DE10224171A1

DE10224171A1 - Pharmazeutische Zusammensetzung, die Arsentrioxid und mindestens eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure umfaßt

Info

Publication number: DE10224171A1
Application number: DE10224171A
Authority: DE
Inventors: Sandra Andrea Sturlan; Thomas Bachleithner-Hofmann; Erich Roth
Original assignee: Fresenius Kabi Austria GmbH
Current assignee: Fresenius Kabi Austria GmbH
Priority date: 2002-05-31
Filing date: 2002-05-31
Publication date: 2003-12-18
Also published as: AU2003232834A1; WO2003101470A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Arsentrioxid und mindestens eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure umfassen. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Arsentrioxid und mindestens einer langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäure zur therapeutischen Behandlung einer malignen Entartung, insbesondere zur Behandlung von Leukämie, promyelocytischer Leukämie, sekundär resistenter promyelocytischer Leukämie und/oder primär resistenter Leukämie oder zur Behandlung eines soliden Tumors, wie eines Leber- oder Nieren-Karzinoms.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die Arsentrioxid und mindestens eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure umfassen. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung entsprechender Zusammensetzungen zur Behandlung von Leukämie, insbesondere zur Behandlung von promyelocystischer Leukämie, primär oder sekundär resistenter Leukämie und von soliden Tumoren.
Leukämie ist eine bösartige Erkrankung der weißen Blutkörperchen, die durch klonale Proliferation unreifer hämatopoetischer Stammzellen gekennzeichnet ist. Die promyelocytische Leukämie ist die Leukämieform, welche die besten Heilungschancen besitzt. Als besonders erfolgreiches Mittel zur Behandlung dieser Leukämieform hat sich die all-trans-Retinsäure (ATRA) gezeigt, mit der bei einem hohen Prozentsatz der Patienten die Krankheitssymptome vollständig zurückgehen. Darunter wird der Zeitpunkt verstanden, zu dem nicht nur die sichtbaren leukämischen Zellen aus dem Knochenmark entfernt sind, sondern auch sichtbare Krankheitszeichen des Blutes nicht mehr feststellbar sind.
In der Literatur wird allerdings darauf hingeweisen, dass auch nach einem völligen Verschwinden der Krankheitssymptome keine Gewissheit besteht, dass keine Rückfälle auftreten. Rückfälle treten vor allem dann auf, wenn die Retinsäurebehandlung als Aufrechterhaltungstherapie angewendet wurde. Häufig ist dann eine Resistenz bei der Anwendung einer zweiten ATRA-Induktionstherapie festzustellen (vgl. Delva L. et al., Blood 82, (1993), 2175-81).
Klinische Studien in China zeigten jedoch auf, dass man die akute promyelocytische Leukämie auch bei Rückfällen nach einer Retinsäuretherapie, erfolgreich behandeln kann, wenn für die Behandlung Arsentrioxid eingesetzt wird. Das gilt auch dann, wenn bereits eine Resistenz gegenüber Retinsäure festzustellen ist (Chen, G. Q., et al., Blood 89, (1997) 3345-53). In dieser Arbeit wurde anhand von in vitro Versuchen gezeigt, dass sowohl primäre Zellen der akuten promyelocytischen Leukämie (APL) und ATRA-empfindliche NB₄-Zellen, als auch Retinsäure- resistente MR₂-Subklon Zellen erfolgreich mit Arsentrioxid behandelt werden können.
Es wurden dabei zwei dosisabhängige Wirkungen auf APL-Zellen festgestellt. Bei relativ hohen Konzentrationen (0,5 bis 2,0 µMol/L) war Apoptose zu beobachten. Bei niedrigeren Konzentrationen (0,1 bis 0,5 µMol/L) trat teilweise eine Differenzierung der APL-Zellen auf, welche durch direkte Einwirkung von Arsentrioxid und nicht durch Apoptose zum Zelltod führte. Es wird davon ausgegangen, dass in vivo sowohl Apoptose als auch eine teilweise Differenzierung stattfindet, die in den ersten 2-3 Wochen der Behandlung im Zelltod endet. Die Kombination beider Effekte wird als mögliche Ursache der klinischen Wirksamkeit der Behandlung von APL-Patienten mit Arsentrioxid gesehen.
Soignet, S. L. et al (New England Journal of Medicine 339, (1998) 1341-1348) beschreiben in ihrer Arbeit die Ergebnisse einer Arsentrioxid-Behandlung bei 11 Patienten, die alle einen oder mehrere Rückfälle nach einer oder mehrerer Behandlungen mit all-trans Retinsäure, einem Anthracyclin Antibiotikum und Cytarabin erlitten hatten. Die Patienten erhielten 0,06 bis 0,2 mg/kg Körpergewicht Arsentrioxid, was bei einem Patienten mit 70 kg Körpergewicht (KG) einer Menge von 4,2 mg bis 14 mg/Tag entspricht.
Zwei der Patienten waren Kinder, deren Dosierung 0,18 bzw. 0,17 mg/kg/Tag betrug. In allen 11 Fällen konnte innerhalb von 12-39 Tagen ein völliges Abklingen der Krankheitssymptome des Knochenmarkes erzielt werden.
Allerdings waren weitere Krankheitssymptome im Blut, wie z. B. die Wiederherstellung der Blutleukozyten und der Zahl der Blutplättchen zu diesem Zeitpunkt noch nicht beseitigt. Dafür wurde mindestens eine weitere Medikationsperiode mit Arsentrioxid benötigt, bei der generell eine Dosis von 0,15 mg/kg/Tag verabreicht wurde, was bei einem Körpergewicht von 70 kg einer Menge von 10,5 mg/Tag entspricht.
Nach 2 Medikationsperioden waren 8 von 11 Patienten im Test negativ hinsichtlich des PML- RAR-alpha Fusionsgen. Alle der 11 Patienten, die eine komplette Remission zeigten erhielten mindestens noch eine Medikationsperiode mit Arsentrioxid.
Die drei der Patienten, die noch nicht negativ waren, erlitten jedoch in der zweiten zusätzlichen Medikationsperiode einen Rückfall. Sie waren im Zuge der Behandlung nie negativ gewesen, und alle drei schienen eine Resistenz gegenüber den verabreichten Medikamenten entwickelt zu haben. Zwei dieser Patienten sind inzwischen gestorben.
In diesem klinischen Versuch wurde die Arsentrioxid-Dosis vorsichtig gewählt, da bei dieser Substanz im Hinblick auf deren Toxizität mit Nebenwirkungen zu rechnen ist. Soignet et al. stellten fest, dass die Nebenwirkungen bei ihrem Dosierungsschema relativ mild waren. Es wurden u. a. Hautausschlag, Verwirrtheit, Ermüdung und Muskelschmerzen festgestellt.
Bei jenem Patienten, der als einziger die tägliche Dosis von 0,20 mg/kg KG/Tag erhalten hatte, wurde eine spezifische Reaktion auf der Haut festgestellt. Auf der anderen Seite dauerte jedoch die Behandlung ziemlich lange, was wiederum zu einer höheren Arsentrioxid- Belastung führte, da diese Substanz während der Behandlung nicht abgebaut wird, sondern kumuliert, und es dann doch zu schweren Nebenwirkungen kommen kann. Bei Versuchen, die Dosierung auf mehr 0,20 mg/kg KG/Tag zu erhöhen, wurden schwere Nebenwirkungen, wie schwache Paralyse und Nierenversagen, beobachtet. Die höchstmögliche Dosis ist 30 mg/Tag. Diese Dosis ist jedoch nur im Notfall zu vertreten, da schwere Nebenwirkungen nicht nur auf die Niere sondern auch auf das Herz auftreten können.
Auch die mögliche Verwendung von Arsentrioxid für die Therapie anderer Krebsarten wurde bereits untersucht, beispielsweise die Verwendbarkeit zur Bekämpfung fester, maligner Tumore, z. B. der Prostata, der Niere, des Gebärmutterhalses und der Blase. Der Review von Murgo et al. (The Oncologist 2001, 6 (Suppl. 2), 22-28) stellt fest, dass bereits in mehreren US-Kliniken klinische Untersuchungen der Wirksamkeit auf eine Reihe von Krebserkrankungen vorgenommen werden.
Gegen Ende der 80iger Jahre wurde festgestellt, dass mehrfach ungesättigte Fettsäuren auf Tumorzellen zytotoxisch wirken. Diese Feststellung erweckte großes Interesse, da es sich hierbei um ein relativ nicht-toxisches Verfahren der Krebsbekämpfung handeln könnte. Es wurden daher eine Reihe von klinischen Untersuchungen an verschiedenen Krebsformen durchgeführt, besonders eingehend waren Untersuchungen betreffend Patienten mit Pankreaskarzinom, insbesondere solche mit schwerer Cachexie.
In einer von Barber und Fearon (Lipids 36 (2001) 347-351) durchgeführten Studie wurde Patienten mit Pancreaskarzinomen und Cachexie täglich 9-27 g Eicosapentaensäure (EPA) in Form einer 20%igen Öl-in-Wasser-Diester-Emulsion oral verabreicht. Die initial Dosis der Studienmedikation betrug 25 ml. Soweit die Verträglichkeit gegeben war wurde die Dosis in einem 2-wöchigem Interval auf 50 ml, 100 ml und schliesslich 200 ml erhöht. Die Ergebnisse der Studie zeigten eine generell gute Verträglichkeit der Studienmedikation, wobei zwei Patienten maximal 100 ml, ein Patient maximal 150 ml und zwei weitere Patienten maximal 200 ml tolerierten. Dosislimitierende Ereignisse waren Völlegefühl, Übelkeit, abdominale Schmerzen und Steatorrhoe. Diese Nebenwirkungen klangen nach einer Dosisreduktion ab. Alle Patienten tolerierten eine reduzierte Dosis über einen längeren Zeitraum und setzten die Therapie nach Abschluss der Studie fort. Die EPA Konzentration im Plasma und die EPA Aufnahme in die Mebranen der Erythrozyten stieg im Studienzeitraum an. Eine einedeutige Korrelation war jedoch nicht nachweisbar, was von den Autoren auf die geringe Patientenzahl zurückgeführt wurde.
In einer Arbeit von Falconer, J. et al. (British Journal of cancer 69 (1994) 826-832) wurde die Wirkung von verschiedenen gesättigten Fettsäuren auf Zellinien, nämlich Mia-Pa-Ca-2, PANC-1 und CFPAC, bei Konzentrationen von 1,25 µM bis 50 µM untersucht. Die Fettsäuren, mit denen diese Untersuchungen durchgeführt wurden, waren Laurinsäure, Stearinsäure, Palmitinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Alpha-Linolensäure, Gamma-Linolensäure (GLA), Arachidonsäure, Docosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure. Das Ergebnis zeigte, dass alle mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren das Zellwachstum hemmten, während einfach ungesättigte Fettsäuren und gesättigte Fettsäuren das Zellwachstum nicht hemmten. Palmitinsäure, Laurinsäure und Ölsäure zeigten sogar eine siginifikante Erhöhung des Wachstums der drei untersuchten Zelllinien.
Von den mehrfach ungesättigten Fettsäuren war die Eicosapentaensäure (C 20; -5- (5, 8, 11, 14, 17) - 3n) mit über 90% Reduktion an lebensfähigen Zellen bei den Mia-Pa Ca-2 Zellen und der höchsten Testkonzentration von 40 µM am wirksamsten. Sehr gut war auch die Wirkung der Gamma-Linolensäure auf die gleiche Zellinie. Hier betrug die Reduktion der lebensfähigen Zellen etwas mehr als 88% bei der höchsten Testkonzentration. Es wird davon ausgegangen, dass die Wirkung der mehrfach ungesättigten Fettsäuren auf eine Lipidperoxidation zurückzuführen ist. Dies wird auch dadurch bestätigt, dass die Eicosapentaensäure in Gegenwart von Vitamin-E keine hemmende Wirkung auf die Zellinien ausübt und unter Einwirkung von Vitamin-E keine Lipidperoxidation zu verzeichnen war.
In dieser Arbeit wurde auch den ungesättigten Fettsäuren alpha-Linolensäure, Linolsäure und Arachidonsäure eine geringe Hemmwirkung auf die drei Pancreas-Zellinien zugeschrieben.
Hawkins. R. A., et al. beschrieben ebenfalls Versuche an den gleichen Pancreas Carcinom- Zellinien (Journal of Pathology 185 (1998) 61-70), untersuchten jedoch auch die Wirkung auf eine Leukämie-Zellinie, nämlich HL-60. Die Ergebnisse bestätigten die zytotoxische Wirkung mehrfach ungesättigter Fettsäuren und die damit verbundene Lipid-Peroxidation. Hinsichtlich der Wirkungsstärke wurden jedoch Unterschiede zu den Ergebnissen anderer Autoren beobachtet. So ist z. B. bei Hawkins et al. (1998) die Arachidonsäure die am stärksten zytotoxisch wirkende Fettsäure (mit Ausnahme der cis-Parinarsäure).
Eine Übersichtsdarstellung der Untersuchungen zur möglichen Wirkung mehrfach ungesättigter Fettsäuren bei der Krebsbekämpfung findet sich in der umfangreichen, zusammenfassenden Arbeit von Jiang et al. (Critical Reviews in Oncology/Hematology 27, (1998), 179-209). Die hemmende Wirkung der Fettsäuren wurde auf Krebszellen einer Reihe von Krebsarten in vitro getestet, wobei die Wirkungsweise sehr genau untersucht wurde. Die Fettsäuren, die dieser ausgedehnten Prüfung zugrunde gelegt wurden, waren die Gamma-Linolensäure (n6), die Dihomo-gamma-Linolensäure (n6), die Eicosapentaensäure (n3) und die Docosahexaensäure (n3). Die alpha-Linolensäure, die Linolsäure und die Arachidonsäure wurden jedoch wegen schwankender Wirkungen in die eingehenden Untersuchungen nicht einbezogen.
Diese Arbeiten zeigen deutlich, dass noch immer ein großer Bedarf an verbesserten pharmazeutischen Zusammensetzungen besteht, welche für die Therapie von malignen Entartungen geeignet sind. Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, verbesserte pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, welche für die Therapie von malignen Entartungen geeignet sind.
Diese Aufgabe wurde nunmehr durch pharmazeutische Zusammensetzungen gelöst, welche Arsentrioxid und mindestens eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure umfaßt.
Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt, dass eine Kombination aus Arsentrioxid und langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren synergistische wachstumshemmende Wirkungen auf entartete Zellen, beispielsweise auf APL-Zellinien, zeigen. Die beobachteten Wirkungen gehen über die Summe der Wirkungen der Bestandteile der Kombination hinaus und beruhen somit auf einer überraschenden synergistischen Wirkung der beiden Stoffe. Die erfindungsgemäße Kombination besitzt eine ausgeprägte zytotoxische Wirkung, welche ohne Erhöhung der Arsentrioxid-Dosis einen rascheren und umfangreicheren Zelltod herbeiführt. Die erfindungsgemäße Kombination erlaubt eine wesentlich kürzere Medikationszeit und verringert damit die Gefahr der Resistenzbildung, die Gefahr eines Rückfalles und/oder die Zahl und das Ausmaß der Nebenwirkungen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfaßt mindestens eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure, selbstverständlich sind somit auch Kombinationen von zwei oder mehreren verschiedenen langkettigen ungesättigten Fettsäuren umfaßt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können die im Stand der Technik bekannten langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen. Vorzugsweise weisen die Fettsäuren mindestens 18 C-Atome und mindestens zwei Doppelbindungen auf. Die maximale Länge der Ketten beträgt vorzugsweise 35 C-Atome, wobei Fettsäuren mit einer Kettenlänge von 18 bis 28 C-Atomen besonders bevorzugt sind. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung weisen die Fettsäuren mindestens drei Doppelbindungen auf, die der n-3 oder der n-6 Reihe angehören können. Die Fettsäuren können dabei in beliebiger Form vorliegen, beispielsweise als freie Fettsäure, Salz oder Ester mit ein- oder mehrwertigen Alkoholen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die pharmazeutische Zusammensetzung mindestens eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure mit mindestens 18 C-Atomen und mindestens drei Doppelbindungen, die der n-3 oder n-6 Reihe angehören, und liegt in Form der freien Fettsäuren, von Salzen oder von Estern mit ein- oder mehrwertigen Alkoholen vor. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfaßt demgemäß vorzugsweise Gammalinolensäure, Dihomo-gamma-Linolensäure, Eicosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure.
Die Wirkstoffe liegen in der pharmazeutischen Zusammensetzung in einer Konzentration vor, die eine das Tumorwachstum-hemmende Wirkung verursacht. Die genaue Konzentration hängt dabei von der Art der verwendeten Fettsäure und der geplanten Indikation ab und ist vom Fachmann durch im Stand der Technik übliche Versuche ohne weiteres ermittelbar.
Die Tagesdosis des Arsentrioxid beträgt üblicherweise maximal 30 mg. Bei dieser Dosis ist jedoch bereits mit Nebenwirkungen für den Patienten zu rechnen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise eine Arsentrioxid Tagesdosis von 5 bis 15 mg verabreicht. Bei dieser Dosierung ist sichergestellt, dass man einem Patienten im Bedarfsfall auch 2 Infusionen, also die zweifache Tagesdosis, verabreichen kann.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist üblicherweise so formuliert, dass Fettsäuren in einer Menge von 100 mg bis 30.000 mg pro 5 bis 15 mg Arsentrioxid verabreicht werden können.
Gammalinolensäure n-6, und/oder Dihomo-gamma-Linolensäure n-6 können beispielsweise in einer Menge von 100 mg bis 30.000 mg pro 5 bis 15 mg Arsentrioxid vorliegen. Eicosapentaensäure n-3, Docosahexaensäure n-3 oder eine Mischung der beiden Fettsäuren können in einer Menge von 140 mg bis 1500 mg pro 5 bis 15 mg Arsentrioxid vorliegen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die pharmazeutische Zusammensetzung ein Gemisch aus Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure. Vorzugsweise liegen die Stoffe in Form eines Fischöles mit einem Gehalt an Eicosapentaensäure von 1,25 bis 2,82 g, und einem Gehalt an Docosahexaensäure von 1,44 bis 3,09 g pro 10 g Fischöl vor.
Das Fischöl kann beispielsweise als Bestandteil einer Emulsion zu einem Arzneimittel formuliert werden. Die Konzentration des Fischöls in der Emulsion kann im Bereich von 0,5 bis 20 Gew.-% liegen, wobei ein Bereich von 5 bis 15 Gew.-% bevorzugt ist. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Emulsion 10 g Fischöl pro 100 ml Fertigprodukt (also 10 Gew.-%).
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können mittels beliebiger, im Stand der Technik bekannter Verfahren zu einer verabreichungsfertigen Zusammensetzung formuliert werden. Je nach Art der Formulierung (Infusionslösung, Weichgelatine-Kapsel, etc.) kann die pharmazeutische Zusammensetzung ferner übliche pharmazeutische Hilfs- und Trägerstoffe enthalten. Vorzugsweise ist die pharmazeutische Zusammensetzung als Infusionslösung formuliert.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um eine Infusionslösung, vorzugsweise in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion, deren wässrige Phase das Arsentrioxid enthält, während die langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure in der Ölphase vorliegt. Die Fettsäure kann in der Ölphase beispielsweise in Form von Triglyceriden vorliegen.
Entsprechende Emulsionen können in Verfahren hergestellt werden, die Schritte umfassen, in denen man das Arsentrioxid in verdünnter Lauge auflöst und durch Rühren zu einer klaren Lösung verarbeitet. Anschließend kann man dieser Lösung einen physiologischen oder nicht- physiologischen Lösungsvermittler zusetzen und fein verteilen. Man rührt die Ölphase mit einem Gehalt an Triglyceriden, einer oder mehrerer der langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren ein und emulgiert, vorzugsweise in mehreren Zyklen. Schließlich wird der pH- Wert der Emulsion auf einen leicht basischen pH-Wert eingestellt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfassen diese Verfahren Schritte, bei denen man das Arsentrioxid in verdünnter Natronlauge auflöst und durch Rühren zu einer klaren Lösung verarbeitet, dieser Lösung ein Ei- oder Sojaphosphatid als Emulgator zustzt und fein verteilt. Die Ölphase mit einem Gehalt an Triglyceriden, einer oder mehrerer der langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren wird eingerührt und in mehreren Zyklen emulgiert, bevor der pH Wert der Emulsion auf 8,7-8,8 eingestellt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Arsentrioxid und mindestens einer langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäure zur therapeutischen Behandlung einer malignen Entartung. Dabei können Arsentrioxid und die langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren als Teil einer Zusammensetzung oder in Form von zwei verschiedenen Zusammensetzungen gleichzeitig oder in einem kurzen zeitlichen Abstand verabreicht werden.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Arsentrioxid und mindestens einer langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäure zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung einer malignen Entartung.
Die für die erfindungsgemäße Verwendung eingesetzten Wirkstoffe entsprechen in Art und Konzentration den Wirkstoffen die in den bereits beschriebenen erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten sind. Vorzugsweise umfaßt die Verwendung eine Verabreichung einer der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen.
Die Verwendung von Arsentrioxid und mindestens einer langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäure zur therapeutischen Behandlung einer malignen Entartung wird vozugsweise zur Behandlung von Leukämie, promyelocytischer Leukämie, sekundär resistenter promyelocytischer Leukämie und/oder primär resistenter Leukämie oder eines soliden Tumors, beispielsweise eines Leber- oder Nieren-Karzinoms eingesetzt. Die Behandlung kann therapeutisch oder prophylaktisch sein und umfaßt auch eine Behandlung zur Hemmung der Metastasen-Bildung.
Die synergistische Wirkung der erfindungsgemäßen Kombination kann in einer Zellproliferationsanalyse an menschlichen leukämischen HL-60-Zellen und an K562-Zellen aufgezeigt werden. Um zu zeigen, dass die Wirkung des Kombinationspräparates selektiv Krebszellen abtötet, gesunde Zellen jedoch kaum oder gar nicht beeinträchtigt, wurden auch menschliche Fibroblastzellen dem Test unterworfen. Ferner wird an HL-60 Zellen auch ein Apoptose-Analyse beschrieben.

BEISPIEL 1

In vitro Zell-Proliferationsanalyse

Menschliche Leukämie-Zellen HL-60 und K562 wurden in RPMI 1640 als Medium kultiviert, das mit 10% fötalem Kälbserum versetzt wurde. Normale menschliche Haut-Fibroblast- Zellen (CCD-32 Sk), erhalten von American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) wurden DMEM (= Dulbecco's modified Eagle's Medium) mit 10% Fetal calf serum aufgezüchtet. Die Zellen wurden bei 37°C, mit 95% Feuchtigkeit und 5% CO₂-Atmosphäre gehalten.
K562 Zellen (1 × 10⁴ pro Vertiefung) und HL-60 Zellen (2 × 10⁴ pro Vertiefung) wurden doppelt in Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen im kompletten Medium enthaltend 25 µM bis 75 µM Fettsäuren mit oder ohne 1 µM Arsentrioxid (Trisenox) in einem Endvolumen von 200 µl pro Vertiefung kultiviert. Zellen, die in Gegenwart des Mediums allein oder mit 1 µM Arsentrioxid kultiviert wurden, dienten als Kontrollen. Menschliche Haut-Fibroblastenzellen wurden in Flachboden Microplatten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 5 × 10³ Zellen pro Vertiefung in 200 µl des kompletten Mediums 24 Stunden vor dem Wechsel des Mediums zu einem solchen enthaltend entweder Arsentrioxid oder Fettsäuren oder die Kombination von Arsentrioxid und Fettsäuren in der oben beschriebenen Konzentration angesät.
Das Maß der Proliferation wurde nach 24 und 48 Stunden durch den colorimetrischen "Easy for You Kit" (EZ4U, Biomedica, Wien, Österreich) gemessen. Diese Methode verwendet Tetrazoliumsalze als Indikatoren der Zell-Lebensfähigkeit. Das Enzym Dehydrogenase der Mitochondrien lebensfähiger Zellen reduziert gelbes Tetrazoliumsalz in ein intensiv rot gefärbtes Formazan. Die Zellen bleiben bei diesem Vorgang intakt und das wasserlösliche Formazanderivat verteilt sich zurück in dem Kulturmedium. Die Farbintensität korreliert mit der Menge an lebensfähigen Zellen in der Probe. Die Analyse wurde entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Absorption der Probe wurde spektrophotometrisch mit einem Microplate Reader 5000 (Dynatech Laboratories Inc. Chantilly, VA) bei 450 nm gemessen.
Wie aus oben angeführten Tabellen ersichtlich, wurde die Zellproliferation von HL-60 Zellen durch Zugabe von 1 µM Arsentrioxid auf 85,8% reduziert. Zugabe von 25 µM DHA allein reduzierte die Zellproliferation auf 69,2%. Wurden beide Substanzen kombiniert, reduzierte sich die Zellproliferation auf 13,0%, also auf etwa ein Fünftel des Wertes bei 25 µM DHA allein. Bei 50 µM DHA konnte in der Kombination mit Arsentrioxid die Zellproliferation von 28,0% auf 7.3% reduziert werden, was etwa einem Viertel des Ausgangswertes entspricht. Für GLA waren Hemmwerte von 83,3% auf 38,8% (bei 25 µM) sowie von 71,2% auf 16,1% (bei 50 µM) zu erreichen.
Bei K562 Zellen konnte für DHA kein nennenswerter Synergismus mit Arsentrioxid beobachtet werden, da DHA bereits bei 25 µM das Zellwachstum auf 37,3% des Ausgangswertes reduzieren konnte. Zugabe von Arsentrioxid bewirkte lediglich eine wietere Reduktion der Zellproliferation auf 32,9%. Für GLA hingegen war auch bei K562 Zelle ein deutlicher Synergismus zu beobachten, mit Hemmung des Zellwachstums von 103,9% auf 53% (bei 25 µM), 83,9% auf 41,8% (bei 50 µM) sowie von 70,4% auf 39,3% (bei 75 µM).
Um die Tumor-Selektivität der Kombination von Arsentrioxid und mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu verifizieren, wurden zusätzlich zu den Tumorzelilinien HL-60 und K562 auch normale humane Fibroblasten getestet. Wie aus der oben gezeigten Tabelle ebenfalls ersichtlich ist, wurde das Wachstum der Fibroblasten auch bei Kombination von Arsentrioxid mit 75 µM beider Fettsäuren nicht nennenswert gehemmt. Allgemein kann man damit sagen, dass bei normalen Zellen keine nennenswerte Hemmung des Zellwachstums auftritt.

BEISPIEL 2

Bestimmung der Zellproliferation mittels (methyl ³H)-Thymidin Inkorporation

HL-60 Zellen (2 × 10⁴ pro wells) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen in 200 µl RPMI- 1640 und 10% fötalem Kälberserum mit As₂O₃ (1 µM) oder DHA (25 µM) allein oder in Kombination der beiden Wirkstoffe kultiviert. Als Kontrolle wurden HL-60 Zellen in RPMI- 1640 und 10% fötalem Kälberserum allein kultiviert.
Nach 48 Stunden wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mittels einer Methyl³H-Thymidin- Inkorporationsanalyse bestimmt, indem die "counts per minute" (cpm) registriert wurden. Diese bewegten sich auf einer Skala zwischen 100.000 und 100 cpm. Hierbei belief sich die Proliferation der unbehandelten Zellen auf 65233 ± 2791 cpm. Wurden 1 µM Arsentrioxid bzw. 25 µM DHA allein zugegeben, wurde die Zellproliferation auf 35862 ± 1293 cpm bzw. 30454 ± 792 cpm reduziert. Bei Kombination beider Substanzen war schließlich ein dramatischer Abfall der Zellproliferation auf 144 ± 26 cpm zu verzeichnen.
Die Kombination von GLA und 1 µM As₂O₃ zeigte eine gestufte Wirkung je nach dem eingesetzten GLA Gehalt. GLA ist weiters bemerkenswert, da sie gegenüber bestimmten malignen Erkrankungen wie z. B. Krebserkrankungen der Leber, eine besondere Selektivität entwicklet.
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die erfindungsgemäße Kombination der beiden Wirkstoffe eine ausgeprägte synergistische Wirkung aufweist, welche die Heilungschancen bei der Behandlung maligner Entartungen mittels der erfindungsgemäßen Kombinationstherapie dramatisch verbesert. Dies gilt insbesondere für die sekundär resistenten promyelocytischen Leukämien, aber auch bei anderen Leukämieformen und auch bei soliden Tumoren, insbesondere bei Pancreas-Carcinom-Formen.
Bei der klinischen Anwendung der erfindungsgemäßen Kombination ist es bevorzugt, dass die Dosen der Fettsäuren der Charakteristik der Wirkung angepaßt werden. 5 bis 15 mg Arsentrioxid als Tagesdosis ist eine an sich übliche Dosis, bei der, mit Ausnahme von empfindlichen Patienten, mit allzu starken Nebenwirkungen durch die Arsenmedikation nicht gerechnet werden muss. Bei der Dosis von 100 mg bis 30 000 mg pro Tag für die Fettsäure ist es hingegen zu empfehlen, deren Dosis der unterschiedlichen Wirkungsweise der zu verwendenden Fettsäuren anzupassen. Handelt es sich um die stark wirkenden n-3-Fettsäuren, die Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA), ist eine Fettsäuremenge von 100 mg bis 1500 mg pro Tag zu bevorzugen, da im Normalfall bei Mengen über 1500 mg keine besondere Wirkungssteigerung zu erwarten ist. Dies trifft vor allem bei der akuten promyelocytischen Leukämie zu, wie die Tests an HL-60 und K 562-Zellen gezeigt haben. Bei schwer behandelbaren Fällen ist es eher zu empfehlen, die Dauer der Medikation zu verlängern. Hingegen ist bei Einsatz der beiden n-6 Fettsäuren, insbesondere der Gamma- Linolensäure, auf 5-15 mg Arsentrioxid als Tagesdosis 100 mg bis 3000 mg dieser Fettsäure einzusetzen, wobei in Fällen eines schlechten Ansprechens auf diese Medikation sogar eine Erhöhung der Gamma-Linolensäure auf über 3000 mg hinaus stattfinden kann. Hingegen soll auch in solchen Fällen die Menge an Arsentrioxid nicht erhöht werden, da die Dosis von 10 mg bis 15 mg bereits im oberen Bereich der empfohlenen Menge liegt.
Auf diese Weise kann vermieden werden, dass die kumulierte Arsentrioxidmenge unnötig hoch ansteigt. Bei soliden Tumoren, bei denen klinische Untersuchungen im Gange sind, können sich andere Empfehlungen hinsichtlich der Dosis ergeben. So hat z. B. Hawkins et al. (1998) in der oben zitierten Arbeit bei in vitro Tests an der Pancreas-Karzinom-Zelllinie Mia- Pa-Ca-2 bei einer Dosis von 5 µM in Platten enthaltend 5 × 10³ cells/Vertiefung nach 50 Stunden Prozent Zelltod ermitteln können, die bei der Zellinie HL-60 im gleichen Test unter gleichen Bedingungen, jedoch der vierfachen Dosis der Fettsäuren und einer Dauer von 25 Stunden ebenso erhalten wurden.
Das erfindungsgemäße Mittel kann intravenös und auch peroral, vor allem nach einer Primärtherapie oder im Zuge von Nachbehandlungen, verabreicht werden. Die mehrfach ungesättigten Fettsäuren können als solche, als Salze oder als Ester mit ein- oder mehrwertigen Alkoholen eingesetzt werden. Hierbei werden die freien Fettsäuren in seltenen Fällen, am ehesten bei oral zu verabreichenden Präparaten, verwendet. Besser ist jedoch auch bei oraler Verabreichung der Einsatz von Salzen, z. B. des Li-Salzes oder einer Öl-in-Wasser- Diester-Emulsion (Fearon et al 2001). Für die intravenöse Verabreichung werden, allein schon wegen der Löslichkeit, in erster Linie Ester dieser Fettsäuren eingesetzt, wobei den Estern mit zwei oder mehrwertigen Alkoholen, insbesondere mit Glycerin, der Vorzug gegeben wird.
Für die Verabreichung, vor allem von Arsenpräparaten, ist die Infusion die am meisten verwendete Anwendungsform. Diese wird auch für die Anwendung des erfindungsgemäßen Mittels besonders bevorzugt, wobei sich besonders eine Öl in Wasser Emulsion zur Verabreichung eignet, in der das Arsentrioxid in der wässrigen Phase, die Fettsäure-Ester in der Ölphase enthalten sind.
Die gemäß vorliegender Erfindung einzusetzenden, mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind auch Bestandteile natürlich vorkommender Öle. So kommen die gamma-Linolensäure und die Dihomo-gamma-Linolensäure als Triglyceride in pflanzlichen Ölen vor, während die Eicosapentaensäure und die Docosahexaensäure in Fischölen zu finden sind. Solche Öle können, sofern diese die erfindungsgemäß angewendeten Fettsäuren in größeren Mengen enthalten, für die Herstellung von Öl-in-Wasser-Emulsionen eingesetzt werden.
Fischöle sind dann für die Herstellung eines Infusionspräparates geeignet, wenn sie diese beiden n-3-Fettsäuren in etwa 2,7 g bis 6,0 g pro 10 g Fischöl enthalten. Bevorzugt sind solche Fischöle, die die Docosahexaensäure in einer Menge von 1,44-3,09 g pro 10 g Fischöl und die Eicosapentaensäure in einer Menge von 1,25-2,82 g pro 10 g Fischöl enthalten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Infusionspräparaten zur Behandlung von sekundär resistenter promyelocytischer Leukämie, primär resistenter Leukämie und von soliden Tumoren, gemäß dem das Arsentrioxid in verdünnter Natronlauge aufgelöst und durch Rühren zu einer klaren Lösung verarbeitet wird, worauf die Ölphase mit einem Gehalt an Triglyceriden einem oder mehreren Zyklen der Emulgierung unterworfen und die Emulsion auf pH 8,7-8,8 eingestellt wird.

Herstellungsbeispiel 1

10 mg Arsentrioxid wurden in 200 l in 1 N Natriumhydroxidlösung unter Rühren aufgelöst. Die so erhaltene Lösung wurde dann anschließend zusammen mit 2,5 g Glycerin und 0,028 g Ölsäure in etwa 50 ml Wasser ad inj., eingetragen, das zuvor unter Stickstoffatmosphäre und unter Rühren auf 60°C erwärmt worden war. Die so erhaltene Mischung wurde unter Beibehaltung der Stickstoffatmosphäre weiter so lange gerührt, bis eine klare Lösung entstanden war. Diese wurde dann über ein steriles Filter (0,2 µM) in ein anderes Reaktionsgefäß übergeführt. Unter weiterem Rühren wurde in diese Lösung 1,2 g Eilezithin in Portionen eingetragen und mechanisch zerkleinert. Anschließend wurde die Mischung in einem Ultra Turrax (2 min. 24.000 rpm) unter Stickstoff dispergiert.
In diese, so erhaltene Dispersion wurden über ein Sterilfilter mit 0,2 µM Membran langsam 10 g hochraffiniertes Fischöl mit einem Gehalt an EPA von 1,75 g und an DHA von 1,92 g, also in Summe 3,67 g, eingetragen und gemischt. Die dabei erhaltene Rohemulsion wurde anschließend unter Rühren in drei Zyklen durch Sonfizierung (Sonic Vitra Cell 600 Watt model VCX 600) bei 60 bis 85°C emulgiert. Die Zeit eines Zyklus betrug 3 Minuten, die Amplitude war 75%.
Die so erhaltene Emulsion wurde mit Wasser ad inj. auf das Endvolumen von 100 ml eingestellt, wobei der pH-Wert auf 8,7 bis 8,8 eingestellt wurde. Sie wurde anschließend in 25 oder 50 ml Glasflaschen abgefüllt, verschlossen, und bei 121°C autoklaviert. Diese Lösung kann den Patienten als Infusion zur Behandlung sekundär, resistenter promyelocytischer Leukämie verabreicht werden, wobei die Tagesdosis an Arsentrioxid bei Verabreichung einer 100 ml Infusion 10 mg/Tag beträgt.

Herstellungsbeispiel 2

Ebenso wie in Beispiel 1 beschrieben wird aus 5 mg Arsentrioxid, 190. µl 1 N Natriumhydroxidlösung, 1,2 g Eilezithin, 2,5 g Glycerin, 0,030 g Ölsäure und 10,0 g Fischöl mit einem EPA-Gehalt von 1,93 g und einem DHA-Gehalt von 1,71 g, das sind in Summe 3,64 g an diesen Fettsäuren, eine Emulsion hergestellt, die nach Abfüllen und Autoklavieren als Infusion für verschieden primär resistente Leukämiearten in einer Dosis von 5 mg As₂O₃ eingesetzt werden kann.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche Arsentrioxid und mindestens eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure umfaßt.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die so formuliert ist, dass das Arsentrioxid in einer Tagesdosis von maximal 30 mg, vorzugsweise von 5 bis 15 mg verabreicht werden kann.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, in der die langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure mindestens 18 C-Atome und mindestens zwei Doppelbindungen aufweist.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, in der die langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure zwischen 18 und 30 C-Atome aufweist.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, die so formuliert ist, dass die Konzentration der Fettsäure im Bereich von 100 mg bis 30.000 mg pro 5 bis 15 mg Arsentrioxid liegt.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, in der die Fettsäure mindestens drei Doppelbindungen aufweist, die der n-3 oder der n-6 Reihe angehören.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, in der die Fettsäuren in Form der freien Fettsäuren, von Salzen oder von Estern mit ein- oder mehrwertigen Alkoholen vorliegen.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, in der die langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren mindestens 18 C-Atome und mindestens drei Doppelbindungen, die der n-3 oder n-6 Reihe angehören, aufweisen und in Form der freien Fettsäuren, von Salzen oder von Estern mit ein- oder mehrwertigen Alkoholen vorliegen.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, welche Gammalinolensäure, Dihomo-gamma-Linolensäure, Eicosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure umfaßt.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, welche Gammalinolensäure n-6, und/oder Dihomo-gamma-Linolensäure n-6 in einer Menge von 100 mg-30000 mg pro 5 bis 15 mg Arsentrioxid umfaßt.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, welche die Eicosapentaensäure n-3 die Docosahexaensäure n-3 oder eine Mischung der beiden Fettsäuren in einer Menge von 140 mg-1500 mg pro 5-15 mg Arsentrioxid umfaßt.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, welche ein Gemisch aus Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure umfaßt, vorzugsweise in Form eines Fischöls mit einem Gehalt an Eicosapentaensäure von 1,25-2,82 g, und einem Gehalt an Docosahexaensäure von 1,44-3,09 g pro 10 g Fischöl.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, welche als Infusionslösung formuliert ist.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, welche eine Öl-in-Wasser-Emulsion ist, wobei die wässrige Phase das Arsentrioxid enthält, während die langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure in der Ölphase vorliegt.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem vorstehenden Ansprüche, in der die Fettsäure in der Ölphase in Form von Triglyceriden vorliegt.

16. Verfahren zur Herstellung des Infusionspräparates gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, Schritte umfassend, in denen man das Arsentrioxid in verdünnter Lauge löst, zu einer klaren Lösung verarbeitet, einen physiologischen oder nicht-physiologischen Lösungsvermittler zusetzt, die Ölphase mit einem Gehalt an Triglyceriden einer oder mehrerer der langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren einrührt, emulgiert und den pH-Wert der Emulsion auf einen leicht basischen pH-Wert einstellt.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, Schritte umfassend, in denen man das Arsentrioxid in verdünnter Natronlauge auflöst und durch Rühren zu einer klaren Lösung verarbeitet, worauf man der Lösung ein Ei- oder Sojaphosphatid als Emulgator zusetzt und verteilt, die Ölphase mit einem Gehalt an Triglyceriden einer oder mehrerer der langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren einrührt, in mehreren Zyklen emulgiert und den pH- Wert der Emulsion auf pH 8,7-8,8 einstellt.

18. Verwendung von Arsentrioxid und mindestens einer langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäure zur therapeutischen Behandlung einer malignen Entartung.

19. Verwendung gemäß Anspruch 18, bei der die Wirkstoffe Arsentrioxid und die langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren gleichzeitig als Teil einer Zusammensetzung oder in Form von zwei verschiedenen Zusammensetzungen verabreicht werden.

20. Verwendung gemäß Anspruch 18 oder 19, bei der die Behandlung eine Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 umfaßt.

21. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Arsentrioxid in einer Tagesdosis von maximal 30 mg, vorzugsweise von 5 bis 15 mg verabreicht wird.

22. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, bei der die langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure mindestens 18 C-Atome und mindestens zwei Doppelbindungen aufweist.

23. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22, bei der die langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure zwischen 18 und 30 C-Atome aufweist.

24. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 23, bei der die Konzentration der Fettsäure im Bereich von 100 mg bis 30.000 mg pro 5 bis 15 mg Arsentrioxid liegt.

25. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 24, bei der die Fettsäure mindestens drei Doppelbindungen aufweist, die der n-3 oder der n-6 Reihe angehören.

26. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 25, bei der die Fettsäuren in Form der freien Fettsäuren, von Salzen oder von Estern mit ein- oder mehrwertigen Alkoholen vorliegen.

27. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 26, bei der die langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren mindestens 18 C-Atome und mindestens drei Doppelbindungen, die der n-3 oder n-6 Reihe angehören, aufweisen und in Form der freien Fettsäuren, von Salzen oder von Estern mit ein- oder mehrwertigen Alkoholen vorliegen.

28. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 27, bei der die Fettsäure Gammalinolensäure, Dihomo-gamma-Linolensäure, Eicosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure umfaßt.

29. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 28, bei der die Fettsäure Gammalinolensäure n-6, und/oder Dihomo-gamma-Linolensäure n-6 in einer Menge von 100 mg-30000 mg pro 5 bis 15 mg Arsentrioxid umfaßt.

30. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 29, bei der die Eicosapentaensäure n-3 die Docosahexaensäure n-3 oder eine Mischung der beiden Fettsäuren in einer Menge von 140 mg-1500 mg pro 5-15 mg Arsentrioxid umfaßt.

31. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 30, die eine Verwendung eines Gemisches aus Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure umfaßt, vorzugsweise in Form eines Fischöls mit einem Gehalt an Eicosapentaensäure von 1,25-2,82 g, und einem Gehalt an Docosahexaensäure von 1,44-3,09 g pro 10 g Fischöl.

32. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 31, wobei die Wirkstoffe in einer pharmazeutischen Zusammensetzung als Infusionslösung formuliert sind.

33. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 32, in der die Infusionslösung eine Öl- in-Wasser-Emulsion ist, wobei die wässrige Phase das Arsentrioxid enthält, während die langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure in der Ölphase vorliegt.

34. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 33, in der die Fettsäure in der Ölphase in Form von Triglyceriden vorliegt.

35. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 33, bei der die maligne Entartung Leukämie, promyelocytische Leukämie, sekundär resistente promyelocytische Leukämie und/oder primär resistente Leukämie oder ein solider Tumor, wie ein Leber- oder Nieren- Karzinom ist.