DE10202466B4

DE10202466B4 - Objektträger für die Fluoreszenzmikroskopie

Info

Publication number: DE10202466B4
Application number: DE10202466A
Authority: DE
Inventors: Peter Dr. Westphal; Tobias Dr. Neumann; Martin Dr.rer.nat. Kühner; Dieter Dipl.-Phys. Gräfe
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2002-01-23
Filing date: 2002-01-23
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2022-01-24
Also published as: US20030156990A1; US6946664B2; DE10202466A1; CN1434318A; GB0301330D0; GB2384573B; CN1264040C; GB2384573A

Abstract

Objektträger für die Fluoreszenzmikroskopie oder Biochip-Anwendungen, der im wesentlichen keine Eigenfluoreszenz zeigt, einen plattenförmigen transparenten Grundkörper (5) und an einer Plattenseite (2, 4) dieses Grundkörpers (5) eine Beschichtung (6, 7, 8) zur Verbesserung der Meßgenauigkeit aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung eine Reflexion verhindernde Antireflexbeschichtung (7) für Fluoreszenzstrahlung oder eine Fluoreszenzstrahlung absorbierende Schicht (8) umfaßt.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen Objektträger für die Fluoreszenzmikroskopie oder Biochip-Anwendungen, der im wesentlichen keine Eigenfluoreszenz zeigt, einen plattenförmigen transparenten Grundkörper und an einer Plattenseite dieses Grundkörpers eine Beschichtung zur Verbesserung der Meßgenauigkeit aufweist. Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Fluoreszenzmikroskop, das eine Objektträgerauflage mit einer Oberseite, auf die ein Objektträger auflegbar ist, aufweist.
In der Fluoreszenzmikroskopie und bei Biochip-Anwendungen ist es bekannt, zur ortsaufgelösten, photometrischen Vermessung fluoreszierender Substanzen, diese auf einer transparenten Trägerplatte, den sogenannte Objektträger anzuordnen. Die fluoreszierenden Substanzen werden dann mit geeigneter Strahlung angeregt und die von ihnen ausgehende Fluoreszenzstrahlung ortsaufgelöst erfaßt. Im Interesse einer guten Meßgenauigkeit sollten dabei Verfälschungen der Fluoreszenzstrahlungsintensität möglichst gering gehalten werden.
Deshalb werden gegenwärtig für hochgenaue Messungen konfokale Mikroskope eingesetzt, deren Schärfentiefe so gering ist, daß sie lediglich aus der zu analysierenden, fluoreszierenden Substanzschicht Fluoreszenzstrahlung empfangen. Aus anderen Bereichen stammende Strahlung im Fluoreszenzwellenlängenbereich wird damit wirkungsvoll ausgeblendet. Damit ist sichergestellt, daß lediglich aus einem zu analysierenden Bereich Fluoreszenzstrahlung aufgenommen wird. Diesen Vorteil erkauft man sich allerdings durch einen entsprechenden apparativen Mikroskopaufwand, da die für eine konfokale Abbildung im Mikroskop notwendige Fokussierbarkeit in der Regel nur durch einen Laser erreichbar ist. Dies schränkt darüber hinaus die Wahl der Lichtquelle stark ein.
Ein anderer Ansatz sieht vor, mehrere ortsaufgelöste Bilder in verschiedenen Tiefenbereichen des Objektes aufzunehmen und anschließend mathematisch zu bearbeiten. Dieser Ansatz erfordert jedoch erheblichen Rechenaufwand, weshalb dann die Aufnahme eines Bildes länger dauert. Weiter kann die Detektionsempfindlichkeit herabgesetzt sein.
Im übrigen eignet sich dieses bekannte Verfahren nur bedingt dazu, Prozesse zeitaufgelöst zu erfassen, da die Aufnahme mehrerer Bilder mit der erforderlichen mathematischen Nachbearbeitung eine gewisse Zeit in Anspruch nimmt.
Verzichtet man auf den Aufwand eines konfokalen Meßmikroskopes bzw. die geschilderte mathematische Korrektur, muß man sich mit einer Verfälschung des Meßergebnisses abfinden oder die Meßempfindlichkeit senken.
Der Katalog Electron Microscopy Sciences zeigte am 20. November 2001 unter der Internet-Adresse www.emsdiasum.com/ems/histology/slides.html unter der Bestellnummer 71876-0 einen Objektträger, dessen Unterseite durch Sandstrahlen aufgerauht ist. Ausweislich der Erläuterung unter Nr. 3 dient diese Aufrauhung dazu, eine bessere Beschreibbarkeit der Objektträgerunterseite zu gewährleisten.

Die JP 10123429 offenbart einen Objektträger der eingangs genannten Art, der als transparente Glasplatte mit einer einseitigen, auf die Anregungsstrahlung abgestimmten Antireflexbeschichtung ausgeführt ist. Die WO 01/27599 A1 beschreibt einen Glas-Objektträger, der zur Meßgenauigkeitssteigerung Fluoreszenzstrahlung absorbiert. Die DE 3333674 C2 betrifft einen teilweise mattierten Objektträger, der eine zur Erzeugung einer Kapillarwirkung strukturierte Oberfläche hat.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, Mittel für die Fluoreszenzmikroskopie bereitzustellen, die ohne erhöhten apparativen oder verfahrenstechnischen Aufwand eine verbesserte Meßgenauigkeit ermöglichen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Objektträger der eingangs genannten Art gelöst, bei dem die Beschichtung eine Reflexion verhindernde Antireflexbeschichtung für Fluoreszenzstrahlung oder eine Fluoreszenzstrahlung absorbierende Schicht umfaßt.

Weiter wird die Aufgabe gelöst durch ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Objektträgerauflage, die eine Oberseite aufweist, auf welche ein Objektträger auflegbar ist, und die an der Oberseite eingekoppelte Fluoreszenzstrahlung nicht zur Oberseite zurückreflektiert.

Die Erfindung geht von der Erkenntnis aus, daß die Meßgenauigkeit wesentlich durch optisches Übersprechen zwischen benachbarten Bereichen einer zu untersuchenden Schicht gemindert wird. Dieses Übersprechen führt u. a. zu einer Einschränkung der Ortsauflösung bei der photometrischen Vermessung fluoreszierender Substanzen, die sich auf der dem Objektiv zugewandten Oberseite eines Objektträgers befinden. Dabei stellt sich heraus, daß dieses Übersprechen durch Reflexionen des Fluoreszenzlichts an Glas/Luft-Grenzflächen verursacht wird, wobei letztlich immer eine Reflexion unterhalb der fluoreszierenden Substanz auftritt.

Zwei Prozesse erwiesen sich als bedeutsam: zum einen wird Fluoreszenzlicht, das von einer mit Fluoreszenzmolekülen versehenen Objektfläche des Objektträgers ausgeht und dabei in den Objektträger austritt, an der gegenüberliegenden Seite an einer Objektträger/Luft-Grenzfläche zumindest teilweise reflektiert und zu der objektivseitig gelegenen Oberfläche, auf der sich die Substanzschicht befindet, zurückgeworfen. Von dort wird es im Mikroskop erfaßt und führt zu einer Verfälschung der gemessenen Lichtintensität. Zum anderen kann Fluoreszenzlicht, das von der mit Fluoreszenzmolekülen versehenen Fläche des Objektträgers ausgeht, an einem zwischen der mit Molekülen versehenen Oberfläche und dem Mikroskopobjektiv liegenden Deckglas reflektiert und dann durch eine weitere Reflexion am Objektträger zum Mikroskop zurückgeworfen werden. Dies führt ebenfalls zu einer Verfälschung in Form eines optischen Übersprechens.

Die Erfindung schaltet beide Prozesse dadurch aus, daß unterhalb der Fluoreszenzschicht entweder eine Absorption der Fluoreszenzstrahlung erfolgt oder dafür gesorgt wird, daß keine Rückreflexion zur Oberseite und damit zum Mikroskopobjektiv möglich ist. Damit ist ein Übersprechen zwischen benachbarten Bereichen unterbunden.

Die Absorption bzw. die Verhinderung der Rückreflektion erfolgt dabei am Objektträger selbst, indem entweder unter der Fläche, die für die Aufnahme der fluoreszierenden Substanzschicht gedacht ist, der Objektträger mit geeigneten fluoreszenzlichtabsorbierenden Eigenschaften versehen wird, oder indem durch eine Antireflexschicht an der Unterseite des Objektträgers, die der Oberseite gegenüberliegt, auf der die fluoreszierende Substanzschicht aufgebracht werden soll, dafür gesorgt wird, daß in den Objektträger eingetretene Fluoreszenzstrahlung diesen an der Unterseite verläßt, ohne dort reflektiert zu werden. Bei einem solchen Objektträger muß durch geeignete Maßnahmen an der Auflage, an der der Objektträger aufliegt, dafür gesorgt werden, daß die Fluoreszenzstrahlung nicht wieder ungewünscht zum Objektträger zurückgeworfen wird.

Das erfindungsgemäße Fluoreszenzmikroskop ist deshalb so ausgestaltet, daß es auf die Objektträgerauflage auftreffende Fluoreszenzstrahlung nicht zum Objektträger zurückreflektiert. Im einfachsten Fall genügt dazu eine absorbierende bzw. nicht-reflektierend ausgestattete Oberseite der Objektträgerauflage.

Üblicherweise besteht die Objektträgerauflage bei einem Fluoreszenzmikroskop aus einem Glaskörper. Damit an dessen Oberseite eine Reflexion von Fluoreszenzstrahlung wie gewünscht vermieden ist, muß diese mit einer Antireflexschicht versehen sein. Alternativ ist es möglich, den Objektträger auf die Auflage mit einer dazwischenliegenden Flüssigkeitsschicht mit einer Brechzahl, die der des Objektträgers bzw. des Glasblockes ähnelt, zu legen. Solche Immersionsöle sind an und für sich in der Mikroskopie für die Anwendung zwischen einem Deckglas und einem Mikroskopobjektiv bekannt. Möchte man eine Flüssigkeit vermeiden, deren Handhabung sich erfahrungsgemäß schwer automatisieren läßt, kann eine Schicht aus einem transparenten, festen, aber flexiblen Material verwendet werden, die die erforderlichen optischen Eigenschaft zeigt, d. h. eine Grenzflächenreflexion vermeidet. Ein solches Material ist beispielsweise in der US 5.313.264 beschrieben.

Ist Sorge dafür getroffen, daß die Fluoreszenzstrahlung nicht an der Oberseite der Objektträgerauflage reflektiert wird, können verschiedene geeignete Mittel erreichen, daß in die Objektträgerauflage eingekoppelte Strahlung nicht zum Objektträger zurückreflektiert wird. Im einfachsten Fall genügt die erwähnte fluoreszenzlichtabsorbierende Eigenschaft.

In einer besonders zweckmäßigen Ausgestaltung eines Fluoreszenzmikroskopes weist die der Oberseite, auf die der Objektträger aufgelegt wird, gegenüberliegende Unterseite der Objektträgerauflage reflektierende Eigenschaften auf und ist so gestaltet, daß die reflektierte Strahlung vom Objektträger weggelenkt wird. Für diese Alternative ist ein Fluoreszenzmikroskop zu bevorzugen, dessen Objektträgerauflage eine der Oberseite gegenüberliegende Unterseite aufweist, die nicht parallel zur Oberseite verläuft, insbesondere einen Winkel größer 45° zur Oberseite aufweist.

Eine solche Objektträgerauflage lenkt eingekoppelte Fluoreszenzstrahlung so um, daß sie nicht mehr zum Objektträger, d. h. nicht mehr zum Mikroskopobjektiv zurückgelangen kann.

Während das geschilderte Mikroskop den Vorteil hat, daß es auch mit herkömmlichen Objektträgern eine Verbesserung der Ortsauflösung ermöglicht, haben die erfindungsgemäßen Objektträger den Vorteil, daß sie auch mit üblichen Standardmikroskopen eine deutliche Verbesserung zeigen, da die Rückreflexion der Fluoreszenzstrahlung bereits im Objektträger selbst unterbunden wird.

Die einfachste Art, eine Reflexion zu verhindern, ist eine geeignete absorbierende Schicht. Um den gewünschten erfindungsgemäßen Effekt zu erzielen, muß die Schicht lediglich unterhalb der Substanzschicht liegen, die fluoreszierende Eigenschaften zeigt, wobei die Angabe „unterhalb" auf die Beobachtungsrichtung durch das Mikroskop objektiv bezogen ist. Für diese Ausgestaltung ist es zu bevorzugen, den plattenförmigen Objektträger an einer Plattenseite lichtabsorbierend zu beschichten.

Für die Verwendung in der Fluoreszenzmikroskopie ist es wesentlich, daß keine unerwünschte Eigenfluoreszenz des Objektträgers vorliegt. Da in der Fluoreszenzmikroskopie je nach Anwendung in einem breiten Spektralbereich Fluoreszenzstrahlung angeregt bzw. detektiert wird, üblicherweise wird ein Wellenlängenbereich zwischen 300 und 700 nm verwendet, sollte das Material des Objektträgers in diesem Wellenlängenbereich keine Eigenfluoreszenz zeigen. Dabei wird erfindungsgemäß unter der Angabe „keine Eigenfluoreszenz" verstanden, daß Eigenfluoreszenz in einem nur so geringen Maße auftritt, daß die übliche Fluoreszenzanalytik davon nicht beeinfluß wird. Andernfalls wäre die gewünschte Tauglichkeit für die Fluoreszenzmikroskopie nicht gegeben, da ein Fluoreszenz zeigender Objektträger jegliches Meßsignal überdecken würde. In der Fluoreszenzmikroskopie hat sich deshalb als Material Glas bewährt, da es keine Eigenfluoreszenz zeigt.

In einer besonders einfach zu erreichenden Realisierung wird deshalb ein plattenförmiger Glaskörper an einer Plattenseite lichtabsorbierend beschichtet, beispielsweise geschwärzt. Die Beschichtung kann dabei durch jedes geeignete Verfahren erreicht werden, beispielsweise Lackierung, Bedampfung, Sputtern, Ätzen, Plasmabehandlung, UV-Bestrahlung, Polymerbeschichtung (z. B. mit Celluloseprodukten) oder Eloxierung. Die beschichtete Seite kann im Objektträger sowohl als spätere Unterseite eingesetzt werden, als auch als Oberseite, auf die dann eine fluoreszierende Substanzschicht aufgebracht wird. In jedem Fall liegt sie unterhalb der Substanzschicht. Aus Reinheitsgründen wird man allerdings meist die Substanzschicht auf die nicht-beschichtete Plattenseite des Glaskörpers aufbringen, um unerwünschte Wechselwirkungen zwischen Substanz und Beschichtung zu vermeiden.

Eine Bauweise, bei der die Substanzschicht auf einer transparenten Objektträgeroberseite liegt, weist den Vorteil auf, daß einem Autofokussystem weiterhin ein geeigneter Luft/Substrat-Übergang zur Fokussierung auf die Grenzfläche zur Verfügung steht.

Metalloxide eignen sich für die Aufbringung der lichtabsorbierenden Schicht. Es ist deshalb zu bevorzugen, daß der Objektträger eine fluoreszenzlichtabsorbierende Substanz, insbesondere ein Metalloxid, aufweist.

Für den Fall, daß ein Mikroskop verwendet wird, dessen Objektträgerauflage Fluoreszenzstrahlung nicht reflektiert, muß dafür gesorgt werden, daß an der Unterseite des Objektträgers keine Fluoreszenzreflexion auftritt. Dies kann beispielsweise durch 'eine geeignete Antireflexbeschichtung erfolgen, die vorzugsweise breitbandig ausgelegt ist, um für Fluoreszenzstrahlung verschiedenster Fluorophore zu wirken.

Je besser die Absorptionseigenschaften des Objektträgers sind, desto stärker wird optisches Übersprechen unterdrückt. Es zeigte sich dabei, daß ab einer Minderung der Rückreflexion um 20% bereits eine merkliche Meßgüteverbesserung erreicht ist. Konsequenterweise steigt damit die Ortsauflösung. Eine verbesserte Absorption wird erreicht, wenn die Plattenunterseite zusätzlich zur lichtabsorbierenden Beschichtung diffus reflektierend für Fluoreszenzstrahlung ausgebildet ist. Dies kann beispielsweise durch eine geeignete Aufrauhung erfolgen. Ansonsten besteht die Möglichkeit, daß trotz absorbierender Beschichtung ein störender Reflexionsanteil nicht ausgeschlossen werden kann.

Um materialunabhängig eine gute Haftung bzw. eine gute Bioverträglichkeit für zu analysierende Substanzen zu erreichen, ist es vorteilhaft, die berseite des Objektträgers mit einer haftungsverbessernden oder bioverträglichkeitssteigerden Schicht, z. B. SiO₂, zu beschichten. Dann besteht größte Freiheit bei der Wahl des Objektträgermaterials.

Ein erfindungsgemäßer Objektträger, der auf einer Plattenseite eingekoppelte Fluoreszenzstrahlung nicht zurückreflektiert, erlaubt den Verzicht auf konfokale Fluoreszenzmikroskope, ohne daß dabei auf Ortsauflösung verzichtet werden müßte. Es ist deshalb erfindungsgemäß die Verwendung eines erfindungsgemäßen Objektträgers zur Fluoreszenzmikroskopie in einem nicht-konfokalen Fluoreszenzmikroskop vorgesehen. Die Verwendung solcher Objektträger erlaubt es überraschenderweise, den bisher unverzichtbar geglaubten Einsatz von konfokalen Fluoreszenzmikroskopen, die nicht nur teuer in der Anschaffung, sondern auch aufwendiger in Unterhalt, Wartung und Bedienung sind, vermeiden zu können. Somit kann mit einfachen Fluoreszenzmikroskopen eine bisher nicht erreichbare Ortsauflösung bzw. Meßempfindlichkeit erzielt werden, da der Einsatz der erwähnten Objektträger das optische Übersprechen mindert und folglicherweise die Ortsauflösung steigert. Im wesentlichen kommt es darauf an, daß der Objektträger möglichst solche Fluoreszenzstrahlung unterdrückt, die nicht auf direktem Wege von der Substanzschicht, sondern über Reflexionen zum Objektiv gelangt.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielhalber noch näher erläutert. In der Zeichnung zeigen:
1 eine perspektivische Darstellung eines Objektträgers,
2 bis 5 Schnittdarstellungen durch Objektträger,
6 eine Schemadarstellung eines nicht-konfokalen Fluoreszenzmikroskopes,
7 eine schematische Schnittdarstellung durch die Objektträgerauflage eines Fluoreszenzmikroskopes und
8 und 9 Intensitätsprofile zur Verdeutlichung des Einflusses des Objektträgers auf die Ortsauflösung.
1 zeigt perspektivisch einen Objektträger 1, der eine Oberseite 2 aufweist, auf der eine fluoreszierende Schicht 3 aufgebracht ist. Zur Analyse in einem Mikroskop wird der Objektträger 1 mit seiner Unterseite 4 auf eine Objektträgerauflage gelegt und auf der Oberseite 2 mit Anregungsstrahlung beaufschlagt. Die durch diese Anregung emittierte Fluoreszenzstrahlung wird dann mit einem über der Oberseite 2 angeordneten Mikroskopobjektiv ortsaufgelöst erfaßt.
Der Objektträger 1 ist ein fluoreszenzlichtabsorbierender Vollkörper, der aus einer Grundsubstanz besteht, die keine merkliche Eigenfluoreszenz im Bereich zwischen 300 und 700 nm zeigt. Diese Grundsubstanz ist mit einer fluoreszenzlichtabsorbierenden Substanz, z. B. auf der Basis von Metalloxiden, derart vermischt, daß sie nach der Formgebung zum plattenförmigen Objektträger 1 durchgefärbt ist. Diese Durchfärbung ist dabei so, daß über den gesamten Querschnitt des Objektträgers 1 parallel zur Oberseite 2 eine Absorption erreicht ist. Die Einfärbung ist vorzugsweise schwarz, jedoch ist auch jede andersfarbige Einfärbung tauglich, die Fluoreszenzstrahlung absorbiert.
Diese lichtabsorbierenden Eigenschaften führen dazu, daß kein nennenswerter Fluoreszenzlichtanteil die Platte durchdringen kann und somit auch nicht wieder zur Oberseite 2 zurückreflektiert werden kann. Auch Strahlung die von einem über der fluoreszierenden Schicht 3 liegenden (nicht dargestellten) Deckglas reflektiert wurde, wird vom gefärbten Objektträger 1 absorbiert und kann somit nicht zum Mikroskopobjektiv gelangen.
2 zeigt eine weitere Ausführungsform eines Objektträgers 1, wobei Elemente, die denen des Objektträgers der 1 entsprechen, mit den gleichen Bezugszeichen versehen sind. Auf der Oberseite 2 des Objektträgers 1 der 2 befindet sich ebenfalls eine fluoreszierende Schicht 3. Unterhalb der fluoreszierenden Schicht 3 befindet sich jedoch zwischen dem Körper 5 des Objektträgers 1 eine Beschichtung 6, die Fluoreszenzstrahlung absorbiert. Diese Beschichtung ist beispielsweise durch Lackierung, Bedampfung, Sputtern, Ätzen, Plasmabehandlung oder Eloxierung hergestellt und führt dazu, daß kein nennenswerter Lichtanteil den plattenförmigen Objektträger 1 durchdringen kann und somit auch nicht an der Unterseite 4 reflektiert werden kann. Auch Licht, das an einem Deckglas reflektiert wurde, wird von der Beschichtung 6 absorbiert. Hinsichtlich der optischen Eigenschaften der Beschichtung 6 gilt das zur Einfärbung des Objektträgers der 1 gesagte entsprechend. Auch kann zusätzlich der Objektträger nichttransparent sein.
3 zeigt eine Abwandlung der Bauweise der 2, bei der sich die fluoreszenzlichtabsorbierende Beschichtung 6 an der Unterseite 4 des Körpers 5 des transparenten Objektträgers 1 befindet. Ansonsten gilt das zur 2 ausgeführte sinngemäß.
4 zeigt eine Objektträger 1, der im wesentlichen dem Objektträger der 3 entspricht. Allerdings ist statt der fluoreszenzlichtabsorbierenden Beschichtung 6 nun eine Antireflexschicht 7 an der Unterseite 4 des Objektträgers 1 vorgesehen. Diese ist breitbandig für den gesamten Bereich, in dem Fluoreszenztätigkeit von in der Fluoreszenzanalytik verwendeten Fluorophoren auftritt, ausgelegt. Optional kann sie auch selektiv für eine oder mehrere Wellenlängen typischer Fluorophore (z. B. Cy3, C5, FGTC) sein. Die Antireflexschicht 7 bewirkt, daß Fluoreszenzlicht, das von der fluoreszierenden Schicht 3 an der Oberseite 2 in den plattenförmigen Objektträger 1 eingekoppelt wurde, den Objektträger 1 an der Unterseite 4 verläßt und nicht zur Oberseite 2 zurückreflektiert wird.
5 zeigt eine weitere Abwandlung der Bauweise der 3. Hier ist die Beschichtung an der Unterseite 4 durch eine Verbundstruktur 8 ersetzt, die aus der Kombination einer aufgerauhten Unterseite 4 und einer danach aufgebrachten fluoreszenzlichtabsorbierenden Schicht besteht. Die Aufrauhung bewirkt, daß Fluoreszenzlicht, das von der fluoreszierenden Schicht 3 an der Oberseite 2 eingestrahlt wird, an der Unterseite 4 noch besser absorbiert wird; durch die Aufrauhung der Verbundstruktur 8 ist eine spiegelnde Rücksteuerung auf jeden Fall vermieden. Es findet höchstens eine diffuse Rückstreuung statt, die eine stark verminderte Strahlungsintensität an der Oberseite 2 zur Folge hat.
Die geschilderten Objektträger ermöglichen es sämtlich, in einem Fluoreszenzmikroskop auf eine konfokale Abbildung zu verzichten, ohne einen Verlust auf Ortsauflösung oder Meßempfindlichkeit hinnehmen zu müssen. Sie werden deshalb bevorzugt in einem nichtkonfokalen Fluoreszenzmikroskop verwendet, wie es in 6 schematisch dargestellt ist. Ein solches Fluoreszenzmikroskop 9 weist üblicherweise ein Lichtquelle 10 auf, die über eine Optik 11 in einem Anregungsstrahlengang 12 ein Anregungsfilter 13 beleuchtet. Die Lichtquelle 10 ist dabei eine vorzugsweise breitbandige Lichtquelle, z. B. eine Weißlichtquelle wie eine Halogenlampe oder eine Bogenlampe. Das Anregungsfilter 13 transmittiert von der im Anregungsstrahlengang eingestrahlten Strahlung nur einen gewünschten für die Fluoreszenzanregung vorgesehenen spektralen Anteil. Das Anregungsfilter 13 kann entfallen, wenn als Lichtquelle 10 eine schmalbandige Lichtquelle, z. B. ein Laser oder eine LED, verwendet wird.
Die Anregungsstrahlung fällt auf einen Strahlteiler 14, der im Anregungswellenlängenbereich reflektierend wirkt. Er lenkt die erzeugte Anregungsstrahlung auf ein Objektiv 15, das damit einen Objektträger 1, auf dem sich die erwähnte fluoreszierende Schicht befindet (in 1 nicht dargestellt) beleuchtet. Alternativ kann das Anregungslicht auch nicht durch das Objektiv geleitet werden, sondern schräg von der Seite am Objektiv 15 vorbei auf den Objektträger 1 eingestrahlt werden.
Das Objektiv 15 nimmt am Objektträger 1 emittierte Fluoreszenzstrahlung auf und leitet sie in einen Beobachtungsstrahlengang 16. Dabei ist der Strahlteiler 14 so ausgebildet, daß er Strahlung bei der Wellenlänge der Fluoreszenz transmittiert. Durch einen Emissionsfilter 17, der dazu dient, etwaige Anregungsstrahlung, die in den Beobachtungsstrahlengang 16 gelangt ist, auszublenden und eine Optik 18 wird die Fluoreszenzstrahlung auf eine Kamera 19, z. B. einen CCD-Empfänger, abgebildet.
Trotz der relativ großflächigen Anregung und Abbildung der Fluorophore tritt bei Verwendung eines Objektträgers, der dafür sorgt, daß an seiner Oberseite eingestrahlte Fluoreszenzstrahlung, nicht zum Mikroskop zurück reflektiert wird, kein optisches Übersprechen auf. Die ansonsten nötige konfokale Abbildung kann deshalb im Fluoreszenzmikroskop 9 entfallen, ohne daß eine Einschränkung der Ortsauflösung oder Meßempfindlichkeit hingenommen werden müßte. Durch die großflächige Abtastung des Objektträgers 1 ist weiter im Vergleich zu konfokal arbeitenden Mikroskopen die Meßgeschwindigkeit deutlich gesteigert.
Beim Fluoreszenzmikroskop kann es sich um ein spezialisiertes optisches Auslesegerät für Biochips handeln.
7 zeigt eine Schnittdarstellung durch ein Meßmikroskop, dessen Objektträgerauflage dafür Sorge trägt, daß keine Rückreflexion von Fluoreszenzstrahlung, die in einen Objektträger eingekoppelt wurde, zum Mikroskopobjektiv 15 erfolgt. Das Mikroskop weist dazu einen Trägerblock 20 auf, der aus einem Glaskörper gefertigt ist. Der Trägerblock 20 hat eine Oberseite 21, auf der sich eine Indexschicht 22 befindet, die dafür Sorge trägt, daß in den Objektträger 1 von der fluoreszierenden Schicht 3 eingekoppelte Fluoreszenzstrahlung an der Oberseite 21 nicht reflektiert wird. Bei der Indexschicht 22 kann es sich beispielsweise um eine Ölimmersion oder einen elastischen transparenten Feststoff mit vergleichbaren optischen Eigenschaften handeln. Die Unterseite 23 des Trägerblockes 20 ist in einer ersten Variante spiegelnd ausgebildet. In den Trägerblock 20 aus dem Objektträger 1 einfallende Strahlung 26 wird somit umgelenkt und gelangt als Strahlung 27 zu einer Austrittsfläche 24, von der sie nicht zum Objektträger 1 zurückgelangen kann. Statt der Spiegelschicht 25 kann auch eine absorbierende Schicht vorgesehen werden. Im allgemeinen gilt für den Trägerblock 20, das zu den 1 bis 5 für den Objektträger 1 besagte analog; alle dort aufgeführten Möglichkeiten, um zu verhindern, daß Fluoreszenzstrahlung an der Oberseite 21 wieder austreten, können auch für den Trägerblock 20 verwendet werden. Insbesondere muß die Unterseite 23 nicht schräg zur Oberseite 21 verlaufen, für die Ausbildung, daß die Strahlung 26 als Strahlung 27 zur Austrittsfläche 24 umgeleitet wird, ist aber eine schräge Spiegelfläche 25 vonnöten.
Die 8 und 9 zeigen in Intensitätsprofilen die Auswirkungen des Konzeptes, eine Rückreflexion von auf den Objektträger treffender Fluoreszenzstrahlung zu vermeiden, auf die Ortsauflösung bzw. die Nachweisempfindlichkeit. Dabei ist in den 8 und 9 die Intensität I eindimensional über der Koordinate x aufgetragen.
8 zeigt dabei das Intensitätsprofil für den Fall, daß eine Rückreflexion auftritt. Es ist in einer Kurve 28 dargestellt. Wie man sieht, beträgt die tatsächliche Breite des fluoreszierenden Elementes in etwa 500 Einheiten in x-Richtung. Diese Breite ergibt sich aber nur dann, wenn man einen Intensitäts-Schwellwert 29 von etwa 1200 Intensitätseinheiten oder mehr zugrundelegt. Ein hoher Intensitäts-Schwellwert 29 bedeutet aber zugleich eine geringe Meßempfindlichkeit. Unter diesem Gesichtspunkt ist es natürlich wünschenswert, den Intensitäts-Schwellwert möglichst weit abzusenken. Bei einem Absenken unter den Intensitäts-Schwellwert 29 nimmt allerdings die Ortsauflösung ab, da die Breite des fluoreszierenden Bereiches dann größer wahrgenommen wird, als sie tatsächlich ist. Wählt man beispielsweise den mit 30 bezeichneten Intensitäts-Schwellwert ergibt sich eine Breite B von fast 900 Längeneinheiten in x-Richtung. Die Ortsauflösung sinkt also nahezu auf die Hälfte.
Wird, wie zuvor beschrieben, eine Rückreflexion von Fluoreszenzstrahlung, die auf die Oberseite eines Objektträgers fällt, verhindert, ergibt sich das in der Kurve 31 der 9 dargestellte Intensitätsprofil. Wie zu sehen ist, ist die ansteigende Flanke zwischen 0 und 500 Längeneinheiten der Kurve 31 sehr viel flacher als bei der Kurve 28. Dies hat zur Folge, daß auch bei einem niedrigen Intensitäts-Schwellwert 30 von etwa 300 Intensitätseinheiten die kOrrekte Breite B ermittelt wird. Somit ist bei gleichbleibender Ortsauflösung die Nachweisgrenze durch Absenkung des Intensitäts-Schwellwertes von 500 auf 300 Intensitätseinheiten nahezu halbiert. Die Kurve 31 der 9 wurde dabei mit einem hinsichtlich seiner absorbierenden Eigenschaften noch nicht optimierten Prototypen gewonnen.

Claims

Objektträger für die Fluoreszenzmikroskopie oder Biochip-Anwendungen, der im wesentlichen keine Eigenfluoreszenz zeigt, einen plattenförmigen transparenten Grundkörper (5) und an einer Plattenseite (2, 4) dieses Grundkörpers (5) eine Beschichtung (6, 7, 8) zur Verbesserung der Meßgenauigkeit aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung eine Reflexion verhindernde Antireflexbeschichtung (7) für Fluoreszenzstrahlung oder eine Fluoreszenzstrahlung absorbierende Schicht (8) umfaßt.
Objektträger nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Glaskörper (5), welcher an einer Plattenseite (4) lichtabsorbierend beschichtet, insbesondere geschwärzt ist.
Objektträger nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung auf der einem Mikroskopobjektiv zugewandten Plattenseite (2) liegt.
Objektträger nach Anspruch 2 oder 3, gekennzeichnet durch eine fluoreszenzlichtabsorbierende Substanz, die insbesondere ein Metalloxid aufweist.
Objektträger nach einem der obigen Ansprüche, der an einer Plattenseite (4) diffus reflektierend für Fluoreszenzstrahlung ausgebildet ist.
Objektträger nach einem der obigen Ansprüche, der an einer Plattenseite mit einer haftungsverbessernden oder bioverträglichkeitssteigernden Schicht, insbesondere einer SiO₂- Schicht, versehen ist.
Verwendung eines Objektträgers gemäß einem der obigen Ansprüche zur Fluoreszenzmikroskopie in einem nicht-konfokalen Fluoreszenzmikroskop (9).
Fluoreszenzmikroskop, mit einer Objektträgerauflage die eine Oberseite (21) aufweist, auf welche ein Objektträger (1) auflegbar ist, und welche die auf die Oberseite (21) treffende Fluoreszenzstrahlung nicht zurückreflektiert.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 8, dessen Objektträgerauflage (20) eine der Oberseite (21) gegenüberliegende Unterseite (23) aufweist, die nicht parallel zur Oberseite (21) verläuft, insbesondere eben ist und in einem Winkel größer oder gleich 45° zur Oberseite (21) liegt.