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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur automatischen Fokussierung eines konfokalen Scanmikroskops.
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Weiterhin betrifft die Erfindung
ein konfokales Scanmikroskop mit einer Lichtquelle zur Erzeugung
eines Beleuchtungslichtstrahles, der auf eine Probe richtbar ist,
und mit einem Detektor, an dem eine Versorgungsspannung anlegbar
ist, zum Detektieren des von Probe ausgehenden Detektionslichtes und
mit einem Mittel zur Einstellung der Fokussierung.
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In der Scanmikroskopie wird eine
Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte
Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines
Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung,
im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene
bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen,
so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die
Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen
bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird
in Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente
mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird
ein Objekt mit denn Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen
abgetastet.
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Ein konfokales Rastermikroskop umfasst
im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das
Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum
Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen
Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über
die Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht,
das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen
Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine
Punktinformation erhält,
die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen
Bild führt.
Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme
erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem
Objekt: idealer Weise einen Mäander
beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position,
anschließend
x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung
auf die nächste
abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position,
diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise
Bilddatennahme zu ermöglichen,
wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht
verschoben und so die nächste
abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Zum Auffinden einer Anfangseinstellung
wird vom Benutzer die Fokussierung meist im konventionellen – nicht
konfokalen Modus – vorgenommen
und anschließend
erst in den konfokalen Modus umgeschaltet. Das Auffinden einer „Grundfokussierung" ist aufwendig und
verlangt vom Benutzer Erfahrung und Verständnis der mikroskopoptischen
Zusammenhänge.
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Aus der US-Patentschrift
US 4,844,617 ist ein konfokales
Messmikroskop mit automatischer Fokussierung bekannt. Das konfokale
Messmikroskop beinhaltet ein Spektrometer und ein Autofokussystem,
die gemeinsame optische Elemente teilen, wobei die Intensität des in
das Spektrometer eintretenden Detektionslichtes gemessen wird, um
die aktuelle Fokuseinstellungsqualität eines Rasterpunktes zu ermitteln.
Um die Fokuseinstellung während
des transversalen Abrasterns der Probe zu erhalten, ist der Probentisch
in axialer Richtung verfahrbar.
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Das aus dem Stand der Technik bekannte Vorgehensweise
hat den Nachteil, dass die Ermittlung der aktuelle Fokuseinstellungsqualität eines Rasterpunktes
von der Charakteristik des Detektors, wie beispielsweise dem Verstärkungsverhalten
oder der Empfindlichkeit, insbesondere der meist unterschiedlichen
spektralen Empfindlichkeit – was
bei der Verwendung unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe oder
unterschiedlicher Beleuchtungslichtwellenlängen bei der Reflexionsmikroskopie
von Bedeutung ist –,
abhängig
ist. Außerdem
ist nachteilig, dass der Such/Fangbereich durch die begrenzte Dynamik
in der Detektion sehr klein ist, so dass man also schon ganz gut
in der Nähe
des Fokus sein muss, damit das Autofokussystem überhaupt arbeiten kann.
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Es ist Aufgabe der Erfindung ein
zuverlässiges,
reproduzierbares und flexibel einsetzbares Verfahren zur automatischen
Fokussierung eines konfokalen Scanmikroskops anzugeben.
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Die Aufgabe wird durch ein Verfahren
gelöst, das
durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
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- – Erzeugen
eines Beleuchtungslichtstrahles,
- – Richten
des Beleuchtungslichtstrahles auf eine Probe,
- – Detektieren
des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes mit einem Detektor,
an dem eine Versorgungsspannung anliegt und
- – Einstellen
der Fokussierung in Abhängigkeit
der von der Höhe
der Versorgungsspannung.
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Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung
ein konfokales Scanmikroskop mit einer zuverlässigen Autofokussierung anzugeben,
die universell und flexibel bei verschiedensten Untersuchungsbedingungen
reproduzierbar einsetzbar ist.
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Diese Aufgabe wird durch ein konfokales Scanmikroskop
gelöst,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Fokussierung in Abhängigkeit
der von der Höhe
der Versorgungsspannung einstellbar ist.
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Die Erfindung hat den Vorteil, dass
auf einfache Weise die Möglichkeit
einer reproduzierbaren Autofokussierung ermöglicht ist. Erfindungsgemäß wird bei
die hohe Dynamik der Verstärkung
(Gain), die insbesondere bei Photomultiplieren bis ca. 105 selbst bei geringsten Lichtmengen beträgt, ausgenutzt.
Bei einer Avalanche-Photodiode, oder Vacuumdiode das beträgt die Verstärkung ca.
103. Insbesondere bei Halbleiterdetektoren
können
wegen der logarithmischen Kennlinie auch Diodenspannungen für die Dynamikerhöhung verwendet
werden. Erfindungsgemäß ist jeder
Detektor einsetzbar, der eine hohe kontinuierlich einstellbare Verstärkungsdynamik
besitzt. Insbesondere bei Photomultiplieren ist vorteilhafter Weise
keine Bereichsumschaltungen etc. bei Annäherung an Fokus notwendig.
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Insbesondere ist es ermöglicht dem
Benutzer schnell und zuverlässig
eine Anfangseinstellung für
die Fokussierung zur Verfügung
zu stellen, ohne dass dieser in den konventionellen nicht konfokalen Modus
umschalten muss.
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Die in der Scanmikroskopie eingesetzten Detektoren
sind meist Photomultiplier oder Halbleiterdetektoren, wie beispielsweise
Photodioden oder Avalanche-Photodioden (Lawinendioden) oder Lawinendetektoren.
Diese werden mit einer Versorgungsspannung beaufschlagt bzw. weisen
eine einstellbare Verstärkung
auf.
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Besonders vorteilhaft ist der Einsatz
von EMCCD-Detektoren. Diese sind beispielsweise aus der Veröffentlichung
von Devenir et al.: „Electron
multiplying CCD-Technology: Application to Ultrasensitive Detection
of Biomolecules" bekannt.
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Im konventionellen Mikroskop wird
ein Objekt bei Defokussierung unscharf und bleibt im wesentlichen
gleich hell. Beim konfokalen Mikroskop dagegen wird ein Objekt wenn
es defokussiert wird dunkel. Die Helligkeit eines Objektes kann
folglich als Qualitätsmerkmal
für die
Fokussierung eingesetzt werden. Der Suchbereich für ein zu
fokussierendes Objektes ist umso größer je größer die Detektionsdynamik ist.
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Die Messdynamik ist beim derzeitigen
Stand der Technik ca. 4000/1 bei festgelegter Verstärkung (Gain)
des Detektors. Nutzt man dagegen zusätzlich die Gaindynamik z.B.
einem Photomultipliers so erhält
man einen weiteren Faktor von bis zu ca. 1e5x um den Suchbereich
zu wirksam zu vergrößern.
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In einer bevorzugen Ausführung wird
die Fokussierung derart eingestellt, dass die Versorgungsspannung
ein Extremum aufweist. Dieses Extremum ist vorzugsweise ein Minimum
oder zumindest ein lokales Minimum ist. Dadurch kann ohne Suchwiederholung
mit verschiedenen Einstellungen in einem Suchvorgang der Objektfokus
gefunden werden.
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Vorzugsweise ist ein Mittel zur Einstellung der
Fokussierung vorgesehen, mit dem beispielsweise die optischen Eigenschaften
der Komponenten des Scanmikroskops, wie beispielsweise Brennweiten
oder die Strahlführung
oder Strahlformung, oder optische Abstände innerhalb des Scanmikroskops veränderbar
sind.
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In einer bevorzugen Ausgestaltung
weist das Scanmikroskop ein Objektiv auf. Das der Fokussierung umfasst
bei diesem Scanmikroskop vorzugsweise das Verändern des Abstandes zwischen
dem Objektiv und der Probe. Hierzu kann der Probentisch verfahrbar
sein, oder auch das Objektiv oder der Objektivrevolver.
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In einer anderen bevorzugen Ausgestaltung umfasst
das Einstellen der Fokussierung das Verändern einer Brennweite. Hierzu
kann eine Zoomoptik vorgesehen sein.
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In einer Ausgestaltung ist ein Mittel
zum Messen der aktuellen Versorgungsspannung vorgesehen. In einer
anderen Ausführung
erfolgt die Fokussierung aufgrund der Relativveränderung der Versorgungsspannung.
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In einer ganz besonders bevorzugten
Ausführung
wird der Abstand zwischen dem Objektiv und der Probe, insbesondere
zur Vermeidung einer Kollision, überwacht.
Vorzugsweise ist ein Mittel zur Überwachung
des Abstandes zwischen dem Objektiv und der Probe vorgesehen, wobei
dieses Mittel zur Überwachung
des Abstandes Bestanteil einer Kollisionsschutzeinrichtung sein
kann.
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In einer besonders bevorzugten Ausführung umfasst
das Mittel zur Überwachung
des Abstandes ein Mittel zum Ermitteln des Wärmeabflusses. Erfindungsgemäß wurde
erkannt, dass bei Annäherung der
Probe an das Objektiv, das in der Regel eine große Wärmekapazität aufweist, ein Temperaturausgleich
stattfindet. Der Wärmefluss
ist beispielsweise mit durch ermitteln der Temperatur der Probe und/oder
des Objektivs mit einem Temperatursensor möglich.
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In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung umfasst
das Mittel zur Überwachung
des Abstandes einen Taster oder eine Tastnase. Der Anstand kann auch
kapazitiv oder induktiv gemessen werden.
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Kollisionen von Probe und Objektiv
beispielsweise auf Grund einer Fehlfunktion der automatischen Fokussierung
können
durch die Überwachung
des Abstandes wirkungsvoll verhindert werden. Vorzugsweise kann,
bei Unterschreitung eines Mindestabstandes der automatische Fokussierungsvorgang
automatisch abgebrochen werden, oder automatisch eine Umschaltung
der Bewegungsrichtung des Probentisches oder des Objektivs eingeleitet werden.
In einer bevorzugen Ausgestaltung wird der Benutzer durch ein akustisches
oder visuelles Warnsignal informiert.
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In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand
schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend
beschrieben, wobei gleich wirkende Bauteile mit denselben Bezugszeichen
versehen sind. Dabei zeigt:
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1 ein
erfindungsgemäßes konfokales Scanmikroskap
und
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2 ein
Ablaufschema des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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1 zeigt
schematisch ein erfindungsgemäßes konfokales
Scanmikroskop. Das Scanmikroskop beinhaltet eine Lichtquelle 1,
die als Laser 3 ausgeführt
ist. Der von dem Laser 3 emittierte Beleuchtungslichtstrahl 5 wird
nach dem Passieren einer Anregungsblende 27 von einem Hauptstrahlteiler 7 zu einer
Strahlablenkeinrichtung 9, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 11 beinhaltet,
reflektiert und von der Strahlablenkeinrichtung 9 durch
die Scanoptik 13, die Tubusoptik 15 und das Objektiv 17 über bzw.
durch die Probe 19 geführt.
Die Probe 19 ist auf einem Objekttisch 29 positioniert,
der von einem Motor 31 angetrieben in Bezug auf die optische
Achse des Beleuchtungsstrahlenganges axial verschiebbar ist. Das
von der Probe 19 ausgehende Detektionslicht 21 gelangt
auf demselben Lichtweg über
die Strahlablenkeinrichtung 9 zurück zum Hauptstrahlteiler 7,
passiert diesen und trifft nach Passieren der Detektionsblende 23 auf
den Detektor 25, der als Photomultiplier 33 ausgeführt ist.
In der Zeichnung ist der Beleuchtungslichtstrahl 5 mit
einer durchgezogenen Linie dargestellt, während das von der Probe 19 ausgehende
Detektionslicht 21 gestrichelt dargestellt ist. Der Detektor 25 erzeugt
elektrische Detektionssignale, die in nicht gezeigten Verarbeitungseinheiten
weiterverarbeitet werden, um beispielsweise ein anzeigbares Abbild
des abgerasterten Bereichs der Probe 19 dem Benutzer anzeigen
zu können.
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Ein Netzgerät 35 erzeugt eine
Versorgungsspannung die, falls kein Detektionslicht 21 auf
den Detektor fällt
vollständig
an dem Detektor 25 anliegt. Wird der Detektor 25 durch
den Einfall von Detektionslicht 21 elektrisch belastet
sinkt die Versorgungsspannung ab, was van einer Steuereinrichtung 37, die
ein Mittel 55 zum Messen der aktuellen Versorgungsspannung
beinhaltet, registriert und ausgewertet wird. Die Steuereinrichtung 37 steuert
in Abhängigkeit
von der Versorgungsspannung über
den Motor 31 den Objekttisch 29 und stellt so
automatisch die Fokussierung ein.
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Am Objektiv 17 ist ein erster
Temperaturfühler 39 und
an dem Objekttisch 41 ein zweiter Temperaturfühler 41 angebracht.
Eine Kollisionsschutzeinrichtung 43 ermittelt aus den Signalen
der Temperaturfühler 39, 41 den
Abstand zwischen dem Objektiv 17 und der Probe 19 und
gibt ein Warnsignal an die Steuereinrichtung 37, wenn ein
zuvor eingestellter Mindestabstand unterschritten wird. Die Steuereinrichtung 37 kehrt
in diesem Fall die Bewegungsrichtung des Objekttischs 29 um.
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2 zeigt
ein Ablaufschema des erfindungsgemäßen Verfahrens. In einem ersten
Schritt erfolgt das Erzeugen 45 eines Beleuchtungslichtstrahles
und in einem weiteren Schritt das Richten 47 des Beleuchtungslichtstrahles
auf eine Probe 19. In einem dritten Schritt erfolgt das
Detektieren 49 des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes
mit einem Detektor, an dem eine Versorgungsspannung anliegt und
dann das Einstellen 51 der Fokussierung in Abhängigkeit
der von der Höhe
der Versorgungsspannung. Die Überwachung
53 des Abstandes zwischen dem Objektiv 17 und der Probe 19 dient
der Vermeidung einer Kollision.
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Die Erfindung wurde in Bezug auf
eine besondere Ausführungsform
beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- Lichtquelle
- 3
- Laser
- 5
- Beleuchtungslichtstrahl
- 7
- Hauptstrahlteiler
- 9
- Strahlablenkeinrichtung
- 11
- Scanspiegel
- 13
- Scanoptik
- 15
- Tubusoptik
- 17
- Objektiv
- 19
- Probe
- 21
- Detektionslicht
- 23
- Detektionsblende
- 25
- Detektor
- 27
- Anregungsblende
- 29
- Objekttisch
- 31
- Motor
- 33
- Photomultiplier
- 35
- Netzgerät
- 37
- Steuereinrichtung
- 39
- erster
Temperaturfühler
- 41
- zweiter
Temperaturfühler
- 43
- Kollisionsschutzeinrichtung
- 45
- Erzeugen
- 47
- Richten
- 49
- Detektieren
- 51
- Einstellen
- 53
- Überwachung
- 55
- Mittel
zum Messen der aktuellen Versorgungsspannung