem Verfahren zur Kontrolle von Microarrays und/oder Überwachung von
Experimenten unter Verwendung von Microarrays gelöst, das
die Merkmale des Anspruches 1 aufweist. Besondere Ausgestaltungen
sind Gegenstand von Unteransprüchen.
Die Aufgabe wird zudem mit einem Verfahren zur Untersuchung bzw.
zum Nachweis von Hybridisierungsreaktionen von Makromolekülen in einer
Flüssigkeit
mit Makromolekülen
an einer Festkörperoberfläche gelöst, das
die Merkmale des Anspruches 12 oder die Merkmale des Anspruches
13 aufweist.
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Erfindungsgemäß ist vorgesehen,
daß ein Microarray
mit einer ersten Vielzahl von Makromolekülen, die auf einer ersten Festkörperoberfläche in einer
vorgegebenen ersten Anordnung von Spots gebunden sind, bereitgestellt
wird. Dieses im folgenden als Probenarray bezeichnete Microarray
enthält
diejenigen Makromoleküle,
deren Hybridisierung mit Makromolekülen in der Probenflüssigkeit
analysiert werden soll. Erfindungsgemäß wird eine zweite Festkörperoberfläche mit
einer zweiten Vielzahl von Makromolekülen in einer zweiten Anordnung
von Spots bereitgestellt. Sowohl die erste als auch die zweite Festkörperoberfläche werden
mit der Flüssigkeit
in Kontakt gebracht, die Makromoleküle enthält, die zumindest mit den Makromolekülen der
Spots auf der zweiten Festkörperoberfläche hybridisieren
können. Dazu
werden die Makromoleküle
in den Spots der zweiten Festkörperoberfläche ggf.
entsprechend ausgewählt.
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Die
Anordnung wird derart gewählt,
daß sich die
Flüssigkeit
in Form eines Filmes zwischen den beiden Festkörperoberflächen befindet. Es wird dann eine
Meßgröße zumindest
eines Teiles der Spots auf der zweiten Festkörperoberfläche ausgewertet, die von dem
Hybridisierungsgrad der Makromoleküle in den Spots auf der zweiten
Festkörperoberfläche mit Makromolekülen in der
Flüssigkeit
abhängt.
Aus der Auswertung dieser Meßgröße lassen
sich die Qualitätsparameter
bei dem Experiment bestimmen.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird also die zweite begrenzende Festkörperoberfläche nicht nur als Begrenzungselement
für den
Flüssigkeitsfilm,
sondern als funktionalisiertes Kontrollelement eingesetzt. Der Abstand
zwischen dem Probenarray und dem so gebildeten Kontrollelement,
d.h. die Dicke des Flüssigkeitsfilmes,
ist mit z. B. 30 μm
bis 500 μm
in der Regel kleiner als die oder gleich der Distanz zwischen benachbarten
Spots auf dem Array, die aus fertigungstechnischen Gründen meist nicht
näher zueinander
als ca. 80 μm
bis 250 μm
aufgebracht werden können.
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Die
Spots des zweiten Microarrays, im folgenden Testarray genannt, können völlig unabhängig von
der Art, der Dichte oder des Layouts des Probenarrays angeordnet
bzw. ausgeführt
sein. Es ist nicht notwendig, eine kleine Anzahl von Spots aus der
großen
Anzahl von Spots des Probenarrays zu identifizieren. Das Testarray
ist ein zusätzliches
in das Experiment integrierbares Kontrollelement. Die Spots des
Testarrays auf der zweiten Festkörperoberfläche sind
in unmittelbarer Nähe
der Spots des Probenarrays auf der ersten Festkörperoberfläche angeordnet, da sie sich
im Abstand der Spalthöhe
von wenigen Mikrometern zueinander befinden. Es ist also mit großer Sicherheit
davon auszugehen, daß die
experimentelle Umgebung der Spots auf dem Probenarray und der Spots
auf dem Testarray gleich sind, wenn sich diese Spots z. B. gegenüberliegen.
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Die
Spots des Testarrays können
in vorbestimmter, aber beliebiger Anordnung auf dem Testarray angeordnet
sein, so daß insbesondere
keine regelmäßige Anordnung
notwendig ist.
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Bei
einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Korrelation
des Signals der Meßgröße nominell
identischer Spots auf dem Testarray ausgewertet. Ein Reaktionsgleichgewicht ist
erreicht, wenn diese Korrelation unabhängig von der Entfernung der
ausgewerteten Spots ist. Bei entsprechender Anordnung z. B. des
Auswertealgorithmus können
auch z. B. zwei verschiedene Spottypen mit unterschiedlichen Makromolekülen von
z. B. unterschiedlicher Konzentration für eine entsprechende Aussage
ausgewertet werden.
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Bei
der Auswertung der Korrelation von Signalen von zumindest zwei Spots
des Testarrays ist es also möglich,
vor der aufwendigen Analyse der Signale der großen Vielzahl von Spots auf
dem Probenarray zunächst
nur die Hybridisierung des Testarrays einer kleinen Anzahl von Spots
mittels einer einfachen Korrelationsanalyse auszuwerten und nur
bei einem positiven Ergebnis das umfangreiche Probenarray zu analysieren,
dessen Auswertung sehr viel Zeit in Anspruch nimmt.
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Die
Auswertung von zwei nominell identischen Spots auf der zweiten Festkörperoberfläche ermöglicht zudem
Aussagen über
den Grad der Übereinstimmung
dieser Spots, um Information über die
Reproduzierbarkeit des zugrundeliegenden Spotherstellungsprozesses
zu erhalten. Speziell wenn das Testarray auf der zweiten Festkörperoberfläche Felder
nominell identischer Spots oder überhaupt
nur eine Sorte nominell identischer Spots umfaßt, ist dazu nicht die Auswahl
bestimmter einzelner Spots notwendig, wie es bei den beschriebenen
Verfahren des Standes der Technik erforderlich ist. Die Distanz zweier
Spots, die auf diese Weise zur Auswertung eingesetzt werden, wird
dabei kleiner gewählt
als die Diffusionslänge
in den betrachteten Hybridisierungszeiten. Typische Werte für Diffusionslängen sind
abhängig
von der Größe der betrachteten
Moleküle,
der Temperatur oder der verwendeten Pufferlösung und liegen z. B. bei 100 μm/Stunde.
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Das
funktionalisierte Testarray kann mit Hilfe eines vollkommen unterschiedlichen
und unabhängigen
Ausleseverfahrens als das Probenarray verwendet werden. Möglich sind
z. B. die Fluoreszenzmarkierung mit einem anderen Farbstoff als
das Probenarray, die Markierung mit magnetischen Beads oder Metallkolloiden,
die Markierung mit radioaktiv markierten Beads, die Markierung mit
chemolumineszenten Bestandteilen, Ausleseverfahren, die ein elektrisches
Auslesen erlauben, oder Auslesen eines Farbumschlages etc.
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Zum
Beispiel bei einem elektrischen Ausleseprozess kann vorteilhafterweise
das Testarray separat kontaktiert werden und das Untersuchungsarray
kann ein Standardarray sein.
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Besonders
einfach ist es, wenn die auszuwertende Meßgröße des Testarrays dieselbe
Meßgröße ist,
die auch bei dem Probenarray zur Durchführung des Experimentes eingesetzt
wird. In der Regel kann dann für
die Auswertung der unterschiedlichen Meßgrößen der gleiche Meßaufbau
verwendet werden.
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Bei
einer besonderen Ausführungsform
umfaßt
das funktionalisierte Testarray zumindest in Teilbereichen eine
Kopie des Untersuchungsarrays in spiegelverkehrter Form. Das Spotmuster
ist also derart angeordnet, daß beim
Anordnen der beiden Festkörperoberflächen mit
dem Flüssigkeitsfilm
zwischen sich jeweils nominell identische Spots gegenüberliegen.
Eine solche Geometrie ist besonders vorteilhaft bei der Qualitätskontrolle
des Spotherstellungsprozesses, da die Entfernung der nominell identischen Spots
nur etwa 30 μm
bis 500 μm
entsprechend der Spaltdicke beträgt
und somit kleiner ist als der Diffusionsradius der Makromoleküle in der
Flüssigkeit
im Verlauf einiger Stunden. Die nominell identischen Spots haben
also eine chemisch identische Umgebung. Unterschiede in der Signalintensität können bei
einer solchen Verfahrensführung
nicht auf der Hybridisierung beruhen, sondern sind ausschließlich auf
die mangelnde Reproduzierbarkeit beim Spotten zurückzuführen. Auf
diese Weise wird also eine Qualitätskontrolle nur des Spotherstellungsprozesses
mit einem realen biologischen System durchführbar.
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Bei
einer besonders vorteilhaften Verfahrensführung wird so zunächst die Übereinstimmung der
Spots und damit die Reproduzierbarkeit des Spotherstellungsprozesses
geprüft.
Die gegenüberliegenden
Spots sind so nahe beieinander, daß sie im wesentlichen die gleiche
chemische Umgebung haben. Bei guter Übereinstimmung der Spots kann dann
wie oben beschrieben auf einfache Weise aus der Auswertung der Korrelation
zweier nominell identischer Spots des Testarrays Information über den Grad
des Reaktionsgleichgewichtes erhalten werden.
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Besonders
vorteilhaft ist es, wenn die Anordnung der Spots auf der ersten
Festkörperoberfläche in dem
Probenarray spiegelsymmetrisch bezüglich einer mittigen Achse
in der Ebene des Microarrays ist und das Testarray mit den Testspots
auf der zweiten Festkörperoberfläche nominell
identisch ist. Auf diese Weise ist es möglich, das Probenarray und
das Testarray identisch herzustellen und durch einfache Verdopplung
des Spotherstellungsprozesses die zwei für das erfindungsgemäße Verfahren
dieser Ausgestaltung notwendigen Microarrays zu erhalten.
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Der
Homogenisierungs- bzw. Verteilungsprozeß der Flüssigkeit in dem Spalt zwischen
den beiden Festkörperoberflächen kann
zusätzlich
gefördert werden.
Bei einer besonderen Ausführungsform
wird dazu ein Mischverfahren mit Hilfe des Impulsübertrages
von Oberflächenschallwellen
eingesetzt, ähnlich wie
es in WO 03/018181 A1 beschrieben ist. Dabei ist es von besonderen
Vorteil, daß die
Oberflächenschallwellen
mit auf dem Substrat integrierten Oberflächenschallwellenerzeugungseinrichtungen,
z. B. Interdigitaltransducern, einfach anzuregen sind.
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Besonders
vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Überprüfungsverfahren im Rahmen eines
Untersuchungs- bzw. Nachweisverfahrens für Hybridisierungsreaktionen
von Makromolekülen
einzusetzen. Es kann dann vor und/oder während der zu untersuchenden
Hybridisierungsreaktion die Reproduzierbarkeit des Spotherstellungsprozesses,
in dem die Spots für
die Hybridisierungsreaktion hergestellt worden sind, untersucht
werden bzw. die Homogenität
des Flüssigkeitsfilms
und die Einstellung des Reaktionsgleichgewichtes überwacht
werden.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
werden anhand der beiliegenden Figuren im Detail erläutert. Die
Figuren sind schematischer Natur und nicht notwendigerweise maßstabsgetreu.
Dabei zeigt:
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1: einen Querschnitt durch
eine Anordnung zur Durchführung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens,
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2: eine Draufsicht auf einen
Schnitt durch die Anordnung der 1 in
Blickrichtung II,
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3: einen Schnitt durch eine
Anordnung zur Durchführung
einer anderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens,
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4: einen Schnitt durch eine
Anordnung zur Durchführung
eines Verfahrens des Standes der Technik, und
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5: einen Schnitt durch eine
Anordnung zur Durchführung
eines anderen Verfahrens des Standes der Technik.
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1 zeigt eine schematische
Schnittansicht durch eine Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. 1 bezeichnet
z. B. einen Glasträger,
z. B. einen Objektträger,
auf den in an sich bekannter Weise ein Microarray aus Spots 5 aufgebracht
ist. Ein solches Microarray kann mehrere 10.000 solcher Spots umfassen,
die z. B. mit unterschiedlichen Makromolekülen funktionalisiert sind. Der
Abstand der einzelnen Spots beträgt
je nach Anwendung in der Regel 80 μm bis 250 μm. Mit 3 ist diejenige
Oberfläche
des Glassubstrates 1 bezeichnet, auf der dieses Probenarray
aufgebracht ist.
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Gegenüber der
Oberfläche 3 befindet
sich ein zweites Substrat 9, das ebenfalls z. B. ein Objektträger aus
Glas sein kann. Auf dessen dem Substrat 1 gegenüberliegender
Oberfläche 11 befinden
sich Testspots 7 in einer Anordnung eines Testmicroarrays.
Auch diese Spots sind in einem an sich bekannten Spotprozess aufgebracht
worden. Die Anzahl der Testspots 7 ist sehr viel kleiner
als die Anzahl der Spots des zu untersuchenden Arrays 5 und
wird z. B. von nur 100 Spots gebildet. Zwischen den Oberflächen 3, 11 der
Substrate 1, 9 befindet sich ein Spalt 15 einer
Höhe von
z. B. 30 μm
bis 500 μm.
Dieser Spalt wird in nicht gezeigter Weise z. B. mit entsprechenden
Abstandshaltern aufrecht erhalten. In dem Spalt 15 befindet
sich die Flüssigkeit 13,
die diejenigen Makromoleküle
enthält,
deren Hybridisierungsverhalten mit den Makromolekülen in den
Spots 5 untersucht werden soll.
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2 zeigt eine Draufsicht
auf die Oberfläche 11 in
Blickrichtung II. Erkennbar ist die Anordnung der Testspots 7,
die in regelmäßiger oder
unregelmäßiger Anordnung
vorgesehen sein können
und in sehr viel geringerer Anzahl als die gegenüberliegenden Untersuchungsspots 5 vorhanden
sind.
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3 zeigt eine Anordnung,
bei der ein Substrat 9 mit Testspots 7 in Form
eines Arrays vorgesehen ist, die in spiegelverkehrter Anordnung
zu den Spots 5 des Untersuchungsarrays auf der Oberfläche 3 des
Substrates 1 vorgesehen sind. So liegen sich nominell identische
Spots gegenüber.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann mit den gezeigten Ausführungsformen
wie folgt durchgeführt
werden. Auf den Objektträger 1 wird
in an sich bekannter Weise z. B. mit Hilfe eines an sich bekannten
Spotters ein Microarray aufgebracht. Dazu wird z. B. mit einem Feld
von Pipetten automatisiert aus einer Mikro-Titerplatte mit entsprechenden
Wirkstoffen Material entnommen und in dem Muster des Feldes der
Pipetten auf den Objektträger 1 in
Arrayform aufgebracht. Die einzelnen Spots enthalten dabei Makromoleküle, die
für den
einzelnen Spot charakteristisch sind. Die Spots unterscheiden sich
in der Regel durch die Art der Makromoleküle, die in ihnen gebunden sind.
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Auf
die Oberfläche 11 des
Substrates 9 werden in an sich ähnlicher Weise Testspots 7 in
sehr viel geringerer Anzahl aufgebracht. Einige oder alle dieser
Testspots sind nominell identisch und enthalten dieselbe Sorte Moleküle in nominell
gleicher Menge.
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Auf
das Microarray, das sich auf der Oberfläche 3 befindet, wird
ein kleines Volumen der Probenflüssigkeit
gegeben, das zu untersuchende Probenmoleküle in meist unbekannter Konzentration
enthält. Im
folgenden wird das Substrat 9 mit der Oberfläche 11,
auf dem sich die Testspots 7 befinden, in Richtung der
Oberfläche 3 des
Substrates 1 auf der Flüssigkeit
angeordnet, wobei ein wohldefinierter Abstand eingehalten wird.
Dies wird z. B. durch entsprechende Abstandshalter erreicht oder
in einer Vorrichtung, die bereits nur eine Anordnung in einem vorgegebenen
Abstand ermöglicht.
Die Höhe
des Flüssigkeitsfilmes
wird auf diese Weise zu etwa 30 μm
bis 500 μm
in gewünschter
Form eingestellt. Wie beschrieben sind die einzel nen Spots 5 des
Microarrays auf der Oberfläche 3 in
der Regel 80 μm
bis 150 μm auseinander.
Insofern unterliegt die vertikale Dimension der Figuren einem anderen
Maßstab
als die horizontale Dimension und ist insofern nur schematisch zu
verstehen.
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Die
Makromoleküle
sind dabei derart fluoreszenzmarkiert, daß sowohl die Spots 5 des
Untersuchungsarrays auf der Oberfläche 3 als auch die
Testspots 7 auf der Oberfläche 11 einen Fluoreszenzsignal
zeigen, das von der Hybridisierung mit den Makromolekülen der
Flüssigkeit 13 abhängt. Alternativ sind
die Makromoleküle
in der Flüssigkeit 13 entsprechend
fluoreszenzmarkiert.
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Gegebenenfalls
wird durch eine zusätzlich vorgesehene
Mischvorrichtung (z. B. unter Verwendung des Impulsübertrages
von Oberflächenschallwellen,
wie es in WO 03/018181 A1 beschrieben ist) gefördert.
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Die
wenigen Testspots 7 lassen sich auf einfache Weise lokalisieren
und auf ihre Fluoreszenz hin untersuchen, nachdem eine typische
Reaktionszeit vergangen ist. Das Reaktionsgleichgewicht ist erreicht,
wenn die Korrelation der Intensität nominell identischer Spots
auf dem Testarray unabhängig
von ihrer Entfernung ist. Wurde auf diese Weise festgestellt, daß sich das
Gleichgewicht eingestellt hat, so wird die sehr viel aufwendigere
Auswertung der Fluoreszenz der Testspots 5 in bekannter
Weise vorgenommen. Dabei ist vorteilhaft, daß sich die Testspots 7 in
unmittelbarer und chemisch gleicher Umgebung befinden wie die direkt
gegenüberliegenden
Spots 5 des Untersuchungsarrays auf der Oberfläche 3.
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Die
jeweilige Korrelation der Spotintensitäten von nominell identischen
Spots 7 des Testarrays auf der Oberfläche 11 kann hierbei
mit bekannten Verfahren der abstandsabhängigen Korrelationsrechnung über z. B.
die Ermittlung der jeweiligen Spotintensitäten der Fluoreszenz und Bildung
der jeweiligen Korrelation auch als Funktion der Zeit angegeben
werden. Bei geeigneter lateraler Anordnung der Testspots 7 kann
Auskunft über
die langreichweitige Homogenität
der Hybridisierungsbedingungen auf dem eigentlichen Microarray mit
den Untersuchungsspots 5 an der gegenüberliegenden Oberfläche 3 gegeben werden.
Das funktionalisierte Substrat 9 mit den Testspots 7 kann
darüber
hinaus auch ein vollkommen anderes und unabhängiges Ausleseverfahren als das
eigentliche Microarray aus Untersuchungsspots 5 auf der
Oberfläche 3 verwenden.
Zum Beispiel kann die Fluoreszenzmarkierung der Makromoleküle in den
Testspots 7 einen gänzlich
anderen Farbstoff verwenden als die markierten Makromoleküle in den Spots 5 des
eigentlichen Microarrays auf der Oberfläche 3.
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Wird
z. B. die Fluoreszenz der Makromoleküle in dem Untersuchungsspots 5 ausgewertet,
so können
andererseits die Makromoleküle
in den Testspots 7 mit magnetischen Beads oder Metallkolloiden,
mit radioaktiv markierten Beads oder z. B. mittels Chemolumineszenz
markiert sein. Ebenso ist es möglich,
Ausleseverfahren einzusetzen, die ein elektrisches Auslesen erlauben,
oder Makromoleküle derart
zu markieren, daß ein
Farbumschlag bei der Hybridisierung stattfindet.
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In
jedem Falle läßt sich über die
entsprechende Auswertung der Korrelation der Signale der einzelnen
Testspots 7 feststellen, ob die Flüssigkeit und die darin enthaltenen
Materialien homogen verteilt sind und sich auf diese Weise ein Reaktionsgleichgewicht
in dem gesamten Flüssigkeitsfilm 13 eingestellt
hat. Untersuchung nominell gleicher Spots mit einem Abstand kleiner
als die Diffusionslänge
in dem betrachteten Zeitraum gibt zudem Auskunft über die
Homogenität
und Reproduzierbarkeit des Spotprozesses.
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3 zeigt eine Anordnung zur
Durchführung
eines Verfahrens, bei dem eine spiegelverkehrte Kopie des Microarrays
auf der Oberfläche 3 des ersten
Substrates 1 auf der Oberfläche 11 des zweiten
Substrates 9 vorgesehen ist. Zunächst wird wie bereits mit Bezug
zu 1 beschrieben das
Microarray mit den Untersuchungsspots 5 auf der Oberfläche 3 in
einem bekannten Spotprozess aufgebracht. Auf die Oberfläche 11 des
Substrates 9 wird eine spiegelverkehrte Kopie desselben
Microarrays aufgebracht, wobei die Spots dieses identischen Testarrays
mit 7 bezeichnet sind. Besonders vorteilhaft ist es für diese Verfahrensführung, wenn
das Microarray spiegelsymmetrisch bezüglich einer mittigen Spiegelachse in
der Ebene des Arrays ist. Dann müssen
zur Erzeugung des Untersuchungsarrays mit den Spots 5 und des
Testarrays mit den Spots 7 nur zwei identische Microarrays
erzeugt werden.
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Die
so erzeugten Microarrays werden mit dem Flüssigkeitsfilm 13 zwischen
sich in analoger Weise gegenüber
angeordnet, wie es bereits mit Bezug zur Ausführungsform der 1 beschrieben ist. Es liegen sich dann
nominell identische Spots im Abstand von der Dicke des Flüssigkeitsfilmes
gegenüber.
Die Entfernung nominell identischer Spots ist damit kleiner als
der typische Diffusionsradius der Probenmoleküle, so daß die sich gegenüberliegenden Spots
eine chemisch im wesentlichen identische Umgebung haben. Unterschiede
in der ausgewerteten Fluoreszenzintensität können also nicht auf der Hybridisierung
beruhen, sondern sind ausschließlich
auf mangelnde Reproduzierbarkeit beim Spotten zurückzuführen. Auf
diese Weise kann eine Qualitätskontrolle
nur des Spotherstellungsprozesses mit einem realen biologischen
System durchgeführt
werden. Das registergerechte Übereinanderbringen
der nominell identischen Spots der zwei Arrays ist mit einfachen
mechanischen Mitteln leicht zu bewerkstelligen.
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Im
Anschluß an
diese Überprüfung der
Reproduzierbarkeit des Spotherstellungsprozesses kann dann z. B.
wie beschrieben aus der Korrelation der Signale zweier Spots des
Testarrays auf den Grad des Reaktionsgleichgewichtes geschlossen werden.
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Weitere
Ausführungsformen
von Anordnungen zur Durchführung
erfindungsgemäßer Verfahren umfassen
noch komplexere Testarrays, die z. B. eine elektrische Auslesung
geeigneter Parameter zur Bestimmung des Experimentfortschrittes
bzw. der Homogenität
der Hybridisierungsbedingungen erlauben. Dabei kann man positiv
von der Tatsache Gebrauch machen, daß das funktionalisierte Testarray getrennt
vom eigentlichen Microarray elektrisch kontaktiert werden kann.
Die Art der Auslesung erfolgt z. B. mittels Gleichstromverfahren
(z. B. Leitfähigkeitsmessung
an speziell präparierten
Meßbereichen), mittels
Wechselstromverfahren (z. B. dielektrische Verfahren, die kapazitive
Signale verarbeiten), induktive Meßverfah ren, die die Permeabilität speziell
präparierter
Meßbereiche
erfassen, mittels Hochfrequenzmeßverfahren (Oberflächenplasma
und Resonanzmethoden, die über
frustrierte Totalreflexion die dielektrische Umgebung speziell präparierter
Meßbereiche
erfassen) oder Meßverfahren
mit akustischen Oberflächenschallwellen,
die die Hochfrequenzleitfähigkeit,
die dielektrische Umgebung oder den Massenbelag speziell präparierter
Meßbereiche
erfassen.
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Bei
den erfindungsgemäßen Verfahren
werden nicht Teile des eigentlichen zu untersuchenden Microarrays
zur Kontrolle eingesetzt, sondern das gegenüberliegende Begrenzungssubstrat.
Vorteilhafterweise ist bei den erfindungsgemäßen Verfahren die vertikale
Distanz zwischen Microarray und Kontrollelement konstant und in
der Regel mit 30 μm
bis 500 μm
kleiner als die Distanz zwischen benachbarten Spots auf dem Array
(80 μm bis
250 μm).
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Mit
den erfindungsgemäßen Verfahren
läßt sich
auf vorteilhafte Weise die Reproduzierbarkeit des Spotherstellungsprozesses
und/oder das Erreichen eines Gleichgewichtes bzw. der Endpunkt eines Hybridisierungexperimentes
auf einfache Weise sicher überprüfen.