DE10202892A1 - Verfahren zur simultanen, quantifizierbaren Bestimmung von infektologisch relevanten Keimen - Google Patents

Verfahren zur simultanen, quantifizierbaren Bestimmung von infektologisch relevanten Keimen

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur simultanen quantifizierbaren Bestimmung von infektologisch relevanten Keimen, insbesondere Bakterien und Viren, mittels Analyse über eine Polymerasekettenreaktion (PCR). Hierbei handelt es sich um einen modifizierten PCR-Labortest, welcher der Bestimmung insbesondere zahnmedizinisch relevanter Bakterien und Viren dient.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur simultanen quantifizierbaren Bestimmung von infektologisch relevanten Keimen, insbesondere Bakterien und Viren, mittels Analyse über eine Polymerasekettenreaktion (PCR). Hierbei handelt es sich um einen modifizierten PCR-Labortest, welcher der Bestimmung insbesondere zahnmedizinisch relevanter Bakterien und Viren dient.
  • Auf dem Gebiet der Infektologie werden verschiedene Methoden zur Identifizierung von Bakterien und Viren angewandt. Hier sind PCR, ELISA, andere Immunoassays und Blotting-Techniken sowie Antigen-Antikörper- Tests, z. B. die ABCS-Methode zu nennen. Quantifizierbare Aussagen lassen sich in den ersten drei Fällen, soweit möglich, lediglich durch interne Standards bewerkstelligen. Allerdings wird dadurch die Zahl der Spezies, welche gleichzeitig detektiert werden kann, in der Regel stark limitiert, wodurch die Obergrenze der Anzahl zu bestimmender Keime in der Regel bei drei bis vier Keimen liegt.
  • Aus dem Stand der Technik sind bislang keine Tests bekannt, mit denen ein komplettes Keimspektrum simultan und quantitativ zu erfassen ist. Dies gilt insbesondere auf dem Gebiet der Zahnmedizin (Parodontologie und Endodontie). Hinzu kommt, dass auf diesen Gebieten noch zahlreiche Fragestellungen im Zusammenhang mit dem Keimspektrum ungeklärt sind. In der Regel werden lediglich 3-4 Keime, sogenannte Leitkeime, bestimmt, Probennahme, in der Regel mit Papierspitzen und Auswertung lassen eine quantitative Auswertung nicht zu. Zudem können diese Tests einige wichtige Fragen nicht oder nur unzureichend beantworten. Hierzu zählen die Fragen nach
    • - der Pathogenität von Einzelkeimen sowie des gesamten Keimspektrums (Gesamtpathogenität),
    • - dem Zusammenhang zwischen der Quantität der im Keimspektrum vorhandenen Bakterien und Viren und der Einzel- bzw. Gesamtpathogenität,
    • - den Wechselwirkungen und dem Gleichgewicht verschiedenener Spezies, sowie bei Störung des Gleichgewichts auftretenden Veränderungen wie Inhibierung oder Stimulation von Wachstum, Potenzierung oder Abschwächung der Einzel- und Gesamtpathogenität sowie Synergien und
    • - der Abstimmung von Antibiotika-Therapien oder alternativer Behandlungsmethoden auf das Keimspektrum.
  • Ausgehend hiervon war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile zu beseitigen und ein Verfahren zur simultanen, quantifizierbaren Bestimmung von infektologisch relevanten Keimen bereitzustellen. Dieses Verfahren soll die Anforderungen an einem ausgereiften Labortest erfüllen, daß ein komplettes Keimspektrum reproduzierbar detektiert und quantifiziert werden kann.
  • Diese Aufgabe wird durch das gattungsgemäße Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Die weiteren abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur simultanen, quantifizierbaren Bestimmung von infektologisch relevanten Keimen oder eines Keimspektrums mittels Analyse einer Polymerasekettenreaktion (PCR) bereitgestellt. Besonderes Kennzeichen dieser Erfindung ist die Probennahme, die mittels einer Probennahmesonde erfolgt, mit der ein die Keime enthaltendes Medium reproduzierbar aufgenommen wird.
  • Bei der Durchführung des Verfahrens wird vorzugsweise eine derart dimensionierte Probennahmesonde verwendet, mit der die Probennahme des Mediums auch an schwer zugänglichen Stellen, z. B. im Mundraum, ermöglicht wird.
  • In einer vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens wird als Probennahmesonde ein Unterdruck erzeugendes Element mit einer für die Aufnahme des Mediums vorgesehenen sterilen Dosierspitze eingesetzt. Dabei kann die Dosierspitze bevorzugt aus sterilen Polymerwerkstoffen, z. B. Polyethylen oder Polypropylen, bestehen.
  • Bevorzugt wird das Verfahren für die Bestimmung zahnmedizinisch relevanter Keime, hierunter besonders Bakterien und/oder Viren, eingesetzt.
  • Vorzugsweise kann das Verfahren so durchgeführt werden, daß ein Spektrum mit einer Anzahl von mindestens 6, bevorzugt 10 und besonders bevorzugt 20 unterschiedlichen Keimen bestimmt wird.
  • In einer vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens wird dieses mittels eines Analyse-Kits ausgeführt, mit dem die Bestimmung der für ein spezifisches Krankheitsbild charakteristischen Keime mittels PCR ermöglicht wird. Die Zusammenstellung der einzelnen Keime zu einem Spektrum wird dabei in Abhängigkeit von dem jeweiligen Krankheitsbild gewählt.
  • Bevorzugt wird das Verfahren in der Weise durchgeführt, daß eine Quantifizierung der einzelnen Keime möglich ist.
  • Als zu untersuchendes Medium kann vorzugsweise ein Biofilm oder aber auch eine planktonische Bakterien enthaltende Flüssigkeit mittels der Probennahmesonde aufgenommen werden.
  • Das Verfahren ermöglicht somit die reproduzierbare Detektion eines kompletten Keimspektrums mit anschließender Quantifizierung. Neben der Probennahme ist auch die Anzahl und Zusammenstellung der Keime, welche durch die dafür entwickelten Primer detektiert werden, neuartig. Somit können alle Fragestellungen, welche sich in der Zahnmedizin auf Art und Zusammensetzung eines Keimspektrums beziehen, hinreichend beantwortet werden. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist somit die Entwicklung verlässlicher und zielorientierter Therapien sowie die Erarbeitung besserer Prophylaxemethoden, z. B. bei Krankheiten wie Behcet's Desease, Coronary Vascular Desease (DVD), Endocarditis oder Gingivostomatitis möglich.
  • Ein weiterer Vorteil des anmeldungsgemäßen Verfahrens beruht darauf, daß die für das Verfahren entwickelten Primer im Baukastenprinzip im Rahmen verschiedener Untersuchungsziele und Fragestellungen hinsichtlich der zu untersuchenden Keime optimiert werden können.
  • Anhand der nachfolgenden Beispiele soll das anmeldungsgemäße Verfahren näher erläutert werden, ohne dieses dadurch auf das Ausführungsbeispiel einzuschränken.
    • Beispiel 1 Methode zur Identifikation von bis zu 70 Bakterien- und Virenspezies
  • Die Probenentnahme wird mit Hilfe einer speziellen Probennahmesonde durchgeführt. Diese spezielle Probenentnahmetechnik ermöglicht die Quantifizierung der Einzelkeime. Anschliessend wird die genomische DNA aller in der Probe vorhandenen Bakterienspezies isoliert. Anschliessend wird die gesamte DNA nach dem Standard-Protokoll für Bakterien des NucleoSpin Tissue-Kits (Firma Macherey-Nagel) isoliert und durch eine Ethanol-Präzipitation gereinigt, indem zur DNA- Lösung 2 µl Pellet-Paint (Fima Novagen) und 20 µl Natriumacetat (3M) pipettiert werden und über Nacht mit 400 µl Ethanol (96%) bei -20°C gefällt wird. Aus diesem DNA-Gemisch werden in 40 PCR-Zyklen mit "universellen" Primer und fünf U/µl Taq-Polymerase (Firma peQLab) ein ca. 700 Basenpaar grosses Fragment der bakteriellen 16S rDNA amplifiziert. Die so erhaltenen PCR-Produkte der 16S rDNA aller in der Probe vorhandenen Bakterien werden in einer zweiten "nested" PCR als Template eingesetzt. In 40 weiteren PCR-Zyklen mit Primerpaaren, welche spezifisch an das zuvor amplifizierte 16s rDNA-Fragment einzelner Bakterienarten binden, werden spezifische Abschnitte dieser Amplikons synthetisiert. Die erhaltenen Fragmente trennt man mit Hilfe der Gelelektrophorese und verwendet sie zum Nachweis der einzelnen Spezies in der Patientenprobe. Die Spezifität der "nested" PCR wurde anhand der Fragmentgrössen verifiziert. Zur Kontrolle der Methodik wird aus kommerziell erhältlichen Stämmen jeder Spezies (DSMZ) die genomische DNA isoliert und als Positivkontrolle in dem oben beschriebenen Verfahren eingesetzt. Um eine Kontamination der verwendeten Lösungen auszuschliessen, wird im PCR- Verfahren die Negativkontrolle mit sterilem aqua destillata statt der DNA-Lösung durchgeführt. Methodische Fehler bei der Probenentnahme werden durch Doppelbestimmungen ausgeschlossen.
  • Folgende 70 orale Mikroorganismen können auf diese Weise bestimmt werden:
    • - Actinobacillus actinomycetemcomitans (ATCC 33384), Actinomyces naeslundii (ATCC 12104), Actinomyces viscosus (ATCC 15987), Actinomyces israelii (ATCC 23860), Actinomyces funkeii, Actinomyces odontolyticus (ATCC 17982), Actinomyces radieidentis, Bacteroides forsythus, Bacteroides fragilis, Bartonella quintana, Campylobacter rectus (ATCC 33238), Capnocytophaga ochracea (ATCC 33596), Capnocytophaga gingivalis (ATCC 33624), Capnocytophaga sputigena (ATCC 33612), Coxiella bumetti (ATCC), Cryptobacterium curtum gen. nov., sp. nov, Dialister pneumosintes (ATCC 33048), Eikenella corrodens (ATCC 23834), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Escherichia coli (ATCC 11775), Eubacterium nodatum (ATCC 33099), Eubacterium limosum (ATCC 8496), Eubacterium lentum (ATCC), Eubacterium alactolyticum (ATCC 23263), Fusobacterium plauti (ATCC 29863), Fusobacterium nucleatum ssp. polymorphum (ATCC 10953), Helicobacter pylori (ATCC), Klebstella pneumoniae (ATCC 15380), Lactobacillus paracasei ssp. paracasei (früher L. casei ssp. Casei) (ATCC), Micromonas micros (früher Peptostreptococcus micros) (ATCC 33270), Porphyromonas gingivalis (früher Bacteroides gingivalis) (ATCC 33277), Porphyromonas asaccharolytica (ATCC 25260), Prevotella denticola (Treponema denticola) (ATCC 35308), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Prevotella dentalis (Mitsuokella dentalis) (ATCC 49559), Prevotella buccae, Prevotella buccalis (ATCC 35310), Prevotella oralis (ATCC 33269), Prevotella tannerae (ATCC), Prevotella pallens, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Prevotella loescheii, Prevotella nigrescens (ATCC 33563), Prevotella pallens (ATCC), Porphyromonas endodontalis (ATCC), Streptococcus mitis (ATCC 49456), Streptococcus oralis (ATCC 35037), Streptococcus sanguinis (ATCC 10556), Streptococcus viridans, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Treponema socranskii
    • - Sulfate reducing bacteria
    • - Chlamydia pneumoniae, Human Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus Typ I, Herpes Simplex Virus Typ I, Coxsackie Virus
    • - Candida albicans
    Beispiel 2
  • Parodontologische Studie
  • Im Rahmen einer Studie wurde das anmeldungsgemäße Verfahren zur Identifikation von 11 Bakterienspezies eingesetzt. Die Bakterien wurden mit Hilfe von speziell entwickelten Probennahmesonden vor einer chirurgischen Wurzelspitzenresektion periapikal isoliert.
  • In die Studie aufgenommen wurden 20 Patientenproben an 16 Zähnen von 16 Patienten mit der Verdachtsdiagnose "chronische periapikale Parodontitis".
  • Vor der chirurgischen Therapie spülten alle Patienten für eine halbe Minute den Mund mit 2%iger Clorhexidin-Lösung. Die Probenentnahme erfolgte nach Bildung eines Muccoperiostlappens und vor Osteotomie der Resektionsstelle, die Kühlung erfolgte mit steriler Kochsalzlösung. Die Probenentnahme selbst wurde mit einer erfindungsgemäßen sterilen Probenahmensonde durchgeführt.
  • Die Bestimmung erfolgte anhand der gleichen Verfahrensschritte wie in Beispiel 1. Es wurde nach den folgenden 11 oralen Mikroorganismen gesucht.
    • - Gram-positive fakultativ anaerobe Kokken aus der Streptococcus oralis Gruppe: Streptococcus mitis (ATCC 49456), Streptococcus oralis (ATCC 35037) und Streptococcus sanguinis (ATCC 10556); weiterhin Staphylococcus aureus (ATCC 12600) und Enterococcus faecalis (ATCC 19433).
    • - Gram-positive anaerobe Kokken: Micromonas micros (früher Peptostreptococcus micros) (ATCC 33270)
    • - Gram-negative anaerobe Stäbchen: Fusobacterium nucleatum ssp. polymorphum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (früher Bacteroides gingivalis) (ATCC 33277).
    • - Gram-positive fakultativ anaerobe Stäbchen: Lactobacillus paracasei ssp. paracasei (früher L. casei ssp. Casei) (ATCC).
    • - Gram-negative fakultativ anaerobische Stäbchen: Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Escherichia coli (ATCC 11775)
  • Hinsichtlich der Bestimmung mittels PCR traten weder bei den Positivkontrollen noch bei den Negativkontrollen Fehler auf. Um methodische Fehler bei der Probenentnahme usw. auszuschliessen, wurden, wenn möglich, bei jedem Patienten zwei unabhängige Proben entnommen.
  • Zur Abschätzung der Sensitivität des Messverfahrens wurden definierte Mengen von Echerichia coli (K12) in der PCR mit dem Ergebnis eingesetzt, dass bei dieser Spezies noch einzelne Bakterien (N < 50) nachgewiesen werden konnten. Es zeigte sich, dass bei anderen Spezies diese Sensitivität nicht ganz erreicht wurde.
  • Von den 11 gesuchten Bakterienspezies wurden folgende sechs Spezies am häufigsten gefunden:
    Micromonas micros, Pseudomonas aroginosa, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis und Streptococcus sanguinis. Mit Ausnahme von Streptococcus oralis konnten auch die anderen Keime vereinzelt nachgewiesen werden.

Claims (10)

1. Verfahren zur simultanen, quantifizierbaren Bestimmung von infektologisch relevanten Keimen, insbesondere Bakterien und/oder Viren, mittels Analyse über eine Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder einen Gensondentest, dadurch gekennzeichnet, dass die Probennahme mittels einer Probennahmensonde erfolgt, mit der ein die Keime enthaltendes Medium reproduzierbar aufgenommen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine derart dimensionierte Probennahmensonde verwendet wird, die die Probenahme des Mediums an schwer zugänglichen Stellen ermöglicht.
3. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Probennahmensonde ein unterdruckerzeugendes Element mit einer für die Aufnahme des Mediums vorgesehenen sterilen Dosierspitze eingesetzt wird.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dass eine Dosierspitze aus einem sterilen Polymeren Werkstoff, z. B. Polyethylen oder Polypropylen, verwendet wird.
5. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dass das Verfahren für die Bestimmung zahnmedizinisch relevanter Keime eingesetzt wird.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Spektrum mit einer Anzahl von mindestens zehn unterschiedlichen Keimen bestimmt wird.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR für die für ein spezifisches Krankheitsbild charakteristischen Keime mittels eines Analyse-Kits durchgeführt wird.
8. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Keime quantifiziert werden.
9. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Medium ein Biofilm verwendet wird.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Medium planktonische Bakterien enthaltende Flüssigkeiten verwendet werden.
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