DE10315074A1

DE10315074A1 - Vorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE10315074A1
Application number: DE10315074A
Authority: DE
Inventors: Ralf Bickel; Thomas Dr. Ellinger; Eugen Ermantraut; Thomas Kaiser; Torsten Schulz; Thomas Ullrich
Original assignee: Clondiag Chip Technologies GmbH
Current assignee: Clondiag Chip Technologies GmbH
Priority date: 2003-04-02
Filing date: 2003-04-02
Publication date: 2004-10-14
Also published as: JP2006523095A; WO2004087951A2; EP2266699B1; WO2004087951A3; JP4917883B2; EP1610899A2; EP2266699A1; US20060078929A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren, umfassend eine Temperatursteuerungs- und/oder -regeleinheit; eine Reaktionskammer, die einen Träger mit einer Detektionsfläche enthält, auf der eine Substanzbibliothek immobilisiert ist, wobei die Temperatur in der Reaktionskammer durch die Temperatursteuerungs- und -regeleinheit steuerbar und/oder regelbar ist; und ein optisches System, mit dem der zeitliche Verlauf von Niederschlagsbildung auf der Detektionsfläche detektierbar ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren sowie zum Nachweis von spezifischen Wechselwirkungen zwischen molekularen Target- und Sondenmolekülen.

Biomedizinische Tests basieren häufig auf dem Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem Molekül, das in bekannter Menge und Position vorhanden ist (der molekularen Sonde) und einem nachzuweisenden, unbekannten Molekül bzw. nachzuweisenden, unbekannten Molekülen (den molekularen Ziel- oder Targetmolekülen). Bei modernen Tests sind die Sonden in Form einer Substanzbibliothek auf Trägern, den so genannten Microarrays oder Chips abgelegt, so dass eine Probe parallel an mehreren Sonden gleichzeitig analysiert werden kann (D. J. Lockhart, E. A. Winzeler, Genomics, gene expression and DNA arrays; Nature 2000, 405, 827–836). Für die Herstellung der Microarrays werden die Sonden dabei üblicherweise in vorgegebener Art und Weise auf einer geeigneten, beispielsweise in WO 00/12575 beschriebenen Matrix immobilisiert (siehe z.B. US 5,412,087 , WO 98/36827) bzw. synthetisch erzeugt (siehe z.B. US 5,143,854 ).

Der Nachweis einer Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem Targetmolekül erfolgt üblicherweise folgendermaßen: Nach der Fixierung der Sonde bzw. der Sonden in vorgegebener Art und Weise an einer bestimmten Matrix in Form eines Microarrays werden die Targets in einer Lösung mit den Sonden in Kontakt gebracht und unter definierten Bedingungen inkubiert. Infolge der Inkubation findet zwischen Sonde und Target eine spezifische Wechselwirkung statt. Die dabei auftretende Bindung ist deutlich stabiler als die Bindung von Targetmolekülen an Sonden, die für das Targetmolekül nicht spezifisch sind. Zum Entfernen von Targetmolekülen, die nicht spezifisch gebunden worden sind, wird das System mit entsprechenden Lösungen gewaschen oder erwärmt.

Der Nachweis der spezifischen Wechselwirkung zwischen einem Target und seiner Sonde kann dann durch eine Vielzahl von Verfahren erfolgen, die in der Regel von der Art des Markers abhängen, der vor, während oder nach der Wechselwirkung des Targetmoleküls mit dem Mikro-Array in Targetmoleküle eingebracht worden ist. Typischerweise handelt es sich bei solchen Markern um fluoreszierende Gruppen, so dass spezifische Target-Sonden-Wechselwirkungen mit hoher Ortsauflösung und im Vergleich zu anderen herkömmlichen Nachweismethoden, vor allem massensensitiven Methoden, mit geringem Aufwand fluoreszenzoptisch ausgelesen werden können (A. Marshall, J. Hodgson, DNA chips: An array of possibilities, Nature Biotechnology 1998, 16, 27–31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the art, Nature Biotechnology 1998, 16, 40–44).

Abhängig von der auf dem Mikro-Array immobilisierten Substanzbibliothek und der chemischen Natur der Targetmoleküle können anhand dieses Testprinzips Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Nukleinsäuren, zwischen Proteinen und Proteinen sowie zwischen Nukleinsäuren und Proteinen untersucht werden (zur Übersicht siehe F. Lottspeich, H. Zorbas, 1998, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin).

Als Substanzbibliotheken, die auf Microarrays oder Chips immobilisiert werden können, kommen dabei Antikörper-Bibliotheken, Rezeptor-Bibliotheken, Peptid-Bibliotheken und Nukleinsäure-Bibliotheken in Frage.

Die Nukleinsäure-Bibliotheken nehmen die mit Abstand wichtigste Rolle ein. Es handelt sich dabei um Microarrays, auf denen Desoxyribonukleinsäure- (DNA) Moleküle oder Ribonukleinsäure- (RNA) Moleküle immobilisiert sind.

Voraussetzung für die Bindung eines beispielsweise mit einer Fluoreszenzgruppe markierten Targetmoleküls in Form eines DNA- oder RNA-Moleküls an eine Nukleinsäuresonde des Microarrays ist, dass sowohl Targetmolekül als auch Sondenmolekül in Form einer einzelsträngigen Nukleinsäure vorliegen. Nur zwischen solchen Molekülen kann eine effiziente und spezifische Hybridisierung stattfinden. Einzelsträngige Nukleinsäureziel- und Nukleinsäuresondenmoleküle erhält man in der Regel durch Hitzedenaturierung und optimale Wahl von Parametern wie Temperatur, Ionenstärke und Konzentration helixdestabilisierender Moleküle. Somit wird gewährleistet, dass nur Sonden mit nahezu perfekt komplementären, d.h. einander entsprechenden Sequenzen mit der Zielsequenz gepaart bleiben (A.A. Leitch, T. Schwarzacher, D. Jackson, I. J. Leitch, 1994, In vitro Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin/Oxford).

Ein typisches Beispiel für die Verwendung von Microarrays in biologischen Testverfahren ist der Nachweis von Mikroorganismen in Proben in der biomedizinischen Diagnostik. Dabei macht man sich die Tatsache zunutze, dass die Gene für ribosomale RNA (rRNA) ubiquitär verbreitet sind und über Sequenzabschnitte verfügen, die für die jeweilige Spezies charakteristisch sind. Diese Spezies-charakteristischen Sequenzen werden in Form von einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden auf ein Mikro-Array aufgebracht. Die zu untersuchenden Target-DNA-Moleküle werden zunächst aus der zu untersuchenden Probe isoliert und mit Markern, beispielsweise fluoreszierenden Markern versehen. Anschließend werden die markierten Target-DNA-Moleküle in einer Lösung mit den auf dem Mikro-Array aufgebrachten Sonden inkubiert, unspezifisch auftretende Wechselwirkungen werden durch entsprechende Waschschritte entfernt und spezifische Wechselwirkungen durch fluoreszenzoptische Auswertung nachgewiesen. Auf diese Art und Weise ist es möglich, mit einem einzigen Test in einer Probe gleichzeitig z. B. mehrere Mikroorganismen nachzuweisen. Die Anzahl der nachweisbaren Mikroorganismen hängt bei diesem Testverfahren theoretisch nur von der Anzahl der spezifischen Sonden ab, die auf dem Mikro-Array aufgebracht worden sind.

Zur Detektion molekularer Wechselwirkungen mit Hilfe von Sonden-Arrays auf festen Oberflächen sind eine Reihe von Methoden und technischen Systemen beschrieben, von denen einige auch kommerziell erhältlich sind.

Klassische Systeme beruhen auf dem Vergleich der Fluoreszenzintensitäten spektral selektiv angeregter, mit Fluorophoren markierter Targetmoleküle. Fluoreszenz ist die Eigenschaft von bestimmten Molekülen, bei Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge selber Licht zu emittieren. Dabei ergibt sich ein charakteristisches Absorptions- und Emissionsverhalten. Bei der Analyse wird mit steigender markierter Moleküldichte auf der funktionalisierten Oberfläche, z.B. durch steigende Effizienz der molekularen Wechselwirkung zwischen Target- und Sondenmolekülen, eine proportionale Zunahme des Fluoreszenzsignals angenommen.

Die insbesondere quantitative Detektion von Fluoreszenzsignalen wird mit modifizierten Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie vorgenommen. Dabei wird das Licht der Absorptionswellenlänge von dem der Emissionswellenlänge mittels Filter oder Dichroiten getrennt und das Messsignal mittels optischer Elemente wie Objektive und Linsen auf geeignete Detektoren wie z.B. zweidimensionale CCD-Arrays bildgebend abgebildet. Die Analyse erfolgt im Allgemeinen durch digitale Bildverarbeitung.

Die bislang bekannten technischen Lösungen unterscheiden sich hinsichtlich ihres optischen Aufbaus und der verwendeten Komponenten. Probleme und Limitationen solcher Aufbauten resultieren aus dem Signalrauschen (dem Hintergrund), das durch Effekte wie Bleichen und Quenching der verwendeten Farbstoffe, Autofluoreszenz der Medien, Assemblierungselementen und optischen Komponenten sowie Streuungen, Reflexionen und Fremdlicht im optischen Aufbau wesentlich bestimmt wird.

Daraus resultiert ein hoher technischer Aufwand zum Aufbau hochsensitiver Fluoreszenz-Detektoren zum qualitativen und quantitativen Vergleich von Sonden-Arrays. Insbesondere zum Screening mit mittleren und hohen Durchsätzen sind speziell angepasste Detektionssysteme erforderlich, die einen gewissen Automatisierungsgrad besitzen.

Zur Optimierung von Standardepifluoreszenz-Aufbauten zum Auslesen molekularer Arrays sind CCD-basierte Detektoren bekannt, die zur Diskriminierung von optischen Effekten wie Streuung und Reflexionen die Anregung der Fluorophore im Dunkelfeld durch Auflicht oder Durchlicht realisieren (siehe z.B. C. E. Hooper et al., "Quantitative Photon Imaging in the Life Sciences Using Intensified CCD Cameras", Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence (1990), S. 337–344). Die Abbildung der Assays erfolgt dabei entweder in einer Belichtung oder durch ein Rastern unter Verwendung von höher auflösender Optik. Die Verwendung von multispektralen Belichtungsquellen ermöglicht einen relativ einfachen Zugang zu verschiedenen Fluorophoren durch die Verwendung verschiedener Anregungsfilter(-kombinationen). Nachteilig ist allerdings, daß Autofluoreszenz und systembedingte optische Effekte wie die Beleuchtungshomogenität über dem Assay komplizierte Beleuchtungsoptiken und Filtersysteme erfordern.

Weitere Methoden zur quantitativen Detektion von Fluoreszenzsignalen basieren auf der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie. In einer typischen konfokalen Anordnung wird das Objekt in der Brennebene des Objektivs durch eine Punktlichtquelle beleuchtet. Das vom Objekt zurückgestrahlte Licht wird durch einen Strahlteiler in Richtung eines optischen Punktlichtdetektors gespiegelt und nachgewiesen. Punktlichtquelle, Objekt und Punktlichtdetektor liegen dabei in exakt optisch konjugierten Ebenen. Daher wird Licht, das von außerhalb der Brennebene stammt, nicht scharf am Detektor fokussiert und damit gar nicht erst registriert. So werden Objektteile, die ober- oder unterhalb der Brennebene liegen, ausgeblendet. In dieser Eliminierung des störenden Streulichtanteils außerhalb der Brennebene liegt der Vorteil der konfokalen Methode. Das Gesamtbild entsteht dadurch, dass der Lichtpunkt zeilenförmig über das Objekt geführt wird ("Scannen"). Die bei diesem Rastervorgang aufgenommenen Bilddatensätze werden nachträglich zu einem 2D- bzw. 3D-Bild kombiniert.

Aufgabe der Scaneinheit ist es, den Lichtstrahl rasterförmig über das unter dem Mikroskop befindliche Objekt zu bewegen. Dazu gibt es prinzipiell vier Möglichkeiten:

a) Das Objekt wird auf einem beweglichen Tisch am ortsfesten Laser vorbeigeführt. Der Laser ist dabei in Ruhestellung.
b) Das Objekt ist beweglich und wird am ortsfesten Laser vorbeigeführt. Auch hierbei ist der Laser in Ruhestellung.
c) Der bewegliche Laserstrahl wird am Objekt vorbeigeführt. Das Objekt ist dabei in Ruhestellung.
d) Der Laserstrahl wird in einer Achse, das Objekt in der anderen Achse bewegt.

Beispielsweise in US 5,304,810 beschriebene konfokale Scanning-Systeme beruhen auf der Selektion der Fluoreszenzsignale entlang der optischen Achse mittels zweier Pinholes. Daraus ergibt sich ein hoher Justieraufwand der Proben bzw. die Etablierung eines leistungsfähigen Autofokussystems. Solche Systeme sind in der technischen Lösung hochkomplex. Erforderliche Komponenten wie Laser, Pinholes, gegebenenfalls gekühlte Detektoren wie z.B. PMT, Avalanche-Dioden oder CCD, komplexe hochgenaue mechanische Translationselemente und Optiken müssen mit erheblichem Aufwand aufeinander optimiert und integriert werden (siehe z.B. US 5,459,325 ; US 5,192,980 ; US 5,834,758 ). Der Miniaturisierungsgrad und Preis ist durch die Vielzahl und Funktionalität der Komponenten limitiert.

Analysen basierend auf Sonden-Arrays werden somit zum derzeitigen Zeitpunkt in der Regel fluoreszenzoptisch ausgelesen (siehe A. Marshall und J. Hodgson, DNA Chips: An array of possibilities, Nature Biotechnology, 16, 1998, 27–31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the Art, Nature Biotechnology, 16, Jan. 1998, 40–44). Nachteilig an den vorstehend beschriebenen Detektionsverfahren ist jedoch der hohe Signalhintergrund, der zu einer eingeschränkten Genauigkeit führt, der teilweise erhebliche technische Aufwand sowie die hohen Kosten, die mit den Nachweisverfahren verbunden sind.

Es sind eine Reihe insbesondere konfokaler Systeme bekannt, die für die Detektion von niederintegrierten Substanzbibliotheken im Array-Format geeignet sind, die in fluidischen Kammern angebracht sind (siehe z.B. US 5,324,633 , US 6,027,880 , US 5,585,639 , WO 00/12759).

Zur Detektion von hochintegrierten molekularen Arrays, die insbesondere in fluidischen Systemen angebracht sind, sind die oben beschriebenen Methoden und Systeme vor allem wegen der dort auftretenden Streuungen, Reflexionen und optischen Aberrationen allerdings nur sehr bedingt adaptierbar. Ferner werden bei derartigen hochintegrierten Arrays hohe Anforderungen hinsichtlich der räumlichen Auflösung gestellt, die jedoch bislang technisch nicht realisiert werden konnten.

Es besteht folglich ein Bedarf an hochintegrierten Arrays, mit denen mit relativ geringem technischen Aufwand die Wechselwirkung zwischen Sonden und Targets mit hoher Genauigkeit qualitativ und/oder quantitativ nachgewiesen werden kann.

Die Erhöhung der Selektivität und der Zugang zu alternativen Komponenten motiviert die Etablierung alternativer Imaging-Technologien wie Fluoreszenz-Polarisation und zeitaufgelöste Fluoreszenz für festkörpergebundene Assays. Solche Lösungen insbesondere für hochintegrierte Arrays liegen derzeit jedoch nur konzeptionell vor. Der Effekt der Verdrehung der Polarisationsachse durch polarisiert angeregte Fluorophore wird zur Quantifizierung im Mikrotiter-Format angewandt. Es gibt ferner Ansätze, durch die Verwendung entsprechend modifizierter Polymerfolien als Polarisationsfilter kostengünstige Systeme mit hohem Durchsatz (HTS-Systeme) aufzubauen (siehe I. Gryczcynski et al., Polarisation sensing with visual detection", Anal. Chem. 1999, 71, 1241–1251). Die zur Verfügung stehenden Lichtmengen und Detektoren erschweren derzeit allerdings eine Umsetzung auf Mikroarrays. Ein derartiger Aufbau würde die Integration von Lichtquellen (z.B. Laser, LED, Hochdrucklampen), Polarisationsfiltern (u.U. beschichtete Polymerfolien) und Detektoren (CCD-, CMOS-Kamera) erfordern, eine entsprechende Lösung ist bislang nicht bekannt.

Neuere Entwicklungen nutzen die Fluoreszenz von anorganischen Materialien, wie zum Beispiel von Lanthaniden (M. Kwiatowski et al., Solid-phase synthesis of chelate-labelled oligonucleotides: application in triple-color ligase-mediated gene analysis, Nucleic Acids Research, 1994, 22, 13) und Quantendots (M. P. Bruchez et. al., Semiconductor Nanocrystals as Fluorescent Biological Labels, Science 1998, 281, 2013). Die Ausnutzung der spezifischen Fluoreszenzlebensdauer von Fluorophoren im ns-Bereich zu deren selektiven Quantifizierung ist sehr aufwendig und wird trotz der Spezifität in dieser ortsaufgelösten Applikation kommerziell nicht verwendet. Farbstoffe mit langer Emissionsdauer im μs-Bereich wie Lanthanid-Gelate erfordert eine Umwandlung der Farbstoffe in eine mobile Phase, so dass eine ortsaufgelöste Detektion nicht möglich ist.

Die Verwendung von Mikropartikeln, die aus ihrer Verwendung in Fernsehröhren bekannt sind (siehe F. van de Rijke et al., Up-Converting Phosphors: A New Reporter Technology for Nucleic Acid Microarrays, European EC Meeting on Cytogenetics (2000) Bari, Italien), als biologische Marker hat bezüglich Sensitivität und Miniaturisierbarkeit des Aufbaus der Detektionstechnik großes Potential, zumal zur Anregung Lichtquellen aus der Datenübertragung Verwendung finden (980 nm Dioden-Laser). Diese Technologie ist jedoch z.Zt. nicht kommerziell zur Detektion von Target/Sonden-Wechselwirkungen auf Arrays verfügbar. Ein Detektor würde Komponenten zur Lichtemission (z.B. Laser, LED, Hochdrucklampen), ein System zur Modulierung des Anregungs- und Detektionslichtes (z.B. Chopperscheiben, elektronische Shutter) und Detektion des zeitverzögerten Signals (z.B. CCD-, CMOS-Kamera) beinhalten. Als grundsätzlich problematisch erweist sich in der Regel die geringe Kompatibilität der Partikel mit biologischen Proben.

In der internationalen Patentanmeldung WO 00172018 sind optische Aufbauten zur Detektion von mittels Goldbeads markierten Proben und deren Sichtbarmachung mittels Silberverstärkung beschrieben. Die dortigen Vorrichtungen sind allerdings lediglich für eine Detektion bei statischer Messung geeignet. Bei der statischen Messung wird nach der Wechselwirkung der Targets mit dem auf dem Sondenarray angeordneten Sonden sowie nach Beginn der Reaktion, die zu einem Niederschlag auf Array-Elementen führt, an denen eine Wechselwirkung stattgefunden hat; ein Bild aufgenommen und den gemessenen, von dem Grad der Niederschlagsbildung abhängigen Grauwerten Konzentrationen zugeordnet.

In der internationalen Patentanmeldung WO 02/02180 wurde beschrieben, dass diese Vorgehensweise der statischen Messung für das jeweilige Array-Element nur in einem sehr schmalen Konzentrationsbereich zu zufriedenstellenden Werten führt und damit auch für die Bewertung der Spezifität von Wechselwirkungen problematisch ist, da die Niederschlagsbildung in hohem Maße nicht linear erfolgt. Insbesondere umfasst der zeitliche Verlauf der Niederschlagsbildung einen exponentiellen Anstieg der Niederschlagsbildung mit der Zeit sowie ein darauffolgendes Sättigungsniveau. Lediglich Grauwerte aus dem Bereich des exponentiellen Anstiegs der Niederschlagsbildung mit der Zeit lassen eine Korrelation mit der Menge an gebundenen Targets zu, während das bei der Niederschlagsbildung auf einem Array-Element nach einer bestimmten, von der jeweiligen Sonden/Target-Wechselwirkung abhängigen und damit für jedes Array-Element unterschiedlichen Zeit erreichte Sättigungs-Niveau einer Quantifizierung nach Abschluss der Niederschlagsbildungs-Reaktion entgegensteht. Es ist nicht möglich, die Experimentparameter so zu gestalten, daß zweifelsfrei sichergestellt ist; daß das Sättigungsniveau auf keinem der Array-Elemente erreicht ist, da die Reaktionsgeschwindigkeit in starkem Maße von Temperatur, Licht, Salzkonzentration, pH und weiteren Faktoren abhängt.

Bei Aufnahme lediglich eines Bildes, also bei statischer Messung, kann folglich nicht gewährleistet werden, daß sich die Niederschlagsbildungs-Reaktionen auf allen Array- Elementen in dem exponentiellen Bereich der Abhängigkeit der Niederschlagsbildung von der Zeit befinden. Somit werden Signalintensitäten, beispielsweise Grauwerte, die von Array-Elementen erhalten werden, bei denen sich die Niederschlagsreaktion bereits im Sättigungsbereich befindet, im Vergleich zu Signalintensitäten von Array-Elementen, die sich noch im exponentiellen Bereich der Niederschlagsbildung befinden, verfälscht dargestellt.

Um die vorstehend beschriebenen Nachteile zu überwinden, wurde in WO 02/02810 ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von Targets in einer Probe durch molekulare Wechselwirkungen zwischen Sonden und Targets auf Sonden-Arrays bereitgestellt, bei dem der zeitliche Verlauf der Niederschlagsbildung an den Array-Elementen in Form von Signalintensitäten detektiert wird, d.h. eine dynamische Messung durchgeführt wird. Jedem Array-Element wird dann anhand einer Kurvenfunktion, die die Niederschlagsbildung als Funktion der Zeit beschreibt, ein Wert zugeordnet, der die Wechselwirkung zwischen Sonde und Target auf einem Array-Element und damit die Menge an gebundenen Targets quantifiziert.

Für eine derartige dynamische Messung ist die Aufnahme von Bilderserien unter z.B. bestimmten thermischen Bedingungen bzw. in einem bestimmten Verfahrensstadium, z.B. bei Vorhandensein bestimmter Lösungen zur Zeit der Aufnahme, erforderlich. Dies bedingt ein komplexes Zusammenwirken der einzelnen Bauteile eines hochintegrierten Arrays insbesondere bei Anwendungen im Bereich des Genotyping.

Bei vielen Tests in der biomedizinischen Diagnostik tritt ferner das Problem auf, dass vor dem eigentlichen Testverfahren die Targetmoleküle zunächst in ausreichender Menge vorhanden sein müssen und damit häufig aus der Probe zunächst vervielfältigt werden müssen. Die Vervielfältigung von DNA-Molekülen geschieht durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Für die Vervielfältigung von RNA müssen die RNA-Moleküle durch reverse Transkription in entsprechend komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt werden.

Diese cDNA kann dann ebenfalls durch PCR vervielfältigt (amplifiziert) werden. Bei der PCR handelt es sich um eine Labor-Standardmethode (wie z.B. in Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Die Vervielfältigung von DNA durch PCR ist verhältnismäßig schnell, ermöglicht durch miniaturisierte Verfahren einen hohen Probendurchsatz in geringen Ansatzvolumina und ist durch Automatisierung arbeitseffizient.

Eine Charakterisierung von Nukleinsäuren durch eine alleinige Vervielfältigung ist jedoch nicht möglich. Vielmehr ist es notwendig, nach der Amplifikation Analysemethoden wie Nukleinsäuresequenzbestimmungen, Hybridisierung und/oder elektrophoretische Trenn- und Isolationsverfahren zur Charakterisierung der PCR-Produkte einzusetzen.

Generell sollten Vorrichtungen und Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren und deren Nachweis so konzipiert sein, dass möglichst wenige Eingriffe seitens eines Experimentators notwendig sind. Die Vorteile von Verfahren, die eine Vervielfältigung von Nukleinsäuren und deren Nachweis ermöglichen und in deren Verlauf ein Experimentator nur minimal eingreifen muss, liegen auf der Hand. Zum einen werden Kontaminationen vermieden. Zum anderen ist die Reproduzierbarkeit solcher Verfahren wesentlich erhöht, da sie einer Automatisierung zugänglich sind. Dies ist auch im Hinblick auf Zulassung von diagnostischen Verfahren extrem wichtig.

Es gibt gegenwärtig eine Vielzahl von Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren und deren Nachweis, bei denen zunächst das Target-Material durch PCR-Amplifikation vervielfältigt wird und die Identität bzw. der genetische Zustand der Zielsequenzen anschließend durch Hybridisierung gegen einen Sondenarray bestimmt wird. Die Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure- bzw. Target-Moleküle ist in der Regel notwendig, um ausreichende Mengen für einen qualitativen und quantitativen Nachweis im Rahmen der Hybridisierung zur Verfügung zu haben.

Sowohl die PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren als auch der Nachweis der selben durch Hybridisierung ist einer Reihe von grundlegenden Problemen unterworfen. Dies gilt in gleicher Weise für Verfahren, die eine PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren und deren Nachweis durch Hybridisierung kombinieren.

Eines der Probleme, das bei Verfahren, die PCR und Hybridisierung kombinieren, auftritt, ist in der Doppelsträngigkeit der Target-Moleküle begründet. Klassische PCR-Amplifikationsreaktionen erzeugen ausgehend von einem doppelsträngigen Template-Molekül üblicherweise doppelsträngige DNA-Moleküle. Diese können nur nach vorhergehender Denaturierung mit den Sonden des Sondenarrays hybridisieren. Während der Hybridisierungsreaktion konkurriert die sehr schnelle Doppelstrangbildung in der Lösung mit der Hybridisierung gegen die immobilisierten Sonden des Sondenarrays. Die Intensität der Hybridisierungssignale und damit die quantitative und qualitative Auswertung der Verfahrensergebnisse werden durch diese Kompetitionsreaktion stark begrenzt.

Hinzu kommen die Probleme, die in der Hybridisierungs-Reaktion an sich bzw. den zur Hybridisierung gebrachten Sonden und Target begründet sind. PCR-Produkte, die als Targets für Array-Hybridisierungs-Reaktionen Verwendung finden, weisen in der Regel eine Länge von mindestens circa 60 Basenpaaren auf. Dies entspricht der Summe der Längen der zur PCR-Reaktion verwendeten forward- und reverse-Primer sowie der Region, die durch die PCR amplifiziert wird und Komplementarität zur Sonde auf dem Array aufweist. Einzelsträngige Moleküle dieser Länge liegen in Lösung häufig nicht unstrukturiert, d.h. linear gestreckt vor, sondern weisen mehr oder wenig stabile Sekundärstrukturen, wie z.B. Haarnadeln oder andere helikale Strukturen, auf. Wenn diese Sekundärstrukturen den Bereich des Targets betreffen, der Komplementarität zur Sonde aufweist, verhindert die Ausbildung der genannten Sekundärstrukturen eine effiziente Hybridisierung des Targets an die Sonde. Die Ausbildung von Sekundärstrukturen kann somit ebenfalls eine effiziente Hybridisierung inhibieren und eine quantitative und qualitative Auswertung der Verfahrensergebnisse erschweren, wenn nicht gar verhindern.

Somit besteht ferner ein Bedarf an Vorrichtungen, die die Durchführung von PCR und Analysereaktion, wie z.B. einer Hybridisierungsreaktion, in einem Reaktionsraum ermöglichen.

Insbesondere besteht ein Bedarf an hochintegrierten Arrays, mit denen die quantitative Wechselwirkung zwischen Sonden und Targets durch Detektion des zeitlichen Verlaufs einer Niederschlagsbildung, wie z.B. durch Detektion von mittels Goldbeads markierten Proben und deren Sichtbarmachung mittels Silberverstärkung, mit hoher Genauigkeit nachgewiesen werden kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, die vorstehend genannten Probleme des Stands der Technik, die sich insbesondere durch die mangelnde Kompatibilität des Assays mit dem Testsystem ergeben, zu überwinden.

Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, mit dem molekulare Wechselwirkungen zwischen Sonden und Targets auf Sonden-Arrays mit hoher Genauigkeit und auf einfache und kostengünstige Weise qualitativ und/oder quantitativ nachgewiesen werden können.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, mit der eine hohe dynamische Auflösung bei der Detektion erreicht wird, d.h. der Nachweis schwacher Sonden/Target-Wechselwirkungen neben starken Signalen gewährleistet bleibt.

Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, die eine nahezu gleichzeitige Vervielfältigung und Charakterisierung von Nukleinsäuren mit einem hohen Durchsatz ermöglicht.

Diese und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.

Dabei wird die Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass eine Vorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren zur Verfügung gestellt wird, die mindestens eine Temperatursteuerungs- und/oder -regeleinheit; eine Reaktionskammer, die eine Detektionsfläche mit einer darauf immobilisierten Sonden-Substanzbibliothek enthält; sowie ein optisches System, mit dem der zeitliche Verlauf von Niederschlagsbildungen auf der Detektionsfläche detektierbar ist, umfasst.

Ein in der Reaktionskammer befindlicher Chip, der einen Träger mit einer Detektionsfläche umfasst, auf der eine Substanzbibliothek immobilisiert ist, gewährleistet die Möglichkeit der Bereitstellung einer sehr hohen Sondendichte in der Reaktionskammer.

Die elektrokalorische Steuerung bzw. Regelung durch die Temperatursteuerungs- und/oder -regeleinheit erlaubt die Einstellung von definierten Temperaturen sowohl während der Prozessierung der zu untersuchenden Probe in der Reaktionskammer als auch während der Detektion der Hybridisierungsereignisse. Somit wird sowohl eine verbesserte Kontrolle als auch eine Optimierung der Nachweisreaktion gewährleistet. Ferner erlaubt die Einstellung definierter Temperaturen über die Temperatursteuerungs- bzw. -regelungseinheit die Durchführung von komplexen Reaktionen wie zum Beispiel von Amplifikationsreaktionen durch PCR.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich ferner dadurch aus, dass aufgrund des integrierten optischen Systems bzw. des Readersystems eine Detektion von molekularen Wechselwirkungen auch im Handbetrieb möglich ist. Dies ist insbesondere in Bereichen wie der medizinischen Diagnostik vorteilhaft. Dadurch, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung ein integriertes optisches System enthält, mit dem der zeitliche Verlauf von Niederschlagsbildungen auf der Detektionsfläche detektierbar ist, wird eine exakte Bestimmung der relativen quantitativen Menge von an die Substanzbibliothek gebundenen Nukleinsäuren gewährleistet.

Allgemein erlaubt die erfindungsgemäße Vorrichtung eine nahezu gleichzeitige, zeiteffiziente und wenig störanfällige Durchführung von Aufarbeitungs- bzw. Konditionierungsreaktionen und die Chip-basierte Charakterisierung von Nukleinsäuren. Dabei wird unter einer Aufarbeitungs- bzw. Konditionierreaktion erfindungsgemäß eine Reaktion verstanden, deren Reaktionsprodukte durch Chip-basierte Experimente charakterisiert werden können.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Detektion von molekularen Wechselwirkungen in geschlossenen Reaktionskammern besteht vorzugsweise aus vier funktionellen Hauptelementen (siehe 1). Die mechanische, elektrische und fluidische Aufnahme der Reaktionskammer erfolgt in einem Aufnahmemodul (1). Die Reaktionskammer wird im folgenden auch als Mikroreaktor bezeichnet. Für die Detektion der Reaktionsergebnisse wird ein optisches System (2) bereitgestellt. Die Verarbeitung der Reaktionsergebnisse zu einem Analyseergebnis kann in einem Controller (3) erfolgen. Das Analyseergebnis wird gegebenenfalls durch geeignete Verbindungselemente (4) der Speicherung und/oder _ Weiterverarbeitung zur Verfügung gestellt.

Eine Reaktionskammer, die vorteilhaft als Bauteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesetzt werden kann, ist in der internationalen Patentanmeldung WO 01/02094 ausführlich beschrieben, auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.

Die ggf. durch einen Barcode identifizierbare Reaktionskammer ist in einem fluidischen Aufnahmemodul eingebracht, wo sie mit einer oder mehreren Reaktionslösungen befüllt werden kann. Die Reaktionskammer weist ferner gegebenenfalls elektrische Kontakte auf, wodurch zum Beispiel über integrierte Sensor- und/oder Heizelemente eine thermische Steuerung bzw. Regelung von Reaktionen in der Reaktionskammer gewährleistet ist. Dies ist insbesondere vorteilhaft für die Durchführung von thermisch empfindlichen Amplifikationsreaktionen für DNA oder RNA, Hybridisierungen von DNA oder RNA oder Reaktionen zur Signalverstärkung wie zum Beispiel durch Metallfällungen an entsprechend markierten und an die Substanzbibliothek gebundenen Target-Molekülen.

Die für die Durchführung der Vervielfältigungs- und Nachweisreaktionen erforderlichen Lösungen, wie Reaktions- und/oder Spüllösungen, sind über geeignete Verbindungselemente wie zum Beispiel Kanäle in die Reaktionskammer einbringbar. Geeignete Controller können der Überwachung des Reaktionsverlaufs dienen.

Das optische System gewährleistet die bildgebende Abbildung der Substanzbibliothek während oder nach Abschluss der Vervielfältigungs- und/oder Nachweisreaktionen auf einen geeigneten Detektor, der beispielsweise als zweidimensionales elektrisch auslesbares Detektionselement ausgeführt ist. In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird die Probe mittels eines Beleuchtungsmoduls bzw. einer Lichtquelle des optischen Systems beleuchtet und die entstehenden Signale entsprechend der verwendeten Markierungen gefiltert abgebildet.

Das optische System gewährleistet ferner eine kinetische, d.h. dynamische Aufnahme der Reaktionsergebnisse. Insbesondere ist das optische System der erfindungsgemäßen Vorrichtung dazu geeignet, den zeitlichen Verlauf eines Silberniederschlags zur Verstärkung von Hybridisierungssignalen zwischen Gold-markierten Target-Molekülen und der Substanzbibliothek aufzuzeichnen. Der hochintegrierte Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung erlaubt die Übergabe von mehreren Bildern während des Reaktionsverlaufs zur Verarbeitung in einem geeigneten Datenverarbeitungsmodul oder Controller.

Die durch den zeitlichen Verlauf der Niederschlagsbildung entstehenden Veränderungen auf den jeweiligen Array-Elementen können in der erfindungsgemäßen Vorrichtung, wie u.a. in der internationalen Patentanmeldung WO 02/02810 ausführlich beschrieben ist, ausgewertet werden. Auf den Inhalt der internationalen Patentanmeldung WO 02/02810 wird hiermit ebenfalls ausdrücklich Bezug genommen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung gewährleistet ferner über gegebenenfalls vorhandene elektronische Schnittstellen die Übergabe der Rohdaten oder Analyseergebnisse an externe Rechner- oder Rechnernetze zum Beispiel zur Speicherung dieser Daten.

Zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden ferner unter anderem folgende Definitionen verwendet: Unter einer Sonde bzw. einem Sondenmolekül wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Molekül verstanden, das zum Nachweis anderer Moleküle durch ein bestimmtes, charakteristisches Bindungsverhalten bzw. eine bestimmte Reaktivität verwendet wird. Für die auf dem Array angeordneten Sonden kommt jede An von Molekülen in Frage, die sich an feste Oberflächen koppeln lassen und eine spezifische Affinität aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um Biopolymere aus den Klassen der Peptide, Proteine, Nukleinsäuren und/oder deren Analoga. Besonders bevorzugt sind die Sonden Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäureanaloga.

Als Sonde werden insbesondere Nukleinsäuremoleküle definierter und bekannter Sequenz bezeichnet, die benutzt werden, um in Hybridisierungsverfahren Target-Moleküle nachzuweisen. Als Nukleinsäuren können sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle verwendet werden. Beispielsweise kann es sich bei den Oligonukleotidsonden um Oligonukleotide mit einer Länge von 10 bis 100 Basen, vorzugsweise 15 bis 50 Basen und besonders bevorzugt von 20 bis 30 Basen Länge handeln. Typischerweise handelt es sich erfindungsgemäß bei Sonden um einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle oder Moleküle von Nukleinsäureanaloga, bevorzugt einzelsträngige DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle, die mindestens über einen Sequenzbereich verfügen, der zu einem Sequenzbereich der Target-Moleküle komplementär ist. Je nach Nachweisverfahren und Anwendung können die Sonden auf einem festen Trägersubstrat, z.B. in Form eines Microarrays immobilisiert sein. Darüber hinaus können sie je nach Nachweisverfahren radioaktiv oder nicht-radioaktiv markiert sein, so dass sie über die im Stand der Technik übliche Nachweisreaktion nachgewiesen werden können.

Unter einem Target bzw. einem Targetmolekül wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das mit einer molekularen Sonde nachzuweisende Molekül verstanden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den zu detektierenden Targets um Nukleinsäuren. Der erfindungsgemäße Sonden-Array kann jedoch analog auch zum Nachweis von Protein/Sonden-Wechselwirkungen, Antikörper/Sonden-Wechselwirkungen, usw. eingesetzt werden.

Falls es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei den Targets um Nukleinsäuremoleküle handelt, die durch eine Hybridisierung gegen auf einem Sondenarray angeordnete Sonden nachgewiesen werden, umfassen diese Target-Moleküle in der Regel Sequenzen mit einer Länge von 40 bis 10000 Basen, bevorzugt von 60 bis 2000 Basen, ebenfalls bevorzugt von 60 bis 1000 Basen, insbesondere bevorzugt von 60 bis 500 Basen und am meisten bevorzugt von 60 bis 150 Basen. Ihre Sequenz beinhaltet gegebenenfalls die Sequenzen von Primern, sowie die durch die Primer definierten Sequenzbereiche des Templates. Bei den Target-Molekülen kann es sich insbesondere um einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle handeln, von denen ein oder beide Stränge radioaktiv oder nicht-radioaktiv markiert sind, so dass sie in einem der im Stand der Technik üblichen Nachweisverfahren nachgewiesen werden können.

Als Target-Sequenz wird erfindungsgemäß der Sequenzbereich des Targets bezeichnet, der durch Hybridisierung mit der Sonde nachgewiesen wird. Erfindungsgemäß wird auch davon gesprochen, dass dieser Bereich durch die Sonde adressiert wird.

Unter einer Substanzbibliothek wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl von unterschiedlichen Sondenmolekülen verstanden, vorzugsweise mindestens zwei bis 1.000.000 unterschiedliche Moleküle, besonders bevorzugt mindestens 10 bis 10.000 unterschiedliche Moleküle und am meisten bevorzugt zwischen 100 und 1.000 unterschiedlichen Molekülen. Die Substanzbibliothek ist vorzugsweise als Array auf einem Träger in der Reaktionskammer der erfindungsgemäßen Vorrichtung angeordnet.

Unter einem Sonden-Array wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Anordnung von molekularen Sonden bzw. einer Substanzbibliothek auf einem Träger verstanden, wobei die Position einer jeden Sonde separat bestimmt ist. Vorzugsweise umfasst der Array definierte Stellen bzw. vorbestimmte Bereiche, so genannte Array-Elemente, die besonders bevorzugt in einem bestimmten Muster angeordnet sind, wobei jedes Array-Element üblicherweise nur eine Spezies an Sonden beinhaltet. Die Anordnung der Moleküle bzw. Sonden auf dem Träger kann dabei durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen erzeugt werden. Eine Position innerhalb der Anordnung, d.h. des Arrays, wird üblicherweise als Spot bezeichnet. Der Sonden-Array bildet somit die Detektionsfläche.

Unter einem Array-Element bzw. einem vorbestimmten Bereich bzw. einem Spot wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein für die Deposition einer molekularen Sonde bestimmtes Areal auf einer Oberfläche verstanden, die Summe aller belegten Array-Elemente ist das Sonden-Array.

Unter einem Trägerelement bzw. Träger bzw. Substanzbibliothekenträger wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Festkörper verstanden, auf dem das Sonden-Array aufgebaut ist. Bei dem Träger, der üblicherweise auch als Substrat oder Matrix bezeichnet wird, kann es sich z.B. um Objektträger oder Wafer handeln. Die Gesamtheit aus in Array-Anordnung auf der Detektionsfläche abgelegten Molekülen bzw. der in Array-Anordnung auf der Detektionsfläche abgelegten Substanzbibliothek und dem Träger wird häufig auch als "Chip", "Microarray", "DNA-Chip", Sondenarray" etc. bezeichnet.

Unter einem Kammerträger wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Festkörper verstanden, der eine Grundfläche für die Reaktionskammer bildet. Vorzugsweise ist der Kammerträger auf der dem Substanzbibliothekenträger gegenüberliegenden Seite angeordnet. Bei einer alternativen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann der Kammerträger aber auch gleichzeitig als Substanzbibliothekenträger dienen.

Unter einem Kammerkörper wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der die Reaktionskammer bildende Festkörper verstanden. Der Substanzbibliothekenträger bzw. der Chip ist üblicherweise Teil des Kammerkörpers, wobei der Substanzbibliothekenträger aus einem anderen Material gebildet sein kann als der übrige Kammerkörper.

Herkömmliche Arrays bzw. Microarrays im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen etwa 50 bis 10.000, vorzugsweise 150 bis 2.000 unterschiedliche Spezies von Sondenmolekülen auf einer, vorzugsweise quadratischen, Fläche von z.B. 1 mm bis 4 mm × 1 mm bis 4 mm, vorzugsweise von 2 mm × 2 mm.

Unter einer Mikrotiterplatte wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Anordnung von Reaktionsgefäßen in einem bestimmten Raster verstanden, die die automatisierte Durchführung einer Vielzahl von biologischen, chemischen und labormedizinischen Tests gestattet.

Eine Markierung bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine detektierbare Einheit, beispielsweise ein Fluorophor oder eine Ankergruppe, an die eine detektierbare Einheit gekoppelt werden kann.

Als Primer wird üblicherweise ein kurzes DNA- oder RNA-Oligonukleotid (circa 12 bis 30 Basen) bezeichnet, das komplementär zu einem Abschnitt eines größeren DNA- oder RNA-Moleküls ist und über eine freie 3-OH-Gruppe an seinem 3'-Ende verfügt. Aufgrund dieser freien 3'-OH-Gruppe kann der Primer als Substrat für beliebige DNA- oder RNA-Polymerasen dienen, die in 5'-3'-Richtung Nukleotide an den Primer synthetisieren. Die Sequenz der neu synthetisierten Nukleotide ist dabei durch die Sequenz des mit dem Primer hybridisierten Templates vorgegeben, die jenseits der freien 3'-OH-Gruppe des Primers liegt. Primer üblicher Länge umfassen zwischen 12 bis 50 Nukleotide, bevorzugt zwischen 15 und 30 Nukleotide.

Als Template oder Template-Strang werden üblicherweise ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül oder ein Nukleinsäurestrang bezeichnet, der als Vorlage zur Synthese von komplementären Nukleinsäuresträngen dient.

Als Hybridisierung wird die Bildung von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen oder Duplexmolekülen aus komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen bezeichnet. Im Rahmen einer Hybridisierung können z.B. DNA-DNA-Duplexes, DNA-RNA- oder RNA-RNA-Duplexes gebildet werden. Durch eine Hybridisierung können auch Duplexes mit Nukleinsäureanaloga gebildet werden, wie z.B. DNA-PNA-Duplexes, RNA-PNA-Duplexes, DNA-LNA-Duplexes und RNA-LNA-Duplexes. Hybridisierungsexperimente werden üblicherweise benutzt, um die Sequenzkomplementarität und damit die Identität zwischen zwei verschiedenen Nukleinsäuremolekülen nachzuweisen.

Unter Prozessierung werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Aufreinigungs-, Markierungs-, Amplifikations-, Hybridisierungs- und/oder Wasch- und Spülschritte, sowie weitere beim Nachweis bzw. der Detektion von Targets mit Hilfe von Substanzbibliotheken durchgeführte Verfahrensschritte verstanden.

Ein wesentliches Merkmal der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Integration einer Temperatursteuerungs- und/oder -regeleinheit, einer temperaturregulierbaren Reaktionskammer sowie eines optischen Systems, das eine dynamische Messung von Signalverstärkungsreaktionen durch Niederschlagsbildung gewährleistet, in einer Vorrichtung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit insbesondere eine Vorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren, die folgende Elemente umfasst:

a) eine Temperatursteuerungs- und/oder -regeleinheit;
b) eine Reaktionskammer, die einen Träger mit einer Detektionsfläche enthält, auf der eine Substanzbibliothek immobilisiert ist, wobei die Temperatur in der Reaktionskammer durch die Temperatursteuerungs- und -regeleinheit steuerbar und/oder regelbar ist; und
c) ein optisches System, mit dem der zeitliche Verlauf von Niederschlagsbildungen auf der Detektionsfläche detektierbar ist.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann beispielsweise so ausgeführt sein, dass der Kammerkörper der Reaktionskammer, der den Chip mit der Detektionsfläche enthält, dichtend auf einem Kammerträger so aufgebracht ist, dass ein Probenraum mit einem Kapillarspalt zwischen dem Kammerträger und der Detektionsfläche des Chips gebildet wird, der temperaturregulierbar und durchflusssteuerbar ist. Diese Art der Konstruktion erlaubt es, Reaktionen, die effizient nur in bestimmten Temperaturbereichen ablaufen, durchzuführen und die Reaktionsprodukte vorzugsweise gleichzeitig durch Chip-basierte Experimente zu detektieren.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann somit zum Beispiel verwendet werden, um nahezu gleichzeitig durch PCR Nukleinsäuremoleküle zu vervielfältigen und die PCR-Produkte durch Chip-basierte Experimente nachzuweisen. Die Probenflüssigkeit für derartige Reaktionen kann durch entsprechende Mittel zur Temperaturregulation effizient beheizt und gekühlt werden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch verwendet werden, um eine reverse Transkription-Reaktion durchzuführen und auf diese Weise mRNA in cDNA zu überführen und die Reaktionsprodukte durch Hybridisierung am Chip zu charakterisieren. Auf diese Weise kann ein so genanntes "gene profiling" durchgeführt werden. Da sowohl die reverse Transkription als auch die Hybridisierung in einer Kammer durchgeführt werden, ist dieses Verfahren äußerst zeiteffizient und wenig störanfällig.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann ferner zum Beispiel ein Restriktionsverdau bei gewünschten Temperaturen in der Reaktionskammer durchgeführt werden und die Reaktionsprodukte durch Hybridisierung an einem Chip charakterisiert werden. Die Denaturierung der Enzyme kann durch Hitzedeaktivierung erfolgen. Damit ermöglicht die erfindungsgemäße Vorrichtung eine zeiteffiziente Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus-Kartierung (RFLP-Kartierung).

Mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung kann ferner zum Beispiel auch eine Ligation durchgeführt werden.

Erfindungsgemäße Vorrichtungen können ferner verwendet werden, um das Bindungsverhalten von Proteinen in Abhängigkeit von der Temperatur durchzuführen. Zum Beispiel kann auf diese Weise getestet werden, ob Antikörper nach Erhitzen über einen längeren Zeitraum noch in der Lage sind, ihre entsprechenden Antigene zu binden. Voraussetzung hierfür ist, dass in diesem Fall der Chip nicht durch Nukleinsäuremoleküle, sondern durch die entsprechenden Proteine bzw. Peptide funktionalisiert ist.

Der Kammerkörper der Reaktionskammer besteht vorzugsweise aus Materialien wie Glas, Kunststoff und/oder Metallen wie Edelstahl, Aluminium und Messing. Zu seiner Herstellung können beispielsweise Spritzguss-geeignete Kunststoffe verwendet werden. Unter anderem sind Kunststoffe wie Makrolon, Nylon, PMMA und Teflon denkbar. Alternativ kann der Reaktionsraum zwischen Substanzbibliothekenträger und Kammerträger aber auch durch Septen abgeschlossen sein, die beispielsweise ein Befüllen des Reaktionsraums mittels Spritzen ermöglichen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Kammerkörper aus optisch durchlässigen Materialien wie Glas, PMMA, Polycarbonat, Polystyrol und/oder Topas. Dabei ist die Wahl der Materialien dem Verwendungszweck der Vorrichtung anzupassen. Zum Beispiel sind die Temperaturen, denen die Vorrichtung ausgesetzt sein wird, bei der Wahl der Materialien zu beachten. Soll die Vorrichtung zum Beispiel für die Durchführung einer PCR verwendet werden, dürfen z.B. nur solche Kunststoffe eingesetzt werden, die über längere Zeiträume bei Temperaturen wie 95°C stabil sind.

Der Kammerträger besteht vorzugsweise aus Glas, Kunststoffen, Silizium, Metallen und/oder keramischen Materialien. Zum Beispiel kann der Kammerträger aus Aluminiumoxid-Keramiken, Nylon und/oder Teflon bestehen.

Bei einer Ausführungsform besteht der Kammerträger aus transparenten Materialien wie Glas und/oder optisch durchlässigen Kunststoffen, z.B. PMMA, Polycarbonat, Polystyrol oder Acryl.

Vorzugsweise ist der Kammerträger mit in der erfindungsgemäßen Vorrichtung integrierten Mitteln zur Temperaturbeaufschlagung verbunden und sollte dann bevorzugt aus Materialien bestehen, die gut wärmeleitend sind. Derartige wärmeleitfähige Materialien bieten den wesentlichen Vorteil, dass sie ein homogenes Temperaturprofil über die gesamte Fläche des Reaktionsraums gewährleisten und somit temperaturabhängige Reaktionen wie beispielsweise eine PCR in der gesamten Reaktionskammer homogen, mit hoher Ausbeute und mit hoher Genauigkeit steuerbar bzw. regelbar durchführbar sind.

Somit besteht der Kammerträger bei einer bevorzugten Ausführungsform aus Materialien mit einer hohen Wärmeleitfähigkeit, insbesondere im Bereich von 15 bis 500 W·m^–1·K^–1, die üblicherweise nicht optisch transparent sind. Beispiele für geeignete wärmeleitfähige Materialien sind Silizium, keramische Materialien wie Aluminiumoxid-Keramiken und/oder Metalle wie Edelstahl, Aluminium oder Messing.

Vorzugsweise ist der Kammerträger auf seiner Rückseite, d.h. der der Reaktionskammer abgewandten Seite mit ggf. miniaturisierten Temperaturfühlern und/oder Elektroden versehen bzw. weist dort Heizerstrukturen auf, so dass ein Temperieren der Probenflüssigkeit sowie eine Durchmischung der Probenflüssigkeit durch einen induzierten elektroosmotischen Fluss möglich ist.

Die Temperaturfühler können beispielsweise als Nickel-Chrom-Dickfilm-Widerstandstemperaturfühler ausgeführt sein.

Die Elektroden können beispielsweise als Gold-Titan-Elektroden und insbesondere als Quadrupol ausgeführt sein.

Die Mittel zur Temperaturbeaufschlagung können vorzugsweise so gewählt werden, dass ein schnelles Erhitzen und Abkühlen der Flüssigkeit im Kapillarspalt möglich ist. Unter schnellem Erhitzen und Abkühlen wird dabei verstanden, dass durch die Mittel zur Temperaturbeaufschlagung Temperaturänderungen in einem Temperaturbereich von 0,5° K/s bis 10° K/s vermittelt werden können. Vorzugsweise können durch die Mittel zur Temperaturbeaufschlagung Temperaturänderungen von 1° K/s bis 10° K/s vermittelt werden.

Die Mittel zur Temperaturbeaufschlagung, zum Beispiel in Form von Heizern, können beispielsweise als Nickel-Chrom-Dickfilm-Widerstandsheizer ausgeführt sein.

Für weitere Einzelheiten über die Spezifikation und Dimension der Temperaturfühler, Mittel zur Temperaturbeaufschlagung und der Elektroden wird auf den Inhalt der internationalen Patentanmeldung WO 01/02094 verwiesen.

Der Chip kann vorzugsweise aus Borofloat-Gläsern, Quarzglas, einkristallinem CaF₂, Saphir-Scheiben, Topas, PMMA, Polycarbonat und/oder Polystyrol bestehen. Die Wahl der Materialien ist ebenfalls am späteren Verwendungszweck der Vorrichtung bzw. des Chips auszurichten. Wird der Chip zum Beispiel für die Charakterisierung von PCR-Produkten verwendet, dürfen nur solche Materialien eingesetzt werden, die einer Temperatur von 95°C standhalten können.

Die Chips sind bevorzugt durch Nukleinsäuremoleküle, insbesondere durch DNA- oder RNA-Moleküle funktionalisiert. Sie können aber auch durch Peptide und/oder Proteine, wie zum Beispiel Antikörper, Rezeptormoleküle, pharmazeutisch aktive Peptide und/oder Hormone funktionalisiert werden.

Erfolgt die Detektion des zeitlichen Verlaufs von Niederschlagsbildungen auf der Detektionsfläche im Dunkelfeld, d.h. werden Änderungen der Streuungseigenschaften der Detektionsfläche detektiert, sind bevorzugte Materialien für den Substanzbibliothekenträger optische transparente Materialien wie Glas, besonders bevorzugt Borosilikatglas, und transparente Polymere wie z.B. PMMA, Polycarbonat und/oder Acryl; für den Kammerträger optisch transparente Materialien, wie Glas und/oder Kunststoffe, und insbesondere optisch nicht transparente Materialien wie Silizium, keramische Materialien; und für die Reaktionskammer Kunststoffe wie Makrolon, PMMA, Polycarbonat, Teflon und dergleichen, Metalle wie Edelstahl, Aluminium, und/oder Messing sowie Glas. Alternativ kann bei Durchführung von Dunkelfeldmessungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung der Kammerträger aus optisch transparenten Materialien bestehen, während der Substanzbibliothekenträger aus nicht transparenten Materialien besteht.

Bei einer Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung zusätzlich mindestens einen Fluidbehälter, der mit der Reaktionskammer verbunden ist, sowie gegebenenfalls eine Einheit zur Steuerung des Be- und Entladens der Reaktionskammer mit Fluiden. Unter Fluiden werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Flüssigkeiten oder Gase verstanden. Die Verbindung der Fluidbehälter mit der Reaktionskammer kann beispielsweise wie in der internationalen Patentanmeldung WO 01/02094 ausgeführt sein.

Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung eine mit dem optischen System verbundene Einheit zur Verarbeitung von durch das optische System aufgenommenen Signalen. Diese Kopplung von Detektiereinheit und Verarbeitungseinheit, die die Umwandlung der Reaktionsergebnisse in das Analyseergebnis gewährleistet, erlaubt u.a. den Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Handgerät beispielsweise in der medizinischen Diagnostik.

Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung ferner eine Schnittstelle für externe Rechner. Dies erlaubt die Übertragung von Daten zur Speicherung außerhalb der Vorrichtung.

Das optische System, mit dem der zeitliche Verlauf von Niederschlagsbildungen auf der Detektionsfläche des Chips detektierbar ist, umfasst vorzugsweise einen zweidimensional auslesbaren Detektor. Der Detektor ist vorzugsweise eine Kamera, insbesondere eine CCD- oder CMOS-Kamera oder eine ähnliche Kamera. Durch Verwendung von Kameras mit elektrischen Bildwandlern wie zum Beispiel CCD- oder CMOS-Chips können hohe örtliche Auflösungen realisiert werden.

Die im optischen System der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesetzten Kameras gewährleisten, dass die Beleuchtungsintensität homogen auf der abzubildenden Fläche verteilt ist und die zu detektierenden Signale durch Reflexion, Transmissionsmodulation, Streuung, Polarisationsmodulation und dergleichen mit der eingesetzten Detektionstechnik im Rahmen der zur Verfügung stehenden Dynamik abbildbar ist. Derartige Beleuchtungsverfahren sind beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung WO 00/72018 beschrieben sowie auch kommerziell verfügbar (zum Beispiel von Vision & Control GmbH (Suhl, Deutschland) für Dunkelfeldbeleuchtungen und von Edmund Industrieoptik GmbH (Karlsruhe, Deutschland) für LED-Ringlicht).

Eine hohe örtliche Auflösung der zu detektierenden Fläche kann beispielsweise auch durch die Abbildung auf Detektoren wie Spiegel-Arrays oder LCD-Elemente und deren Verstellung gemäß eines zu detektierenden Musters oder einer zu definierenden Fläche erreicht werden, wie es beispielsweise für Fluoreszenzanwendungen in der deutschen Offenlegungsschrift DE 199 14 279 beschrieben ist. Der Vorteil eines derartigen Detektors bei der Messung von Reflexions- oder Transmissionsmodulationen besteht in der Integration der thermischen, elektrischen und fluidischen Steuerung bzw. Regelung in der Möglichkeit der optischen Signalverarbeitung und somit in geringeren technischen Anforderungen an die involvierte Rechentechnik.

Die Detektoren zeichnen üblicherweise den gesamten Bereich des Sonden-Arrays auf.

Alternativ können auch scannende Detektoren zum Auslesen des Chips eingesetzt werden. Bei der Verwendung von scannenden Punktlichtquellen und/oder scannenden Detektoren umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung bewegliche optische Komponenten zur Lichtführung bzw. bewegliche mechanische Komponenten zur Halterung der Reaktionskammern, so dass die Führung der jeweiligen Komponenten über die einzelnen abzutastenden Positionen, das heißt die jeweiligen Messpunkte, gewährleistet ist. Die Bildaufnahme erfolgt bei dieser Ausführungsform durch eine rechnerische Rekonstruktion des Bildes aus den jeweiligen Messpunkten. Insbesondere ist die Kamera bei dieser Ausführungsform eine bewegbare Zeilenkamera.

Ferner umfasst das optische System vorzugsweise zusätzlich eine Lichtquelle, besonders bevorzugt eine multispektrale oder eine kohärente Lichtquelle. Beispiele für Lichtquellen im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Laser, Licht-emittierende Dioden (LED) und/oder Hochdrucklampen. Die Lichtquelle des optischen Systems gewährleistet vorzugsweise eine homogene Beleuchtung des Trägers.

Neben punktförmigen Lichtquellen können auch Lichtquellen in Form von Beleuchtungs-Arrays in der erfindungsgemäßen Vorrichtung Verwendung finden. Eine homogene Beleuchtung des Trägers kann in dieser Ausgestaltung beispielsweise dadurch gewährleistet werden, dass die Lichtquelle mehrere diffus strahlende Lichtquellen umfasst, deren Überlagerung in einer homogenen Beleuchtung resultiert. So ermöglichen beispielsweise diffus streuende LED, die matrixförmig angeordnet sind, auf kurze Entfernungen zur Probe eine homogene Beleuchtung.

Wie bereits vorstehend erwähnt, kann die erfindungsgemäße Vorrichtung derart ausgeführt sein, dass die Detektionsfläche durch die Lichtquelle zeilenförmig abtastbar ist. Falls eine rasterförmige bzw. scannende Führung des Lichtstrahls über die Detektionsfläche gewünscht ist, sind folgende Ausführungsmöglichkeiten für die erfindungsgemäße Vorrichtung denkbar:
Z.B. kann die Detektionsfläche bzw. die Reaktionskammer beweglich ausgeführt sein und an einer ortsfesten Lichtquelle vorbeigeführt werden. Ist die Lichtquelle ein Laser, ist der Laser dabei in Ruhestellung. Ferner kann die Detektionsfläche in Ruhestellung vorliegen und ein beweglicher Laserstrahl über die Detektionsfläche geführt werden. Schließlich ist es auch möglich, dass die Lichtquelle in einer Achse und die Detektionsfläche in der anderen Achse bewegt wird.

Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst die Vorrichtung zusätzlich Linsen, Spiegel und/oder Filter. Der Einsatz von Filtern ermöglicht zum Einen die spektrale Eingrenzung der homogenen Beleuchtung und zum Anderen die Beleuchtung der Proben mit verschiedenen Wellenlängen. Bei einer weiteren Variante umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung zusätzlich Filterwechsler. Mit diesen Filterwechslern können die optischen Filter schnell gewechselt werden und somit mögliche Fehlinformationen, die zum Beispiel durch Verunreinigungen auftreten, eindeutig erkannt und eliminiert werden.

Wie bereits. vorstehend erwähnt, ist das optische System vorzugsweise derart ausgestaltet, dass die Detektionsfläche homogen beleuchtbar ist, vorzugsweise mit einer Beleuchtungsintensitäts-Homogenität von mindestens 50%, besonders bevorzugt von mindestens 60% und am meisten bevorzugt von mindestens 70%.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist das optische System derart ausgestaltet, dass der zeitliche Verlauf der Änderung von Transmissionseigenschaften der Detektionsfläche detektierbar ist. Dies kann beispielsweise dadurch gewährleistet werden, dass Lichtquelle und Detektor auf entgegengesetzten Seiten in der Reaktionskammer angeordnet sind und die Reaktionskammer einschließlich des Trägers für die Detektionsfläche zumindest im Bereich des Strahlengangs von der Lichtquelle zum Detektor optisch transparent ist.

Bei einer weiteren Ausführungsform ist das optische System derart angeordnet, dass der zeitliche Verlauf der Änderung von Reflexionseigenschaften der Detektionsfläche detektierbar ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Messung der Reflektivität befindet sich zusätzlich ein Oberflächenspiegel auf der Unterseite des Trägerelements. Der Nachteil der schlechten Reflekion der Probe wird in dieser Ausgestaltung durch Transmissionseffekte ergänzt, in denen das Beleuchtungslicht über eine Spiegelschicht hinter der Probe, entweder als eigenständiger Spiegel oder als auf der Rückseite des Probenträgers aufgetragene Schicht, reflektiert. Dabei kann beispielsweise ein Flächenstrahler auf der gegenüberliegenden Seite des Trägerelements und damit auch zum Sensor beispielsweise einer CCD-Kamera angeordnet werden. Auf diese Weise wird eine sehr kompakte Anordnung ermöglicht. Bei einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung, insbesondere wenn die Reflektivität des Trägerelements gemessen wird, umfasst die Vorrichtung zusätzlich einen halbdurchlässigen Spiegel zwischen Lichtquelle und Trägerelement. Bei dieser Ausführungsform gelangt das Licht der Lichtquelle durch einen halbdurchlässigen Spiegel auf die Probe und das Bild wird in Reflexion durch den halbdurchlässigen Spiegel und gegebenenfalls eine Ausleseoptik auf eine Kamera abgebildet.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist das optische System derart angeordnet, dass der zeitliche Verlauf der Änderung von Streuungseigenschaften der Detektionsfläche detektierbar ist. Dabei sind Lichtquelle und Detektor vorzugsweise auf derselben Seite der zu detektierenden Fläche angeordnet. Das optische System kann bei dieser Ausführungsform beispielsweise derart angeordnet sein, dass die Probe bzw. der Chip in einem bestimmten Winkel, der vorzugsweise kleiner 45°C und besonders bevorzugt kleiner 30°C ist, beleuchtbar ist. Der Beleuchtungswinkel wird so gewählt, dass das eingestrahlte Licht ohne das Vorhandensein lokaler Streuzentren, d.h. z.B. vor einer Niederschlagsbildung auf der Detektionsfläche, nicht direkt in den Detektionsstrahlengang reflektiert wird und somit kein Signal detektierbar ist: Treten lokale Streuzentren auf der Detektionsfläche auf, z.B. durch Bildung eines Niederschlags, gelangt ein Teil des eingestrahlten Lichtes in den Detektionsstrahlengang und führt somit zu einem messbaren Signal in dem optischen System der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Besonders bevorzugt ist der Kammerträger oder der Substanzbibliothekenträger zumindest im Bereich der Detektionsfläche bei dieser Ausführungsform optisch nicht transparent. Geeignete nicht optisch transparente Materialien sind beispielsweise Silizium, keramische Werkstoffe oder Metalle. Der Einsatz eines nicht optisch transparenten Kammerträgers hat den Vorteil, dass aufgrund von vorteilhaften physikalischen Eigenschaften der Trägermaterialien eine leichtere, exaktere und homogenere Temperatursteuerung der Reaktionskammer gewährleistet ist, so dass eine erfolgreiche Durchführung von temperatursensitiven Reaktionen wie eine PCR gewährleistet ist.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Anregungsstrahlengang der Lichtquelle derart gestaltet, dass Bereiche parallelen Lichtes vorliegen und somit Interferenzfilter ohne Verschiebung ihrer Transmissionsfenster in das optische System eingebracht werden können.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Detektionsstrahlengang derart gestaltet, dass Bereiche parallelen Lichtes vorliegen und somit Interferenzfilter ohne Verschiebung ihrer Transmissionsfenster in das optische System einbringbar sind.

Interferenzfilter verändern ihre spektrale Selektivität bei nichtparallelen Strahlengängen stark. Ermöglicht das optische System durch das Vorhandensein von Bereichen parallelen Lichtes die Einbringung bzw. Anordnung von Interferenzfiltern in der erfindungsgemäßen Vorrichtung, ohne deren spektrale Selektivität zu verändern, so ist die erfindungsgemäße Vorrichtung auch zur Detektion molekularer Wechselwirkungen von mit Fluorochromen markierten Substanzen geeignet. Somit kann eine universelle CCD-basierte Reaktions- und Detektionsvorrichtung realisiert werden.

Bei dieser Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die auch zur Detektion von Fluoreszenzmarkierung geeignet ist, kann das optische System, bei der Verwendung von weißem oder multispektralem Licht wie z.B. Halogenbeleuchtung, Xenon, Weißlicht-LED und dergleichen, z.B. zwei Filter im Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang oder, bei der Verwendung monochromer Lichtquellen wie z.B. LED oder Laser, z.B. einen Filter im Detektionstrahlengang aufweisen.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Reaktionskammer über eine Datenmatrix individuell gekennzeichnet. Dazu wird bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ein Datensatz in einer Datenbank gespeichert, welcher Informationen über die Substanzbibliothek, die Durchführung der Nachweisreaktion und dergleichen enthält. So kann der Datensatz insbesondere Informationen über die Anordnung der Sonden auf dem Array sowie Informationen darüber enthalten, wie die Auswertung am vorteilhaftesten zu erfolgen hat. Der Datensatz bzw. die Datenmatrix kann ferner Informationen über das Temperatur-Zeit-Regime einer ggf. durchzuführenden PCR zur Vervielfältigung der Zielmoleküle enthalten. Der so erstellte Datensatz erhält vorzugsweise eine Nummer, die in Form der Datenmatrix auf der Halterung angebracht wird. Über die in der Datenmatrix verzeichnete Nummer kann dann ggf. beim Auslesen der Substanzbibliothek der angelegte Datensatz aufgerufen werden. Schließlich kann die Datenmatrix von der Temperatursteuerungs- bzw. -regeleinheit und anderen Controllern wie z.B. einer Steuerung für die Be- und Entfüllung der Reaktionskammer über die Fluidbehälter ausgelesen werden und so eine automatische Durchführung von Vervielfältigungs- und Nachweisreaktion gewährleistet werden.

Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren bereit gestellt, die ebenfalls eine wie vorstehend beschriebene Temperatursteuerungs- und/oder -regeleinheit; sowie eine wie vorstehend beschriebene Reaktionskammer enthält, die einen Träger mit einer Detektionsfläche, auf der eine Substanzbibliothek immobilisiert ist, umfasst, wobei die Temperatur in der Reaktionskammer durch die Temperatursteuerungs- und -regeleinheit steuerbar und/oder regelbar ist.

Anstelle eines optischen Systems weist die Vorrichtung bei diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung jedoch elektrische Kontakte an den jeweiligen Array-Spots auf. Diese elektrischen Kontakte können beispielsweise über Elektroden kontaktiert werden. Durch die Bildung eines metallischen Niederschlags auf den Array-Elementen zur Signalverstärkung der an die Substanzbibliothek gebundenen, beispielsweise Gold-markierten Targets wächst auf den Array-Spots, an denen eine derartige Bindung stattgefunden hat, ein leitfähiges Material auf, das zu einer Veränderung des lokalen Widerstands führt. Somit ist über die elektrischen Kontakte an den Array-Spots eine Modulation bestimmter elektrischer Parameter wie beispielsweise Leitfähigkeit, Widerstand und Permeabilität möglich.

Vorzugsweise weist der Substanzbibliothekenträger der erfindungsgemäßen Vorrichtung bei diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung eine dreidimensionale Struktur auf, die zum Beispiel durch Erhebungen, Grund- und/oder Durchgangsbohrungen gebildet wird, wodurch der Effekt in der Verschmelzung des aufwachsenden leitfähigen Materials durch den sich bildenden Niederschlag mit den elektrischen Kontakten und die daraus resultierende Änderung elektrischer Parameter unterstützt wird.

Die auf der optischen Detektion basierende erfindungsgemäße Vorrichtung weist somit vorzugsweise eine Fluidikeinheit zum Austausch von Lösungen in der Reaktionskammer, eine Temperatursteuer- oder -regeleinheit, sowie ein für dynamische Messungen geeignetes optisches System auf. Die vorstehend genannten Einheiten können gegebenenfalls gerätetechnisch durch die Realisierung entsprechender Schnittstellen auch separat ausgeführt sein.

Substanzbibliotheken, die auf den Microarrays oder Chips immobilisiert sind, sind insbesondere Proteinbibliotheken wie Antikörper-, Rezeptorprotein- oder Membranproteinbibliotheken, Peptidbibliotheken wie Rezeptorligandenbibliotheken, Bibliotheken pharmakologisch aktiver Peptide oder Bibliotheken von Peptidhormonen, und Nukleinsäurebibliotheken wie DNA- oder RNA-Molekülbibliotheken. Besonders bevorzugt sind es Nukleinsäurebibliotheken.

Wie bereits vorstehend erwähnt, ist die Substanzbibliothek vorzugsweise in Form eines Microarrays, besonders bevorzugt mit einer Dichte von 2 bis 10.000 Array-Spots pro cm², am meisten bevorzugt mit einer Dichte von 50 bis 5000 Array-Spots pro cm², auf dem Substanzbibliothekenträger bzw. der Detektionsfläche immobilisiert.

Ferner ist bei sämtlichen vorstehend beschriebenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine Voramplifikation des zu analysierenden Materials nicht erforderlich. Von dem aus Bakterien, Blut oder anderen Zellen extrahierten Probenmaterial können gezielte Teilbereiche mit Hilfe einer PCR (Polymerase-Kettenreaktion) insbesondere in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. des Substanzbibliothekenträgers wie in DE 102 53 966 beschrieben amplifiziert und an den Träger hybridisiert werden. Dies stellt eine wesentliche Vereinfachung des Arbeitsaufwands dar.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist somit insbesondere zur Verwendung bei der parallelen Durchführung von Amplifikation der zu analysierenden Zielmoleküle durch PCR und Nachweis durch Hybridisierung der Zielmoleküle mit dem Substanzbibliothekenträger geeignet. Dabei wird die nachzuweisende Nukleinsäure zunächst durch eine PCR amplifiziert, wobei der Reaktion zu Anfang mindestens ein Kompetitor zugesetzt wird, der die Bildung eines der beiden durch die PCR amplifizierten Template-Stränge inhibiert. Insbesondere wird bei der PCR ein DNA-Molekül zugesetzt, das mit einem der zur PCR-Amplifikation des Templates verwendeten Primer um die Bindung an das Template konkurriert, und nicht enzymatisch verlängert werden kann. Die durch die PCR amplifizierten einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküle werden dann durch Hybridisierung mit einer komplementären Sonde nachgewiesen. Alternativ wird die nachzuweisende Nukleinsäure zunächst im Einzelstrangüberschuss durch eine PCR amplifiziert und durch eine anschließende Hybridisierung mit einer komplementären Sonde nachgewiesen, wobei der PCR-Reaktion zu Anfang ein Kompetitor zugesetzt wird, bei dem es sich um ein DNA-Molekül oder ein Molekül eines Nukleinsäure-Analogons handelt, das an einen der beiden Stränge des Templates hybridisieren kann, aber nicht an den Bereich, der durch die Sonden-Hybridisierung nachgewiesen wird, und das enzymatisch nicht verlängerbar ist.

Als Kompetitor in der PCR kann jedes Molekül eingesetzt werden, das eine bevorzugte Amplifikation nur eines der beiden in der PCR-Reaktion vorhandenen Template-Stränge bewirkt. Bei Kompetitoren kann es sich daher erfindungsgemäß um Proteine, um Peptide, um DNA-Liganden, um Interkalatoren, um Nukleinsäuren oder deren Analoga handeln. Als Kompetitoren werden bevorzugt Proteine bzw. Peptide eingesetzt, die in der Lage sind, einzelsträngige Nukleinsäuren mit Sequenz-Spezifität zu binden und über die oben definierten Eigenschaften verfügen. Besonders bevorzugt werden als Sekundärstrukturbrecher Nukleinsäuremoleküle und Nukleinsäure-Analoga-Moleküle eingesetzt.

Durch anfängliche Zugabe des Kompetitors zur PCR während der Amplifikation wird die Bildung eines der beiden Template-Stränge im wesentlichen inhibiert. "Im wesentlichen inhibiert" bedeutet, dass im Rahmen der PCR ein ausreichender Einzelstrangüberschuss und eine ausreichende Menge des anderen Template-Strangs hergestellt werden, um einen effizienten Nachweis des amplifizierten Strangs durch die Hybridisierung zu gewährleisten. Die Amplifikation erfolgt damit nicht einer exponentiellen Kinetik der Form 2ⁿ (mit n = Anzahl der Zyklen), sondern einer gedämpften Amplifikationskinetik der Form <2ⁿ.

Der durch die PCR erzielte Einzelstrangüberschuss beträgt gegenüber dem nichtamplifizierten Strang den Faktor 1,1 bis 1000, bevorzugt den Faktor 1,1 bis 300, ebenfalls bevorzugt den Faktor 1,1 bis 100, besonders bevorzugt den Faktor 1,5 bis 100, ebenfalls besonders bevorzugt den Faktor 1,5 bis 50, insbesondere bevorzugt den Faktor 1,5 bis 20 und am meisten bevorzugt den Faktor 1,5 bis 10.

Typischerweise wird die Funktion eines Kompetitors darin bestehen, dass er selektiv an einen der beiden Template-Stränge bindet und. damit die Amplifikation des entsprechenden komplementären Stranges behindert. Als Kompetitoren kommen daher einzelsträngige DNA- oder RNA-bindende Proteine mit Spezifität für einen der beiden in einer PCR zu amplifizierenden Template-Stränge in Frage. Ebenso kann es sich um Aptamere handeln, die Sequenz-spezifisch nur an bestimmte Bereiche eines der beiden zu amplifizierenden Template-Stränge binden.

Bevorzugt werden Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-Analoga als Kompetitoren eingesetzt. Üblicherweise werden die Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäure-Analoga dadurch als Kompetitor der PCR wirken, dass sie entweder mit einem der zur PCR verwendeten Primer um die Primer-Bindungsstelle konkurrieren oder, aufgrund einer Sequenz-Komplementarität mit einem Bereich eines nachzuweisenden Template-Strangs hybridisieren können. Bei diesem Bereich handelt es sich nicht um die Sequenz, die durch die Sonde nachgewiesen wird. Solche Nukleinsäure-Kompetitoren sind enzymatisch nicht verlängerbar.

Bei den Nukleinsäure-Analoga kann es sich z.B. um sogenannte Peptid-Nukleinsäuren (peptide nucleic acids, PNA) handeln. Bei Nukleinsäure-Analoga kann es sich aber auch um Nukleinsäuremoleküle handeln, bei denen die Nukleotide über eine Phosphothioat-Bindung anstelle einer Phosphat-Bindung miteinander verknüpft sind. Ebenso kann es sich um Nukleinsäure-Analoga handeln, bei denen die natürlich vorkommenden Zuckerbausteine Ribose bzw. Deoxyribose gegen alternative Zucker wie z.B. Arabinose oder Trehalose etc. ausgetauscht wurden. Weiterhin kann es sich bei dem Nukleinsäurederivat um „locked nucleic acid" (LNA) handeln. Weitere übliche Nukleinsäure-Analoga sind dem Fachmann bekannt.

Bevorzugt werden als Kompetitoren DNA- oder RNA-Moleküle, insbesondere bevorzugt DNA- oder RNA-Oligonukleotide bzw. deren Analoga eingesetzt.

Abhängig von der Sequenz der als Kompetitoren eingesetzten Nukleinsäuremoleküle bzw. Nukleinsäure-Analoga beruht die Inhibierung der Amplifikation eines der beiden Template-Stränge im Rahmen der PCR-Reaktion auf unterschiedlichen Mechanismen. Dies wird im Folgenden beispielhaft anhand eines DNA-Moleküls diskutiert.

Wenn als Kompetitor z.B. ein DNA-Molekül verwendet wird, kann dies eine Sequenz aufweisen, die mit der Sequenz eines der zu PCR verwendeten Primer zumindest teilweise derart identisch ist, dass eine spezifische Hybridisierung des DNA-Kompetitor-Moleküls mit dem entsprechenden Template-Strang unter stringenten Bedingungen möglich ist. Da das zur Kompetition verwendete DNA-Molekül erfindungsgemäß in diesem Fall nicht durch eine DNA-Polymerase verlängerbar ist, kompetiert das DNA-Molekül mit dem jeweiligen Primer während der PCR-Reaktion um die Bindung an das Template. Je nach Mengenverhältnis des DNA-Kompetitor-Moleküls zum Primer kann auf diese Weise die Amplifikation des durch den Primer definierten Template-Strangs derart inhibiert werden, dass die Herstellung dieses Template-Strangs deutlich reduziert ist. Die PCR verläuft dabei nach einer exponentiellen Kinetik, die höher ist, als bei den verwendeten Kompetitor-Mengen zu erwarten wäre. Auf diese Weise entsteht ein Einzelstrangüberschuss in einer Menge, die ausreichend für einen effizienten Nachweis der amplifizierten Target-Moleküle durch Hybridisierung ist.

Bei dieser Ausführungsform dürfen die zur Kompetition verwendeten Nukleinsäuremoleküle bzw. Nukleinsäureanaloga enzymatisch nicht verlängerbar sein. "Enzymatisch nicht verlängerbar" bedeutet, dass die zur Amplifikation verwendete DNA- oder RNA-Polymerase den Nukleinsäure-Kompetitor nicht als Primer verwenden kann, d.h. nicht in der Lage ist, 3' von der durch den Kompetitor definierten Sequenz den jeweiligen Gegenstrang zum Template zu synthetisieren.

Alternativ zu der oben dargestellten Möglichkeit kann das DNA-Kompetitor-Molekül auch über eine Sequenz verfügen, die zu einem Bereich des nachzuweisenden Template-Strangs komplementär ist, der nicht durch eine der Primer-Sequenzen adressiert wird, und die enzymatisch nicht verlängerbar ist. Im Rahmen der PCR wird das DNA-Kompetitor-Molekül dann an diesem Template-Strang hybridisieren und die Amplifikation dieses Stranges entsprechend blockieren.

Dem Fachmann ist bekannt, dass die Sequenzen von DNA-Kompetitor-Molekülen oder allgemein Nukleinsäure-Kompetitor-Molekülen entsprechend gewählt werden können. Wenn die Nukleinsäure-Kompetitor-Moleküle eine Sequenz aufweisen, die nicht mit der Sequenz eines der zur PCR verwendeten Primer im Wesentlichen identisch, sondern zu einem anderen Bereich des nachzuweisenden Template-Strangs komplementär ist, ist diese Sequenz so zu wählen, dass sie nicht in den Bereich der Template-Sequenz fällt, der im Rahmen der Hybridisierung mit einer Sonde nachgewiesen wird. Dies ist deswegen notwendig, da zwischen der PCR und der Hybridisierungsreaktion keine Aufarbeitungsreaktion stattfinden muss. Würde als Kompetitor ein Nukleinsäuremolekül verwendet, das in den nachzuweisenden Bereich fällt, würde dies mit dem einzelsträngigen Target-Molekül um die Bindung an die Sonde kompetieren.

Bevorzugt hybridisieren solche Kompetitoren in der Nähe der Template-Sequenz, die durch die Sonde nachgewiesen wird. Die Positionsangabe "in der Nähe" ist dabei erfindungsgemäß so zu verstehen, wie sie für Sekundärstrukturbrecher angegeben ist. Allerdings können die erfindungsgemäßen Kompetitoren auch in unmittelbarer Nachbarschaft der nachzuweisenden Sequenz hybridisieren, d.h. exakt ein Nukleotid von der nachzuweisenden Target-Sequenz entfernt.

Wenn als kompetitierende Moleküle enzymatisch nicht verlängerbare Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-Analoga verwendet werden, sind diese hinsichtlich ihrer Sequenz oder Struktur so zu wählen, dass sie nicht enzymatisch durch DNA- oder RNA-Polymerasen verlängert werden können. Bevorzugt ist das 3'-Ende eines Nukleinsäure-Kompetitors so ausgelegt, dass es keine Komplementarität zum Template aufweist und/oder anstelle der 3-OH-Gruppe am 3'-Ende einen anderen Substituenten trägt.

Weist das 3'-Ende des Nukleinsäure-Kompetitors keine Komplementarität zum Template auf, unabhängig davon, ob der Nukleinsäure-Kompetitor an eine der Primer-Bindungsstellen des Templates oder an eine der durch die PCR zu amplifizierenden Sequenzen des Templates bindet, kann der Nukleinsäure-Kompetitor wegen der fehlenden Basen-Komplementarität am 3'-Ende nicht durch die gängigen DNA-Polymerasen verlängert werden. Diese Art der Nicht-Verlängerbarkeit von Nukleinsäure-Kompetitoren durch DNA-Polymerasen ist dem Fachmann bekannt. Bevorzugt weist der Nukleinsäure-Kompetitor an seinem 3'-Ende bezüglich der letzten 4 Basen, besonders bevorzugt bezüglich der letzten 3 Basen, insbesondere bevorzugt bezüglich der letzten 2 Basen und am meisten bevorzugt bezüglich der letzten Base keine Komplementarität zu seiner Zielsequenz auf. Solche Kompetitoren können an den genannten Positionen auch nicht-natürliche Basen aufweisen, die keine Hybridisierung erlauben.

Nukleinsäure-Kompetitoren, die enzymatisch nicht verlängerbar sind, können auch eine 100%-ige Komplementarität zu ihrer Zielsequenz aufweisen, wenn sie in ihrem Rückgrat oder an ihrem 3'-Ende derart modifiziert sind, dass sie enzymatisch nicht verlängerbar sind.

Weist der Nukleinsäure-Kompetitor an seinem 3'-Ende eine andere Gruppe als die OH-Gruppe auf, handelt es sich bei diesen Substituenten bevorzugt um eine Phosphat-Gruppe, um ein Wasserstoff-Atom (Dideoxynukleotid), eine Biotingruppe oder eine Aminogruppe. Diese Gruppen können durch die gängigen Polymerasen nicht verlängert werden.

Besonders bevorzugt wird bei einem derartigen Verfahren als Kompetitor ein DNA-Molekül verwendet, das mit einem der beiden zur PCR verwendeten Primer um die Bindung an das Template kompetiert und welches am 3'-Ende während der chemischen Synthese mit einem Aminolink versehen wurde. Solche Kompetitoren können 100%-ige Komplementarität zu ihrer Zielsequenz haben.

Nukleinsäure-Analoga-Kompetitoren wie z.B. PNAs müssen dagegen nicht über eine blockierte 3'-OH-Gruppe oder eine nicht-komplementäre Base an ihrem 3'-Ende verfügen, da sie aufgrund des durch die Peptid-Bindung veränderten Rückgrats nicht durch die DNA-Polymerasen erkannt und somit auch nicht verlängert werden. Entsprechende andere Modifikationen der Phosphatgruppe, die durch die DNA-Polymerasen nicht erkannt werden, sind dem Fachmann bekannt. Dazu gehören u.a. Nukleinsäuren mit Rückgratmodifikationen wie z.B. 2'-5' Amid-Bindungen (Chan et al. (1999) J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 315–320), Sulfid-Bindungen (Kawai et al. (1993) Nucleic Acids Res., 1 (6), 1473–1479), LNA (Sorensen et al. (2002) J. Am. Chem. Soc., 124 (10), 2164–2176) und TNA (Schoning et al. (2000) Science, 290 (5495), 1347–1351).

Es können auch mehrere Kompetitoren, die an unterschiedliche Bereiche des Templates (z.B. u.a. die Primer-Bindungsstelle) hybridisieren, gleichzeitig in einer PCR eingesetzt werden. Wenn die Kompetitoren über Sekundärstrukturbrechereigenschaften verfügen, kann dadurch die Effizienz der Hybridisierung zusätzlich gesteigert werden.

In einer alternativen Ausführungsform kann das DNA-Kompetitor-Molekül über eine zu einem der Primer komplementäre Sequenz verfügen. Solche z.B. Antisense-DNA-Kompetitor-Moleküle können dann je nach Mengenverhältnis zwischen Antisense-DNA-Kompetitor-Molekül und Primer dazu verwendet werden, den Primer in der PCR-Reaktion zu titrieren, so dass dieser nicht mehr mit dem jeweiligen Template-Strang hybridisiert und entsprechend nur der durch den anderen Primer definierte Template-Strang amplifiziert wird. Dem Fachmann ist bewusst, dass bei dieser Ausführungsform der Erfindung der Nukleinsäure-Kompetitor enzymatisch verlängerbar sein kann, aber nicht muss.

Wenn im Rahmen dieser Erfindung von Nukleinsäure-Kompetitoren gesprochen wird, schließt dies Nukleinsäure-Analoga-Kompetitoren mit ein, wenn sich nicht aus dem Kontext etwas anderes ergibt. Der Nukleinsäure-Kompetitor kann an den entsprechenden Strang des Templates reversibel oder irreversibel binden. Die Bindung kann durch kovalente bzw. nicht kovalente Wechselwirkungen erfolgen.

Bevorzugt erfolgt die Bindung des Nukleinsäure-Kompetitors über nicht-kovalente Wechselwirkungen und ist reversibel. Insbesondere bevorzugt erfolgt die Bindung an das Template durch Ausbildung von Watson-Crick Basenpaarungen.

Die Sequenzen der Nukleinsäure-Kompetitoren richten sich in der Regel nach der Sequenz des Template-Strangs; der nachgewiesen werden soll, bei antisense-Primern dagegen nach den zu titrierenden Primer-Sequenzen, die aber wiederum durch die Template-Sequenzen definiert sind.

Bei der PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren handelt es sich um eine Labor-Standardmethode, mit deren vielfältigen Variations- und Ausgestaltungsmöglichkeiten der Fachmann vertraut ist. Prinzipiell ist eine PCR dadurch charakterisiert, dass das doppelsträngige Nukleinsäure-Template, üblicherweise ein doppelsträngiges DNA-Molekül, zuerst einer Hitze-Denaturierung für 5 Minuten bei 95° C unterworfen wird, wodurch die beiden Stränge voneinander getrennt werden. Nach einer Abkühlung auf die sogenannte "annealing"-Temperatur (definier durch den Primer mit der niedrigeren Schmelztemperatur) lagern sich die in der Reaktionslösung vorhandenen "forward"- und "reverse"-Primer an die zu ihrer Sequenz komplementären Stellen in den jeweiligen Template-Strängen an. Die "annealing"-Temperatur der Primer richtet sich dabei nach der Länge und Basenzusammensetzung der Primer. Sie kann aufgrund theoretischer Überlegungen kalkuliert werden. Angaben zur Kalkulation von "annealing"-Temperaturen finden sich z.B. in Sambrook et al. (vide supra).

Nach dem Annealen der Primer, das typischerweise in einem Temperaturbereich von 40–75°C, bevorzugt von 45–72°C und insbesondere bevorzugt von 50–72°C erfolgt, folgt ein Elongationsschritt, bei dem durch die Aktivität der in der Reaktionslösung vorhandenen DNA-Polymerase Desoxyribonukleotide mit dem 3'-Ende der Primer verknüpft werden. Die Identität der eingefügten dNTPs richtet sich dabei nach der Sequenz des mit dem Primer hybridisierten Template-Strangs. Da in der Regel thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt werden, läuft der Elongationsschritt üblicherweise zwischen 68–72°C ab.

Bei der symmetrischen PCR wird durch eine Wiederholung dieses beschriebenen Zyklus aus Denaturierung, Annealing der Primer und Elongation der Primer eine exponentielle Vermehrung des durch die Primersequenzen definierten Nukleinsäureabschnitts des Targets erreicht. Hinsichtlich der Pufferbedingungen bei der PCR, der verwendbaren DNA-Polymerasen, der Herstellung von doppelsträngigen DNA-Templates, des Designs von Primern, der Wahl der Annealing-Temperatur und Variationen der klassischen PCR steht dem Fachmann zahlreiche Literatur zur Verfügung.

Dem Fachmann ist geläufig, dass als Template auch z.B. einzelsträngige RNA, wie z.B. mRNA, eingesetzt werden kann. Diese wird in der Regel vorher durch eine Reverse Transkription in eine doppelsträngige cDNA überführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird als Polymerase eine thermostabile DNAabhängige DNA-Polymerase verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Taq-DNA-Polymerase (Eppendorf, Hamburg, Deutschland sowie Qiagen, Hilden, Deutschland), Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA), Tth-DNA-Polymerase (Biozym Epicenter Technol., Madison, USA), Vent-DNA-Polymerase, DeepVent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, USA), Expand-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim, Deutschland) verwendet.

Die Verwendung von Polymerasen, die aus natürlich vorkommenden Polymerasen durch gezielte oder evolutive Veränderung optimiert worden sind, ist ebenfalls bevorzugt. Bei der Durchführung der PCR in Gegenwart des Substanzbibliothekenträgers ist insbesondere die Verwendung der Taq-Polymerase der Firma Eppendorf (Deutschland) bzw. des AdvantagecDNA-Polymerase-Mix von Clontech (Palo Alto, CA, USA) bevorzugt.

Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellung einer wie vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung;
b) Wechselwirkung der nachzuweisenden Nukleinsäuren mit der auf der Detektionsfläche immobilisierten Substanzbibliothek; und
c) Detektion der Wechselwirkung.

Die zu untersuchenden Targets können in jeder Art von Probe, vorzugsweise in einer biologischen Probe vorliegen.

Vorzugsweise werden die Targets vor ihrer Detektion und Quantifizierung durch das erfindungsgemäße Verfahren isoliert, gereinigt, kopiert und/oder amplifiziert.

Die Amplifikation erfolgt üblicherweise durch herkömmliche PCR-Methoden oder durch ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren zur parallelen Durchführung von Amplifikation der zu analysierenden Zielmoleküle durch PCR und Nachweis durch Hybridisierung der Zielmoleküle mit dem Substanzbibliothekenträger.

Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Amplifikation als Multiplex-PCR in einem zweistufigen Prozess ausgeführt (siehe auch WO 97/45559). In einer ersten Stufe wird eine Multiplex-PCR durchgeführt, indem Fusionsprimer eingesetzt werden, deren 3'-Enden genspezifisch sind und deren 5'-Enden eine universelle Region darstellen. Letztere ist bei allen in der Multiplex-Reaktion eingesetzten forward- und reverse-Primern gleich. In dieser ersten Stufe ist die Primermenge limitierend. Dadurch können alle Multiplex-Produkte bis zu einem einheitlichen molaren Niveau amplifiziert werden, vorausgesetzt, dass die Zyklenzahl hinreichend ist, um für alle Produkte Primerlimitation zu erreichen. In einer zweiten Stufe sind universelle Primer zugegen, die identisch mit den 5'-Regionen der Fusionsprimer sind. Es erfolgt Amplifikation bis zur gewünschten DNA-Menge.

Der Nachweis erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise dadurch, dass die gebundenen Targets mit mindestens einer Markierung versehen sind, die in Schritt c) detektiert wird.

Wie bereits vorstehend erwähnt, ist die Markierung, die an die Targets oder Sonden gekoppelt ist, vorzugsweise eine detektierbare Einheit oder eine über eine Ankergruppe an die Targets oder Sonden gekoppelte detektierbare Einheit. Hinsichtlich der Möglichkeiten der Detektion bzw. der Markierung ist das erfindungsgemäße Verfahren äußerst flexibel. So ist das erfindungsgemäße Verfahren mit einer Vielzahl physikalischer, chemischer oder biochemischer Detektionsverfahren kompatibel. Voraussetzung ist lediglich, dass die zu detektierende Einheit bzw. Struktur direkt an eine Sonde oder ein Target, beispielsweise ein Oligonukleotid gekoppelt bzw. über eine mit dem Oligonukleotid koppelbare Ankergruppe verknüpft werden kann.

Die Detektion der Markierung kann auf Fluoreszenz, Magnetismus, Ladung, Masse, Affinität, enzymatischer Aktivität, Reaktivität, einer Goldmarkierung u.dgl. beruhen. So kann die Markierung beispielsweise auf der Verwendung von Fluorophor-markierten Strukturen bzw. Bausteinen basieren. In Verbindung mit der Fluoreszenz-Detektion kann die Markierung ein beliebiger an Targets oder Sonden während oder nach deren Synthese koppelbarer Farbstoff sein. Beispiele hierfür sind Cy-Farbstoffe (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), Alexa-Farbstoffe, Texas-Rot, Fluorescein, Rhodamin (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), Lanthanide wie Samarium, Ytterbium und Europium (EG&G, Wallac, Freiburg, Deutschland).

Neben Fluoreszenz-Markern können im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Markierung bzw. als Detektiereinheit, die mit den Targets bzw. Sonden gekoppelt ist, auch Lumineszenz-Marker, Metall-Marker, Enzym-Marker, radioaktive Marker und/oder polymere Marker eingesetzt werden.

Ebenso kann eine Nukleinsäure als Markierung (Tag) genutzt werden, die durch Hybridisierung mit einem markierten Reporter detektiert werden kann (Sandwich-Hybridisierung). Einsatz zum Nachweis des Tags finden diverse molekularbiologische Nachweisreaktionen wie Primer-Extension, Ligation und RCA.

Bei. einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die detektierbare Einheit über eine Ankergruppe mit den Targets oder Sonden gekoppelt. Bevorzugt verwendete Ankergruppen sind Biotin, Digoxygenin u.dgl. Die Ankergruppe werden in einer anschließenden Reaktion mit spezifisch bindenden Komponenten, beispielsweise Streptavidin-Konjugaten oder Antikörper-Konjugaten umgesetzt, die selbst detektierbar sind oder eine detektierbare Reaktion auslösen. Bei Einsatz von Ankergruppen kann die Umsetzung der Ankergruppen in detektierbare Einheiten vor, während oder nach Zugabe der Probe umfassend die Targets bzw. ggf. vor, während oder nach der Spaltung der selektiv spaltbaren Bindung in den Sonden erfolgen.

Die Markierung kann erfindungsgemäß auch durch Wechselwirkung eines markierten Moleküls mit den Sonden-Molekülen erfolgen. Beispielsweise kann die Markierung durch Hybridisierung eines wie vorstehend beschrieben markierten Oligonukleotids mit einer Oligonukleotid-Sonde bzw. einem Oligonukleotid-Target erfolgen.

Weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Markierungsverfahren und Nachweissysteme sind beispielsweise in Lottspeich und Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, 1998, Kapitel 23.3 und 23.4 beschrieben.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Nachweisverfahren eingesetzt, die im Ergebnis ein Addukt mit einem bestimmten Löslichkeitsprodukt, das eine Präzipitation zur Folge hat, liefern. Zur Markierung werden insbesondere Substrate eingesetzt, die in ein schwer lösliches, üblicherweise gefärbtes Produkt umgesetzt werden können. Beispielsweise können bei dieser Markierungsreaktion Enzyme verwendet werden, die den Umsatz eines Substrats in ein schwer lösliches Produkt katalysieren. Reaktionen, die geeignet sind, um zu einem Niederschlag an Array-Elementen zu führen, sowie Möglichkeiten für die Detektion des Niederschlags sind beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung WO 00/72018 und in der internationalen Patentanmeldung WO 02/02810 beschrieben, auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die gebundenen Targets mit einer Markierung versehen, die die Reaktion eines löslichen Substrats zu einem schwer löslichen Niederschlag auf dem Array-Element katalysiert, an dem eine Sonden/Target-Wechselwirkung stattgefunden hat bzw. die als Kristallisationskeim für die Umwandlung eines löslichen Substrats zu einem schwer löslichen Niederschlag auf dem Array-Element wirkt, an dem eine Sonden/Target-Wechselwirkung stattgefunden hat.

Der Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt auf diese Weise die simultane qualitative und quantitative Analyse einer Vielzahl von Sonden/Target-Wechselwirkungen, wobei einzelne Array-Elemente mit einer Größe von ≤1000 μm, vorzugsweise von ≤100 μm und besonders bevorzugt von ≤50 μm realisiert werden können.

In der Immunzytochemie und bei immunologischen Mikrotiterplatten-basierten Tests ist der Einsatz von enzymatischen Markierungen bekant (siehe E. Lidell und I. Weeks, Antibody Technology, BIOS Scientific Publishers Limited, 1995). So katalysieren beispielsweise Enzyme den Umsatz eines Substrats in ein schwerlösliches, in aller Regel gefärbtes Produkt.

Eine weitere Möglichkeit des Nachweises molekularer Wechselwirkungen auf Arrays besteht im Einsatz von Metallmarkierungen. Hierbei werden beispielsweise kolloidales Gold oder definierte Goldcluster mit den Targets gekoppelt, ggf. über bestimmte Vermittlermoleküle wie Streptavidin. Die durch die Goldmarkierung entstehende Färbung wird vorzugsweise durch nachfolgende Reaktion mit unedleren Metallen wie z.B. Silber verstärkt, wobei die mit den Targets gekoppelte Goldmarkierung als Kristallisationskeim bzw. Katalysator beispielsweise für die Reduktion von Silberionen zu einem Silberniederschlag wirkt. Die mit Goldmarkierungen gekoppelten Targets werden im Folgenden auch als Goldkonjugate bezeichnet.

Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auch eine relative Quantifizierung der Sonden-/Target-Wechselwirkung erfolgen. Die relative Quantifizierung der Konzentration der gebundenen Targets auf einem Sonden-Array durch Nachweis eines Präzipitats bzw. eines Niederschlags erfolgt über die Konzentration der mit den Targets gekoppelten Markierungen, die die Reaktion eines löslichen Substrats zu einem schwerlöslichen Niederschlag auf dem Array-Element, an dem eine Sonden/Target-Wechselwirkung stattgefunden hat, katalysieren bzw. als Kristallisationskeim für derartige Reaktionen wirken. Beispielsweise beträgt im Fall von mit Nanogold markierten HPLC-gereinigten Oligonukleotidsonden das Verhältnis von gebundenem Target zu Goldpartikel 1:1. In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es ein Vielfaches oder auch einen Bruchteil davon betragen.

Die Detektion bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens erfolgt somit durch Messung der Transmissionsänderung, Reflexion oder Streuung, die durch den Niederschlag hervorgerufen wird, der auf den Array-Elementen, an denen eine Sonden/Target-Wechselwirkung stattgefunden hat, durch die katalytische Wirkung der mit den gebundenen Targets gekoppelten Markierung erzeugt wird.

Die Lichtabsorption wird im Fall der Kopplung von kolloidalem Gold oder definierten Goldcluster mit den Targets bereits durch die Gegenwart dieser metallischen Markierungen hervorgerufen. Zur Verstärkung der Lichtabsorption wird allerdings vorzugsweise katalytisch durch derartige Wechselwirkungshybride, d.h. die mit einer Markierung wie beispielsweise kolloidalem Gold oder definierten Goldclustern versehene Targets, ein nicht transparentes Präzipitat abgeschieden. Als besonders vorteilhaft hat sich im Fall von Goldkonjugaten die Verwendung von Silber als Präzipitat herausgestellt.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird somit in Schritt c) der zeitliche Verlauf der Niederschlagsbildung an den Array-Elementen in Form von Signalintensitäten detektiert. Auf diese Weise kann eine genaue Bestimmung der relativen quantitativen Menge an gebundenen Targets gewährleistet werden. Eine derartige Vorgehensweise ist ausführlich in der internationalen Patentanmeldung WO 02/02810 beschrieben, auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.

Im Folgenden wird der qualitative und/oder quantitative Nachweis der Sonden-/Target-Wechselwirkung durch Messung der Durchlichtabsorption anhand eines Beispiel erläutert. Selbstverständlich ist die im Folgenden beschriebene Vorgehensweise nicht auf die vorstehend beschriebene Silber/Gold-Färbung beschränkt, sondern kann entsprechend auf alle Nachweisverfahren angewendet werden, bei denen die gebundenen Targets mit einer Markierung versehen sind, die die Reaktion eines löslichen Substrats zu einem schwer löslichen Niederschlag auf dem Array-Element katalysiert, an dem eine Sonden/Target-Wechselwirkung stattgefunden hat bzw. die als Kristallisationskeim für die Umwandlung eines löslichen Substrats zu einem schwer löslichen Niederschlag auf dem Array-Element wirkt, an dem eine Sonden/Target-Wechselwirkung stattgefunden hat.

Zunächst wird das Targetmolekül z.B. mittels PCR biotinyliert. Das PCR-Produkt wird gegen eine Substanzbibliothek, beispielsweise eine DNA-Bibliothek, hybridisiert. Anschließend werden der Reaktionskammer Streptavidin-funktionalisierte Goldkügelchen zugegeben, die mit den biotinylierten Hybriden, beispielsweise DNA-Hybriden reagieren. An den nun spezifisch an der Oberfläche gebundenen Goldkügelchen kann ein Silberniederschlag erzeugt werden, indem beispielsweise Silbernitrat mit Hydrochinon unter der katalytischen Wirkung von Gold reduziert wird (siehe u.a. WO 00/72018, DE 100 33 334.6 , M.A. Hayat, Immunogold-Silver Staining, CRC Press, New York, 1995).

Die Lichtabsorption durch das Silberpräzipitat hängt von der Menge des abgeschiedenen Silbers ab. Folglich kann die Lichtintensität I, die das Präzipitat durchstrahlt, nach einem dem Lambert-Beerschen Gesetz ähnlichen Funktion berechnet werden: I = I0·exp(–a·b) (I)

Dabei ist I die Lichtintensität nach der Absorption, I₀ die Lichtintensität vor der Absorption, a ein Absorptionskoeffizient multipliziert mit der Abschattung pro Flächeneinheit b durch das Silberpräzipitat. Als Messgrößen stehen die Intensität I und die Zeit t zur Verfügung. Diese Messgrößen erhält man, indem das Trägerelement mit der Substanzbibliothek beleuchtet wird und das durchstrahlte Licht mit einer Kamera aufgenommen wird. Diese Aufnahme wird in regelmäßigen Abständen wiederholt, während die Silberabscheidung durchgeführt wird. Die Helligkeitswerte der einzelnen Bibliotheksregionen (Spots) werden für jede Aufnahme ausgewertet, wodurch die Intensität I eines jeden Spots erhalten wird. Diese Helligkeitswerte können mittels Standardsoftware, wie zum Beispiel IconoClust^® (Clondiag, Jena, Deutschland) automatisch berechnet werden. Durch Auftragen von I/I₀ gegen die Zeit t erhält man Messkurven. Das Lambert-Beersche Gesetz entsprechend der Gleichung (I) kann mit den derart erhaltenen Silberabscheidungszeitreihen auf folgende Weise in Zusammenhang gebracht werden.

Die Fläche F, die ein Silberkügelchen abschattet, beträgt: F = π·r2 (II)

Da die Abscheidungsgeschwindigkeit pro Flächenelement für einen Spot als konstant angenommen werden kann, wächst der Radius r der Silberkügelchen ebenfalls mit konstanter Geschwindigkeit: r = dr/dt·t (III)

Die Abschattung pro Flächeneinheit b durch das Silberpräzipitat ist proportional zur der Zahl der Silberkügelchen pro Flächeneinheit N, der Abschattungsfläche pro Silberkügelchen F und einer Konstante k. b = N·F·k (III)

Damit berechnet sich die Funktion für die Intensität I in Abhängigkeit von der Zeit t zu I = I0·exp (–a'·t2), (IV)wobei a' eine unbekannte zusammengesetzte Silberabsorptionskonstante ist.

Für jede Silberabscheidungsreaktion muss eine eigene Abscheidungsrate angenommen werden, so auch für die unspezifische Reaktion an der Oberfläche: I = I0·exp(–a'H·t2), (V)wobei a'_H die unspezifische Silberabsorptionskonstante ist.

An jedem Spot i, findet also sowohl eine spezifische Abscheidungsreaktion als auch eine unspezifische Abscheidungsreaktion statt: Ii = I0i·(exp(–a'i·t2) + exp(–a'H·t2)) + Oi, (VI)wobei 0 ein geräteabhängiger Offsetwert ist.

Die Zahl der Goldkügelchen, die pro Flächeneinheit abgeschieden werden, hängt einerseits von der Menge an mit Goldkügelchen markierten Targets und andererseits von der Bindungsstärke der Targets, beispielsweise der Target-DNA, mit den Sonden, beispielsweise der Spot-DNA, ab. Liegt kein Target in der Probe vor, das mit einer Sonde auf dem entsprechenden Array-Element wechselwirkt, so kommt es auch nicht zur Abscheidung von Goldkügelchen auf der Oberfläche dieses Array-Elements bzw. Spots. Ist die Bindung zwischen Sonde und Target schwach, so werden sich nur sehr wenige Goldkügelchen an der Oberfläche dieses Array-Elements absetzen.

Da b und damit a' direkt proportional zur Goldkügelchen- und damit Silberkügelchenanzahl N ist, stellt a' ein Maß für die Konzentration der Target-DNA und der Bindungsstärke der Target-DNA am Array-Element bzw. Spot i da.

Aus den erhaltenen Messkurven lässt sich durch nicht-lineare Regression mit Hilfe der Gleichung (VI) die Silberabsorptionskonstante a' berechnen. Die Berechnung der Konstanten a' kann als signifikante Messgröße für die Bindungsstärke und die Konzentration der Target-DNA an einem Spot genutzt werden. Des Weiteren kann man aus der Konstanten a' die Zeitkonstante τ der Abscheidungsreaktion bestimmen: τi = (1/a'i)0.5 (VII)

Durch die Regression können als weitere Parameter I₀ und 0 ermittelt werden. Mit der Lichtintensität I₀ können Beleuchtungsinhomogenitäten der DNA-Bibliothek korrigiert werden. Alternativ kann mittels des Abbildes der gesamten DNA-Bibliothek zum Zeitpunkt t = 0 eine Flatfieldkorrektur aller weiteren Bilder, die für die Zeitreihe zu einem späteren Zeitpunkt aufgenommen wurden, vorgenommen werden. Anhand des Parameters 0 lässt sich die Validität einer Messung abschätzen.

Da die korrekte Anpassung einer Exponentialfunktion an die Messwerte einen nicht-linearen Regressionsalgorithmus, beispielsweise eine nicht-lineare Regression nach Marquardt (H.R. Schwarz, Numerische Mathematik, Teubner Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1998) erfordert, kann es vorteilhaft sein, auf eine weniger genaue, aber dafür robustere und daher lineare Methode zur Bestimmung der Messwerte aus den Zeitreihen zuzugreifen. Dazu werden die Zeitwerte quadriert und die Intensitätsmesswerte logarithmiert. Die so erhaltenen Werte werden dann an eine lineare Gleichung 1. Gerades angepasst. Die dabei erhaltenen Regressionsparameter können als Messwert und zur Testung der Validität herangezogen werden. Beleuchtungsinhomogenitäten lassen sich bei Verwendung einer linearen Methode über I₀ nicht mehr korrigieren, es verbleibt aber die Möglichkeit der Flatfieldkorrektur.

Eine weitere Variante der Auswertung besteht darin, nach einer festgelegten Zeit die Grauwerte der einzelnen Spots direkt als Messwerte zu verwenden. Dieses Verfahren hat allerdings die Nachteile, dass nicht im Voraus beurteilt werden kann, welcher Zeitpunkt zur Auswertung optimal ist und dass die Messwerte eine geringere statistische Sicherheit aufweisen. Darüber hinaus lässt sich eine etwaige Beleuchtungsinhomogenität nur über eine Flatfieldkorrektur durchführen.

Im folgenden werden besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben:

In 1 ist eine bevorzugte Konfiguration einer erfindungsgemäßen Vorrichtung schematisch dargestellt. Eine Reaktionskammer (6) bzw. ein Mikroreaktor (6) mit einer auf einer Detektionsfläche angeordneten Substanzbibliothek (5) ist in geeigneter Weise in der Vorrichtung gehaltert. Die Kammer (6) ist elektrisch und fluidisch mit einer Temperatur-Prozessierungseinheit (1.1) und einer Fluid-Prozessierungseinheit (1.2) verbunden, so dass eine Temperatursteuerung bzw. -regelung und/oder der Austausch von Flüssigkeiten oder Gasen zwischen Kammer (6) und den Behältern der Fluid-Prozessierungseinheit (1.2) realisierbar ist. Durch ein Identifikationssystem (2.5), wie z.B. ein Barcodereader, ist die Reaktionskammer (6) einem in einem Prozess-Controller (3) definierten Prozessablauf zugeordnet. Somit können zur Prozessierung eines Tests die entsprechenden Parameter an die Prozessierungseinheiten (1.1) und (1.2) übergeben werden. In Abhängigkeit der testspezifischen Erfordernisse ist das optische System durch den Prozess-Controller (3) während oder nach der fluidischen und/oder thermischen Prozessierung ansteuerbar, so dass ein, vorzugsweise dynamischer, optischer Detektionsvorgang erfolgen kann.

Bei der in 1 gezeigten Ausführungsform erfolgt die Detektion durch Detektion der Änderung der Transmissionseigenschaften der Probenbereiche in einer Durchlichteinrichtung mittels einer Leuchtquelle (2.4), die durch eine Beleuchtungsoptik (2.3) auf die Probe mit einer Intensitätsverteilungshomogenität von vorzugsweise mindestens 30% beleuchtbar und mittels einer Detektionsoptik (2.2) auf einen geeigneten Detektor (2.1), wie z.B. eine Kamera, abbildbar sind. Die so erzeugten Bilder sind im Detektionssystem oder im Prozess-Controller (3) digitalisierbar und in letzterem auch analysierbar. Alternativ sind die erzeugten Bilder auch über eine Datenschnittstelle (4) an externe Computer oder Netzwerke von Computern weiterleitbar.

Der modulartige Aufbau dieser Komponenten erlaubt die Prozessierung verschiedener Tests mit verschiedenen Temperatur-, Fluidführungs- und Detektionsparametern. Durch eine Verbindung mit externen Datenbanken über die Datenschnittstelle (4) können jederzeit neue Prozessführungsparameter-Protokolle implementiert werden. Wenn bestimmte Tests insbesondere im Bereich der medizinischen Diagnostik ohne eine Datenanbindung nach außen erfolgen sollen, ist die Schnittstelle (4) vorzugsweise für den Nutzer nicht zugänglich, so dass alle benötigten Prozessführungsprotokolle als auch die notwendigen Analysen im Prozess-Controller (3) realisiert werden.

Bei einer alternativen, in 2 dargestellten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Prozesssteuerung über einen externen Computer durchführbar. Über die Schnittstelle (4) ist die Verteilung der Datenflüsse auf die einzelnen technischen Einheiten bzw. Module der erfindungsgemäßen Vorrichtung realisierbar. Bei dieser Ausführungsform sind ferner optional verschiedene Beleuchtungssysteme (2.3) und (2.4) dargestellt, mit denen die Detektionsfläche von unten und schräg oben beleuchtbar ist. Somit ist es bei dieser Ausführungsform möglich, verschiedene Detektionsmethoden je nach der An des durch einen Detektor zur Identifizierung (2.5), z.B. einen Datenmatrix-Reader ermittelten Chips zu aktivieren. Beispielsweise ist bei dieser Ausführungsform der zeitliche Verlauf der Änderung von optischen Transmissionseigenschaften sowie der Änderung von im Auflicht-Dunkelfeld induzierbaren Streuungseigenschaften detektierbar.

Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die erfindungsgemäße Vorrichtung keine Fluidprozessierungseinheit auf (siehe 3). Diese Ausführungsform ist vorteilhaft, falls es für bestimmte Tests nicht erforderlich ist, während der Prozessierung Flüssigkeiten auszutauschen und eine Befüllung des Reaktionsraumes auch vor Einbringung der Reaktionskammer (6) in die erfindungsgemäße Vorrichtung in einer externen manuellen oder automatisierten Befüllstation erfolgen kann.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung und sollen in nicht einschränkender Weise ausgelegt werden.

In den folgenden Beispielen wird im wesentlichen auf die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchführbaren Detektionsmethoden eingegangen. Die Kontrolle thermischer Parameter und der Austausch von Flüssigkeiten kann mittels dem Fachmann bekannter und auch kommerziell verfügbarer Module technisch realisiert werden. Dabei ist in der technischen Realisation vor allem die Ansteuerung und Datenübertragung von besonderem Interesse, die insbesondere durch schwachstromige Verbindungen wie TTL-Pegel sowie mittels beschriebener Transferprotokolle erfolgen kann.
Beispiel 1:
Optische Detektion kinetisch verlaufender Signalverstärkungsreaktionen
Die optische Detektion kinetisch verlaufender Signalverstärkungsreaktionen erfolgt bei den folgenden Varianten des Ausführungsbeispiels durch die Aufnahme von Modulationen bestimmter optischer Parameter, insbesondere von Transmission, Reflexion, Streuung, Beugung und Interferenz.
Durch die Anlagerung von Silber während einer Silberfällungsreaktion an z.B. mit Goldpartikeln markierten Targetmolekülen nach einer spezifischen Hybridisierung mit auf festen Oberflächen immobilisierten oder synthetisierten Probenmolekülen wachsen Schichten auf, welche die optischen Eigenschaften des Gesamtsystems signifikant verändern. Die Signalverstärkung von Gold-markierten Targetmolekülen durch Silber ist z.B. in der internationalen Patentanmeldung WO 02/02810 ausführlich beschrieben, auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
a) Transmission
Die Detektion der Änderung von Transmissionseigenschaften erfolgt in einer wie in 1 gezeigten Durchlichtanordnung. Die Lichtquelle (2.4) ist dabei als eine Weißlichtquelle wie z.B. eine Halogenlampe, Weißlicht-LED oder als eine schmalbandige Lichtquelle wie z.B. LED, Laserdiode, organische LED ausgeführt. Das optische System (2.3) bestehend aus Linsen, Spiegeln und Filtern ist derart ausgeführt, dass eine gleichmäßige Beleuchtung der zu detektierenden Substratfläche mit mindestens 70% Beleuchtungsintensitäts-Homogenität erfolgt.
Die Substratfläche wird durch ein weiteres optisches System (2.2) bestehend aus Linsen, Spiegeln und Filtern auf einen Detektor abgebildet. Dieser kann eine zweidimensionale CCD- oder CMOS-Kamera oder eine sich bewegende Zeilenkamera sein.
Die Änderung der Transmissionseigenschaften wird als Sequenz aufgezeichnet und die Kurven der Abnahme der Transmission an verschiedenen Punkten verglichen. Abhängig von der Steigung der Transmissionsänderung an den jeweiligen Array-Spots können die Targetkonzentrationen, wie in der internationalen Patentanmeldung WO 02/02810 beschrieben, quantitativ bestimmt werden.
Die Reaktionskammer ist aus einem für die bei der Detektion verwendeten Wellenlängen transparenten Substrat ausgeführt. Beispielsweise ist die Reaktionskammer bei der Verwendung von Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich aus Glas und bei der Verwendung von Licht im infraroten Bereich aus Silizium.
b) Reflexion
Eine Detektion der Änderung von Reflexionseigenschaften erfolgt bei diesem Ausführungsbeispiel in einer wie in 4 dargestellten Auflichtanordnung. Dabei ist die Optik (2.3) derart ausgestaltet, dass eine gleichmäßige Beleuchtung der zu detektierenden Substratfläche mit mindestens 70% Beleuchtungsintensitätshomogenität gewährleistet ist. Die Substratfläche wird durch das optische System (2.2) auf einen Detektor abgebildet. Dieser ist eine zweidimensionale Kamera wie z.B. eine CCD- oder CMOS-Kamera oder eine sich bewegende Zeilenkamera.
Die Änderung der Reflexionseigenschaften wird als Sequenz aufgezeichnet und die Kurven der Zunahme der Reflexion an verschiedenen Punkten verglichen. Abhängig von der Steigung der Reflexionsänderung an den jeweiligen Array-Spots können die Targetkonzentrationen, wie in der internationalen Patentanmeldung WO 02/02810 beschrieben, quantitativ bestimmt werden. Die Berechnung erfolgt invers zu der bei der Detektion der Transmissionsänderung, da bei der Anreicherung mit Silberpartikeln an Targetmolekülen die lokale Reflektivität steigt.
Die Reaktionskammer ist aus einem für die bei der Detektion verwendeten Wellenlängen transparenten Substrat ausgeführt. Beispielsweise ist die Reaktionskammer bei der Verwendung von Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich aus Glas und bei der Verwendung von Licht im infraroten Bereich aus Silizium.
c) Streuung
Eine Detektion der Änderung von Streueigenschaften erfolgt bei diesem Beispiel in einer wie in 5 dargestellten Dunkelfeldanordnung. Das optische System (2.3) bestehend aus Linsen, Spiegeln und Filtern ist derart ausgeführt, dass eine gleichmäßige Beleuchtung der zu detektierenden Substratfläche mit mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70% Beleuchtungsintensitätshomogenität erfolgt. Die Substratfläche wird durch das optische System (2.2) auf einen Detektor abgebildet. Dieser kann eine zweidimensionale Kamera (z.B. CCD, CMOS) oder eine sich bewegende Zeilenkamera sein.
Die Änderung der Streueigenschaften wird als Sequenz aufgezeichnet und die Kurven der Zunahme der Streuung an verschiedenen Punkten verglichen. Abhängig von der Steigung der Reflektionsänderung an den jeweiligen Array-Spots können die Targetkonzentrationen, wie in der internationalen Patentanmeldung WO 02/02810 beschrieben, quantitativ bestimmt werden. Die Berechnung erfolgt invers zu der bei der Detektion der Transmissionsänderung, da bei der Anreicherung mit Silberpartikeln an Targetmolekülen die Anzahl lokaler Streuzentren und damit die Streuung steigt.
Wird der Anstieg entsprechend klassifizierter Probenbereiche ausgewertet, kann bei vorzugsweise homogener Temperaturverteilung in der Reaktionskammer ein exakter qualitativer und quantitativer Nachweis der hybridisierten Targetmoleküle durchgeführt werden.
In 6 ist eine typische Bildfolge für die Detektion der Silberaufwachsreaktion nach der Hybridisierung spezifischer Gold-markierter Targetmoleküle auf einer DNA-basierten Substanzbibliothek dargestellt.
Die Reaktionskammer ist aus einem für die bei der Detektion verwendeten Wellenlängen transparenten Substrat ausgeführt. Beispielsweise ist die Reaktionskammer bei der Verwendung von Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich aus Glas und bei der Verwendung von Licht im infraroten Bereich aus Silizium.
Beispiel 2:
Elektrische Detektion kinetisch verlaufender Signalverstärkungsreaktionen
Die elektrische Detektion kinetisch verlaufender Signalverstärkungsreaktionen erfolgt bei den folgenden Varianten des Ausführungsbeispiels durch die Aufnahme von Modulationen bestimmter elektrischer Parameter, insbesondere von Leitfähigkeit, Widerstandsänderungen und Permeabilität.
Durch die Anlagerung von Silber während einer Silberfällungsreaktion an z.B. mit Goldpartikeln markierten Targetmolekülen nach einer spezifischen Hybridisierung mit auf festen Oberflächen immobilisierten oder synthetisierten Probenmolekülen wachsen Schichten auf, welche die optischen Eigenschaften des Gesamtsystems signifikant verändern. Die Signalverstärkung von Gold-markierten Targetmolekülen durch Silber ist z.B. in der internationalen Patentanmeldung WO 02/02810 ausführlich beschrieben, auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Bei der in diesem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung beschriebenen Vorrichtung sind die einzelnen Array-Spots elektrisch kontaktierbar und die dort erzeugten Signale parallel zu einem Messgerät abführbar.
Zur Messung der Widerstandsänderung an den jeweiligen Array-Spots sind die Array-Spots wie in 7 dargestellt über Elektroden elektrisch kontaktiert. Durch die Verschmelzung mit aufwachsendem leitfähigem Material, wie z.B. Silber, ist eine Veränderung des lokalen Widerstandes messbar. Durch dreidimensionale Strukturen auf der Detektionsfläche wie z. B. Erhebungen, Grund- und Durchgangsbohrungen, wird der Effekt der Verschmelzung und die daraus resultierende Widerstandsänderung unterstützt.
8 zeigt schematisch eine Anordnung zur Messung dieser Widerstandsänderungen an einem einzelnen dreidimensionalen Array-Spot.
Abbildungen
1: Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Prozessierungs- und Detektionsvorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren.
2: Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Prozessierungs- und Detektionsvorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren mit einem externen Prozeßkontroller und je nach Individualisierung des Chips variabel wählbaren Detektionssystemen.
3: Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Prozessierungs- und Detektionsvorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren ohne Fluid-Prozessierungseinheit.
4: Auflichtanordnung der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
5: Dunkelfeldanordnung der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
6: Darstellung einer Bilderfolge zur Dokumentation des Aufwachsens von Silberpartikeln bei der Hybridisierung von Gold-markierten Targetmolekülen mit auf der Detektionsfläche in Form einer Substanzbibliothek immobilisierten Sondenmolekülen.
7: Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Prozessierungs- und Detektionsvorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren durch elektrische Detektion der Kinetik des Silberniederschlags an einem einzelnen mit Sondenmolekülen belegten planaren Array-Spot.
8: Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Prozessierungs- und Detektionsvorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren durch elektrische Detektion der Kinetik des Silberniederschlags an einem einzelnen mit Sondenmolekülen belegten mit Durchgangsbohrungen versehenen Array-Spot.

Claims

Vorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren mit: a) einer Temperatursteuerungs- und/oder -regeleinheit; b) einer Reaktionskammer, die einen Träger mit einer Detektionsfläche enthält, auf der eine Substanzbibliothek immobilisiert ist, wobei die Temperatur in der Reaktionskammer durch die Temperatursteuerungs- und -regeleinheit steuerbar und/oder regelbar ist; und c) einem optischen System, mit dem der zeitliche Verlauf von Niederschlagsbildungen auf der Detektionsfläche detektierbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zusätzlich mindestens einen Fluidbehälter, der mit der Reaktionskammer verbunden ist, und ggf. eine Einheit zur Steuerung des Be- und Entladens der Reaktionskammer mit Fluiden umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine mit dem optischen System verbundene Einheit zur Verarbeitung von durch das optische System aufgenommenen Signalen umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zusätzlich eine Schnittstelle für externe Rechner aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das optische System einen zweidimensional auslesbaren Detektor umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das optische System eine Kamera umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kamera eine CCD-Kamera, eine CMOS-Kamera und/oder eine bewegbare Zeilenkamera ist.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Lichtquelle umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle eine multispektrale Lichtquelle ist.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle eine kohärente Lichtquelle ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle ein Laser, eine Licht-emittierende Diode (LED) und/oder eine Hochdrucklampe ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsfläche durch die Lichtquelle zeilenförmig abtastbar ist.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das optische System Linsen, Spiegel und/oder Filter umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das optische System derart ausgestaltet ist, dass die Detektionsfläche homogen beleuchtbar ist.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das optische System derart angeordnet ist, dass der zeitliche Verlauf der Änderung von Transmissionseigenschaften der Detektionsfläche detektierbar ist.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das optische System derart angeordnet ist, dass der zeitliche Verlauf der Änderung von Reflexionseigenschaften der Detektionsfläche detektierbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer sowie der Kammerträger zumindest im Bereich des Strahlengangs von der Lichtquelle zum Detektor optisch transparent ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das optische System derart angeordnet ist, dass der zeitliche Verlauf der Änderung von Streuungseigenschaften der Detektionsfläche detektierbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Kammerträger oder der Träger der Detektionsfläche zumindest im Bereich der Detektionsfläche optisch nicht transparent ist.
Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Kammerträger aus einem Material mit einer Wärmeleitfähigkeit von 15 bis 500 W·m^–1·K^–1 besteht.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Lichtquelle und Detektor auf der selben Seite der Detektionsfläche angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Detektor und Lichtquelle auf entgegen gesetzten Seiten der Detektionsfläche angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer mit einer Datenmatrix versehen ist, die Informationen über die Substanzbibliothek und/oder die Durchführung der Vervielfältigungs- und/oder Nachweisreaktion enthält.
Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23; b) Wechselwirkung der nachzuweisenden Nukleinsäuren (Targets) mit der auf der Detektionsfläche immobilisierten Substanzbibliothek; und c) Detektion der Wechselwirkung.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass zur Detektion der Wechselwirkung eine Reaktion durchgeführt wird, die zu einem Niederschlag an den Array-Elementen führt, an denen eine Wechselwirkung erfolgt ist.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) der zeitliche Verlauf der Niederschlagsbildung auf der Detektionsfläche in Form von Signalintensitäten detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion, die zur Bildung eines Niederschlags auf der Detektionsfläche führt, die Umwandlung eines löslichen Substrats in einen metallischen Niederschlag ist.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Bildung eines Niederschlags an den Array-Elementen führende Reaktion die chemische Reduktion einer Silberverbindung, vorzugsweise Silbernitrat, Silberlactat, Silberacetat oder Silbertartrat, zu elementarem Silber ist.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Umwandlung eines löslichen Substrats in einen metallischen Niederschlag in Gegenwart von mit den Targets gekoppelten Metallclustern bzw. kolloidalen Metallpartikeln erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Umwandlung eines löslichen Substrats in einen metallischen Niederschlag in Gegenwart von Goldclustern oder kolloidalen Goldpartikeln erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplung der Metallcluster bzw. kolloidalen Metallpartikel an die Targets direkt oder über an die Targets gekoppelte Ankermoleküle erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der Gegenwart eines Niederschlags auf einem Array-Element durch Reflexion, Absorption oder Diffusion eines Lichtstrahls, vorzugsweise eines Laserstrahls oder einer Leuchtdiode, durch den Niederschlag erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Wechselwirkung der Targets mit der Substanzbibliothek eine Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass eine Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäuren sowie deren Nachweis durch Wechselwirkung der Targets mit der Substanzbibliothek in einem kontinuierlichen Prozess erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäuren durch eine PCR erfolgt.
Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Durchführung einer PCR und/oder von Mikro-Array basierten Tests.