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Eine bisher unbekannte Bedrohung
stellt – seit
dem Auftreten von BSE und der nachgewiesenen Übertragbarkeit dieser Tierkrankheit
auf den Menschen – die
neue Variante der Creutzfeldt-Jacob-Krankheit (vCJK) dar. Der Erreger
der Transmissiblen Spongiformen Enzephalophatien (TSEs = CJK, vCJR,
Ruru etc.) muss bezüglich
der Inaktivierung/Desinfektion als eine außergewöhnliche Herausforderung verstanden
werden.
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Ursache der TSE-Erkrankungen sind
fehlgefaltete Glykoproteine, die von ihrem Entdecker S. Prusiner als
Prion(en) bezeichnet wurden (proteinaceus infectious only). Es konnte
gezeigt werden, daß zur
pathologischen Variante des Prions ein physiologisches Gegenstück existiert,
das auch als Prion Isoform bezeichnet wird. In der Literatur findet
sich die Bezeichnung PrPSc,
BSE,
CJd als Kurzform für die pathologische Variante,
während
die physiologische Isoform mit PrPc (c =
cell) abgekürzt
wird.
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Beide Varianten des Prion-Proteins
resultieren aus einem gemeinsamen Vorläuferprotein, das nach Reifung
ein Molekulargewicht von 33-35 kd hat. Die Wandlung in das infektiöse Prion
erfolgt – aus
noch nicht bekannten Gründen – durch
Konformationsänderung
der Sekundärstruktur
des Proteins, wobei alpha-Helices in die beta-Faltblattstruktur
umgewandelt werden. Diese Wandlung geht einher mit einer deutlichen Änderung der
physikalisch-chemischen Eigenschaften des nun fehlgefalteten Proteins.
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Die veränderten Eigenschaften werden
in diagnostischen Untersuchungsverfahren zur Differenzierung zwischen
infektiösen
und physiologischen Proteinen genutzt.
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Die infektiöse Form der Prionen zeigt aufgrund
der Sekundärstruktur
eine partielle Resistenz gegenüber
Proteisen. Von einem Prion – Protein
PrPsc mit 33 – 35 kd bleiben nach Behandlung
mit Proteinase K etwa 28 – 30
kd unter Beibehaltung der Infektiosität erhalten. Als Kurzbezeichnung
für alle
pathologischen Prion – Formen
wird daher auch häufig
PrPres (res = resistant) verwendet. Die
Prion Isoform PrPC (c = cell) wird hingegen
vom Enzym vollständig
verdaut.
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Aus der beta-Faltblattstruktur erklärt sich
u. a. auch die Widerstandsfähigkeit
gegen hohe Temperaturen, UV-Strahlen, Säuren und Desinfektionsmittel
sowie die Unlöslichkeit
in Wasser, was einen Abbau im Organismus verhindert und Ablagerungen
in Form von Fibrillen oder Amyloid-Plaques zur Folge hat. Diese
Ablagerungen sind schließlich
ursächlich
für den
Zelltod im Hirn. Die schwammförmige
Feinstruktur des Hirngewebes läßt den Untergang
der Zellen visuell erkennbar werden.
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Von besonderer Bedeutung ist die
Ausdünnbarkeit
der Infektiosität
fehlgefalteter Prionen im Tiermodell, dadurch ist der Grad der Infektiosität titrierbar,
woraus sich die Möglichkeit
herleitet, Agenzien unterschiedlichster Art auf eine inaktivierende
Wirkung gegenüber
pathogenen Prionen zu prüfen.
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Gängige
Desinfektionsmittel oder Inaktivierungsverfahren wie z. B. die Autoklavensterilisation
sind entweder gar nicht oder nur in unbefriedigendem Ausmaß wirksam.
Die Resistenz der fehlgefalteten, infektiösen Prionen gegenüber trockener
Hitze übertrifft
zudem die Überlebensfähigkeit
bakterieller Sporen, so ist selbst bei kurzzeitiger Einwirkung von
600°C noch
eine Restinfektiosität
nachgewiesen worden.
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Von Zobeley et al. konnte gezeigt
werden, daß Prionen
eine hohe Affinität
zu Metalloberflächen
aufweisen. Rleine Stahlstifte aus einem Material, wie es auch für chirurgische
Instrumente verwendet wird, wurden mit dem Hirnhomogenat von Scrapie
infizierten Mäusen
kontaminiert, gereinigt und mit Formaldehyd behandelt und anschließend in
das Gehirn von Indikatormäusen
implantiert. Pro Stahlstift wurde eine verbliebene Infektiosität von ca
. 105 LD50 errechnet.
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Auf Grund des mit 1 – 2 Fällen pro
1 Million Einwohner pro Jahr sehr seltenen Vorkommens der Creutzfeld-Jakob-Rrankheit(CJK)
konnte bisher das Risiko einer iatrogenen Übertragung durch chirurgische
Instrumente auf den Menschen vernachlässigt werden. Bei der chirurgischen
Behandlung von CJK- Verdachtsfällen konnte
das verwendete Gerät
(OP-Besteck, Endoskope etc.) im Zweifelsfall entsorgt werden.
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Mit dem Auftreten von vCJK, der BSE-Infektion
des Menschen, hat sich diese Situation in Europa nachhaltig geändert. Anstelle
weniger CJK-Fälle
ist auch auf Grund epidemiologischer Hochrechnungen von einer unbekannten,
ungleich größeren Anzahl
infizierter Personen auszugehen, die über viele Jahre asymptomatisch
sein werden, d. h. die nicht als vCJK- Verdachtsfälle eingeordnet
werden können,
dennoch als Träger der
Krankheit diese, im Falle einer Behandlung mit chirurgischen Instrumenten
oder Endoskopen, weiter verbreiten können.
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Derzeit stehen als anerkannt wirksame
Inaktivierungsmittel von PrPres lediglich
Alkalien (z. B. Natronlauge; Kalilauge) und Hypochloritverbindungen
(Chlorbleichlauge; Chlorabspalter) zur Verfügung. Beide Verbindungsklassen
bewirken in hinreichend hoher Konzentration Hydrolyse oder Denaturierung
des Proteinanteils im Prion.
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Eine Verwendung dieser Chemikalien
zur ständigen
Desinfektion von chirurgischen Instrumenten oder Endoskopen verbietet
sich, da aufgrund der aggressiven Eigenschaften mit einer baldigen
Unbrauchbarkeit des Instrumentariums zu rechnen wäre.
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Daraus ergab sich die Notwendigkeit
nach Verbindungen oder Verbindungsklassen zu suchen, die einerseits
im Hinblick auf ihre korrosiven Eigenschaften (Metallkorrosion,
Spannungsrißkorrosionen
etc.) beherrschbar sind und andererseits eine ausreichend inaktivierende
Wirkung gegenüber
pathogenen Prionen aufweisen.
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Überraschend
wurde nun gefunden, daß Gemische
aus bestimmten anorganischen und organischen Säuren und Alkylsulfonaten bzw.
-sulfaten und/oder Alkylarylsulfonaten diese Aufgabe zu lösen vermögen. Die Gemische
wirken miteinander als Synergisten. Hingegen ist die Wirkung der
Säuren
ohne die anionischen Tenside und die der Tenside ohne Säuren sehr
mangelhaft.
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Nachfolgend aufgeführte Beispiele
und Tabellen dienen der Erläuterung
der vorliegenden Erfindung und dem Nachweis des Synergismus.
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Gemäß F.C. Kull und P.C. Eisman,
Applied Microbiology 9,538-41(1946) gilt ein Synergismus als nachgewiesen,
wenn durch Anwendung der nachstehenden Berechnungsformel das Ergebnis
F < 1 zustande kommt.
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F = QA/Qa + QB/Qb (Gl.1) wobei
die Zeichen bedeuten:
F < 1
Synergismus
F = 1 Additive Wirksamkeit
F > 1 Antagonismus
Qa
= Menge von A allein zum Endpunkt
Qb = Menge von B allein zum
Endpunkt
QA = Menge von A in der Mischung mit B
QB = Menge
von B in der Mischung mit A
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Bei der Untersuchung der Synergisten
als Einzelsubstanz konnte nicht immer ein Endpunkt gefunden werden,
weil eine beliebige Konzentrationserhöhung wegen Methodik und/oder
physikalischen Eigenschaften der jeweiligen Substanzen nicht realisierbar
war. Die im Test verwendete höchste
Konzentration wurde in diesen Fällen
als die Konzentration zum Endpunkt angenommen und zur Berechnung
in Gleichung (1) eingesetzt.
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Zum Nachweis der Wirksamkeit und
des synergistischen Effektes durch die erfindungsgemäßen Gemische
wurden
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die Formulierungsbeispiele 1 – 9 verwendet. Beispiele
| Beispiel 1 | Gew.
Teile |
| Alkyl (C12) sulfat – Na -Salz | 20,
00 |
| L (+)-Weinsäure DAB | 20
, 00 |
| Wasser entionisiert | 60,00 |
Beispiel
2
| Alkyl (C12) sulfat – Na -Salz | 20,
00 |
| Wasser entionisiert | 80,00 |
Beispiel
3
| L (+)-Weinsäure | 40
, 00 |
| Wasser entionisiert | 60,00 |
Beispiel
4
| Alkyl (C8-14) sulfonat -Na- Salz | 20,
00 |
| Ameisensäure
(98%ig) | 40,00 |
| Wasser entionisiert | 40,00 |
Beispiel
5
| Alkylarylsulfonat-Na-Salz | 40,00 |
| Wasser entionisiert | 60,00 |
Beispiel
6
| Ameisensäure | 40,00 |
| Wasser entionisiert | 60,00 |
Beispiel
7
| Alkyl(C12)sulfonat-Na-Salz | 20,00 |
| Ammidoschwefelsäure | 10,00 |
| Wasser entionisiert | 70,00 |
Beispiel
8
| Alkyl(C12)sulfonat-Na-Salz | 30,00 |
| Wasser entionisiert | 70,00 |
Beispiel
9
| Amidoschwefelsäure | 10,00 |
| Wasser entionisiert | 90,00 |
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In vitro Prüfung
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Das als Western- Blot bekannte in
vitro Testverfahren, ermöglicht
es, die Inaktivierung von Prionen über die Denaturierung/Zerstörung von
PrPres qualitativ zu bestimmen.
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Alle Substanzen bzw. Substanzgemische
wurden zunächst
mittels Blot-Methode untersucht. Konnte auf diesem Weg kein Abbau
des infektiösen
Hirnhomogenats durch Protease R festgestellt werden, so wurde die
Formulierung als unwirksam verworfen.
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Gemische die dazu führten, dass
nach Einwirkung auf das infektiöse
Material ein proteolytischer Abbau durch das Enzym wieder möglich war,
wurden als potentiell wirksam eingestuft und einer quantitativen
Untersuchung im Tiermodell zugeführt.
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Ausgangsmaterial für den Test
waren 100 μl – Ansätze eines
5%igen Hirnhomogenats. Zur Infektion wurde der Scrapie-Stamm 263
K verwendet.
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Aus einem Hamsterhirn (mit ca. 1g
Gewicht) ergibt sich ca. 1 mg Hirngewebe im 20 μl Ansatz mit einer durchschnittlichen
Infektiosität
von 106 – 107 infektiösen Einheiten
(LD5
0). Zur Kontrolle
wird das Hirn von gesunden Hamstern verwendet.
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Jeder Testansatz enthielt:
20 μl Hirnhomogenat
30 μl H2O
50 μl Testsubstanz (diverse Konz.)
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Jeder Kontrollansatz enthielt:
20 μl Hirnhomogenat
80 μl H2O
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Nach 30 minütiger Inkubation der Ansätze bei
der gewünschten
Temperatur von 37°C
auf einem Schüttler,
wurden diese zur Neutralisierung (Inaktivierung) der sauren Testsubstanzen
auf pH 7,0 eingestellt. Der Kontrollansatz wurde mit dem gleichen
Neutralisierungspuffer versetzt, der Neutralisierungspuffer für den Kontrollansatz
wurde jedoch zuvor auf pH 7,0 eingestellt. Zur Neutralisierung der
Säuren
wurden durchschnittlich 2,5 mM – 1000
mM Tris-Base eingesetzt. Das Volumen aller auf pH 7.0 eingestellten
Ansätze
ergab 150 μl.
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Jeweils 2 μl Ansatz (Testansatz bzw. Kontrollansatz)
wurden anschließend
mit 18 μl
H2O und 2 μl Proteinase K- Stammlösung (1mg/ml)
(Boehringer Mannheim) versetzt.
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Der enzymatische Abbau durch Proteinase
R erfolgte über
1 Stunde bei 37°C.
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Als Kontrolle dienten Ansätze denen
statt 2 μl
Proteinase K 2 μl
H2O zugegeben wurde und die ebenfalls 1
Stunde bei 37 C inkubiert wurden.
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Abschließend wurde jeder Ansatz mit
5 μl Eiweiß- Solubilisierungspuffer
versetzt. 20 μl
von jedem Ansatz wurden zur SDS- Gelelektrophorese verwendet. Die
Gele werden auf PVDF PVDF = Polyvinylidendifluorid – Membranen
(0,45 μm)
geblottet.
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Analyse des Blots mit
spezifischen Antikörpern:
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Die Blotfolie wurde zur Vermeidung
unspezifischer Bindungen auf der PVDF - Membran mit Milcheiweiß behandelt
(Blockierung der Bindungsstellen) und diversen Spülvorgängen unterzogen,
danach mit dem primären
monoklonalen anti-Prion-protein Antikörper 3F4 inkubiert. Nach weiteren
Vorbehandlungen und Spülungen
wurde dann mit dem sekundären
Antikörper – AP- konjugiertes
anti Maus IgG aus der Ziege – inkubiert.
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Nach erneutem Spülen wurde mit einem Lumineszenzpuffer
inkubiert (Eine Lichtemission wird dadurch an den Stellen der Membran
erzeugt, an denen sich die Prionproteine befinden). Nach dem Entfernen von überschüssiger Lösung wurde
die Membran in eine Expositionsbox verbracht und auf Röntgenfilm
entwickelt.
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Eine Auswertung des Blots ist in
Bild(1) wiedergegeben.
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Daraus lässt sich zweifelsfrei erkennen,
ob eine Wirkung durch Agenzienaktivität auf das infektiöse Material
stattgefunden hat. Dennoch gibt dieses Verfahren keine sichere Auskunft über den
Umfang einer Inaktivierung und die mögliche verbleibende Restinfektiosität.
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Die in vitro Methode ermöglicht – nach internationalen
Maßstäben – lediglich
eine qualitative Aussage zur Wirksamkeit und gilt erst dann als
validiert, wenn durch die quantitative in vivo Methode (Tiermodell)
ein bestätigendes
Ergebnis erzielt werden kann.
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In vivo Prüfung (Tiermodell)
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Zur Durchführung der Versuche im Tiermodell
wurden Hamster mit 20 μl
der neutralisierten Proben und der Kontrollen intrazerebral beimpft
(Lösungen
wie bei der Blot-Methode). Für
jede Probe wurde eine Zahl von mehr als 8 Hamstern verwendet,
um zu einer statistisch belastbaren Aussage zu gelangen.
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Tiere bei denen statt einer inaktivierenden
Substanz nur Wasser verwendet wurde, starben im statistischen Mittel
86 Tage nach Inokulation an Scrapie.
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Durch Anwendung der erfindungsgemäßen Gemische
ist eine Verzögerung
des Krankheitseintritts der Tiere von 125 Tagen und mehr erreichbar.
Infektionsdosis und Inkubationszeit korrelieren miteinander, daher kann
unter Einbeziehung entsprechender Titrationsexperimente für die Inkubationszeit
eine damit einhergehende Titerreduktion angegeben werden Grafik(1).
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Eine Verzögerung von z. B. 86 Tagen auf
125 Tage entspricht einer Titerreduktion von mehr als 4 logarithmischen
Einheiten oder einer Reduktion der Infektiosität um 99,99.
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Die Infektiosität der Hirnhomogenate (Zahl
der infektiösen
Einheiten/Partikel) wurde durch Verdünnung zum Endpunkt bestimmt.
Die gemittelten Ergebnisse aus den Verdünnungsreihen stehen halblogarithmisch
in linearer Beziehung zu den Inkubationszeiten. Aus diesen Untersuchungen
resultiert die graphische Darstellung Grafik (1) und die Regressionsfunktion
(Gleichung 2), die zur Berechnung der Untersuchungsergebnisse aus
den Tabellen 1-3 diente.
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Die gemittelten Ergebnisse der Beispielformulierungen
1 – 9
sind in den Tabellen 1 – 3
dargestellt. Die angegebenen Zahlenwerte bedeuten soweit nicht anders
bezeichnet den Infektionstiter (log LD5
0) der reduzierten infektiösen Dosis,
deren Differenz zur Ausgangsdosis den Reduktionsfaktor ergibt.
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Ein Ergebnis ist als ausreichend
wirksam zu bewerten, wenn der Infektionstiter um 4 log-Stufen reduziert
wurde, d. h. wenn eine 99,99%ige Reduktion der Infektiosität erreicht
ist.
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Aus Tabelle 1 folgt, dass mit der
Säurekomponente
aus Beispiel 3 und der Tensidkomponente aus Beispiel 2 keine ausreichende
Wirksamkeit erzielt werden konnte. Formulierungsbeispiel 1 hingegen
enthielt beide Komponenten und zeigte bereits bei 0,5%iger Konzentration
eine ausreichende Inaktivierung infektiöser Prionen.
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Setzt man diese Ergebnisse in die
Formel von Kull und Eisman ein (Gl. 1), so erhält man F
= 0,5 × 20/5 × 40 + 0,5 × 20/5 × 20 = 0,15
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Der Zahlenwert 0,15 erbringt somit
einen eindeutigen Nachweis für
das Vorliegen eines synergistischen Effektes.
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Für
Tabelle 2 mit den Beispielen 4-6 ergibt sich für F = 0,4 und für Tabelle
3 mit den Beispielen 7-9 für F
= 0,076 als Zahlenwert.
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Demzufolge ist die Wirksamkeit gegen
pathogene Prionen und der synergistische Effekt der erfindungsgemäßen Gemische
durch die dargestellten Ergebnisse bewiesen.
