DE10243301A1 - Neue Glycopeptid-Antibiotika und Verfahren zu deren Synthetisierung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Glycopeptid-Antibiotika, sowie ein Verfahren zur Generierung dieser neuen Glycopeptid-Antibiotika durch Verfütterung von nicht-natürlichen Aminosäuresubstituenten an Mikroorganismen.

Description

• Die Bedeutung von Glycopeptid-Antibiotika liegt in der antimikrobiellen Wirkung gegen Gram-positive Mikroorganismen, deren wichtigste Vertreter die klinisch relevanten Glycopeptid-Antibiotika Vancomycin und Teicoplanin sind und die als Notfallantibiotika bei Infektionen mit methicillinresistenten Staphylococcus aureus-Stämmen (MRSA) angewendet werden.^[1] Einige Glycopeptid-Antibiotika zeigen auch antivirale Eigenschaften.^[2] Darüber hinaus finden Glycopeptid-Antibiotika als chirale Trennphasen in der Enantiomerenanalytik Verwendung.^[3] Es sind eine ganze Reihe von Glycopeptid-Antibiotika isoliert und charakterisiert und auch semisynthetische Derivate hergestellt worden. ^[1b] Charakteristisches Strukturelement der Verbindungsklasse der Glycopeptid-Antibiotika Typ I, II, III und IV ist die trizyklische Seitenkettenverbrückung bestehend aus einer Biaryl- und zwei Biarylether-Bindungen (Abb. 1).
• Ein weiterer Typ von Glycopeptid-Antibiotika ist der Typ V, der sog. Complestatin- oder Kistamycin-Typ, dessen Vertreter antivirale Eigenschaften zeigen (Abb. 2).
Beschreibung
• Erstmals wurde die putative Gensequenz eines Glycopeptidbiosynthesegenclusters aus Glycopeptid-Antibiotikaproduzenten durch von Wageningen et al. publiziert.^[5] Der Einbau von nicht-natürlichen Aminosäuresubstraten (abgesehen von Isotopenmarkierung) in Strukturen der Glycopeptid-Antibiotika war bisher nicht bekannt.^[6] Dieser Beitrag stellt die Generierung der ersten in-vivo modifizierten Glycopeptid-Antibiotika mit Aminosäuresubstraten vor, die anstelle einer oder mehrerer der folgenden natürlichen Aminosäuren 3,5-Dihydroxyphenylglycin,^[10] 4- Hydroxyphenylglycin, β-Hydroxytyrosin und 3-Chlor-β-hydroxytyrosin nach Fütterung nicht-natürliche Aminosäureanaloga enthalten. Die neuen Glycopeptid-Antibiotika wurden erhalten durch Fütterung an den Wildtyp oder bevorzugt an Mutanten, die gezielt mit molekulargenetischen Techniken erzeugt wurden. Durch den Einbau ergeben sich antibiotische Wirkstoffe mit bisher unbekannten Strukturelementen. Neue bisher unbekannte Strukturen von Glycopeptid-Antibiotika, die durch die Verwendung nicht-natürlicher Substrate generiert werden können, bieten neue Anwendungsbereiche als pharmazeutische Wirkstoffe mit antimikrobiellen und antiviralen Eigenschaften sowie als chirale Trennphasen. Dies gilt insbesondere auch für den Einsatz als antimikrobielle Wirkstoffe gegen vancomycinresistente bzw. gegen Glycopeptid-Antibiotika resistente Organismen.
• Die vorliegende Arbeit zeigt, dass mittels Mutasynthese Strukturvariationen an Glycopeptid-Antibiotika eingeführt werden können, die zu neuen, bisher unbekannten Glycopeptid-Antibiotikaderivaten führen. Es war nicht zu erwarten, dass bei Glycopeptid-Antibiotikaproduzenten das Verfahren der Fütterung an Mutanten auf Analoga der natürlichen Substrate angewendet werden kann, da die natürlichen Glycopeptid-Varianten (z. B. Balhimycin, Vancomycin, Chloroeremomycin), die aus verschiedenen Produzenten (A. mediterranei, A. orientalis) isoliert wurden, sich unterscheiden und stammspezifisch sind. Dies zeigt, dass die beteiligten Biosyntheseenzyme hochspezifisch sind und in der Regel keine als die jeweiligen natürlichen Substrate akzeptiert werden.
• Die Verwendung von nicht-natürlichen Substraten in der Mutasynthese wird am Beispiel von chemisch-synthetischen Analoga gezeigt. Diese nicht-natürlichen Substrate können Precursor-Aminosäuren sein, die nicht den bisher bekannten Precursor-Aminosäuren des natürlichen Biosyntheseweges entsprechen, d. h. die an jeweils aus dem Wildtyp bekannten Positionen eine oder mehrere Aminosäuren tragen, die nicht 3,5-Dihydroxyphenylglycin, 4-Hydroxyphenylglycin, β-Hydroxytyrosin oder 3-Chlor-β-hydroxytyrosin sind. Dabei schließt die Verwendung von chemisch-synthetischen Aminosäuren eine Verwendung von biotechnologisch hergestellten Derivaten nicht aus. Ebenso kann diese Vorgehensweise analog auf andere Glycopeptid-Antibiotikaproduzenten angewendet werden.
• Das besondere an dem hier vorgestellten Verfahren ist, dass als Produzenten bevorzugt Mutanten eingesetzt werden, die durch gezielte molekulargenetische Manipulation des Produzentenstammes A. mediterranei erhalten wurden. Erstmals wurde für einen Glycopeptid- Antibiotikaproduzenten durch "in-frame"-Deletion Mutanten herstellen, die nur in einer spezifischen Eigenschaft (z. B. die Expression eines Biosyntheseenzyms) betroffen sind, die aber sonst vollkommen mit dem Wildtyp genetisch identisch sind. Es können aber auch herkömmliche Mutanten oder der Wildtyp für entsprechende Fütterungen eingesetzt werden.
a) Einführung von Strukturvariationen in die Aminosäurepositionen 2 und 6
• Der Balhimycin-Produzent Amycolatopsis mediterranei DSM5908 produziert ein Glycopeptid-Antibiotikum des Typs I.^[7] Die Generierung einer Deletionsmutante (OP696) im bhp-Gen des Balhimycin- Biosynthesegenclusters ist eine Neuentwicklung auf der Grundlage bereits beschriebener Methoden und Protokolle (s. Experimenteller Teil)^{[7, 8, 9]} Die bhp-Deletionsmutante akzeptiert 3-Chlor-β-hydroxytyrosin und β-Hydroxytyrosin als natürliche Substrate. Dieser Befund wurde experimentell nachgewiesen.
• Als nicht-natürliches Analogon von β-Hydroxytyrosin (AS 2 und AS 6 des Aglycons von Glycopeptidantibiotika Typ I-IV) wurde 3-Fluor-β- hydroxytyrosin eingesetzt (racemisch und enantiomerenrein). β- Hydroxytyrosin und entsprechend Aromaten-substituierte Analoga sind gemäss bereits bekannter Vorschriften synthetisierbar.^{[1b und dort zitierte Literatur]} Der Zusatz von 3-Fluor-β-hydroxytyrosin zum Medium der bhp- Mutante von A. mediterranei ergab nach Fermentation mit der bhp- Mutante das zweifach fluorierte Glycopeptid-Antibiotikum 3- Fluorbalhimycin (Abb. 3). Dieser Befund wurde durch höchstauflösende Massenspektrometrie bestätigt (Abb. 4).
• Es wurden weitere Aminosäuren synthetisiert und mittels Supplementierung getestet (Abb. 5). Die Aminosäuren 2-Fluor-β-hydroxytyrosin und 3,5-Difluor-β-hydroxytyrosin wurde ebenfalls synthetisiert und ergaben die fluorierten Glycopeptid-Antibiotika 2-Fluorbalhimycin sowie 3,5- Fluorbalhimycin, welche ebenso wie das 3-Fluorbalhimycin antibiotische Aktivität zeigten.
• Zusätzlich zum Hauptmetaboliten Fluorbalhimycin wurden verschieden glycosylierte und an Leucin Nmethylierte Glycopeptid-Antibiotika nachgewiesen. Alle Fluorbalhimycine zeigen antibiotische Aktivität gegen den Indikatorstamm B. subtilis.
b) Einführung von Strukturvariationen in Aminosäureposition 7
• Als Mutanten wurden die Stämme A. mediterranei VP1-2 verwendet (s. Experimenteller Teil).^[10] Die "in-frame"-Deletionsmutante im dpgA-Gen von A. mediterranei VP1-2 akzeptiert als nicht-natürliches Substrat die Aminosäure 3-Hydroxyphenylglycin (Abb. 6) und 3- Methoxyphenylglycin. Es wurde ein racemisches Aminosäurengemisch verwendet, was die Verwendung enantiomerenreiner Verbindungen nicht ausschließt. Das Kulturfiltrat zeigt nach Fütterung von 3- Hydroxyphenylglycin bzw. 3-Methoxyphenylglycin antibiotische Aktivität gegen den Indikatorstamm B. subtilis.
• Dieser Befund ist neu, da alle bisher bekannten Glycopeptid-Antibiotika an Aminosäureposition 7 (AS7) nur Substituenten in 3- und 5-Position des aromatischen Rings von AS7 gleichzeitig tragen (Abb. 6). Chemisch-analytisch wurde dies nachgewiesen durch eine charakteristische Massendifferenz von -16 amu gegenüber dem durch die Supplementierung mit 3,5-Dihydroxyphenylglycin erhaltenen Hauptmetaboliten Balhimycin.
• Es wurden ebenfalls verschieden glycosylierte und an Leucin N- methylierte Nebenmetaboliten detektiert die ebenfalls antibiotische Aktivität zeigen.
c) Einführung von Strukturvariationen in Aminosäureposition 2 und 6 durch Supplementierung mit anderen Halogenid-Ionen
• Es ist bekannt, dass in Einzelfällen durch Supplementierung des Mediums mit Bromid anstatt Chlorid im Sekundärmetaboliten ein vorhandenes Chlor-Atom durch ein Brom-Atom ersetzt werden kann. Dies wurde am Beispiel des Glycopeptid-Antibiotikums Actaplanin gezeigt, das nur ein Halogenatom enthält.^[4]
• Ein bisher unbekanntes Derivat ist das zweifach bromierte Aglycon des Balhimycins, das wir mit dem Produzentenstamm A. mediterranei herstellen konnten (s. Experimenteller Teil). Neu ist ferner, dass bei Zugabe von Mischungen von Bromid (MgBr₂ oder CaBr₂) und Chlorid (MgCl₂ oder CaCl₂) zu gleichen Teilen gemischt-halogenierte Derivate erhalten werden. Aus Fermentationen unter Zusatz dieser Halogenide wurden neben Balhimycin und zweifach bromiertem Bromobalhimycin auch gemischt substituierte Derivate erhalten. Der Bromsubstituent kann sowohl in Aminosäureposition 2 als auch in Aminosäureposition 6 sitzen ( Abb. 7). Die Derivate wurden durch Massenspektrometrie charakterisiert (Abb. 8 und 9). Das Brombalhimycin zeigte im MIC-Test das gleiche antimikrobielle Profil sowie die gleiche Aktivität wie die beiden Referenzen Teicoplanin und Vancomycin.
• Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren sowie die Verbindungen durch ausführliche Beschreibung von besonderen Ausführungsformen sowie durch Abbildungen erläutert. In diesen Ausführungsformen können einzelne Merkmale der Erfindung allein oder in Kombination mit anderen Merkmalen verwirklicht sein. Die beschriebenen besonderen Ausführungsformen dienen lediglich zur Erläuterung und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in keiner Weise einschränkend zu verstehen.
• Im übrigen ist die Erfindung anhand der Abbildungen dargestellt, dabei zeigen:
• Abb. 1:
  Die fett dargestellten Linien geben das charakteristische Strukturelement von Glycopeptidantibiotika (Typ 1-4) wieder. Die Reste R³ und R⁵ sind meist Seitenketten von aliphatischen oder aromatischen Aminosäuren. Aromatische Aminosäuren mit den aromatischen Seitenketten R³ und R⁵ können miteinander verbrückt sein (z. B. Teicoplanin). Die Reste R⁶-R¹⁰ sind abgesehen von R^6,7,8,9,10 = H meist Zuckerreste mit verschiedenen Glycosylierungsmustern und teilweiser Acylierung von Aminogruppen der Kohlenhydratsubstituenten. Für die Reste X^1,2,10,4 sind aus der Literatur ^[1b] bisher nur X = H oder X = Cl bekannt. Nur ein Fall wurde mit X^1,2,4 = H und X¹⁰ = Br beschrieben ^[4]. Der Substituent R⁴ kann H oder OH sein. R¹¹ ist in natürlichen Derivaten eine OH-Gruppe. (AS bezeichnet die Aminosäurenpositionen des Heptapeptidrückgrats)
• Abb. 2:
  Die fett dargestellten Linien geben das charakteristische Strukturelement von Typ V-Glycopeptidantibiotika wieder. Die Reste R^1-R⁴ sind meist Seitenkettenreste aromatischer Aminosäuren. Eine Glycosylierung phenolischer oder sonstiger OH-Gruppen wurde bisher nicht beschrieben. (AS bezeichnet die Aminosäurenpositionen des Heptapeptidrückgrats)
• Abb. 3:
  Struktur von 3-Fluorbalhimycin das durch Supplementierung mit 3-Fluor- β-hydroxytyrosin erhalten wurde.
• Abb. 4:
  FTICR-MS von 3-Fluorbalhimycin. Das Molekülion [M+2H]²⁺ wurde bei m/z = 707,7439 mit einer Massengenauigkeit von δ = 0,3 ppm detektiert (Summenformel C₆₆H₇₃F₂N₉O₂₄). Zur internen Kalibrierung wurde PEG1020 als Standard verwendet.
• Abb. 5:
  Synthetische Aminosäuren, die zur Supplementierungsversuchen mit der bhp-Mutante von A. mediterranei eingesetzt wurden. Biologische Aktivität gegen den Indikatorstamm B. subtilis wurde bei Einsatz von AS 1, 2, 5 und 8 detektiert. Für AS 3, 4, 6, und 7 wurde keine antimikrobielle Aktivität gegen den Indikatorstamm B. subtilis festgestellt und mit HPLC- ESI-MS keine Molekülmassen der entsprechenden Glycopeptid- Antibiotika detektiert
• Abb. 6:
  Chemische Struktur von Dehydroxy-Balhimycin mit fehlender OH- Funktion in der 5-Position der Aminosäure 7.
• Abb. 7:
  Struktur von verschieden halogensubstituierten Balhimycinen mit X¹ = Cl, Br und X² = Cl, Br.
• Abb. 8:
  FTICR-MS der verschieden halogensubstituierten Balhimycine von ²Chlor⁶Brom-Balhimycin mit X¹ = Cl und X² = Br bzw. ²Brom ⁶Chlor- Balhimycin X¹ = Br und X² = Cl. Das Molekülion [M+2H]²⁺ wurde bei m/z = 745,6899 mit einer Massengenauigkeit von δ = 0,7 ppm (Summenformeln: C₆₆H₇₃BrClN₉O₂₄) detektiert. Die nicht bezeichneten Signale im Massenspektrum stammen vom internen Standart PEG600 der zur internen Kalibrierung verwendet wurde.
• Abb. 9:
  FTICR-MS von Brombalhimycin mit X₁ = Br und X₂ = Br. Das Molekülion [M+2H]²⁺ wurde bei m/z = 767,6643 mit einer Massengenauigkeit von δ = 0,3 ppm detektiert (Summenformel: C₆₆H₇₃Br₂N₉O₂₄). Zur internen Kalibrierung wurde PEG1020 als Standard verwendet.
Experimenteller Teil 1. Chemische Synthesen a) Synthese von 3-Hydroxyphenylglycin
• Die Synthesen der enantiomerenreinen 3-Hydroxyphenylglycine sind in Anlehnung an die von Nicolaou et al.^[1b] beschriebenen und dort zitierten Literaturvorschriften durchgeführt worden. Racemische Produkte wurden durch die Strecker-Synthese hergestellt.
b) Synthesen von β-Hvdroxytyrosin, 3-Fluor-β-hydroxytyrosin, 3- Chlor-β-hydroxytyrosin
• Die enantiomerenreinen Produkte sind in Anlehnung an die in Nicolaou et.^[1b] beschrieben und dort zitierten Literatur durchgeführt worden. Diese wurde durch dort beschriebene Schöllkopf-Reaktion und die Sharpless-Aminohydroxylierung synthetisiert. Racemische Produkte wurden durch Aldolreaktion aus dem entsprechenden aromatischen Aldehyd und einem Glycinäquivalent z. B. Boc-Gly-OtBu mit BuLi in Tetrahydrofuran erhalten.
2. Generierung von Mutanten in A. mediterranei DSM5908
• Die Nucleotidsequenzen der Gene der Balhimycin-Biosynthese sind in der EMBL Datenbank unter der Nummer Y16952 zugänglich.
a) Generierung von Mutanten im bhp-Gen von A. mediterranei DSM5908 Konstruktion des Plasmids pOP1
• Zur Deletion des Perhydrolase-Gens bhp (pOP1) wurden Plasmide konstruiert. Die relevanten Regionen des Plasmidkonstrukts wurden durch Sequenzierung verifiziert. Das 1,116 bp Fragment frOP1 schließt eine Sequenz des N-terminal kodierenden Teils des Perhydrolase-Gens bhp ein (96 bp, entspricht einer Länge von 32 Aminosäuren). Das 1,286 bp-Fragment frOP2 umfasst den C-terminal kodierenden Teil des bhp- Gens (342 bp, entspricht 114 Aminosäuren). Diese beiden Fragmente wurden in getrennten Ansätzen in die EcoRV-Schnittstelle des Vektors pJOE890 ligiert. Daraus ergaben sich die Plasmide pJOEOP1 und pJOEOP2. frOP2 wurde dann hieraus als XbaI-Fragment in die singuläre XbaI-Schnittstelle des Vektors pSP1 ligiert und das Plasmid pSPOPa erhalten. frOP1 wurde als BamHI-Fragment aus pJOEOP1 in die Bam- HI-Schnittstelle des Vektors Litmus28 ligiert und das Plasmid pLitmus29OPa erhalten. frOP1 wurde dann als Bg/II-Fragment in die Bg/II- Schnittstelle des Plasmids pSPOPa ligiert und das Plasmid pOP1 erhalten, daß das teilweise deletierte bhp-Gen enthielt.
PCR Protokoll zur Amplifizierung der frOP1- und frOP2-Fragmente
• Die Amplifizierung wurde auf einem Thermocylcer (Stratagene, La Jolla, CA, USA) mit einem Expand High Fidelity PCR System (Roche) durchgeführt. Die PCR-Mischung (100 µl) enthielt je 100 µl Primer, 1.0 µg Template-DNA (pUC18bhA oder pUC18Bbhp), Desoxyribonucleosid 5'- triphosphate in einer Gesamtkonzentration von je 200 µl (DNA Polymerisation Mix, Pharmacia), 10 × Reaktionspuffer, 1.5 mM MgCl₂ und 3.5 U Taq DNA Polymerase. DMSO wurde zu 3% der Gesamtkonzentration der Reaktionsmischung zugegeben. Zur Amplifizierung der Fragmente wurde folgendes PCR-Protokoll verwendet: Initial Denaturierung (94°C, 3 min) vor Zugabe der Polymerase; 30 Denaturierungszyklen (94°C, 1 min), Annealing (60°C, 1 min) und Polymerisation (72°C, 2 min); am Ende erfolgte ein zusätzlicher Polymerisationsschritt (72°C, 10 min). Die Primersequenzen sind im Sequenzprotokoll dargestellt. Es erfolgt die Amplifikation des Fragments frOP1 mit den Primern prOP1-1 und prOP1-2 sowie des Fragments frOP2 mit den Primern prOP2-1 und prOP2-2.
b) Generierung von Mutanten im dpgA-Gen und pgat-Gen von A. mediterranei DSM5908
• Die Mutante A. mediterranei VP1-2 wurde gemäss dem in der Literatur angegebenen Protokoll generiert.^[10]
3. Fermentationsbedingungen b) Fermentation von A. mediterranei und Mutanten
• Der Stamm A. mediterranei und Mutanten wurden mit Kulturmedien bekannter Zusammensetzung fermentiert.^[8] Vor Beimpfen des Mediums mit A. mediterranei Mutanten wurde die jeweils zu fütternde Aminosäure nach Sterilfiltration in einer Endkonzentration von 0.4 mg/ml dem Medium zugegeben.
• Fluorbalhimycin wurde in einer Ausbeute von 8,6 mg/l Medium isoliert. Der Prozess kann auf höhere Ausbeuten durch Variation der Fermentationsbedingungen optimiert werden. Um eine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten wurden Fütterungsexperimente mit allen Aminosäuren dreimal wiederholt.
c) Fermentation von A. mediterranei und Mutanten unter Halogenidsubstitution
• Der Stamm A. mediterranei und Mutanten wurden mit Kulturmedien bekannter Zusammensetzung fermentiert.^[8] Die für das Medium dort angegebenen Chlorid-Salze (MgCl₂ oder CaCl₂) durch Bromidsalze (MgBr₂ oder CaBr₂) ersetzt (Vollsubstitution), bzw. zur Hälfte (50 mol%) durch Bromid ersetzt um die gemischt-substituierten Derivate zu erhalten.
4. Isolierung und analytische Charakterisierung der Glycopeptidantibiotika a) Isolierung
• Kulturfiltrate wurden mittels Adsorptionschromatographie an XAD 1160 (Serva) und mittels nachfolgender präparativer RP18-HPLC (Grom-Sil RP-C18, 5 µm, 20 × 250 mm) gereinigt.
b) Analytische Charakterisierung der Glycopeptid-Antibiotika
• Massenspektren wurden auf einem API III (Perkin-Elmer Sciex, Ontario, Kanada) Triple-Quadrupol Massenspektrometer aufgenommen. Die Summenformeln der charakterisierten Verbindungen wurden aus hochaufgelösten FTICR-Massenspektren mit interner Kalibrierung bestimmt, die auf einem FTICR-Massenspektrometer (Bruker-Franzen, Bremen) mit Elektrospray-Ionisierung im Positivionenmodus aufgenommen wurden. Der Magnet besitzt eine Feldstärke von 4,7 T.
5) Nachweis fluorierter Balhimycine durch LCMS nach Suppl. von Δbhp OP696 β-Hydroxytyrosin-Derivaten Bedingungen
• 10 ml-Kulturen supplementiert mit Aminosäure 1 mg/ml; abzentrifugiert, über Solid Phase Extraktion (Varian BondElut 2 ml-Kartuschen) gewonnene Fraktionen (Elution mit Methanol/Wasser Stufengradienten (Elutionsfolge: 2 ml Wasser, 1 ml 90/10 Wasser/Methanol (v/v), 80/20, 50/50, schließlich 100% Methanol). Fraktionen vermessen mit LCMS am Esquire 3000plus ESI-Ionenfallen-Massenspektrometer (Bruker Daltonics) gekoppelt mit HP-Agilent 1100 ChemStation HPLC-Anlage. Säule: Purospher RP-C18e (Merck) 125 × 4 mm, 5 µm Korngröße. Gradientenprogramme jeweils aus A) Wasser (0,1% Trifluoressigsäure) und B) Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure).
  
• 1. Gradientenprogramm (bei 2-Fht, 3,5-Fht, 3-OMe-Pg) innerhalb 6 min: von 10% B auf 70% B.
• 2. Gradientenprogramm innerhalb 15 min. von 10% B auf 50% B.
Zitierte Literatur
• 1 a) D. H. Williams, B. Bardsley, Angew. Chem. 1999, 111, 1264-1286; Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1172-1193; b) K. C. Nicolaou, C. N. C. Boddy, S. Bräse, N. Winssinger, Angew. Chem. 1999, 111, 2230-2287; Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 2096-2152.
• 2 a) N. Naruse, O. Tenmyo, S. Kobaru, M. Hatoru, K. Tomita, Y. Hamagishi, T. Oki, J. Antibiotics 1993, 46, 1804-1811. b) N. Naruse, M.. Oka, M. Konishi, T. Oki, J. Antibiotics 1993, 46, 1812-1818. c) K. Matsuszaki, H. Ikeda, T. Ogino, A. Matsumoto; H. Tanaka, H. B. Woodruff, S. Omura, J Antibiotics, 1994, 47, 1173-1174. d) H. Tanaka, K. Matsuszaki, H. Nakashima, T. Ogino, A. Matsumoto, H. Ikeda, H. B. Woodruff; S. Omura, J. Antibiotics, 1997, 50, 58-65 und dort publizierte Literatur.
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• 4 F. M. Huber, K. H. Hunt, J. W. Martin, M. T. Molloy, J. Antibiotics, 1988, 41, 798-801.
• 5 A. M. A. von Wageningen, P. N. Kirkpatrick, D. H. Williams, B. R. Harris, J. K. Kershaw, N. J. Lennard, M. Jones, S. J. M. Jones, P. J. Solenberg, Chem. Biol. 1998, 5, 155-162.
• 6 S. J. Hammond, M. P. Williamson, D. H. Williams, L. D. Boeck; G. G. Marconi, Chem. Comm. 1982, 344-346.
• 7 S. Pelzer, R. Süssmuth, D. Heckmann, J. Recktenwald, P. Huber, G. Jung, W. Wohlleben, Antimicrob. Agents Chemother. 1999, 1565-1573.
• 8 Pelzer, S., Huber, P., Süßmuth, R., Recktenwald, J., Heckmann, D. & Wohlleben, W. (2000). Nucleic acid fragment and vector containing halogenase and method for the halogenation of chemical compounds. Patent WO 00/77182 A1
• 9 S. Pelzer, W. Reichert, M. Huppert, D. Heckmann, W. Wohlleben, J. Biotechnol. 1997, 56, 115-128.
• 10 V. Pfeifer, G. J. Nicholson, J. Ries, J. Recktenwald, A. B. Schefer, R. M. Shawky, J. Schröder, W. Wohlleben, S. Pelzer, J. Biol. Chem. 2001, 276, 38370-38377.

Claims (2)

1. Verfahren zur Generierung von Glycopeptid-Antibiotika, dadurch gekennzeichnet, daß an Mikroorganismen, insbesondere an im Glycopeptid Biosynthesegencluster mutierten Mikroorganismen, nicht-natürliche Aminosäuresubstituenten verfüttert werden.

2. Glycopeptid-Antibiotikum der allgemeinen Formel


wobei für X^1-8, Y^1,2, Z^1,2 und R^1,2 gilt: