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Die
Erfindung betrifft neue Verwendungen von proNGF, Derivaten des proNGF
und funktionellen Teilen von proNGF.
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Allgemeiner
Stand der Technik
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Die
Cornea hat die Funktion der Lichtbrechung als wesentliche Voraussetzung
des scharfen Sehens. Die Cornea besteht aus 3 Schichten, einer äußeren Epithelschicht,
dem Stroma und einer inneren Endothelschicht. Das Stroma ist durch
die Bowmansche Membran nach außen
und durch die Descement-Membran nach innen abgegrenzt. Läsionen der
Cornea können
in allen Schichten auftreten. Verletzungen der Epithelschicht werden
durch Migrationsprozesse der Epithelzellen in frühen Phasen und Proliferationsprozesse
in späten
Phasen der Wundheilung ausgeglichen.
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Stromaverletzungen
werden durch Proliferations- und Migrationsprozesse von Keratinozyten
des Stromagewebes sowie nach deren fibroblastischer Transformation
durch die Produktion verschiedener Kollagene, im wesentlichen Typ
I und Typ VI, ausgeglichen.
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Läsionen des
Endothels werden in Abhängigkeit
der Spezies durch Proliferation und/oder Migration endothelialer
Zellen ausgeglichen.
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Verletzungen
der Kornea können
diese Funktion beeinträchtigen
und in schweren Fällen
zum Verlust des Augenlichts führen.
Es werden verschiedene Ursachen cornealer Verletzungen beschrieben:
viral-induzierte Keratitis, neurotrophe und neuroparalytische Keratitis,
post-traumatische
Keratitis, post-infektiöse
Keratitis, post-chirurgische Keratitis, dystrophische, degenerative
oder post-traumatische Keratitis aber auch Korneatransplantationen
(lamellar, penetrierend). Darüber
hinaus treten corneale Beeinträchtigungen
in Zusammenhang mit eingeschränkter
Tränenproduktion
(z. B. durch Medikamente, Kontaktlinsen, gestörter Hormonhaushalt etc.),
als Folge von Laserbehandlungen der Kornea, als Folge chemischer
oder physikalischer Verbrennungen (Burn) und als Folge nichttraumatischer
pathologischer Zustände
(z. B. Autoimmunerkrankungen, Diabetes, Infektionen) auf. Die Heilung
derartiger cornealer Wunden ist häufig eingeschränkt und
kann die postoperative bzw. posttraumatische Genesung erschweren.
Nicht selten entstehen corneale Ulzerationen bis hin zu cornealen
Perforationen.
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Zur
Behandlung cornealer Verletzungen existieren verschiedene Therapieansätze, die
unter anderem Tränenersatzmittel
in flüssiger
und gelartiger Form, antiinflammatorische Substanzen (z. B. Kortikoide,
Cyclosporin A, Antibiotika) und therapeutische Kontaktlinsen einschließen. Diese
Applikationen zeigen jedoch nicht den optimalen Erfolg bei der Behandlung
von Korneaschäden.
Eine Therapie mit heilungsstimulierender Wirkung auf corneale Wunden
wird daher angestrebt. Vor diesem Hintergrund wird zunehmend die
Bedeutung von Wachstumsfaktoren für die Förderung von Wundheilungsprozessen,
aber auch für
die Aufrechterhaltung der Integrität der Augenoberfläche, diskutiert.
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Eine
Stimulation bzw. Induktion der dermalen Wundheilung ist dann von
Bedeutung, wenn Wundheilungsstörungen
vorliegen, die nicht selten chronische Wunden zur Folge haben können. Die
Gefahr chronischer Wunden besteht, bei Nichtbehandlung, in der Notwendigkeit
von Gliedmaßenamputationen
und einer erhöhten
Mortalitätsrate.
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Eine
gestörte
dermale Wundheilung findet man häufig
in Zusammenhang mit Durchblutungsstörungen peripherer Gewebe (z.
B. der Haut) und/oder verminderter peripherer Sensitivität sowie
entzündlicher
Prozesse. Als Beispiele dermaler Wundheilungsstörungen sind das diabetische
Fußulkus,
das venöse
Ulkus oder das Druckulkus zu nennen.
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Die
konventionelle Behandlung dermaler Wunden besteht in der Anwendung
verschiedener Wundauflagen, die ein feuchtes Milieu der Wunde aufrechterhalten
sollen, aber auch von Kompressionsverbänden sowie der Gabe von Antibiotika
zur Eindämmung
bzw. Verhinderung von Infektionen. Darüber hinaus werden zusätzliche,
die Wundheilung fördernde
Agenzien eingesetzt, z. B. Protease-Hemmer, aber auch auf Wachstumsfaktorebene
basierende Wundauflagen (OASISTM) bzw. Hautäquivalente
(Apligraf, Dermagraft). Auf Gelbasis ist derzeit ein PDGF-BB-basierendes
Produkt auf dem Markt, welches die Wundheilung bei Patienten mit
diabetischen Fußulkus
stimuliert. Trotz dieser Therapieansätze ist die Zahl der aufgrund
eines diabetischen Fußulkus
notwendigen Amputationen enorm und beläuft sich allein in den USA
auf 60 000 Amputationen pro Jahr.
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Wachstumsfaktoren
sind Proteine, die aufgrund ihrer spezifischen Wechselwirkung mit
einem Rezeptor in der Lage sind, Zellteilungs-, Migrations-, Differenzierungs-
und Reifungsprozesse anzuregen bzw. zu beeinflussen. Die Proteine
lassen sich in großem
Maßstab
sowohl in genetisch modifizierten Eukaryoten als auch Prokaryoten
herstellen (
EP 0994188 ,
WO 0022119). Die Bedeutung von Wachstumsfaktoren bei der Wundheilung
der Haut wurde bereits nachgewiesen.
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NGF
aus den Speicheldrüsen
der Maus (WO 9848002,
US 2002037584 )
wurde als Wirkstoff zur Behandlung cornealer epithelialer Schädigungen
beschrieben.
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Die
US 6063757 beschreibt die
Anwendung von rekombinantem humanen NGF zur Heilung cornealer und
auch dermaler Schäden.
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In
der WO 0044396 wird nach Applikation von murinem NGF eine Steigerung
des Augeninnendrucks sowohl im Tiermodell (Kaninchen) als auch bei
Patienten mit vermindertem Augeninnendruck beschrieben. Vor dem
Hintergrund einer therapeutischen Anwendung von NGF bei cornealen
Defekten ist eine solche Wirkung als möglicher Verursacher der Entwicklung
von Schädigungen
des Augenhintergrundes (Glaukom) negativ zu bewerten.
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ProNGF
ist das Vorläuferprotein
des NGF. Humaner NGF wird in vivo als präproNGF synthetisiert. Die prä-Sequenz
umfasst eine Länge
von 21 Aminosäuren
und wird nach der Translokation des Proteins in das endoplasmatische
Retikulum abgespalten. Das entstandene Proprotein wird anschließend N-
und C-terminal proteolytisch prozessiert, wodurch der reife NGF
zugänglich
wird. ProNGF besitzt ein Molekulargewicht von 49 kDa, besteht aus
221 Aminosäuren
und tritt in seiner reifen Form als Homodimer auf. Die pro-Sequenz
ist auf der Oberfläche
des gefalteten NGF lokalisiert und nahezu unstrukturiert (Rattenholl
et al., Eur. J. Biochem. 2001, 268, 3296–3303; J. Mol. Biol. 2001,
305, 523–533).
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In
vivo wurde proNGF in verschiedenen Geweben detektiert. Darüber hinaus
wurde die biologische Aktivität
von NGF-Vorstufen und Peptidsequenzen des Precursorproteins in verschiedenen
in vitro- und in vivo-Systemen (Induktion des Neuritenwachstums
bzw. Umverteilung des F-Actin in PC12-Zellen, Steigerung der Aktivität cholinerger
Enzyme nach intrazerebroventrikularer Injektion in neonatale Ratten)
nachgewiesen (Chen et al., Mol. Cell. Endocrinol. 1997, 127, 129–136; Clos
et al., Develop. Brain Res. 1997, 99, 267–270). Die biologische Bedeutung
von proNGF, von der aufgrund von Sequenzhomologien der Prosequenzen
innerhalb der Neurotrophine und der Lokalisation in verschiedenen
Geweben ausgegangen wird, ist bislang nicht geklärt. Einerseits werden Proproteine
als Reservoir des reifen aktiven Proteins diskutiert. Daneben wird
der pro-Sequenz eine Funktion als Helfer der Faltung des reifen
Proteins (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem. 2001, 268, 3296–3303; J.
Mol. Biol. 2001, 305, 523–533)
oder eine Rolle bei der Sortierung der Neurotrophine hinsichtlich
anaboler oder kataboler Wege (Farhadi et al., J. Neurosci. 2000,
20, 4059–4068)
zugeschrieben.
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Die
pharmazeutische Aktivität
von proNGF wurde zum ersten Mal in der
EP 0 994 188 gezeigt. Im Beispiel
4f wird die Stimulierbarkeit und das Überleben sensorischer Neuronen
aus dissoziierten Dorsalwurzelganglien anhand der Ausbildung von
Neuriten untersucht. Bei diesen Versuchen ergab sich eine halb so
große biologische
Aktivität
für den
rekombinanten proNGF im Vergleich zum rekombinanten reifen β-NGF. Aufgrund dieser
Versuchsergebnisse wurde vorgeschlagen, rekombinanten proNGF zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Neuropathien
einzusetzen. Eine Anwendung an Cornea- und Conjunctivazellen und Hautzellen
wird nicht beschrieben.
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Die
WO 96/08562 beschreibt NGF, welcher N-Terminal um ein Peptidfragment
von bis zu ca. 19 Aminosäuren
verlängert
ist, wobei es sich bei diesem Peptidfragment um das C-terminale Fragment
des Precursor-Anteils von NGF handelt. Dieser Precursor enthält am C-Terminus eine Konsensusspaltstelle
des Furintyps, in der ein Austausch in der Aminosäure-1 und/oder
-2 erfolgt ist. Es wird vorgeschlagen, derartige NGF-Varianten in
Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems
einzusetzen, beispielsweise von degenerativen Erkrankungen des Nervensystems
wie einer Degeneration der Retina, bei der Behandlung von Verletzungen
oder Beschädigungen
des Nervensystems usw. Eine Anwendung an Cornea- und Conjunctivazellen
sowie Hautzellen wird nicht gezeigt.
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Die
EP 0786520 beschreibt N-terminal
verlängerten β-NGF, der,
wie natürlicher β-NGF, eine
Wirkung auf Neuronen zeigen soll. Eine Wirkung auf die hier vorgeschlagenen
Indikationsgebiete wird nicht diskutiert.
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Die
Wirkung von Wachstumsfaktoren wird über deren Bindung an spezifische
Rezeptoren vermittelt. Für
NGF sind 2 Rezeptoren beschrieben, TrkA ein hochaffiner Rezeptor
mit Tyrosinkinaktivität
und P75 ein niedrig affiner Rezeptor, an den neben NGF auch andere
neurotrophe Proteine sowie Zytokine binden. Die Expression von TrkA
wurde in der Basalschicht des cornealen Epithels sowie im Stroma
und Endothel nachgewiesen (Lambiase et al., Invest. Ophthalmol.
Vis. Sci. 1998, 39, 1272–1275;
Lambiase et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000, 41, 1063–1069; You
et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000, 41, 692–702). P75
wird von allen Zelltypen der Cornea exprimiert/Touhami et al., Invest.
Ophtalmol. Vis. Sci. 2002, 43, 987–994). Im verletzten Corneagewebe
kann eine Stimulierung der NGF-Rezeptorexpression
zur verstärkten
NGF-Bindung führen
(Lambiase et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000, 41, 1063–1069).
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Die
Wirkung, die über
die Interaktion des NGF mit den jeweiligen Rezeptoren vermittelt
wird, ist bislang nicht bis in alle Details geklärt. P75 wird als Rezeptor beschrieben, über den
apoptotische Prozesse vermittelt werden. Es wurde allerdings auch
gezeigt, dass die durch TrkA vermittelten Prozesse wie Proliferation
und Überleben
sowie Differenzierung von Zellen in Gegenwart von P75 verstärkt werden
können.
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Auch
für proNGF
wird nach neuesten Untersuchungen aufgrund der Wechselwirkung mit
den jeweiligen Rezeptoren von einer eigenständigen biologischen Funktion
ausgegangen. So konnten Hempstead et al. (Science 2002, 294, 1945–1948) erstmals
zeigen, dass an der Furinspaltstelle mutagenisiertes und damit nicht spaltbares
rh-proNGF (rekombinanter humaner proNGF) im Vergleich zu NGF mit
einer geringen Affinität
an TrkA, jedoch mit einer höheren
Affinität
an P75 bindet. Die stärkere
Wechselwirkung mit P75, dem Rezeptor, über den apoptotische Prozesse
vermittelt werden, und die schwächere
Wechselwirkung mit TrkA, dem Rezeptor, über den Proliferation und Überleben
vermittelt werden, lassen für
proNGF einen alternativen Wirkmechanismus im Vergleich zu NGF vermuten.
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Die
bevorzugte Bindung an P75 und die damit verbundene erhöhte Aktivierung
der P75-vermittelten Signalkaskade
wird als Ursache der durch proNGF induzierten Apoptoseprozesse gesehen.
Die Induktion der Apoptose durch proNGF wurde sowohl für Zellen,
die nur P75 exprimieren als auch für Neuronen, die beide Rezeptoren
tragen, nachgewiesen. Nach diesen Ergebnissen wird proNGF als Stimulator
von Apoptoseprozessen über
eine P75 vermittelte Signalkaskade angesehen, während NGF über dessen bevorzugte TrkA-Bindung
das Überleben
der Zellen auch in Gegenwart von P75 bewirken kann. In diesen Versuchen
konnte eine um mindestens den Faktor 10 erhöhte Apoptose-Induktion im Vergleich
zu reifem NGF festgestellt werden. Da P75 gerade bei Entzündungsprozessen,
degenerativen Erkrankungen und bei Verletzungen zusammen mit Neurotrophinen
exprimiert wird, scheint proNGF bei diesen Erkrankungen für die Induktion
der hier ablaufenden apoptotischen Prozesse eine Rolle zu spielen.
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Auch
in der Veröffentlichung
von Beattie et al. (Neuron 2002, 36, 375–386) wird gezeigt, dass der
Neurotrophinrezeptor P75, der bei verschiedenen Verletzungen des
Nervensystems induziert wird, durch seine Verbindung mit proNGF
den Zelltod von Oligodendrozyten fördert. Durch proNGF spezifische
Antikörper
konnte die apoptotische Wirkung des proNGF-P75-Rezeptorkomplexes verhindert werden.
Diese Daten zeigen, dass proNGF bei der Eliminierung von geschädigten Nervenzellen
durch Aktivierung der P75-vermittelten Apoptose ein entscheidende
Rolle spielt. Die Aktivierung von P75 durch proNGF bewirkt damit
den Zelltod von Oligodendrozyten. Das Wechselspiel zwischen dem
P75-Neurotrophinrezeptor
und proNGF ist damit ein zentraler Punkt bei Apoptoseprozessen nach
Verletzungen des Nervensystems.
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Weitere
Hinweise auf P75-vermittelte Apoptoseprozesse werden in Zusammenhang
mit einer erhöhten
proNGF-Konzentration im Gehirn von Alzheimer Patienten diskutiert
(Fahnestock et al., Mol. Cell. Neurosci. 2001, 18, 210–220).
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Die
oben beschriebenen, erst in jüngster
Zeit veröffentlichten
Untersuchungen, unter anderem in der höchst renommierten Wissenschaftszeitschrift
Science, scheinen zu beweisen, dass proNGF Apoptoseprozesse induziert.
Für einen
auf diesem Gebiet arbeitenden Fachmann erscheint es damit kontraproduktiv,
zur Behandlung von Wunden, beispielsweise von Verletzungen der Haut,
der Cornea und der Conjunctiva, proNGF und seine Derivate einzusetzen.
Die Ergebnisse lassen nämlich
vermuten, dass bei Anwendung von proNGF bei der Behandlung von Wunden
z. B. die geschädigten
Haut-, Cornea- und Conjunctivazellen abgetötet werden. Eine therapeutische
Wirksamkeit von proNGF scheint ausgeschlossen.
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Die
in der WO 96/08562 und der
EP
0 994 188 beschriebenen Versuche zur Wirksamkeit von proNGF und
Derivaten von NGF mit einem Anteil von bis zu 19 Aminosäuren des
Precursor- Anteils
von NGF am N-Terminus wurden an sensorischen Neuronen und symphatischen
Neuronen, an Neuronen der Dorsalwurzelganglien bzw. neuronalen embryonalen
Zellen als Testsystemen durchgeführt.
Experimente mit nicht neuronalen Systemen oder eine Übertragbarkeit
auf derartige Systeme wurde nicht beschrieben. In der
EP 0 994 188 wurde zudem auf eine
signifikant schlechtere biologisch-medizinische Wirksamkeit von
proNGF auf neuronale embryonale Zellen hingewiesen.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Wirkstoff
zur Wundheilung und zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen
der Haut-, Cornea- und Conjunctivazellen bereitzustellen.
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Diese
Aufgabe wurde dadurch gelöst,
dass, proNGF, Derivate des proNGF, mit Ausnahme solcher, bei denen
der pro-Anteil vollständig
deletiert wurde, und/oder ein funktioneller Teil hiervon in einer
wirksamen Menge zusammen mit Trägerstoffen
zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen von Haut-, Cornea-
und Conjunctivazellen, insbesondere -gewebe, einsetzbar sind. Die
erfindungsgemäß gewonnenen
Ergebnisse lassen auch den Schluss zu, dass die genannten Wirkstoffe
zur Lagerung und Stabilisierung von Haut-, Cornea- und Conjunctivazellen
sowie zur in-vitro-Vermehrung dieser Zellen geeignet sind.
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Von
der Erfindung umfasst werden auch Derivate des proNGF, bei denen
ein oder mehrere Aminosäuren
ausgetauscht, deletiert, hinzugefügt und/oder chemisch modifiziert
wurden, immer unter Beibehaltung der oben beschriebenen pharmazeutischen,
medizinischen und biologischen Wirksamkeit.
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Aminosäuresubstitutionen
können
auf Grundlage der Ähnlichkeit
in der Polarität,
Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie,
Hydrophilie, und/oder der amphipatischen (amphiphilen) Natur der
involvierten Reste vorgenommen werden. Beispiele für unpolare
(hydrophobe) Aminosäuren
sind Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan
und Methionin. Polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin,
Cystein, Thyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Positiv geladene
(basische) Aminosäuren
schließen
Arginin, Lysin und Histidin ein. Und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und
Glutaminsäure ein.
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"Insertionen" oder "Deletionen" bewegen sich typischerweise
im Bereich von ein bis fünf
Aminosäuren. Der
erlaubte Variationsgrad kann experimentell durch systematisch vorgenommene
Insertionen, Deletionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren in
einem Polypeptidmolekül
unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken und durch Untersuchen
der sich ergebenden rekombinanten Varianten bezüglich ihrer biologischen Aktivität ermittelt
werden.
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Bei
der Durchführung
dieser Änderungen
kann auch der hydropatische Index der Aminosäuren in Betracht gezogen werden.
Jeder Aminosäure
kann auf der Grundlage ihrer Hydrophobizität und ihrer Ladungseigenschaften
ein bestimmter hydropatischer Index zugeschrieben werden. Beispiele
hierfür
finden sich in der WO 00/32039, in der
US 4,554,101 sowie in Kyte & Doolittle, 1982,
auf die hier mit ihrem Inhalt Bezug genommen wird. Es ist bekannt,
daß bestimmte
Aminosäuren
durch andere Aminosäuren
substituierbar sind, wenn sie einen ähnlichen hydropatischen Index
besitzen und bei Ihrem Austausch eine vergleichbare biologische Aktivität des Gesamtmoleküls bewirken.
Entscheidend ist bei allen Derivatisierungen des proNGF immer, daß die biologische,
medizinische bzw. pharmazeutische Wirksamkeit beibehalten bleibt.
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Die
Derivatisierungen von proNGF können
sich sowohl auf den pro-Anteil als auch auf den NGF-Anteil beziehen.
Die Abänderungen
des pro-Anteils umfassen auch Aminosäureadditionen am N-Terminus
des pro-Anteils, die durch den pre-Anteil definiert sind. Die Sequenz
des pre-Anteils, des pro-Anteils von NGF und von NGF selbst sind
bekannt, und es wird hier beispielsweise verwiesen
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Unter "funktioneller Teil" von proNGF werden
erfindungsgemäß solche
Teile verstanden, welche die in der vorliegenden Anmeldung beanspruchten
Indikationen und Verwendungen erfüllen, bei gleichzeitiger Ausschaltung,
z.B. durch Deletion, solcher Anteile von proNGF, die zur Funktion
nicht beitragen.
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Die
funktionellen Anteile können
von einem Fachmann beispielsweise durch Deletionsanalysen ermittelt
werden. Durch systematische Deletionen des pro-Anteils, des prepro-Anteils
und/oder des NGF-Anteils und einer nachfolgenden Analyse des verbleibenden
Moleküls
auf die hier beschriebenen und beanspruchten Indikationen ist der
Fachmann in der Lage, die gewünschten
funktionellen Abschnitte zu ermitteln. Beispielsweise sind derartige
funktionelle Anteile die 25 bzw. 71 Aminosäuren des pro-C-Terminus von proNGF.
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Der
Wirkstoff proNGF umfasst solchen humanen Ursprungs, tierischen Ursprungs,
insbesondere von Nagern wie Ratte, Kaninchen und Maus, von Rind
und Schwein, sowie rekombinant hergestellten proNGF. Zu den rekombinanten
Formen des proNGF gehören
auch Fusionsproteine des proNGF, bei denen proNGF mit einem anderen
Protein bzw. Peptid verknüpft
wurden. Zu Beispielen für
NGF, in denen Fusionierungen mit Proteasen eine kontrollierte Freisetzung
des NGF aus Matrices ermöglichen,
verweisen wir auf Sakiyama-Elbert et
al., FASEB J. 2001, 15, 1300–1302;
Park et al., J. Drug Target 1998, 6, 53–64.
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Die
Derivate des pro-Anteils von NGF umfassen insbesondere solche pro-Formen,
bei denen mindestens 25, weiterhin bevorzugt 71 Aminosäuren des
pro-C-Terminus am N-Terminus des NGF vorhanden sind (Dicou et al.,
J. Cell. Biol. 1997, 136, 389–398).
Weiterhin bevorzugt werden solche Derivate des proNGF, die auf Aminosäureebene
eine Homologie zur pro-Form,
zur prepro-Form und/oder zum NGF-Anteil des proNGF von mindestens
80% aufweisen, bevorzugt von 85 %, von 90 % oder von 95 % oder darüber. Voraussetzung für die erfindungsgemäße Anwendbarkeit
der Derivate ist immer, daß nach
der Derivatisierung die Wirksamkeit in den hier beanspruchten Einsatzgebieten
erhalten bleibt. Verschiedene Testsysteme zur Bestimmung der Aktivität des proNGF
und seiner Derivate sind in den nachfolgenden Beispielen angegeben.
Der Fachmann kann aber auch andere beispielhafte Testsysteme aus
der Literatur ermitteln oder entwickeln (DRG-Test: Davies, in: Nerve
Growth Factors (Rusch, R. A., ed.), 95–109, Wiley &Sons, Boston;
PC12-Test: Greene und Tischler, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1976,
73, 2424–2428;
in vitro skin wound healing model: Geer et al., Tissue Eng. 2002,
8, 787–798;
in vitro cornea wound healing model: Taliana et al., Invest. Ophthalmol.
Vis. Sci. 2001, 42, 81–89).
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Die
Derivatisierungen von proNGF können
sowohl auf Aminosäure-Ebene
stattfinden über
direkte chemische Modifikationen von Aminosäuren. Bevorzugt ist aber eine
Modifikation durch Mutagenese der für das Protein kodierenden DNA.
Hierzu gehört
beispielsweise die site directed-Mutagenese, wie sie aus dem Stand
der Technik bekannt ist und beständig
weiterentwickelt wird (Brannigan und Wilkinson, Nat. Rev. Mol. Cell.
Biol. 2002, 3, 964-970).
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Die
Herstellung von proNGF und seiner Derivate durch rekombinante Techniken
ist beschrieben, und auf diese vorveröffentlichte Literatur wird
hier Bezug genommen (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem. 2001, 268, 3296–3303; Rattenholl
et al., J. Mol. Biol. 2001, 305, 523–533).
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ProNGF
und die oben beschriebenen Derivate stimulieren die Proliferation
und die Migration von Cornea-Zellen, Conjunctivazellen und dermalen
Zellen, fördern
die Aufrechterhaltung der Vitalität dieser Zellen und die Wundheilung
der Haut und der Cornea, beispielsweise akuter und chronischer traumatisch-induzierter und
nicht-traumatisch-induzierter Wunden. Auch werden die Regenerationsprozesse
induziert und gefördert. Weitere
Einzelheiten zur Wirksamkeit werden nachfolgend beschrieben.
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Die
Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung können entweder als Einzelsubstanz
oder in Verbindung mit den Derivaten des proNGF oder in Verbindung
mit anderen Wirkstoffen eingesetzt werden. Insbesondere geeignete
Wirkstoffe sind solche, die die Heilung stimulieren, entzündungshemmend
wirken, antibiotische Eigenschaften haben, antivirale Wirksamkeit
entfalten, antimykotische Stoffe und Wirksubstanzen, die Schmerzen lindern
oder vorbeugen. Eine Vielzahl weiterer Wirkstoffkombinationen ist
möglich,
und hängt
vom Anwendungszweck, vom zu behandelnden Patienten, von der Verträglichkeit
der Wirkstoffe miteinander und weiteren, dem Fachmann bekannten
Faktoren ab. Insbesondere sollen die weiteren in der pharmazeutischen
Zusammensetzung enthaltenen Wirkstoffe die Aktivität des proNGF-Wirkstoffs
erhöhen
oder dessen Aktivität
bei der Behandlung in für
den Patienten günstiger
Form ergänzen.
Bevorzugt ist eine synergistische Wirkung im Arzneimittel und eine
Minimierung von Nebenwirkungen und unerwünschten Wirkungen.
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Die
Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in Form
einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet, in der sie mit
geeigneten Trägern
in solchen Dosen vermischt werden, so daß die Erkrankung behandelt
und/oder gelindert wird. Eine derartige Zusammensetzung kann (zusätzlich zu
den Wirkstoffen und dem Träger) Verdünnungsmittel,
Füllmaterialien,
Salze, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisierungsmittel, Penetrationsverstärker und
andere Materialien enthalten, die in der Technik wohlbekannt sind.
Der Begriff "pharmazeutisch
verträglich" ist als ein nichttoxisches
Material definiert, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven
Inhaltsstoffes bzw. Wirkstoffes nicht stört. Die Auswahl des Trägers und
der weiteren Additive hängt
vom Verabreichungsweg ab. Bevorzugt wurden ophthalmologisch und
dermatologisch verträgliche
Träger
und Additive eingesetzt.
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Techniken
zur Formulierung bzw. Zubereitung und Verabreichung der Verbindungen
der vorliegenden Anmeldung sind in "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing
Co., Easton, PA, letzte Ausgabe, zu finden. Eine therapeutisch wirksame
Dosis bezieht sich ferner auf eine Menge der Verbindung, die ausreicht,
um eine Verbesserung der Symptome zu erreichen, beispielsweise eine
Behandlung, Heilung, Prävention
oder Verbesserung derartiger Zustände. Geeignete Verabreichungswege
sind insbesondere eine topische Anwendung.
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Hierzu
können
die Zusammensetzungen in flüssiger
Form vorliegen, beispielsweise in Form von Emulsionen, Suspensionen
und Lösungen,
in Sprayform, in Form transdermaler Systeme wie Pflaster, in Form
einer Creme, einer Salbe oder eines Gels. Bevorzugt werden auch
Retardformen. Weitere, an sich bekannte Darreichungsformen sind
dem Fachmann geläufig.
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Die
Menge an Wirkstoff, die adäquat
ist, um die oben beschriebenen Wirkungen zu erreichen, wird als therapeutisch
wirksame Dosis definiert. Die Menge, die für diese Verwendung wirksam
sind, hängen
vom Schweregrad des Zustandes des Patienten und seiner Erkrankung
ab. Einfache oder mehrfache Verabreichungen nach einem täglichen,
wöchentlichen
oder monatlichen Behandlungsplan können mit Dosisstärken und
Mustern kombiniert werden, die durch den behandelnden Arzt ausgewählt werden.
Die einzusetzenden Dosen werden ebenfalls durch den Arzt bestimmt,
wobei bevorzugt Mengen von 1 ng/ml bis 1 mg/ml bzw. 1 ng/g bis 1
mg/g, bevorzugt von 10 ng/ml bis 200 μg/ml bzw. 10 ng/g bis 200 μg/g eingesetzt
werden. Selbstverständlich
sind auch andere Wirkstoffdosen einsetzbar, die beispielsweise auch
von der Formulierung des Wirkstoffs, von der Anwesenheit weiterer
Wirkstoffe, vom einzelnen Patienten, vom Applikationsort, von der An
der Erkrankung usw. abhängen.
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Es
wird darauf hingewiesen, daß der
Ausdruck "proNGF", wie er vorliegend
eingesetzt wird, die in den Patentansprüchen angegebenen und der vorliegenden
Beschreibung näher
definierten Ausgestaltungen mit umfasst, also beispielsweise auch
Derivate des proNGF.
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Nachfolgend
wird die Erfindung in weiteren Einzelheiten beschrieben, wobei der
Fachmann aufgrund seines Fachwissens in der Lage ist, die Erfindung
im Rahmen der Patentansprüche
abzuwandeln, so daß auch Ausgestaltungen
mitumfasst werden, die in der vorliegenden Beschreibung nicht gesondert
aufgeführt
sind.
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Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet die Verwendung von proNGF zur Aufrechterhaltung
der Vitalität cornealer
Zellen und zur Stimulation proliferativer und migratorischer Prozesse
von Zellen. ProNGF ist geeignet zur Behandlung cornealer und dermaler
Verletzungen mit dem Ziel einer Unterstützung bzw. Stimulation cornealer
und dermaler Regenerationsprozesse. Die proNGF-haltigen Zusammensetzungen
sind geeignet zur Lagerung und Stabilisierung von Corneas aufgrund
deren Fähigkeit,
die Vitalität
cornealer Zellen positiv zu beeinflussen.
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Die
zugrunde liegende Verwendung von proNGF und seiner Derivate zur
Beschleunigung der Wundheilung beinhaltet weiterhin: I.) Bereitstellung
einer ophthalmologisch und/oder dermatologisch verträglichen Zusammensetzung,
die eine wirksame Konzentration an proNGF enthält, II.) Applikation der Zusammensetzung
auf die Kornea präventiv
vor einer Verletzung der Kornea oder therapeutisch nach einer Verletzung
der Kornea mit dem Ziel eine klinisch nachweisbare Stimulation der
Heilung der cornealen Verletzungen durch Stimulation proliferativer
und/oder migratorischer Prozesse cornealer Zellen des Epithels,
Stromas oder Endothels zu erreichen bzw. therapeutisch zur Behandlung
dermaler Wunden mit dem Ziel, eine klinisch nachweisbare Stimulation
der Heilung der Verletzungen durch Stimulation proliferativer und/oder
migratorischer Prozesse dermaler Zellen zu erreichen.
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I Ophthalmologisch und/oder
dermatologisch verträgliche
Zusammensetzung, die proNGF enthält
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- A: Die Bezeichnung proNGF schließt ein:
1.) die Aminosäuresequenz
des NGF, die N-terminal
um die vollständige
oder partielle Sequenz des Proproteins bzw. Präproproteins erweitert ist,
wobei die Erweiterung mindestens die Aminosäuren ab Position 1 bis 25,
weiterhin 1–71
des C-Terminus der Prosequenz umfasst und 2.) glykosyliert oder
nicht glykosyliert vorliegt bzw. sich im Glykosylierungsstatus unterscheidet,
3.) humanen oder nicht humanen Ursprungs ist, 4.) rekombinant oder
nicht rekombinant gewonnen wird, 5.) als Fusionsprotein mit einem
anderen heterologen Protein als Fusionspartner oder nichtfusioniert
vorliegt, 6.) unmodifiziert oder modifiziert ist durch Aminosäureaustausche,
Deletionen oder Insertionen oder chemisch modifizierte Derivate
des proNGF.
- B: ProNGF kann mittels verschiedener Methoden gewonnen werden:
1.) Isolation aus humanem oder tierischem Gewebe, 2.) chemische
Synthese z. B. Festphasenpeptidsynthese, 3.) Herstellung durch gentechnisch
veränderte
Pro- oder Eukaryoten.
- C: Ophthalmologisch verträgliche
Zusammensetzungen sind Materialien wässriger, salbenartiger oder
gelartiger Konsistenz, die einen pharmazeutisch akzeptierten Träger enthalten.
Die Träger
können
steriles Wasser, verschiedene organische Lösungsmittel, emulsierende oder
suspendierende Agenzien oder Verdünnungsmittel enthalten. Die
Träger
können
physiologisch verträgliche
oberflächenaktive
ionische oder nicht-ionische Substanzen enthalten. Die Träger können antibakterielle,
antifungale Komponenten und/oder Konservierungsstoffe (z. B. Parabene,
Chlorbutanol, Sorbinsäure,
Phenol, Thimerosal) enthalten. Die Träger können Puffer zur Aufrechterhaltung
eines pH-Werts zwischen 5.0 und 8.0 enthalten. Die Puffer können konventionelle
Puffer sein wie z. B. Phosphat-, Borat-, Zitrat-, Bikarbonat- oder
Tris-HCl-Puffer. Die Träger
können
durch Zugabe entsprechender osmotisch aktiver Komponenten (z. B.
Kochsalzlösung,
Zucker) isotonisch sein. Die Träger
können
andere solubilisierende Komponenten wie proteinöse Träger oder Solubilisatoren (z.
B. Albumin) enthalten. Die Träger
können
Antioxidantien und Stabilisatoren wie z. B. Natriumbisulfit, Natriummetabisulfit,
Natriumthiosulfat, Thioharnstoff enthalten. Mögliche Benetzungsagenzien können z.
B. Polysorbat 80, Polysorbat 20, Poloxamer 282 oder Tyloxapol sein.
Die Träger
können
viskositätssteigernde
Agenzien wie z. B. Dextran 40, Gelatine, Glycerin, Lanolin, Zellulosederivate
(z.B. Hydroxyethylzellulose, Hydroymethylpropylzellulose, Methylzellulose,
Carboxymethylzellulose), Vinylpolymere (z.B. Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon)
Hyaluronsäure,
Polyacrylsäure,
Petrolatum, Polyoxyethylen, Polyethylenglycol, Polyoxypropylen und/oder
pflanzliche Öle
zur Erleichterung der Applikation und/oder für eine bessere Tolerierbarkeit
enthalten. Die Träger
können
Antibiotika zur Kontrolle von Infekten enthalten. Die Träger können Agenzien
zur verlangsamten Freisetzung des Wachstumsfaktors enthalten. Alle
Bestandteile des Trägers
sind dadurch gekennzeichnet, dass sie ophthalmologisch verträglich und
nicht toxisch sind.
- D: Wenn als ophthalmologisch verträglicher Träger zur Behandlung der Cornea
Augentropfen verwendet werden, liegt die Konzentration des proNGF
im Träger
zwischen 1 ng/ml und 1 mg/ml. Wenn als ophthalmologisch verträglicher
Träger
zur Behandlung der Cornea Salben oder Gele verwendet werden, liegt
die Konzentration des proNGF im Träger zwischen 1 ng/g und 1 mg/g.
- E: proNGF kann im ophthalmologisch verträglichen Träger alleine oder in Kombination
mit anderen heilungsstimulierenden, antiinflammatorischen oder schmerzlindernden
Substanzen eingesetzt werden.
- F: Dermatologisch verträgliche
Zusammensetzungen sind Materialien auf wässriger, salbenartiger, emulsionsartiger,
cremeartiger oder gelartiger Konsistenz, die einen pharmazeutisch
akzeptierten Träger
enthalten. Die Träger
können
steriles Wasser, verschiedene organische Lösungsmittel, emulsierende oder
suspendierende Agenzien oder Verdünnungsmittel enthalten.
Die
Träger
können
physiologisch verträgliche
oberflächenaktive
ionische oder nicht-ionische Substanzen. Die Träger können antibakterielle, antifungale
Komponenten und/oder Konservierungsstoffe (z. B. Parabene, Chlorbutanol,
Sorbinsäure,
Phenol, Thimerosal) enthalten. Die Träger können Puffer zur Aufrechterhaltung
eines definierten pH-Werts enthalten. Die Puffer können konventionelle
Puffer sein wie z. B. Phosphat-, Borat-, Zitrat-, Bikarbonat- oder
Tris-HCl-Puffer. Die Träger
können
andere solubilisierende Komponenten enthalten. Die Träger können Antioxidantien
und Stabilisatoren enthalten. Die Träger können viskositätssteigernde
Agenzien/Polymere wie z. B. Dextran 40, Gelatine, Glycerin, Zellulosederivate
(z. B. Hydroxyethylzellulose, Hydroymethylpropylzellulose, Methylzellulose,
Carboxymethylzellulose), Polyethylenglycol, Vinylpolymere (z. B.
Polyvinylalkohol, Polyvinylpolyvinylpyrrolidon), Polyacrylsäure und
deren Derivate, Polyoxyethylene, Polyoxypropylen und deren Copolymere
(z. B Pluronic), Polysaccharide (z. B. Hyaluronsäure, Heparin) Kollagen und/oder
pflanzliche Öle
bzw. Fettsäuren
oder Fettsäureester
bzw. -Derivate enthalten. Die Träger
können
Antibiotika zur Kontrolle von Infekten enthalten. Alle Bestandteile
des Trägers
sind dadurch gekennzeichnet, dass sie dermatologisch verträglich und
nicht toxisch sind.
- G: Bei Verwendung eines dermatologisch verträglichen Trägers zur Behandlung von Hautwunden
auf Salben- Gel- oder Cremebasis, liegt die Konzentration des proNGF
im Träger
zwischen 1 ng/g und 1mg/g. Bei Verwendung von Lösungen, Sprays etc. liegt die
proNGF-Konzentration im Träger
zwischen 1 ng/ml und 1 mg/ml. Wundauflagen können mit einer effektiven Dosis
lyophilisierten proNGF's
präpariert
werden in einem Bereich zwischen 1 ng/cm2 und
1 mg/cm2.
- H: proNGF kann im dermatologisch verträglichen Träger alleine oder in Kombination
mit anderen heilungsstimulierenden, antiinflammatorischen oder schmerzlindernden
Substanzen eingesetzt werden.
-
II Applikation
-
- A: Die Applikation des proNGF-enthaltenden
Trägers
auf die Kornea kann präventiv
vor einer Verletzung der Kornea oder therapeutisch nach einer Verletzung
der Kornea erfolgen in einer Menge die ausreichend ist, eine klinisch
nachweisbare Stimulation der Heilung der cornealen Verletzungen
durch Stimulation proliferativer und/oder migratorischer Prozesse
cornealer Zellen zu erreichen.
- B: Der proNGF-enthaltende Träger
wird auf die Kornea aufgebracht in einer Menge zwischen 10 und 500 μl, vorzugsweise
50 bis 100 μl.
- C: Ein- oder mehrfache Applikationen auf die Kornea sind möglich, vorzugsweise
ein- bis 4-fache
Applikation täglich.
Die Applikation kann zu jeder Zeit nach der Verletzung beginnen.
- D: Unter Verletzungen der Cornea werden alle Vorgänge und
Zustände
verstanden die eine Schädigung aller
Bereiche der Cornea, des Epithels, des Stromas und des Endothels
(einschließlich
der Bowmanschen- und Descement-Membranen) verursachen oder charakterisieren.
Dazu gehören
sowohl oberflächliche
Verletzungen als auch tiefe Wunden der gesamten Fläche der
Cornea. Beispiele für
oberflächliche
Wunden des Epithels und Stromas sind viral-induzierte, neurotrophe
und neuroparalytische, post-traumatische, post-infektiöse, post-chirurgische, dystrophische,
degenerative Keratitis aber auch Korneatransplantationen und corneale
Beeinträchtigungen
in Zusammenhang mit eingeschränkter
Tränenproduktion
(z. B. durch Medikamente, Kontaktlinsen, gestörter Hormonhaushalt etc.),
als Folge von Laserbehandlungen, als Folge chemischer oder physikalischer
Verbrennungen (Burn), Verätzungen,
Prellungen, Perforationen, und als Folge nichttraumatischer pathologischer
Zustände
(z. B. Autoimmunerkrankungen, Diabetes). Tiefe Verletzungen bis
hin zum Endothel können
z. B. durch Erkrankungen die mit der Entwicklung von Abnormitäten des
Endothels einhergehen (z. B. Fuchs Dystrophie, aphakisch bullöse Keratopatie,
pseudoaphakisch bullöse
Keratopatie, virale Endothelitis, Iritis) oder durch operative Eingriffe
im vorderen Augenbereich, z. B. nach Kataraktoperationen, penetrierender
Keratoplasty, intraokularer Linseninsertion, intraokularem Linsenaustausch,
Iridoplasty, Pupiloplasty, Trabeculectomy entstehen. Die Aufbringung
erfolgt bei der Behandlung von Cornea-Erkrankungen auf die Augenoberfläche und/oder
in die vordere Augenkammer.
- E: Die Applikation des proNGF-enthaltenden Trägers auf
dermale Wunden erfolgt therapeutisch nach einer Verletzung in einer
Menge die ausreichend ist, eine klinisch nachweisbare Stimulation
der Heilung der dermalen Verletzung durch Stimulation proliferativer
oder migratorischer Prozesse dermaler Zellen zu erreichen.
- F: Der proNGF-enthaltende Träger
wird auf die Hautwunde aufgebracht in einer Menge die ausreichend
ist die Wundfläche
zu bedecken.
- G: Ein- oder mehrfache Applikationen auf die Hautwunde sind
möglich,
vorzugsweise ein- bis
2-fache Applikation täglich.
Die Applikation kann zu jeder Zeit nach der Verletzung beginnen.
Unter "Haut" wird die Epidermis
und das Korium mit ihren einzelnen Schichten verstanden. Zu den
Einzelheiten wird hier auf die Stichwörter "Cutis", "Epidermis" und "Korium" in Pschyrembel,
Klin. Wörterbuch,
de Gruyter Verlag, Berlin-New York, letzte Auflage, hingewiesen.
- H: Unter Verletzungen der Haut werden alle Vorgänge und
Zustände
verstanden, die eine Schädigung
aller Bereiche der Haut verursachen oder charakterisieren. Dazu
gehören
sowohl oberflächliche
Verletzungen als auch tiefe Hautwunden. Beispiele für dermale
Wunden sind das diabetische Fußulkus,
das venöse
Ulkus und das Druckulkus, chronische Wunden, Verletzungen der Haut
durch chemische oder thermische Einwirkungen, durch Unfälle, durch
Mikroorganismen wie Viren, Pilze und Bakterien usw.
-
Die
erfindungsgemäß eingesetzten
proNGF-Wirkstoffe können
auch zur Lagerung, zur Kultivierung und zur Herstellung in vitro
von Cornea-, Conjunctiva- und Hautzellen, Zellverbänden, insbesondere
Zellgeweben, eingesetzt werden. Die Wirkstoffe werden dann in das
Kulturmedium in einer die Lagerung und Kultivierung fördernden
Menge zugegeben, die vom Fachmann bestimmt werden kann; bevorzugt
werden Mengen von 1 ng/ml bis 100 μg/ml eingesetzt. Die Zugabe
der proNGF-Wirkstoffe bewirkt eine Stimulation der Proliferation
sowie eine Aufrechterhaltung der Vitalität der Haut-, Cornea- und Conjunctivazellen,
fördert
die Regeneration von verletzten Zellen und erleichtert damit die
Lagerung und Stabilisierung dieser Zellen und unterstützt die
Kultivierung der Zellen in vitro. Die so gewonnenen Zellen können beispielsweise
zur Transplantation bei Patienten mit geschädigten Haut-, Cornea- und Conjunctivazellverbänden eingesetzt
werden. Die Zellen können
durch den Einsatz der proNGF-Wirkstoffe über einen längeren Zeitraum gelagert werden
und fördern damit
die Möglichkeit
von Transplantationen von Haut-, Cornea- und Conjunctivagewebe.
Längere
Transportzeiten vom Spender zum Empfänger des Transplantats können damit überbrückt werden.
-
Bei
der Förderung
der Proliferation und Migration der Zellen in Kultur können die
Zellen in Verbindung mit Trägergeweben
und verschiedensten Zelltypen kokultiviert werden. So ist es auch
möglich,
Corneazell-Mischgewebe herzustellen, um eine künstliche Cornea zur Transplantation
einzusetzen (Griffith et al., Cornea 2002, 21 (7 Suppl), 554–61; Germain
et al., Prog. Retin. Eye. Res. 2000, 19, 497–527). Auch die Differenzierungsprozesse
der Haut-, Cornea- und Conjunctivazellen können durch die erfindungsgemäß eingesetzten proNGF-Moleküle angeregt
werden.
-
Auch
bei Conjunctivazellen wird die Proliferation in Verbindung mit dem
proNGF-Wirkstoffen
gefördert; unterstützt wird
damit die Transplantation von Conjunctivagewebe bei Patienten, die
beispielsweise am Trockenaugensyndrom leiden.
-
Die
EP 0994188 und WO 0022119
befassen sich mit der Herstellung von NGF (Nerve Growth Factor) aus
proNGF und patentieren gleichzeitig die Substanz proNGF. In dem
in diesen Patenten publizierten in vitro-Assay (Dorsal Root Ganglion
Assay) wird eine vergleichbare Wirkung von proNGF und NGF hinsichtlich
des Überlebens
von Hühnerembryoneuronen
beschrieben was eine vergleichbare Wechselwirkung mit den für NGF relevanten
Rezeptoren TrkA bzw. P75 vermuten lässt. Hempstead et al. (Science
2002, 294, 1945–1948) konnten
jedoch zeigen, dass an der Furinspaltstelle mutagenisiertes, nicht
spaltbares rh-proNGF im Vergleich zu NGF mit einer geringeren Affinität an TrkA
aber mit einer höheren
Affinität
an P75 bindet. Die bevorzugte Bindung des proNGF an P75 und die
damit verbundene verstärkte
Aktivierung der P75-vermittelten Signalkaskade wird als Ursache
der durch proNGF induzierten Apoptoseprozesse beschrieben. In diesem
Zusammenhang wird die durch diese unterschiedliche Rezeptorbindung
beider Proteine vermittelte biologische Wirkung auf verschiedene
Wirkmechanismen zurückgeführt.
-
Die
Induktion der Apoptose durch proNGF wurde sowohl für Zellen,
die nur P75 exprimieren als auch für Neuronen, die beide Rezeptoren
tragen, nachgewiesen und scheint demnach durch die Koexpression
des hochaffinen Rezeptors TrkA nicht beeinflusst zu werden. Nach
diesen Ergebnissen wird proNGF als Stimulator von Apoptoseprozessen über eine
P75 vermittelte Signalkaskade angesehen während NGF über dessen bevorzugte TrkA-Bindung
das Überleben
der Zellen auch in Gegenwart von P75 bewirken kann.
-
Vor
dem Hintergrund der durch Hempstead et al. publizierten Apoptoseinduktion
durch proNGF scheint eine Anwendung von proNGF zur Stimulierung
der cornealen und dermalen Wundheilung und bei den anderen, hier
beschriebenen Indikationen über
die Induktion proliferativer und migratorischer Prozesse ungeeignet
zu sein.
-
Bei
Untersuchungen von proNGF in verschiedenen in-vitro Zellsystemen
wurde überraschenderweise festgestellt,
dass proNGF nicht wie bisher beschrieben die Apoptose induziert,
sondern bei den erfindungsgemäß eingesetzten
Zellen die Proliferation und das Überleben sowie die Migration
von Zellen stimulieren. Im Vergleich zu NGF wurde in verschiedenen
in vitro-Tests sogar eine stärkere
Wirkung des proNGF auf die Proliferation und Migration cornealer
Zellen nachgewiesen. Darüber
hinaus konnte im Tierversuch gezeigt werden, dass proNGF eine stärkere Wirkung
auf die Heilung künstlich
gesetzter cornealer Wunden im Vergleich zu NGF hat.
-
Demnach
wird durch proNGF keine Apoptose in den von uns verwendeten Zellsystemen
induziert. Alle diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der durch
proNGF vermittelte Wirkmechanismus über eine Interaktion mit P75
nicht ausschließlich
apoptotische Prozesse zu Folge hat sondern überraschenderweise auch proliferative
oder migratorische Prozesse initiieren kann.
-
1.) Wirkung von proNGF
auf die Migration von Fibroblasten
-
Bei
dem hier beschriebenen in vitro-Testsystem zur Migrationsinduktion
handelt es sich um Fibroblasten aus der Maus (NIH3T3), die hinsichtlich
der durch rh-proNGF und rh-NGF vermittelten Effekte auf die Migration
im Boyden-Kammer-Test untersucht wurden.
-
Wenn
eine Apoptoseinduktion durch proNGF nach obigen Ergebnissen aufgrund
der Wechselwirkung mit P75 zu erwarten sein sollte, sollte sich
in diesem Test keine migratorische Aktivität der Zellen in Gegenwart von
proNGF nachweisen lassen. Überraschenderweise
konnte in diesem Testsystem eine bislang nicht beschriebene stimulatorische
Aktivität
von proNGF auf die Migration der Fibroblasten in vitro gefunden
werden. Der durch proNGF vermittelte Effekt ist dabei vergleichbar
zu dem durch NGF vermittelten Effekt (Beispiel 1, 1).
-
2.) Wirkung von proNGF
auf corneale Zellen
-
Bei
den hier beschriebenen in vitro-Testsystemen handelt es sich um
Zellen des Corneagewebes (BCE C/D 1-b), die hinsichtlich ihrer der
durch proNGF und NGF-vermittelten
Effekte untersucht wurden. Eine Apoptoseinduktion durch proNGF wäre nach
obigen Ergebnissen aufgrund der Wechselwirkung mit P75 zu erwarten
gewesen.
-
Es
wurde jedoch eine bislang nicht beschriebene stimulatorische Aktivität von proNGF
auf die Proliferation und die Migration cornealer Zellen in vitro
gefunden (Beispiel 2 und 3, 2 und 3). Überraschenderweise konnte in
diesen Testsystemen im Gegensatz zu den bereits publizierten Daten
zur Apoptoseinduktion durch proNGF kein Nachweis einer Apoptose
erbracht werden. Darüber
hinaus konnte gezeigt werden, dass proNGF im Vergleich zu NGF eine
stärkere
Proliferationsinduktion (2)
sowie eine signifikant stärkere
Migrationsinduktion (3)
boviner Corneazellen (BCE C/D 1-b) auslöst.
-
3.) Wirkung von proNGF
auf die Heilung cornealer Wunden im Tiermodell
-
Im
Kaninchenmodell konnte überrschenderweise
gezeigt werden, dass die Wundheilung nach Setzung künstlicher
Wunden der Cornea durch proNGF beschleunigt verläuft und keine Anzeichen einer
Apoptoseinduktion durch rh-proNGF zu beobachten sind (Beispiel 4). Überraschenderweise
konnte im Vergleich zu rh-NGF gezeigt werden, dass die durch proNGF
vermittelte Stimulation der Wundheilung beschleunigt ist. So wird
bei einer Dosis von 2 μg/ml
rh-proNGF eine fast vollständige
Wundheilung (> 98%)
nach 4 Tagen erreicht. Für
rh-NGF einer Dosis von 2 μg/ml
wird eine > 98%ige
Wundheilung am Tag 5 erreicht während
die Vehikelkontrolle erst an Tag 7 zu mehr als 98% abgeheilt war.
Mit rh-proNGF wird demnach ein besserer Effekt als mit rh-NGF erreicht.
-
Darüber hinaus
wurde gezeigt, dass keinerlei toxische Effekte bzw. eine Beeinflussung
des Augeninnendrucks durch rh-proNGF verursacht werden (Tabelle
1). Auch diese Ergebnisse sprechen gegen eine proNGF-vermittelte
Apoptoseinduktion im cornealen Gewebe.
-
Die
Erfindung wird durch nachfolgende Beispiele illustriert. Alle Beispiele
dienen der Illustration und sind nicht einschränkend zu verstehen.
-
Beispiel 1
-
Migrationsinduktion muriner
Fibroblasten (3T3)
-
Die
Zellen werden in Vollmedium (DMEM (Sigma D 5796) mit 10% FBS (Sigma,
F-2442) und 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin (Sigma, P-4333)
bei 37°C,
5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Bei
Erreichen einer Konfluenz von ca. 60% werden die Zellen trypsinisiert.
Je 210 μl
einer NGF bzw. proNGF-haltigen Lösung
verschiedener Konzentrationen (z. B. NGF : 10–7,
10–8,
10–9 M;
proNGF : 5·10–7, 5·10–8,
5·10–9,
5·10–10 M)
in Testmedium (DMEM mit 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin)
werden in die untere Kammer einer Boyden-Kammer (Blind well, 8 mm
Durchmesser, 200 μl
well (BW200L), Neuro Probe Inc.) gegeben. Als Positivkontrolle dient
Vollmedium (s.o.), als Negativkontrolle dient Testmedium mit Antibiotikum.
Nach Auflage einer porösen
Membran (VWR, 150446, Whatman, Nuclepore Track-Etch Membrane, PC MB,
13 mm, 8.0 μm
Porengröße, PVPF)
werden je 800 μl
einer Zellsuspension einer Dichte von 2·105 Zellen/ml in
die obere Kammer der Boyden-Kammer gegeben. Die Kammern werden 4
Stunden bei 37 °C,
5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Danach werden die Kammern
auseinander geschraubt und die Membranen mittels Hämalaun/Eosin
(HEMACOLOR®-Fixierlösung HEMACOLOR® 2-Färbereagenz
rot HEMACOLOR® 3-Färbereagenz
blau, VWR International, 1.11957.2500) gefärbt. Je 5 Felder werden je
Filter im gesamten Feld eines Netzmikrometer-Okulars (10 × Vergrößerung,
12.5 mm2 = Großquadrat, bestehend aus 100
Kleinquadraten) ausgezählt
und gemittelt. Der Wert der Positivkontrolle wird 100% gesetzt und
alle anderen Werte werden darauf bezogen. Die statistische Auswertung
erfolgte mittels t-Test
(a = 0.05)
-
Die
Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
-
ProNGF
zeigt bei den Dosen 5·10–7 M
und 5·10–8 M
eine signifikante Migrationsinduktion muriner Fibroblasten im Vergleich
zur Migration im Testmedium alleine. Weiterhin wird durch rh-proNGF
eine vergleichbare Migrationsinduktion wie durch rh-NGF nachgewiesen.
-
Beispiel 2
-
Proliferationsinduktion
endothelialer Corneazellen (BCE C/D 1-b)
-
Die
Zellen werden in Vollmedium (DMEM (Sigma, D-6046) mit 5% FBS (Sigma,
F-2442) und 10% Kälberserum
(Sigma, C-8056), 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin (Sigma, P-4333)
sowie 150 μM
Monothioglycerol (Sigma, M-6145) bei 37°C, 5% CO2 und
95% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Bei Erreichen einer Konfluenz von
ca. 80% werden die Zellen trypsinisiert. Je 1 ml Zellsuspension
einer Dichte von 5·104 Zellen/ml wird in die wells einer 24-Loch
Platte ausgesät.
Die Zellen werden 24 Stunden in Vollmedium kultiviert, danach wird das
Medium entnommen, die Zellen 3 × mit
sterilem PBS gewaschen und anschließend in jeweils 1 ml Testmedium
(DMEM mit 1% FBS sowie 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin)
welches die zu testenden Proteine rh-NGF oder rh-proNGF in verschiedenen
Konzentrationen (z. B. 10–7 M, 10–9 M,
10–11 M)
enthält,
aufgenommen. Die Zellen werden weitere 48 Stunden kultiviert und
die Proliferation anschließend
mit Hilfe des Nachweises des BrdU-Einbaus (Roche, 144611) in die
zelluläre
DNA über
anti-BrdU spezifische Antikörper entsprechend
der dazu vorliegenden Vorschrift nachgewiesen.
-
Die
Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
-
ProNGF
zeigt bei allen Dosen (z. B. 10–7 M,
10–9 M
und 10–11 M)
eine signifikante Proliferationsinduktion cornealer BCE C/D 1-b-Zellen
im Vergleich zur Proliferation im Testmedium alleine. Weiterhin
wird durch rh-proNGF eine stärkere
Proliferationsinduktion im Vergleich zur Proliferationsinduktion
durch rh-NGF nachgewiesen.
-
Beispiel 3
-
Migrationsinduktion endothelialer
Corneazellen (BCE C/D 1-b)
-
Die
Zellen werden in Vollmedium (DMEM (Sigma, D-6046) mit 5% FBS (Sigma,
F-2442) und 10% Kälberserum
(Sigma, C-8056), 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin (Sigma, P-4333)
sowie 150 μM
Monothioglycerol (Sigma, M-6145) bei 37°C, 5% CO2 und
95% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Bei Erreichen einer Konfluenz von
ca. 80% werden die Zellen trypsinisiert. Je 210 μl einer NGF bzw. proNGF-haltigen
Lösung
verschiedener Konzentrationen (z. B. NGF : 10–6,
10–7,
10–8 M;
proNGF : 10–6,
10–7,
10–8 M)
in Testmedium (DMEM mit 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin)
werden in die untere Kammer einer Boyden-Kammer (Blind well, 8 mm
Durchmesser, 200 μl
well (BW200L), Neuro Probe Inc.) gegeben. Als Positivkontrolle dient
Vollmedium (s.o.), als Negativkontrolle dient Testmedium mit Antibiotikum.
Nach Auflage einer porösen
Membran (VWR, 150446, Whatman, Nuclepore Track-Etch Membrane, PC
MB, 13 mm, 8.0 μl
Porengröße, PVPF)
werden je 800 μl
einer Zellsuspension einer Dichte von 2·105 Zellen/ml
in die obere Kammer der Boyden-Kammer gegeben. Die Kammern werden
4 Stunden bei 37 °C,
5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Danach werden die Kammern
auseinander geschraubt und die Membranen mittels Hämalaun/Eosin
(HEMACOLOR®-Fixierlösung HEMACOLOR® 2
-Färbereagenz
rot HEMACOLOR® 3-Färbereagenz
blau, VWR International, 1.11957.2500) gefärbt. Je 5 Felder werden je
Filter im gesamten Feld eines Netzmikrometer-Okulars (10 × Vergrößerung, 12.5 mm2 =
Großquadrat,
bestehend aus 100 Kleinquadraten) ausgezählt und gemittelt. Der Wert der
Positivkontrolle wird 100% gesetzt und alle anderen Werte werden
darauf bezogen. Die statistische Auswertung erfolgte mittels t-Test
(α = 0.05)
-
Die
Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
-
ProNGF
zeigt bei einer Dosis von 10– 6 M
eine signifikante Migrationsinduktion der Corneazellen im Vergleich
zur Migration im Testmedium alleine. Weiterhin wird bei dieser Dosis
durch proNGF eine signifikant stärkere
Migrationsinduktion im Vergleich zu der durch NGF verursachten Migration
nachgewiesen.
-
Beispiel 4
-
In vivo – Beschleunigung
der Heilung künstlich
gesetzter Wunden der Cornea
-
New
Zealand Albino-Kaninchen (2,5 bis 3,1 kg Körpergewicht, weiblich) werden
operativ bilaterale Corneawunden gesetzt. Dazu werden die Tiere
z. B. mit 25 mg/kg Tiletamine-Zolazepam
(Zoletil®,
VIRBAC) und 5 mg/ml Xylazine (Rompun® 2%,
BAYER AG) anästhesiert.
Eine topische Komplementäranästhesie
des Auges wird durch Eintropfen von z. B. Tetracaïne 1 % (TVM)
erreicht. Die Wundsetzung auf der Cornea erfolgt am Tag 0 durch
Anwendung einer bilateralen, zentral lokalisierten 6 mm lamellaren
Keratektomie. Die gesamte Behandlung erfolgt unter standardisierten
aseptischen Bedingungen.
-
Die
Behandlung der Korea der Tiere erfolgt 4 × täglich durch Eintropfen von
50 μl einer
0,9%-Kochsalzlösung oder
einer rh-proNGF- bzw. rh-NGF-haltigen (2 μg/ml, 20 μg/ml oder 200 μg/ml Protein)
0,9%-Kochsalzlösung
beginnend am Tag 1 nach Wundsetzung bis einschließlich Tag
7 nach Wundsetzung.
-
Der
Wundheilungsverlauf wird täglich
von Tag 1 bis Tag 7 durch Eintropfen einer Fluoresceinlösung in die
Augen und digitale Photodokumentation morphologischer Veränderungen
anhand der Corneafärbung
verfolgt. Die Wundgröße wird
mittels entsprechender Morphometrie-Software (z. B. Focus®,
ESCIL) bestimmt. Zur Bestimmung des EC50-Wertes
als Zeitpunkt zu dem 50% der Wunde abgeheilt sind, wird als 100%
Wundfläche die
Wundgröße am Tag
1 nach Wundsetzung zugrunde gelegt. Alle anderen Rohdaten werden
darauf bezogen.
-
Die
Ergebnisse der morphometrischen Auswertung sind in 4 dargestellt.
-
Im
Vergleich zur Kontrolle konnte gezeigt werden, dass rh-proNGF einer
Konzentration von 2 μg/ml überraschenderweise
den stärksten
stimulatorischen Effekt auf die Heilung cornealer Wunden hat (4) und auch im Vergleich
zu rh-NGF eine stärkere
Wundheilungsbeschleunigung verursacht. Eine fast vollständige Abheilung
der Wunden (> 98%)
wird mit dieser Dosis bereits am 4. Tag nach Wundsetzung erreicht.
Am Tag 5 nach Wundsetzung wird eine fast vollständige Heilung der Wunden (> 98%) durch rh-proNGF
einer Dosis von 20 μg/ml
und 200 μg/ml
erreicht. Mit rh-NGF einer Konzentration von 2 μg/ml und 20 μg/ml wird eine fast vollständige Heilung
(> 98%) der cornealen
Wunden am Tag 5 erreicht während
die höhere
rh-NGF-Dosierung (200 μg/ml)
erst am Tag 6 eine > 98%ige
Wundheilung aufweist. Die mit der Vehikelkontrolle behandelten Tiere zeigten
erst am 7. Tag nach Wundsetzung eine fast vollständige Abheilung (> 98%) der cornealen
Wunden. Diese Reduzierung der Wundheilungsdauer durch rh-proNGF
um nahezu 50% ist von großer
klinischer Relevanz.
-
Der
EC50-Wert wurde für rh-proNGF und rh-NGF einer
Dosis von 2 μg/ml
im Vergleich zur Vehikelkontrolle ermittelt. Demnach hat sich die
Wundgröße mit einer
rh-proNGF-Behandlung nach 1,24 Tagen um 50% reduziert während man
im Falle des rh-NGF eine 50%ige Reduktion nach 1,28 Tagen findet.
Bei Behandlung der Augen mit der Vehikelkontrolle wird eine 50%ige
Verringerung der Wundfläche
erst nach 1,42 Tagen erreicht.
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Ein
apoptotisches Potential des rh-proNGF kann in diesem in vivo-Versuch
nicht nachgewiesen werden.
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Beispiel 5
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Die
Cornea von New Zealand Albino-Kaninchen (2,5 bis 3,1 kg Körpergewicht,
weiblich) wird 4 × täglich durch
Eintropfen von 50 μl
einer 0,9%-Kochsalzlösung
oder rh-proNGF-haltigen (200 μg/ml
Protein) 0,9%-Kochsalzlösung über einen
Zeitraum von 6 Tagen behandelt.
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Der
Augeninnendruck und mögliche
Intoleranzanzeichen (Spaltlampe) werden am Tag vor Behandlungsbeginn
(Tag 0) und an weiteren 6 Behandlungstagen (Tag 1 bis Tag 7) untersucht.
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Für rh-proNGF
konnte im Gegensatz zu murinem NGF (WO 0044396) kein Einfluss auf
den Augeninnendruck nachgewiesen werden (Tabelle 1), was als Vorteil
des rh-proNGF zu bewerten ist.
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Nach
ophthalmologischen Untersuchungen verschiedener Parameter (z. B.
corneale Trübung,
Rötung,
Chemosis, corneale Neovaskularisierung, Photophobie, Epiphorie,
Blepharospasmus, Pupillendurchmesser, konjunktivale Hyperämie, Infektionen)
konnten keine Anzeichen von Unverträglichkeiten oder toxischen
Nebeneffekten nachgewiesen werden. Auch diese Ergebnisse sprechen
gegen ein apoptotisches Potential des rh-proNGF.
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Untersuchung
des Augeninnendrucks während
der Behandlung mit rh-proNGF über
einen Zeitraum von 7 Tagen Tabelle
1
