WO2003070756A2 - Neue glycopeptid-antibiotika und verfahren zu deren synthetisierung - Google Patents

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WO2003070756A2
WO2003070756A2 PCT/DE2003/000557 DE0300557W WO03070756A2 WO 2003070756 A2 WO2003070756 A2 WO 2003070756A2 DE 0300557 W DE0300557 W DE 0300557W WO 03070756 A2 WO03070756 A2 WO 03070756A2
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Roderich Suessmuth
Guenther Jung
Wolfgang Wohlleben
Stefan Pelzer
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Combinature Biopharm Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
    • C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin

Definitions

  • the invention relates to new glycopeptide antibiotics, processes for their preparation, their use for producing a pharmaceutical composition, and processes using such pharmaceutical compositions.
  • glycopeptide antibiotics lie in the anti-microbial activity against Gram-positive microorganisms, the most important representatives of which are the clinically relevant glycopeptide antibiotics vancomycin and teicoplanin and which are used as emergency antibiotics in infections with methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains (MRSA) , [1] Some glycopeptide antibiotics also show antiviral properties. [2] In addition, glycopeptide antibiotics are used as chiral separation phases in enantiomer analysis. [3] A whole range of glycopeptide antibiotics have been isolated and characterized, and semisynthetic derivatives have also been produced.
  • a characteristic structural element of the compound class of glycopeptide antibiotics type I, II, III and IV is the tricyclic side chain bridging consisting of one biaryl and two biaryl ether bonds ( Figure 1).
  • Another type of glycopeptide antibiotic is type V, the so-called complestatin or kistamycin type, the representatives of which show antiviral properties ( Figure 2).
  • the invention is based on the technical problem of specifying new antibiotics which are particularly effective against strains which are resistant to known antibiotics. Furthermore, antibiotics are to be made available, which are highly effective even at low doses and have the least possible side effects.
  • glycopeptide antibiotics were obtained by feeding on the wild type or, preferably, on mutants that were specifically generated using molecular genetic techniques.
  • the installation results in antibiotic active ingredients with previously unknown structural elements.
  • New hitherto unknown structures of glycopeptide antibiotics which can be generated through the use of non-natural substrates, offer new areas of application as active pharmaceutical ingredients with antimicrobial and antiviral properties and as chiral separation phases. This also applies in particular to the use as antimicrobial active substances against organisms resistant to vancomycin or resistant to glycopeptide antibiotics.
  • Glycopeptide antibiotic derivatives lead. It was not to be expected that the method of feeding mutants to analogues of the natural substrates could be applied to glycopeptide antibiotic producers, since the natural glycopeptide variants (e.g. balhimycin, vancomycin, chloroeremomycin), which are from different producers (A. mediterranei, A. orientalis) were isolated, differ and are strain-specific. This suggested that the biosynthetic enzymes involved are highly specific and would generally not accept any as the respective natural substrates.
  • the natural glycopeptide variants e.g. balhimycin, vancomycin, chloroeremomycin
  • non-natural substrates in mutasynthesis is shown using the example of chemical-synthetic analogues.
  • These non-natural substrates can be precursor amino acids which do not correspond to the precursor amino acids of the natural biosynthetic pathway known hitherto, i.e. which carry one or more amino acids at positions known from the wild type, which are not 3, 5-dihydroxyphenylglycine, 4-hydroxyphenylglycine, ß-hydroxytyrosine or 3-chloro-ß-hydroxytyrosine.
  • the use of chemically synthetic amino acids does not preclude the use of biotechnologically produced derivatives. This procedure can also be applied analogously to other glycopeptide antibiotic producers.
  • mutants which have been obtained by targeted molecular-genetic manipulation of the A. mediterranei producer strain.
  • "In-frame" deletions can be used to produce mutants that are only affected in one specific property (e.g. the expression of a biosynthetic enzyme), but which are otherwise completely genetically identical to the wild type.
  • conventional mutants or the wild type can also be used for corresponding feedings.
  • a monosaccharide is a polyhydroxyaldehyde or polyhydroxyketone with 4 (tetroses), 5 (hexoses), 6 (pentoses), 7
  • Heptoses or 8 (octoses) carbon atoms, linear, branched or ring-shaped.
  • one or more hydroxyls can be replaced by -H or amine (primary, secondary or tertiary).
  • Examples are: glucose, galactose, mannose, fructose, arabinose, fucose, 2-O-methyl-rhamnose, rhamnose, olivose, rhodinose, actinosamine, acosamine, ristosamine, vancosamine (also epi), eremosamine, 4-0xovancosamine, ureido-4 -oxovancosamine, glucosamine, 2-amino-2-deoxyglucuronic acid, xylose, ribose, deoxyribose, apiose or muramic acid
  • Disaccharides contain two monosaccharide molecules that are linked by a glycosidic bond. This bond can be arranged between the acetal carbon atoms of the two monosaccharides or between an acetal carbon atom of a monosaccharide and any other carbon atom of the other monosaccharide. Derivatization is possible analogously to the monosaccharides. Examples of disaccharides are cellobiose, maltose, lactose, sucrose, gentobiose, melibiose, trehalose and turanose as well as disaccharides of all the monosaccharides mentioned above, the same or different.
  • Trisaccharides and tetrasaccharides contain 3 and 4 monosaccharide molecules, respectively.
  • the explanations for disaccharides apply analogously.
  • the above saccharides are preferably bound directly to one of their carbon atoms or to the molecules of the formulas via a hydroxyl oxygen.
  • Amino acid precursors are substances that can be converted into amino acids using natural metabolic processes.
  • Non-natural amino acid precursors are substances that can be converted into non-natural amino acids by means of natural metabolic processes. These substances include, in particular, ⁇ -hydroxycarboxylic acids, which can be converted to ⁇ -oxocarboxylic acids, for example by conversion using dehydrogenases, followed by transamination to ⁇ -amino acids.
  • the non-natural amino acid precursors have side groups which correspond to the side groups of the analog amino acids.
  • Amino acids are carboxylic acids with at least one amine group in the molecule, in particular ⁇ -aminocarboxylic acids.
  • Non-natural amino acids are amino acids that do not occur naturally in organisms. This includes in particular ⁇ -aminocarboxylic acids, the natural side chains of which are derivatized.
  • Examples of unnatural amino acids are natural amino acids in which one or more -H in the side group are replaced by C1-C10 alkyl, hydroxyl, C1-C10 alkyl ether (-OR,
  • R C1-C10 alkyl), or halogen.
  • Counter ions for ionic compounds include, for example, Na + , K + , Li + or cyclohexylammonium
  • Suitable solid or liquid galenic Formulations are, for example, granules, powders, coated tablets, tablets, (micro) capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions (i., Ip, im) and preparations with a protracted active ingredient release, in the case of which Manufacture customary auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coating, swelling, lubricants or lubricants, flavors, sweeteners and solubilizers, are used.
  • customary auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coating, swelling, lubricants or lubricants, flavors, sweeteners and solubilizers
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be produced by mixing at least one antibiotic used according to the invention in a defined dose with a pharmaceutically suitable and physiologically compatible carrier and, if appropriate, other suitable active ingredients, additives or auxiliaries and preparing the desired dosage form.
  • An antibiotic according to the invention can be mixed with one or more conventional antibiotics, such as, for example, dactinomycin, daunorubicin, idarubicin, anthracycline, bleomycin, L-asparaginase, and prepared into a pharmaceutical composition.
  • an antibiotic according to the invention can be mixed with an immunostimulating component to form a pharmaceutical composition.
  • the immunostimulating component can also be used as a separate pharmaceutical composition in combination with a composition according to the invention be presented.
  • An immunostimulating component is typically a protein or an effective component thereof that stimulates cells of the immune system.
  • Examples include: cytokines such as M-CSF, GM-CSF, G-CSF, interferons such as IFN-alpha, -beta, -gamma, interleukins such as IL-1 to -16 (except -8), human LIF , Chemokines such as Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 and IL-8.
  • cytokines such as M-CSF, GM-CSF, G-CSF
  • interferons such as IFN-alpha, -beta, -gamma, interleukins such as IL-1 to -16 (except -8)
  • human LIF human LIF
  • Chemokines such as Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 and IL-8.
  • Formulas claimed according to the invention can be equipped with discriminators, by means of which specific previously known substances are excluded.
  • Previously known substances are those that are known on the filing date, or that only become known after the filing date, but are described in a senior patent application.
  • the Balhimycin producer Amycolatopsis mediterranei DSM5908 produces a type I glycopeptide antibiotic.
  • the generation of a deletion mutant (OP696) in the bhp gene of the balhimycin biosynthetic gene cluster is a new development based on the methods and protocols already described (see experimental section).
  • the bhp deletion mutant accepts 3-chloro-ß-hydroxy-tyrosine and ß-hydroxytyrosine as natural substrates. This finding has been demonstrated experimentally.
  • 3-Fluoro-ß-hydroxytyrosine was used as a non-natural analogue of ß-hydroxytyrosine (AS 2 and AS 6 of the aglycone of glycopeptide antibiotics type I-IV) (racemic and enantiomerically pure).
  • ß-Hydroxytyrosine and corresponding aro aten-substituted analogs can be synthesized according to already known regulations. [1b and the literature cited there]
  • the addition of 3-fluoro-ß-hydroxytyrosine to the medium of the bhp mutant of A. mediterranei resulted in the double-fluorinated glycopeptide antibiotic 3-fluorobalhimycin after fermentation with the bhp mutant ( Figure 3). This finding was confirmed by high-resolution mass spectrometry (Figure 4).
  • the A. mediterranei VP1-2 strains were used as mutants (see experimental section).
  • the "in-frame" deletion mutant in A. mediterranei VP1-2's dpgA gene accepts the amino acid 3-hydroxyphenylglycine ( Figure 6) and 3-methoxyphenylglycine as a non-natural substrate.
  • Figure 6 The amino acid 3-hydroxyphenylglycine
  • Figure 6 The amino acid 3-hydroxyphenylglycine
  • Leucine N-methylated minor metabolites are detected which also show antibiotic activity.
  • a previously unknown derivative is the double-brominated aglycon of balhimycin, which we were able to produce with the A. mediterranei producer strain (see Experimental Part).
  • Another novelty is that when mixtures of bromide (MgBr2 or CaBr2) and chloride (MgC12 or CaC12) are added, mixed-halogenated derivatives are obtained in equal parts.
  • mixed-substituted derivatives were also obtained from fermentations with the addition of these halides.
  • the bromine substituent can be located in amino acid position 2 as well as in amino acid position 6 ( Figure 7).
  • the derivatives were characterized by mass spectrometry ( Figures 8 and 9).
  • the bromobalhimycin showed the same antimicrobial profile and the same activity as the two references teicoplanin and vancomycin in the MIC test.
  • Illustration 1
  • the lines shown in bold represent the characteristic structural element of glycopeptide antibiotics (type 1-4).
  • the residues R3 and R5 are mostly side chains of aliphatic or aromatic amino acids. Aromatic amino acids with the aromatic side chains R3 and R5 can be bridged together (eg teicoplanin).
  • the residues R6-R10 are mostly sugar residues with different glycosylation patterns and partial acylation of amino groups of the carbohydrate substituents.
  • the substituent R4 can be H or OH.
  • Rll is an OH group in natural derivatives. (AS denotes the amino acid positions of the heptapeptide backbone)
  • Figure 5 Synthetic amino acids that were used to attempt supplementation with the bhp mutant of A. mediterranei. Biological activity against the indicator strain B. subtilis was detected when using AS 1, 2, 5 and 8. No antimicrobial activity against the indicator strain B. subtilis was found for AS 3, 4, 6 and 7 and no molecular masses of the corresponding glycopeptide antibiotics were detected with HPLC-ESI-MS
  • nucleotide sequences of the genes of balhimycin biosynthesis are available in the EMBL database under number Y16952.
  • the 1,116 bp fragment frOPl includes a sequence of the N-terminal coding part of the perhydrolase gene bhp (96 bp, corresponds to a length of 32 amino acids).
  • the 1,286 bp fragment frOP2 comprises the C-terminal coding part of the bhp gene (342 bp, corresponds to 114 amino acids).
  • frOP2 was ligated as an Xbal fragment into the singular Xbal interface of the vector pSPl and the plasmid pSPOPa was obtained.
  • frOPl was ligated as a BamHI fragment from pJOEOPl into the BamHI site of the vector Litmus28 and the plasmid pLitmus290Pa was obtained.
  • frOPl was then ligated as a BglII fragment into the BglII site of the plasmid pSPOPa and the plasmid pOPl was obtained, which contained the partially deleted bhp gene.
  • the amplification was carried out on a Thermocylcer (Stratagene, La Jolla, CA, USA) with an Expand High Fidelity PCR System (Röche).
  • the PCR mixture (100 ⁇ l) each contained 100 ⁇ l primer, 1.0 ⁇ g template DNA (pUC18bhA or pUC18bhp), deoxyribonucleoside 5 ′′ triphosphates in a total concentration of 200 ⁇ l each (DNA Polymerization Mix, Pharmacia), lOx reaction buffer, 1.5 mM MgC12 and 3.5 U Taq DNA polymerase, DMSO was added to 3% of the total concentration of the reaction mixture and the following PCR protocol was used to amplify the fragments: Initial denaturation (94 ° C., 3 min) before adding the polymerase; 30 denaturation cycles (94 ° C, 1 min), annealing (60 ° C, 1 min) and polymerization (72 ° C, 2 min); at the end there was an
  • the mutant A. mediterranei VP1-2 was generated according to the protocol given in the literature. [10]
  • the A. mediterranei strain and mutants were fermented using culture media of known composition.
  • the amino acid to be fed was added to the medium after sterile filtration in a final concentration of 0.4 mg / ml. Fluorobalhimycin was isolated in a yield of 8.6 mg / 1 medium. The process can be optimized for higher yields by varying the fermentation conditions. To ensure reproducibility of the results, feeding experiments with all amino acids were repeated three times.
  • Table A relates to Formula AI.
  • Table B relates to formulas B through G.
  • X8 to X17 if present, are -H or -Hai (-Hai as above).
  • S2 in particular can also be a tetrasaccharide.
  • S5 can also be -S03H.
  • Yl can in particular be -H or -OH.
  • S3 can in particular be -OCH3.
  • Glc glucose
  • Ovc oxovancosamine
  • Ovc-GIc oxovancosaminyl-glucosyl
  • Example 7 Preparation of a pharmaceutical composition.
  • An antibiotic from Example 6 is prepared into a tablet according to the following instructions. The following components are first mixed together:
  • antibiotic active ingredient
  • lactose filler
  • sucrose sucrose
  • the mixture is homogenized and shaped into a tablet using an eccentric and rotary press.
  • the dosage of the active ingredient or a dosage unit can be independent of the above specific
  • Example 8 Treatment of a bacterial infection.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Glycopeptid-Antibiotika, sowie ein Verfahren zur Generierung dieser neuen Glycopeptid­Antibiotika durch Verfütterung von nicht-natürlichen Ami­nosäuresubstituenten an Mikroorganismen.

Description

Neue Glycopeptid-Antibiotika und Verfahren zu deren
Synthetisierung
Gebiet der Erfindung.
Die Erfindung betrifft neue Glycopeptid-Antibiotika, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, sowie Verfahren unter Verwendung solcher pharmazeutischen Zusammensetzungen .
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik.
Die Bedeutung von Glycopeptid-Antibiotika liegt in der anti ikrobiellen Wirkung gegen Gram-positive Mikroorganismen, deren wichtigste Vertreter die klinisch relevanten Glycopeptid-Antibiotika Vancomycin und Teicoplanin sind und die als Notfallantibiotika bei Infektionen mit me- thicillinresistenten Staphylococcus aureus-Stämmen (MRSA) angewendet werden. [1] Einige Glycopeptid-Antibiotika zeigen auch antivirale Eigenschaften. [2] Darüber hinaus finden Glycopeptid-Antibiotika als chirale Trennphasen in der Enantiomerenanalytik Verwendung. [3] Es sind eine ganze Reihe von Glycopeptid-Antibiotika isoliert und charakterisiert und auch semisynthetische Derivate hergestellt worden. [lb] Charakteristisches Strukturelement der Verbindungsklasse der Glycopeptid-Antibiotika Typ I, II, III und IV ist die trizyklische Seitenkettenverbrückung bestehend aus einer Biaryl- und zwei Biarylether-Bindungen (Abbildung 1) . Ein weiterer Typ von Glycopeptid-Antibiotika ist der Typ V, der sog. Complestatin- oder Kistamycin-Typ, dessen Vertreter antivirale Eigenschaften zeigen (Abbildung 2).
Bei der Behandlung von Infektionserkrankungen zeigt sich bei der Anwendung bekannter Antibiotika nach einiger Zeit die Entwicklung von resistenten Stämmen der Krankheitserreger. Hierdurch werden die bislang verwendeten Antibiotika wirkungslos jedenfalls gegenüber den resistenten Stämmen. Es besteht daher ein Bedarf an neuen Antibiotika
Technisches Problem der Erfindung.
Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, neue Antibiotika anzugeben, welche insbesondere wirksam sind gegen Stämme, die Resistenzen gegenüber bekannten Antibiotika aufweisen. Desweiteren sollen Antibiotika zur Verfügung gestellt werden, welche auch bei niedriger Dosierung hochwirksam sind und möglichst reduzierte Nebenwirkungen aufweisen.
Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung die Gegenstände der Patentansprüche.
Erstmals wurde die putative Gensequenz eines Glycopeptid- biosynthesegenclusters aus Glycopeptid-
Antibiotikaproduzenten durch von Wageningen et al. publiziert. [5] Der Einbau von nicht-natürlichen Aminosäuresubstraten (abgesehen von Isotopenmarkierung) in Strukturen der Glycopeptid-Antibiotika war bisher nicht bekannt. [6] Dieser Beitrag stellt die Generierung der ersten in-vivo modifizierten Glycopeptid-Antibiotika mit Aminosäuresubstraten vor, die anstelle einer oder mehrerer der folgenden natürlichen Aminosäuren
3, 5-Dihydroxyphenylglycin [10], 4-Hydroxyphenylglycin, ß-Hydroxytyrosin und 3-Chlor-ß-hydroxytyrosin nach Fütterung nicht-natürliche Aminosäureanaloga enthalten. Die neuen Glycopeptid-Antibiotika wurden erhalten durch Füt- terung an den Wildtyp oder bevorzugt an Mutanten, die gezielt mit molekulargenetischen Techniken erzeugt wurden. Durch den Einbau ergeben sich antibiotische Wirkstoffe mit bisher unbekannten Strukturelementen. Neue bisher unbekannte Strukturen von Glycopeptid-Antibiotika, die durch die Verwendung nicht-natürlicher Substrate generiert werden können, bieten neue Anwendungsbereiche als pharmazeutische Wirkstoffe mit antimikrobiellen und antiviralen Eigenschaften sowie als chirale Trennphasen. Dies gilt insbesondere auch für den Einsatz als antimikrobielle Wirkstoffe gegen vancomycinresistente bzw. gegen Glycopeptid-Antibiotika resistente Organismen.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass mittels Mutasynthese Strukturvariationen an Glycopeptid-Antibiotika eingeführt werden können, die zu neuen, bisher unbekannten
Glycopeptid-Antibiotikaderivaten führen. Es war nicht zu erwarten, dass bei Glycopeptid-Antibiotikaproduzenten das Verfahren der Fütterung an Mutanten auf Analoga der natürlichen Substrate angewendet werden kann, da die natürli- chen Glycopeptid-Varianten (z.B. Balhimycin, Vancomycin, Chloroeremomycin) , die aus verschiedenen Produzenten (A. mediterranei, A. orientalis) isoliert wurden, sich unterscheiden und stammspezifisch sind. Dies ließ vermuten, dass die beteiligten Biosyntheseenzyme hochspezifisch sind und in der Regel keine als die jeweiligen natürlichen Substrate akzeptieren würden.
Die Verwendung von nicht-natürlichen Substraten in der Mutasynthese wird am Beispiel von chemisch-synthetischen Analoga gezeigt. Diese nicht-natürlichen Substrate können Precursor-Aminosäuren sein, die nicht den bisher bekannten Precursor-Aminosäuren des natürlichen Biosyntheseweges entsprechen, d.h. die an jeweils aus dem Wildtyp bekannten Positionen eine oder mehrere Aminosäuren tragen, die nicht 3, 5-Dihydroxyphenylglycin, 4-Hydroxyphenylglycin, ß- Hydroxytyrosin oder 3-Chlor-ß-hydroxytyrosin sind. Dabei schließt die Verwendung von chemisch-synthetischen Ami- nosäuren eine Verwendung von biotechnologisch hergestellten Derivaten nicht aus. Ebenso kann diese Vorgehensweise analog auf andere Glycopeptid-Antibiotikaproduzenten angewendet werden.
Das besondere an dem hier vorgestellten Verfahren ist, dass als Produzenten bevorzugt Mutanten eingesetzt werden, die durch gezielte molekulargenetische Manipulation des Produzentenstammes A. mediterranei erhalten wurden. Durch "in-frame"-Deletionen lassen sich Mutanten herstellen, die nur in einer spezifischen Eigenschaft (z.B. die Expression eines Biosyntheseenzyms) betroffen sind, die aber sonst vollkommen mit dem Wildtyp genetisch identisch sind. Es können aber auch herkömmliche Mutanten oder der Wildtyp für entsprechende Fütterungen eingesetzt werden.
Definitionen. Ein Monosaccharid ist ein Polyhydroxyaldehyd oder Polyhy- droxyketon mit 4 (Tetrosen) , 5 (Hexosen) , 6 (Pentosen) , 7
(Heptosen) oder 8 (Octosen) Kohlenstoffatomen, linear, verzweigt oder ringförmig. Bei Derivaten von Monosacchari- den kann ein oder können mehrere Hydroxyl durch -H oder Amin (primär, sekundär oder tertiär) ersetzt sein. Beispiele sind: Glucose, Galactose, Mannose, Fructose, Arabinose, Fucose, 2-O-Methyl-Rhamnose, Rhamnose, Olivose, Rhodinose, Actinosamin, Acosamin, Ristosamin, Vancosamin (auch epi) , Eremosamin, 4-0xovancosamin, Ureido-4-oxo- vancosamin, Glucosamin, 2-Amino-2-desoxyglucuronsäure, Xylose, Ribose, Desoxyribose, Apiose oder Muraminsäure
(jeweils D- und/oder L-Form) .
Disaccharide enthalten zwei Monosaccharidmoleküle, welche durch eine glycosidische Bindung miteinander verbunden sind. Diese Bindung kann zwischen den acetalischen Kohlenstoffatomen der beiden Monosacchariden oder zwischen einem acetalischen Kohlenstoffato eines Monosaccharids und einem anderen beliebigen Kohlenstoffatom des anderen Monosaccharids angeordnet sein. Derivatisierung ist analog der Monosaccharide möglich. Beispiele für Disaccharide sind Cellobiose, Maltose, Lactose, Saccharose, Gentobiose, Melibiose, Trehalose und Turanose sowie Disaccharide aller vorstehend genannten Monosaccharide, gleich oder verschieden.
Trisaccharide und Tetrasaccharide enthalten 3 bzw. 4 Monosaccharidmoleküle. Es gelten die Ausführungen zu Disaccha- riden analog. Die vorstehenden Saccharide sind vorzugsweise direkt mit einem ihrer Kohlenstoffatome oder über einen Hydroxylsau- erstoff an die Moleküle der Formeln gebunden.
Aminosäurenvorläufer sind Substanzen, welche mittels natürlicher Stoffwechselprozesse zu Aminosäuren umsetzbar sind. Nicht-natürliche Aminosäurenvorläufer sind Substanzen, die mittels natürlicher Stoffwechselprozesse in nicht-natürliche Aminosäuren umsetzbar sind. Unter diese Substanzen fallen insbesondere α-Hydroxycarbonsäuren, welche sich beispielsweise durch Umsetzung mittels Dehy- drogenasen zu α-Oxocarbonsäuren mit anschließender Transaminierung zu α-Aminosäuren umsetzen lassen. Dabei weisen die nicht-natürlichen Aminosäurenvorläufer Seiten- gruppen auf, die den Seitengruppen der analogen Aminosäuren entsprechen.
Aminosäuren sind Carbonsäuren mit zumindest einer Amin- gruppe im Molekül, insbesondere α-Aminocarbonsäuren.
Nicht-natürliche Ami•nosäuren sind Aminosäuren, di>e nicht natürlicherweise in Organismen vorkommen. Hierunter fallen insbesondere α-Aminocarbonsäuren, deren natürliche Seitenketten derivatisiert sind. Beispiele für nichtnatürliche Aminosäuren sind natürliche Aminosäuren, bei welchen in der Seitengruppe ein oder mehrere -H ersetzt sind durch C1-C10 Alkyl, Hydroxyl, C1-C10 Alkylether (-OR,
R=C1-C10 Alkyl), oder Halogen.
Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen phar- mazeutischen Zusammensetzung kann m fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium in
Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder injizierbare Lösungen (i. ., i.p., i.m.) sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxyd, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendetes Antibiotikum in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist.
Ein erfindungsgemäßes Antibiotikum kann mit einem oder mehreren herkömmlichen Antibiotika, wie z.B. Dactinomycin, Daunorubicin, Idarubicin, Anthracycline, Bleomycin, L- Asparaginase, gemischt und zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung hergerichtet werden. Des weiteren kann ein erfindungsgemäßes Antibiotikum mit einer immunstimulier- enden Komponente zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemischt werden. Die immunstimulierenden Komponente kann aber auch als getrennte pharmazeutische Zusammensetzung in Kombination mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung dargereicht werden. Eine immunstimulierende Komponente ist typischerweise ein Protein oder ein wirksamer Bestandteil hiervon, welches Zellen des Immunsystems stimuliert. Beispiele hierfür sind: Zytokine, wie M-CSF, GM-CSF, G- CSF, Interferone, wie IFN-alpha, -beta, -gamma, Interleuk- ine wie IL-1 bis -16 (außer -8), human LIF, Chemokine wie Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 und IL-8.
Erfindungsgemäß beanspruchte Formeln können mit Dis- claimern ausgestattet werden, mittels welcher konkrete vorbekannte Substanzen ausgeschlossen werden. Vorbekannte Substanzen sind solche, die am Anmeldetag bekannt sind, oder die erst nach dem Anmeldetag bekannt werden, jedoch in einer zeitrangälteren Schutzrechtsanmeldung beschrieben sind.
a) Einführung von Strukturvariationen in die Aminosäurepositionen 2 und 6.
Der Balhimycin-Produzent Amycolatopsis mediterranei DSM5908 produziert ein Glycopeptid-Antibiotiku des Typs I.[7] Die Generierung einer Deletionsmutante (OP696) im bhp-Gen des Balhimycin-Biosynthesegenclusters ist eine Neuentwicklung auf der Grundlage bereits beschriebener Methoden und Protokolle (s. Experimenteller Teil) . [7, 8, 9] Die bhp-Deletionsmutante akzeptiert 3-Chlor-ß-hydroxy- tyrosin und ß-Hydroxytyrosin als natürliche Substrate. Dieser Befund wurde experimentell nachgewiesen.
Als nicht-natürliches Analogon von ß-Hydroxytyrosin (AS 2 und AS 6 des Aglycons von Glycopeptidantibiotika Typ I-IV) wurde 3-Fluor-ß-hydroxytyrosin eingesetzt (racemisch und enantiomerenrein) . ß-Hydroxytyrosin und entsprechend Aro aten-substituierte Analoga sind gemäss bereits bekannter Vorschriften synthetisierbar. [1b und dort zitierte Literatur] Der Zusatz von 3-Fluor-ß-hydroxytyrosin zum Medium der bhp-Mutante von A. mediterranei ergab nach Fermentation mit der bhp-Mutante das zweifach fluorierte Glycopeptid-Antibiotikum 3-Fluorbalhimycin (Abbildung 3) . Dieser Befund wurde durch höchstauflösende Massenspek- trometrie bestätigt (Abbildung 4) .
Es wurden weitere Aminosäuren synthetisiert und mittels Supplementierung getestet (Abbildung 5) . Die Aminosäuren 2-Fluor-ß-hydroxytyrosin und 3, 5-Difluor-ß-hydroxytyrosin wurde ebenfalls synthetisiert und ergaben die fluorierten Glycopeptid-Antibiotika 2-Fluorbalhimycin sowie 3, 5-Fluorbalhimycin, welche ebenso wie das 3-Fluorbalhimycin antibiotische Aktivität zeigten. Zusätzlich zum Hauptmetaboliten Fluorbalhimycin wurden verschieden glycosylierte und an Leucin N-methylierte Glycopeptid-Antibiotika nachgewiesen. Alle Fluorbalhi y- cine zeigen antibiotische Aktivität gegen den Indikatorstamm B. subtilis.
b) Einführung von Strukturvariationen in Aminosäureposi- tion 7.
Als Mutanten wurden die Stämme A. mediterranei VP1-2 verwendet (s. Experimenteller Teil) . [10] Die "in-frame"- Deletionsmutante im dpgA-Gen von A. mediterranei VP1-2 akzeptiert als nicht-natürliches Substrat die Aminosäure 3-Hydroxyphenylglycin (Abbildung 6) und 3-Methoxyphenylglycin. Es wurde ein race isches Aminosäurengemisch verwendet, was die Verwendung enantio erenreiner Verbindungen nicht ausschließt. Das Kulturfiltrat zeigt nach Fütterung von
3-Hydroxyphenylglycin bzw. 3-Methoxyphenylglycin antibiotische Aktivität gegen den Indikatorstamm B. subtilis.
Dieser Befund ist neu, da alle bisher bekannten Glycopeptid-Antibiotika an Aminosäureposition 7 (AS7) nur Substituenten in 3- und 5-Position des aromatischen Rings von AS7 gleichzeitig tragen (Abbildung 6) . Chemisch- analytisch wurde dies nachgewiesen durch eine charakteristische Massendifferenz von -16 amu gegenüber dem durch die Supplementierung mit 3, 5-Dihydroxyphenylglycin erhaltenen Hauptmetaboliten Balhimycin.
Es wurden ebenfalls verschieden glycosylierte und an
Leucin N-methylierte Nebenmetaboliten detektiert die ebenfalls antibiotische Aktivität zeigen.
c) Einführung von Strukturvariationen in Aminosäureposition 2 und 6 durch Supplementierung mit anderen Halogenid-Ionen
Es ist bekannt, dass in Einzelfällen durch Supplemen- tierung des Mediums mit Bromid anstatt Chlorid im
Sekundärmetaboliten ein vorhandenes Chlor-Atom durch ein Brom-Atom ersetzt werden kann. Dies wurde am Beispiel des Glycopeptid-Antibiotikums Actaplanin gezeigt, das nur ein Halogenatom enthält. [4]
Ein bisher unbekanntes Derivat ist das zweifach bromierte Aglycon des Balhimycins, das wir mit dem Produzentenstamm A. mediterranei herstellen konnten (s. Experimenteller Teil) . Neu ist ferner, dass bei Zugabe von Mischungen von Bromid (MgBr2 oder CaBr2) und Chlorid (MgC12 oder CaC12) zu gleichen Teilen gemischt-halogenierte Derivate erhalten werden. Aus Fermentationen unter Zusatz dieser Halogenide wurden neben Balhimycin und zweifach bromiertem Bromobal- himycin auch gemischt substituierte Derivate erhalten. Der Bromsubstituent kann sowohl in Aminosäureposition 2 als auch in Aminosäureposition 6 sitzen (Abbildung 7) . Die Derivate wurden durch Massenspektrometrie charakterisiert (Abbildung 8 und 9) . Das Brombalhimycin zeigte im MIC-Test das gleiche antimikrobielle Profil sowie die gleiche Aktivität wie die beiden Referenzen Teicoplanin und Vancomycin.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren sowie die Verbindungen durch ausführliche Beschreibung von besonderen Ausführungsformen sowie durch Abbildungen erläutert. In diesen Ausführungsformen können einzelne Merkmale der Erfindung allein oder in Kombination mit anderen Merkmalen verwirklicht sein. Die beschriebenen besonderen Ausführungsformen dienen lediglich zur Erläuterung und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in keiner Weise einschränkend zu verstehen.
Im übrigen ist die Erfindung anhand der Abbildungen dargestellt, dabei zeigen:
Abbildung 1 :
Die fett dargestellten Linen geben das charakteristische Strukturelement von Glycopeptidantibiotika (Typ 1-4) wieder. Die Reste R3 und R5 sind meist Seitenketten von aliphatischen oder aromatischen Aminosäuren. Aromatische Aminosäuren mit den aromatischen Seitenketten R3 und R5 können miteinander verbrückt sein (z.B. Teicoplanin) . Die Reste R6-R10 sind abgesehen von R6, 7, 8, 9, 10=H meist Zuckerreste mit verschiedenen Glycosylierungsmustern und teilweiser Acylierung von Aminogruppen der Kohlenhydratsubstituenten. Für die Reste XI, 2, 10, 4 sind aus der Literatur [lb] bisher nur X=H oder X=C1 bekannt. Nur ein Fall wurde mit Xl,2,4=H und X10 = Br beschrieben [4] . Der Substituent R4 kann H oder OH sein. Rll ist in natürlichen Derivaten eine OH-Gruppe. (AS bezeichnet die Aminosäurenpositionen des Heptapeptidrückgrats)
Abbildung 2 :
Die fett dargestellten Linien geben das charakteristische
Strukturelement von Typ V-Glycopeptidantibiotika wieder. Die Reste R1-R4 sind meist Seitenkettenreste aromatischer Aminosäuren. Eine Glykcosylierung phenolischer oder sonstiger OH-Gruppen wurde bisher nicht beschrieben. (AS bezeichnet die Aminosäurenpositionen des Heptapeptidrückgrats)
Abbildung 3:
Struktur von 3-Fluorbalhimycin, das durch Supplementierung mit 3-Fluor-ß-hydroxytyrosin erhalten wurde.
Abbildung 4:
FTICR-MS von 3-Fluorbalhimycin. Das Molekülion [M+2H]2+ wurde bei m/z = 707,7439 mit einer Massengenauigkeit von δ = 0,3 pp detektiert (Summenformel C66H73F2N9024) . Zur internen Kalibrierung wurde PEG1020 als Standard verwendet.
Abbildung 5: Synthetische Aminosäuren, die zur Supplementierungsver- suchen mit der bhp-Mutante von A. mediterranei eingesetzt wurden. Biologische Aktivität gegen den Indikatorstamm B. subtilis wurde bei Einsatz von AS 1, 2, 5 und 8 detek- tiert. Für AS 3, 4, 6, und 7 wurde keine antimikrobielle Aktivität gegen den Indikatorstamm B. subtilis festgestellt und mit HPLC-ESI-MS keine Molekülmassen der entsprechenden Glycopeptid-Antibiotika detektiert
Abbildung 6:
Chemische Struktur von Dehydroxy-Balhimycin mit fehlender OH-Funktion in der 5-Position der Aminosäure 7.
Abbildung 7 : Struktur von verschieden halogensubstituierten Balhimy- cinen mit XI = Cl, Br und X2 = Cl, Br.
Abbildung 8:
FTICR-MS der verschieden halogensubstituierten Balhimycine von 2Chlor6Brom-Balhimycin mit XI = Cl und X2 = Br bzw. 2Brom 6Chlor-Balhimycin XI = Br und X2 = Cl. Das Molekülion [M+2H] 2+ wurde bei m/z = 745,6899 mit einer Massengenauigkeit von δ = 0,7 ppm (Summenformeln: C66H73BrClN9024) detektiert. Die nicht bezeichneten Sig- nale im Massenspektrum stammen vom internen Standart PEG600 der zur internen Kalibrierung verwendet wurde.
Abbildung 9:
FTICR-MS von Brombalhimycin mit XI = Br und X2 = Br. Das Molekülion [M+2H]2+ wurde bei m/z = 767,6643 mit einer Massengenauigkeit von δ = 0,3ppm detektiert (Summenformel: C66H73Br2N9024) . Zur internen Kalibrierung wurde PEG1020 als Standard verwendet. Beispiel 1 : Chemische Synthesen
a) Synthese von 3-Hydroxyphenylglycin: Die Synthesen der enantiomerenreinen 3-Hydroxyphenylglycine sind in Anlehnung an die von Nicolaou et al.[lb] beschriebenen und dort zitierten Literaturvorschriften durchgeführt worden. Racemische Produkte wurden durch die Strecker-Synthese hergestellt.
b) Synthesen von ß-Hydroxytyrosin, 3-Fluor-ß-hydroxytyro- sin, 3-Chlor-ß-hydroxytyrosin: Die enantiomerenreinen Produkte sind in Anlehnung an die in Nicolaou et al.[lb] beschrieben und dort zitierten Literatur durchgeführt worden. Diese wurde durch dort beschriebene Schöllkopf- Reaktion und die Sharpless-Aminohydroxylierung synthetisiert. Racemische Produkte wurden durch Aldolreaktion aus dem entsprechenden aromatischen Aldehyd und einem Gly- cinäquivalent z.B. Boc-Gly-OtBu mit BuLi in Tetrahydrofu- ran erhalten.
Beispiel 2: Generierung von Mutanten in A. mediterranei DSM5908
Die Nucleotidsequenzen der Gene der Balhimycin-Biosynthese sind in der EMBL Datenbank unter der Nummer Y16952 zugänglich.
a) Generierung von Mutanten im bhp-Gen von A. mediterranei
DSM5908
Konstruktion des Plasmids pOPl : Zur Deletion des Perhydrolase-Gens bhp (pOPl) . wurden Plasmide konstruiert. Die relevanten Regionen des Plas- midkonstrukts wurden durch Sequenzierung verifiziert. Das 1,116 bp Fragment frOPl schließt eine Sequenz des N- terminal kodierenden Teils des Perhydrolase-Gens bhp ein (96 bp, entspricht einer Länge von 32 Aminosäuren) . Das 1,286 bp-Fragment frOP2 umfasst den C-terminal kodierenden Teil des bhp-Gens (342 bp, entspricht 114 Aminosäuren) . Diese beiden Fragmente wurden in getrennten Ansätzen in die EcoRV-Schnittstelle des Vektors pJOE890 ligiert. Daraus ergaben sich die Plasmide pJOEOPl und pJOEOP2. frOP2 wurde dann hieraus als Xbal-Fragment in die singuläre Xbal-Schnittstelle des Vektors pSPl ligiert und das Plas- mid pSPOPa erhalten. frOPl wurde als BamHI-Fragment aus pJOEOPl in die BamHI-Schnittstelle des Vektors Litmus28 ligiert und das Plasmid pLitmus290Pa erhalten. frOPl wurde dann als Bglll-Fragment in die Bglll-Schnittstelle des Plasmids pSPOPa ligiert und das Plasmid pOPl erhalten, das das teilweise deletierte bhp-Gen enthielt.
PCR Protokoll zur Amplifizierung der frOPl- und frOP2-Fragmente :
Die Amplifizierung wurde auf einem Thermocylcer (Stratagene, La Jolla, CA, USA) mit einem Expand High Fi- delity PCR System (Röche) durchgeführt. Die PCR-Mischung (100 μl) enthielt je 100 μl Primer, 1.0 μg Template-DNA (pUC18bhA oder pUC18bhp) , Desoxyribonucleosid 5"-triphosphate in einer Gesamtkonzentration von je 200 μl (DNA Polymerisation Mix, Pharmacia) , lOx Reaktionspuffer, 1.5 mM MgC12 und 3.5 U Taq DNA Polymerase. DMSO wurde zu 3 % der Gesamtkonzentration der Reaktionsmischung zugegeben. Zur Amplifizierung der Fragmente wurde folgendes PCR- Protokoll verwendet: Initial Denaturierung (94 °C, 3 min) vor Zugabe der Polymerase; 30 Denaturierungszyklen (94 °C, 1 min), Annealing (60 °C, 1 min) und Polymerisation (72 °C, 2 min) ; am Ende erfolgte ein zusätzlicher Polymerisationsschritt (72 °C, 10 min) . Die Primersequenzen sind im Sequenzprotokoll dargestellt. Es erfolgt die Amplifikation des Fragments frOPl mit den Primern prOPl-1 und prOPl-2 sowie des Fragments frOP2 mit den Primern prOP2-l und prOP2-2.
b) Generierung von Mutanten im dpgA-Gen und pgat-Gen von A. mediterranei DSM5908
Die Mutante A. mediterranei VP1-2 wurde gemäss dem in der Literatur angegebenen Protokoll generiert. [10]
Beispiel 3: Fermentationsbedingungen
b) Fermentation von A. mediterranei und Mutanten:
Der Stamm A. mediterranei und Mutanten wurden mit Kultur- medien bekannter Zusammensetzung fermentiert . [8] Vor Beimpfen des Mediums mit A. mediterranei Mutanten wurde die jeweils zu fütternde Aminosäure nach Sterilfiltration in einer Endkonzentration von 0.4 mg/ml dem Medium zugegeben. Fluorbalhimycin wurde in einer Ausbeute von 8,6 mg/1 Medium isoliert. Der Prozess kann auf höhere Ausbeuten durch Variation der Fermentationsbedingungen optimiert werden. Um eine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten wurden Fütterungsexperimente mit allen Aminosäuren dreimal wiederholt.
c) Fermentation von A. mediterranei und Mutanten unter Halogenidsubstitution: Der Stamm A. mediterranei und Mutanten wurden mit Kulturmedien bekannter Zusammensetzung fermentiert . [8] Die für das Medium dort angegebenen Chlorid-Salze (MgCl2 oder CaC12) durch Bro idsalze (MgBr2 oder CaBr2) ersetzt (Vollsubstitution) , bzw. zur Hälfte (50mol%) durch Bromid ersetzt um die gemischt- substituierten Derivate zu erhalten.
Beispiel 4: Isolierung und analytische Charakterisierung der Glycopeptidantibiotika
a) Isolierung: Kulturfiltrate wurden mittels Adsorptionschromatographie an XAD 1160 (Serva) und mittels nachfolgender präparativer RP18-HPLC (Grom-Sil RP-C18, 5 μm, 20 x 250 mm) gereinigt.
b) Analytische Charakterisierung der Glycopeptid-Antibiotika: Massenspektren wurden auf einem API III (Perkin- Elmer Sciex, Ontario, Kanada) Triple-Quadrupol Massenspek- trometer aufgenommen. Die Summenformeln der charakterisierten Verbindungen wurden aus hochaufgelösten FTICR-Massenspektren mit interner Kalibrierung bestimmt, die auf einem FTICR-Massenspektrometer (Bruker-Franzen, Bremen) mit Elektrospray-Ionisierung im Positivionenmodus aufgenommen wurden. Der Magnet besitzt eine Feldstärke von 4,7 T.
Beispiel 5: Nachweis fluorierter Balhimycine durch LCMS nach Suppl. von (bhp OP696 ß-Hydroxytyrosin- Derivaten
Bedingungen: lOml-Kulturen supplementiert mit Aminosäure lmg/ml; abzentrifugiert, über Solid Phase Extraktion (Var- ian BondElut 2ml-Kartuschen) gewonnene Fraktionen (Elution mit Methanol/Wasser Stufengradienten (Elutionsfolge : 2 ml Wasser, 1 ml 90/10 Wasser/Methanol (v/v), 80/20, 50/50, schließlich 100 % Methanol) . Fraktionen vermessen mit LCMS am Esquire 3000plus ESI-Ionenfallen-Massenspektrometer (Bruker Daltonics) gekoppelt mit HP-Agilent 1100 ChemSta- tion HPLC-Anlage. Säule: Purospher RP-C18e (Merck) 125 x 4 mm, 5 μm Korngröße.
Gradientenprogramme: jeweils aus A) Wasser (0,1 % Trifluo- ressigsäure) und B) Acetonitril (0,1 % Trifluoressigsäure)
1. Gradientenprogramm (bei 2-Fht, 3,5-Fht, 3-OMe-Pg) innerhalb 6min. von 10 % B auf 70 % B.
2. Gradientenprogramm innerhalb 15 min. von 10 % B auf 50 % B.
Beispiel 6: Erfindungsgemäße Antibiotika
In den folgenden Tabellen sind verschiedene konkrete Aus- führungsformen erfindungsgemäßer Glycopeptid-Antibiotika angegeben. Tabelle A bezieht sich auf Formel AI. Tabelle B bezieht sich auf die Formeln B bis G.
Im Falle der Formel AI ist X9 = -H oder -Hai mit -Hai = -F, -Cl, oder -Br. Im Falle der Formeln B bis G sind X8 bis X17, sofern vorhanden, -H oder -Hai (-Hai wie vorstehend) . Insbesondere S2 kann auch ein Tetrasaccharid sein. S5 kann auch -S03H sein. Yl kann insbesondere -H oder -OH sein. S3 kann insbesondere -OCH3 sein. In aller Allgemein- heit gilt: eine Gruppe -OSn (n = 1 bis 6) steht auch für -Sn und umgekehrt. Tabelle A
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000020_0003
Fortsetzung Tabelle A
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
Fortsetzung Tabelle A
Figure imgf000022_0002
Und Glc = Glucose, Ovc = Oxovancosamin, Ovc-GIc = Oxovancosaminyl-Glucosyl
Figure imgf000022_0001
Tabelle B
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 S1 S2 S3
H, F, H F, H, F, H, F, H, F, H, F, H, H, H, H,
Cl, Cl, Cl, Cl, Cl, Cl, F, Mono- Mono- OH,
Br Br Br Br Br Br Cl, sac- sac- Man Br chari- cha- nose de, ride, Deri-
DisacDisac vati- charicha- ve de ride
S4 S5 S6 R1 R2 R3 R4 R5 n
H, H, H, H, H, H, H, Lineare 0,1,2
OH, Mono- Mono- CH3 CH3 CH3 OH, oder
Man sac- sac- NH2, verzw. nose cha- cha- CH3 Fett¬
Deriride, ride säuren vatiDisac ve cha- ride
Beispiel 7: Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Ein Antibiotikum aus Beispiel 6 wird gemäß der folgenden Vorschrift zu einer Tablette hergerichtet. Folgende Komponenten werden zunächst miteinander gemischt:
50 mg Antibiotikum (Wirkstoff) 200 mg Lactose (Füllstoff) 100 mg Saccharose (Füllstoff)
50 mg Polyvinylpyrrolidon (Bindemittel) 50 mg Talkum (Gleitmittel)
50 mg Polyethylenglykolsorbitanfettsäureester (Sprengmittel)
Die Mischung wird homogenisiert und mittels einer Exzenter- und Rundlaufpresse zu einer Tablette geformt.
Die Dosierung des Wirkstoffes bzw. einer Darreichungsein- heit kann unabhängig von dem vorstehenden konkreten
Beispiel im Bereich von 0,1 mg bis 100 mg, insbesondere 1 mg bis 20 mg, je kg Körpergewicht und je Tag gewählt werden. Es ergeben sich hieraus für eine Person mit 80 kg Körpergewicht Tagesdosen von 8 mg bis 8000 mg bzw. 80 mg bis 1600 mg.
Beispiel 8: Behandlung einer bakteriellen Infektion.
Einem an einer Wundinfektion erkrankten Patienten werden täglich vier Tabletten aus Beispiel 7 über einen Zeitraum von 2 Wochen dargereicht. Zitierte Literatur
la) D. H. Williams, B. Bardsley, Angew. Che . 1999, 111, 1264-1286; Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1172-1193; lb) K.C. Nicolaou, C.N.C. Boddy, S. Bräse, N. Winssinger, Angew. Chem. 1999, 111, 2230-2287; Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 2096-2152. 2a) N. Naruse, 0. Tenmyo, S. Kobaru, M. Hatoru, K. Tomita, Y. Hamagishi, T. Oki, J. Antibiotics 1993, 46, 1804-1811.
2b) N. Naruse, M. Oka, M. Konishi, T. Oki, J. Antibiotics
1993, 46, 1812-1818. 2c) K. Matsuszaki, H. Ikeda, T. Ogino, A. Matsumoto, H.
Tanaka, H.B. Woodruff, S. Omura, J. Antibiotics, 1994, 47, 1173-1174.
2d) H. Tanaka, K. Matsuszaki, H. Nakashima, T. Ogino, A. Matsumoto, H. Ikeda, H.B. Woodruff, S. Omura, J. Antibiotics, 1997, 50, 58-65 und dort publizierte Literatur. 3 D.W. Armstrong, Y. Tang, S. Chen, Y. Zhou, C. Bagwill, J.-R. Chen, Anal. Chem. 1994, 66, 1473-1484.
4 F.M. Huber, K.H. Hunt, J.W. Martin, M.T. Molloy, J. Antibiotics, 1988, 41, 798-801.
5 A.M.A. van Wageningen, P.N. Kirkpatrick, D.H. Williams, B.R. Harris, J.K. Kershaw, N.J. Lennard, M. Jones,
S.J.M. Jones, P.J. Solenberg, Chem. Biol. 1998, 5, 155-162.
6 S.J. Hammond, M.P. Williamson, D.H. Williams, L.D. Boeck, G.G. Marconi, Chem. Comm. 1982, 344-346. 7 S. Pelzer, R. Süssmuth, D. Heckmann, J. Recktenwald, P. Huber, G. Jung, W. Wohlleben, Antimicrob. Agents Che- mother. 1999, 1565-1573. Pelzer, S., Huber, P., Süßmuth, R., Recktenwald, J., Heckmann, D. & Wohlleben, W. (2000) . Nucleic acid frag- ment and vector containing halogenase and method for the halogenation of chemical compounds. Patent Wo 00/77182A1 S. Pelzer, W. Reichert, M. Huppert, D. Heckmann, W. Wohlleben, J. Biotechnol. 1997, 56, 115-128. V. Pfeifer, G.J. Nicholson, J. Ries, J. Recktenwald, A.B. Schefer, R.M. Shawky, J. Schröder, W. Wohlleben, S. Pelzer, J. Biol. Chem. 2001, 276, 38370-38377.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Generierung von Glycopeptid-Antibiotika insbesondere der Klassen I bis V, dadurch gekennzeichnet, daß an Mikroorganismen, insbesondere an im Glyco- peptid Biosynthesegencluster mutierten Mikroorganismen, nicht-natürliche Bausteine, wie z.B. Aminosäuren oder Aminosäurevorläufer, verfüttert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei gentechnisch veränderte Mikroorganismen verwendet werden, in die fremde nichtribosomal-e Peptidsynthetasemodule einge- führt sind, welche Peptidsynthetasemodule Spezifitäten für andere nicht-natürliche Aminosäuren zeigen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein gentech- nisch verändertes oder mutiertes Glykopeptid Biosynthesegencluster heterolog in Mikroorganismen exprimiert wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei in den Mikroorganismen zusätzlich auch weitere heterologe Biosynthesegene zur Modifikation der Glykopeptid- Antibiotika exprimiert werden.
5. Glykopeptid-Antibiotikum, erhältlich mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und anschließender chemischen oder enzymatischen Modifizierung, z.B. in vivo durch Biotransformation oder in vitro durch Biokatalyse.
Typ I Glycopeptid-Antibiotikum, insbesondere Balhimycin-Derivate, gemäß Formel AI,
wobei XI bis X9 = -H oder -Hai ist, wobei XI bis X9 gleich oder verschieden sein können, wobei Hai = -F, -Cl, oder -Br ist,
wobei YI und Y2 = -H oder -OR100 ist, wobei YI und Y2 gleich oder verschieden sein können, wobei R100 = -H oder Cl-ClO-Alkyl, linear oder verzweigt, insbesondere -H, Methyl oder Ethyl, ist,
wobei ZI und Z2 = -H oder Cl-ClO-Alkyl, linear oder verzweigt, insbesondere Methyl oder Ethyl, ist,
wobei Rl und R2 = -H, -Sac, insbesondere -Glc, -Ovc, oder Ovc-Glc, ist, wobei -Sac für einen Mono- Di-, Trioder Tetrasaccharidrest steht, wobei Glc, Ovc und Ovc- Glc definiert sind gemäß der Formeln A2 bis A4.
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
A2 A3 A4
Glucose Oxovancosamin Oxovancosamin-Glucosyl
Glykopeptid-Antibiotikum gemäß einer der Formeln B bis
G (Typen I bis V, respektive) , welches insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhältlich ist,
wobei XI bis X17 = -H oder -Hai ist, wobei XI bis X17 gleich oder verschieden sein können, wobei Hai = -F, -Cl, oder -Br ist,
wobei YI = -H oder -OR100 ist, wobei R100 = -H oder Cl-ClO-Alkyl, linear oder verzweigt, insbesondere -H, Methyl oder Ethyl, ist,
wobei Sl bis S6 = -H, -OH, -S03H, OR100, Monosaccha- ridrest, Disaccharidrest, Trisaccharidrest, Tetrasaccharidrest, Mannoserest, oder Manosederivatrest ist, wobei Sl bis S6 gleich oder verschieden sein können,
wobei Rl bis R4 = -H, -OR100, -NR200R201, oder C1-C10 Alkyl ist, wobei Rl bis R4 gleich oder verschieden sein können, wobei R100 = -H oder Cl-ClO-Alkyl, linear oder verzweigt, insbesondere -H, Methyl oder Ethyl, ist, wobei R200 und R201 = -H oder Cl-ClO-Alkyl, linear oder verzweigt, insbesondere -H, Methyl oder Ethyl, ist, wobei R200 und R201 gleich oder verschieden sein können, wobei R5 eine lineare oder verzweigte, gesättigte oder einfach oder mehrfach ungesättigte Cl-C29-Fettsäure ist,
wobei n = 0,1 oder 2.
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0002
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0002
Figure imgf000032_0001
Complestatin
Figure imgf000032_0002
Chloropeptin
8. Verwendung eines Glycopeptid-Antibiotikums nach einem der Ansprüche 6 oder 7 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei ein Glycopeptid- Antibiotikum oder eine Mischung verschiedener der Glyco- peptid- Antibiotika optional in einer physiologisch wirksamen Dosis mit üblichen Hilfs- und/oder Trägerstof- fen gemischt und galenisch hergerichtet wird.
9. Verwendung nach Anspruch 8 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionserkrankungen des Menschen und/oder von Säugetieren, insbesondere von bakteriellen oder viralen Infektionen.
10. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionserkrankungen des Menschen und/oder von Säugetieren, wobei ein Glycopeptid Antibiotikum oder eine Mischung verschiedener Glycopeptid Antibiotika nach einem der Ansprüche 6 oder 7 in einer physiologisch wirksamen Dosis mit Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und galenisch hergerichtet wird.
11. Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionserkrankungen, wobei einem Menschen oder einem Säugetier eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 10 einmalig oder mehrmalig, mehrmalig vorzugsweise über einen Zeitraum von zumindest 3 Tagen, insbesondere zumindest 7 Tagen, dargereicht wird.
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