DE10239290B3

DE10239290B3 - Hochsensitiver Biosensor durch Aktivierung der erkennenden Komponente

Info

Publication number: DE10239290B3
Application number: DE2002139290
Authority: DE
Inventors: Friedrich Ueberle
Original assignee: Dornier Medtech Systems GmbH
Current assignee: Dornier Medtech Systems GmbH
Priority date: 2002-08-27
Filing date: 2002-08-27
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2022-08-28

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Erfassen eines Probenmaterials, basierend auf einer biologischen und/oder biochemischen Erkennungsreaktion zwischen dem Probenmaterial und einem probensensitiven Material sowie auf einen entsprechenden Biosensor zum Erfassen eines Probenmaterials. Um ein verbessertes Verfahren zum hochsensitiven Nachweis eines Probenmaterials mittels einer biologischen und/oder biochemischen Erkennungsreaktion sowie einen entsprechenden hochsensitiven Biosensor anzugeben, wird das probensensitive Material erfindungsgemäß mittels einer physikalischen Energie für die Erkennungsreaktion aktiviert. Eine solche Energie zur Aktivierung des probensensitiven Materials kann beispielsweise durch eine Anregung mittels Ultraschall oder Laserlicht bereitgestellt werden. Insbesondere bei sogenannten "whole-cell"-Biosensoren, bei denen das probensensitive Material in Form ganzer Zellen vorliegt, lässt sich die Sensitivität gegenüber einem Analyten durch eine solche physikalische Anregung deutlich steigern.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Erfassen eines Probenmaterials basierend auf einer biologischen und/oder biochemischen Erkennungsreaktion zwischen dem Probenmaterial und einem probensensitiven Material sowie auf einen entsprechenden Biosensor zum Erfassen eines Probenmaterials.
Mit dem Begriff Biosensor bezeichnet man üblicherweise eine Analysenvorrichtung, die mit Hilfe biologisch und/oder biochemisch aktiver Substanzen (z. B. Gewebe, Mikroorganismen, Organellen, Membranrezeptoren, Enzymen, Antikörpern, Nukleinsäuren oder dgl.) zu detektierende Probenmaterialien, sogenannte Analyten, in einer Messprobe bestimmt.
Die Selektivität des Biosensors 100, wie er in 1 schematisch dargestellt ist, gegenüber einem bestimmten Analyten in einer Probe 104 entsteht dabei durch die Bindungsspezifität einer biologischen und/oder biochemischen Reaktion der erkennenden Komponente 102 mit dem Analyten. Die Analytkonzentrationen werden über die Umwandlung einer durch solche Analytbindungsereignisse verursachten messbaren Zwischengröße 106 (z. B. der Produktion einer elektroaktiven Substanz, einer elektrischen Ladung, einer Lichtemission, einer pH-Wert-Änderung oder einer Massenänderung) mittels eines physikochemischen Messwandlers 108 (dem sogenannten Transducer) in ein elektrisches Ausgangssignal 110 bestimmt.
Daher umfasst ein Biosensor 100 als grundlegende Bestandteile die biologische und/oder biochemische Erkennungskomponente 102 als probensensitives Material und den Messwandler 108 (oder Transducer), wobei die erkennende Komponente 102 eng mit dem Messwandler 108 gekoppelt oder in diesen integriert ist. Das Prinzip des verwendeten Transducers 108 hängt von der jeweiligen durch die Bindungsreaktion verursachten Zwischengröße 106 ab und kann beispielsweise elektronischer, optischer, elektrochemischer, thermischer, piezoelektrischer oder magnetischer Natur sein. Aufgabe eines Biosensors ist es üblicherweise, ein diskretes oder kontinuierliches elektrisches Ausgangssignal 110, das mit der Konzentration eines einzelnen Analyten oder einer verwandten Gruppe von Analyten korreliert ist, bereitzustellen.

Entsprechend den verwendeten Messwandlern werden Biosensoren üblicherweise in drei Kategorien aufgeteilt: elektrochemische, optische oder physikalische Sensoren. Die verschiedenen Messwandlerprinzipien sind allgemein bekannt und umfassen beispielsweise kalorimetrische, piezoelektrische, amperometrische, faseroptische, potentiometrische und elektrochemische Messwandler (siehe z. B. EP 0362 304 B1 ). Für eine Erhöhung der Genauigkeit können dabei, wie in der WO 02/08736 gezeigt, auch Differenzmessanordnungen eingesetzt werden.

Nach der verwendeten erkennende Komponente eines Biosensors unterscheidet man unter anderem Enzymsensoren, Immunosensoren oder sogenannte „whole-cell"-Biosensoren, die ganze Zellen oder Gewebeteile verwenden. Grundsätzlich handelt es sich bei Enzymen, Antikörpern und Membranrezeptoren um biologische Makromoleküle, deren Funktion darin besteht, bestimmte Moleküle in hochspezifischer Weise zu binden. So können mit Hilfe von Enzymsensoren eine große Anzahl von Analytmolekülen bestimmt werden. Eine hohe Sensitivität erreicht man mit Hilfe der Immunosensoren, die Antikörper als ihre biologische Komponente verwenden.

Infolge der großen Vielzahl an detektierbaren Analyten und verwendeten Transducer-Prinzipien eröffnet sich den Biosensoren ein breites Spektrum an möglichen Einsatzgebieten (siehe z. B. Kim R. Rogers; Clare L. Gerlach, Environmental Biosensors: A Status Report, Environmental Science and Technology, 1996):

– Klinische Diagnostik und Biomedizin,
– landwirtschaftliche und Veterinäranalytik,
– Prozesskontrolle, z. B. in der Fermentationskontrolle,
– bakterielle und vitale mikrobiologische Analytik,
– pharmazeutischen Entwicklung und Produktionsüberwachung,
– Lebens- und Futtermittel- sowie Trinkwasseranalyse,
– Umweltüberwachungsaufgaben,
– Gasanalytik, z. B. im Bergbau, und
– militärische Anwendungsfelder.

Biosensoren, die immobilisierte ganze Zellen als erkennende Komponente verwenden, sind beispielsweise in IEEE Engineering in Medicine and Biology, June/July 1994, pp. 402-408, oder in der deutschen Offenlegungsschrift DE 100 34 578 A1 gezeigt.

Derartige „whole-cell"-Biosensoren haben, ebenso wie generell alle Biosensoren, mit dem Problem zu kämpfen, dass die erreichbare Sensitivität für verschiedene Analysenaufgaben nicht ausreicht. Insbesondere in der Trinkwasseranalytik ist hier meist ein vorgeschaltetes Anreicherungsverfahren zwingend erforderlich, um die gesetzlichen Nachweisgrenzen einzuhalten.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein verbessertes Verfahren zum hochsensitiven Nachweis eines Probenmaterials mittels einer biologischen und/oder biochemischen Erkennungsreaktion sowie einen entsprechenden hochsensitiven Biosensoranzugeben.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 sowie durch einen Biosensor mit den Merkmalen des Patentanspruchs 12 gelöst.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass die Reaktivität einer probensensitiven Komponente während der Erkennungsreaktion dadurch erhöht wird, dass mittels einer zusätzlichen physikalischen Energieübertragung die Aufnahmebereitschaft der erkennenden Komponente für den Analyten erhöht wird. So ist beispielsweise aus der US 5,885,211 bekannt, dass die Durchlässigkeit von Zellmembranen (hier der Haut) durch die Einwirkung von akustischer Energie für bestimmte Stoffe erhöht werden kann. Aus der WO 99/60168 ist außerdem bekannt, Reaktionsgeschwindigkeiten, z. B. bei der Polymerasekettenreaktion, durch elektromagnetische Strahlung zu erhöhen. Beispielsweise für eine Anwendung eines "whole-cell"-Biosensors kann daher auf besonders einfache Weise die Permeabilität der Zellmembranen für den Analyten durch eine physikalische Energieübertragung erhöht werden. Damit kann die Sensitivität eines solchen Biosensors gegenüber dem Fall, in dem keine derartige Aktivierung erfolgt, signifikant gesteigert werden. Die Einflussnahme einer solchen physikalischen Energieübertragung kann aber auch bei Biosensoren, die als erkennende Komponente lediglich Moleküle benützen, dazu verwendet werden, die erkennende Komponente durch eine Umkonfiguration des Moleküls zu aktivieren.

Eine besonders effektive Kombination der aktivierenden Energieübertragung mit dem eigentlichen Messwandler erhält man durch eine Energieübertragung mittels elektromagnetischer Wellen. Solche elektromagnetischen Wellen können beispielsweise Laserstrahlung sein, die auf die erkennende Komponente gerichtet wird. Die Verwendung von Laserstrahlung bietet den Vorteil, dass sie besonders effizient auch auf kleinere Bereiche fokussiert werden kann. Dies ist beispielsweise im Zusammenhang mit Mikrochipbiosensoren von großer Bedeutung.

Eine alternative Anregungsform erfolgt durch die Einwirkung mechanischer Kräfte. Ins besondere im Zusammenhang mit ganzen Zellen als erkennender Komponente lässt sich die Einwirkung mechanischer Kräfte besonders effektiv zur Veränderung der Membraneigenschaften einsetzen.

Verwendet man zur Aktivierung mittels mechanischer Kräfte eine Energieübertragung durch die Einwirkung akustischer Stoßwellen, so bietet diese Ausführungsform den Vorteil, dass eine reversible Veränderung der Membraneigenschaften durch das Auftreten von Kavitationen und/oder eine Verformung durch mechanische Scherkräfte auftritt. Dadurch kann einerseits die Sensitivität verbessert werden, und andererseits die Standzeit solcher Biosensoren größtmöglich gehalten werden.

Biosensoren, bei denen die biologische und/oder biochemische Erkennungsreaktion als Zwischengröße ein optisches Signal erzeugt, das beispielsweise von einem Fotodetektor als Messwandler in ein elektronisches Messsignal umgewandelt wird, bieten den Vorteil, dass sie eine besonders hohe Empfindlichkeit mit einer kurzen Reaktionszeit verbinden.

Als Messwandler für einen solchen Biosensor eignet sich hier besonders ein Lichtwellenleiter, der das optische Signal empfängt und zur Weiterverarbeitung leitet. Diese Ausgestaltung erlaubt auch die Ausformung eines sogenannten "Dipstick-Sensors", der in eine entsprechende Probenlösung eingetaucht werden kann.

Bildet man den Lichtwellenleiter so aus, dass er neben den optischen Signalen auch akustische Stoßwellen leitet, so kann auf besonders kompakte Art und Weise ein opti scher Biosensor mit physikalisch aktivierter probensensitiver Komponente erreicht werden.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform handelt es sich bei dem optischen Signal um eine Lumineszenzlichtstrahlung. Dies stellt eine weitverbreitete Möglichkeit der Signalgenerierung dar, für die sehr viele und gut charakterisierte Reagenzien und Sensorelemente zur Verfügung stehen. Eine automatisierte Erfassung dieser Strahlung kann beispielsweise durch einen Fotodetektor (Fotodioden, Avalanchedioden, Fotomultiplier oder CCDs) erfolgen.

Anhand der in den beiliegenden Zeichnungen dargestellten vorteilhaften Ausgestaltungen wird die Erfindung im Folgenden näher erläutert. Es zeigen:
1 eine schematische Darstellung des Biosensorprinzips;
2 eine schematische Darstellung eines Biosensors mit der erfindungsgemäßen Aktivierungsvorrichtung.
2 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Biosensors 200 zur Detektion eines Probenmaterials basierend auf einer biologischen und/oder biochemischen Erkennungsreaktion. Der Biosensor 200 umfasst eine probensensitive Komponente 202, die aufgrund spezieller hochspezifischer Bindungsplätze in der Lage ist, mit einem Analyten, der beispielsweise in wässriger Lösung 204 vorliegt, zu reagieren. Die Reaktion zwischen dem Analyten und dem probensensitiven Material 202 führt zu einer geänderten Zwischengröße 206, die von dem Messwandler 208 erfasst und als elektrisches Messsignal 210 ausgegeben werden kann.
Alle üblichen Biosensormesswandlertechniken und -Vorrichtungen, wie Elektroden, Thermistoren, Photonendetektoren und massensensitive Transducer, können im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Aber auch analytische Techniken wie Massenspektroskopie, Gaschromatographie oder der NMR-Spektroskopie können im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Zusätzlich zu den bereits in 1 gezeigten konventionellen Strukturen weist der Biosensor 200 gemäß der vorliegenden Erfindung eine Aktivierungsvorrichtung 212 auf, die auf das probensensitive Material 202 in einer Weise einwirkt, dass eine physikalische Energieübertragung 214 zur Aktivierung des probensensitiven Materials 202 auftritt.
Handelt es sich beispielsweise bei dem probensensitiven Material 202 um eine Schicht immobilisierter ganzer Zellen, so kann als Aktivierungsvorrichtung 212 ein akustischer Stoßwellengenerator verwendet werden, um während der Reaktion mit dem Analyten aus der Probe 204 die Permeabilität der Zellmembranen so zu verändern, dass die Analytmoleküle verstärkt aufgenommen werden und somit die Erkennungsreaktion in verstärktem Maße abläuft.
Bei Verwendung von Stoßwellen bzw. Ultraschall als aktivierende Energieform 214 erfolgt eine Pertoration der Zellmembranen durch Kavitationsereignisse, insbesondere in Verbindung mit Kavitationsmediatoren. Von Bedeutung ist hier, dass die Pertoration reversibel ist, so dass die Zelle nicht dauerhaft geschädigt wird, sondern wiederholt aktiviert werden kann.
Die Erzeugung geeigneter Schallsignale kann dabei entweder durch Schallwandler, gegebenenfalls fokussiert, geschehen, oder indem man eine Trägerplatte in geeignete Schwingungen versetzt. Auch eine Rotation ist denkbar, wobei sich ähnlich wie bei Schiffsschrauben an den Kanten die Kavitation ausbildet.
Eine alternative Möglichkeit der Aktivierung der probensensitiven Komponente 202 stellt die Bestrahlung derselben mit Laserlicht dar. Auch das Laserlicht kann eine Pertoration der Membran bewirken, ohne dabei die Zelle dauerhaft zu schädigen. Das Laserlicht kann mittels geeigneter On-Chip-Laser erzeugt oder alternativ durch Glasfasern vor Ort gebracht werden.
Handelt es sich bei der probensensitiven Komponente 202 um Moleküle wie Enzyme, Antikörper oder dergleichen, die mit den zu erkennenden Stoffen reagieren, so kann mittels geeigneter Schallsignale oder einer Laseraktivierung ein Aufbrechen von chemi schen Bindungen bzw. eine Umformung von Molekülstrukturen zu einer Aktivierung der probensensitiven Komponente 202 führen.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform kann zur Übertragung der physikalischen Aktivierungsenergie 214 ein flexibles Leistungsübertragungssystem verwrendet werden, das sowohl optische Signale als auch Ultraschall und Laserstrahlung leiten kann, wie dies beispielsweise in der DE 4432666C2 gezeigt ist. Hier kann die Aktivierungsenergie zusammen mit dem eigentlichen optischen Signal zum bzw. vom Messort innerhalb einer einzigen Leitung transportiert werden.
Eine weitere Möglichkeit der Zuführung physikalischer Aktivierungsenergie stellt die Einstrahlung von Mikrowellenstrahlung dar.

Claims

Verfahren zum Erfassen eines Probenmaterials durch eine biologische und/oder biochemische Erkennungsreaktion zwischen dem Probenmaterial und einem probensensitiven Material, dadurch gekennzeichnet, dass das probensensitive Material mittels einer physikalischen Energieübertragung für die Erkennungsreaktion aktiviert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Energieübertragung durch Einwirkung von elektromagnetischen Wellen erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetischen Wellen durch einen Laser erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Energieübertragung durch Einwirkung von mechanischen Kräften erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Energieübertragung durch die Einwirkung akustischer Stoßwellen erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische und/oder biochemische Erkennungsreaktion ein optisches Signal erzeugt, das von einem Messwandler in ein Messsignal umgewandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal über einen Lichtwellenleiter empfangen und weitergeleitet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtwellenleiter so ausgebildet ist, dass er weiterhin akustische Stoßwellen leitet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal eine Lumineszenzlichtstrahlung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das probensensitive Material immobilisierte Zellen, die mit dem Probenmaterial reagieren, aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das probensensitive Material immobilisierte Moleküle, die mit dem Probenmaterial reagieren, aufweist.
Biosensor zum Erfassen eines Probenmaterials durch eine biologische und/oder biochemische Erkennungsreaktion zwischen dem Probenmaterial (204) und einem probensensitiven Material (202), wobei der Biosensor (200) einen Messwandler (208), der zum Erzeugen eines Messsignals (210) in Abhängigkeit von der biologischen oder biochemischen Erkennungsreaktion mit dem probensensitiven Material (202) koppelbar ist, aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor (200) eine Aktivierungsvorrichtung (212) zur Aktivierung des probensensitiven Materials (202) mittels einer physikalischen Energieübertragung (214) aufweist.
Biosensor nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierungseinrichtung (212) so ausgebildet ist, dass sie elektromagnetische Wellen zur Aktivierung des probensensitiven Materials (202) aussendet.
Biosensor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetischen Wellen durch einen Laser erzeugt werden.
Biosensor nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierungseinrichtung (212) so ausgebildet ist, dass sie das probensensitive Material (202) mittels mechanischer Kräfte aktiviert.
Biosensor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die mechanischen Kräfte durch akustische Stoßwellen erzeugt sind.
Biosensor nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische oder biochemische Erkennungsreaktion ein optisches Signal erzeugt, das von dem Messwandler (208) in ein Messsignal (210) umwandelbar ist.
Biosensor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierungseinrichtung (212) ein akustischer Stoßwellengenerator ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische oder biochemische Erkennungsreaktion ein optisches Signal erzeugt, das von dem Messwandler (208) erfassbar ist.
Biosensor nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Messwandler (208) einen Lichtwellenleiter zum Empfangen und Weiterleiten des optischen Signals aufweist.
Biosensor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtwellenleiter so ausgebildet ist, dass er weiterhin akustische Stoßwellen leitet.
Biosensor nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal eine Lumineszenzlichtstrahlung ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 12 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das probensensitive Material (202) immobilisierte Zellen, die mit dem Probenmaterial reagieren, aufweist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 12 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das probensensitive Material (202) immobilisierte Moleküle, die mit dem Probenmaterial reagieren, aufweist.