CN1264040C - 特别用于荧光显微的载玻片 - Google Patents
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Abstract
为了提高荧光发射层的位置分辨率及测量灵敏度,提出一种不显示自身荧光的,平板形构成的载玻片,并且所述载玻片至少在一个平板侧有吸收荧光的特性,或者设有荧光光线的抗反射层。
Description
技术领域
本发明涉及一种不显示出自身荧光的载玻片,特别是适用于荧光显微或者生物芯片应用。本发明还涉及载玻片在荧光显微方法上的应用,以及涉及具有载玻片支座的荧光显微镜,在所述的载玻片支座上可以安置载玻片。
背景技术
在荧光显微和生物芯片应用中公知,为了对荧光发射物质进行位置分辨的光度测量应在透明的载体板上,也就是载玻片上,安置荧光发射物质。然后用适当的光线照射激发荧光物质,然后位置分辨地测量从之发出的荧光发射。为了有良好的精确性,应当使荧光发射强度的误差尽可能地小。
因此当前为了高精度的测量采用了共焦显微镜,其焦深很小,以致于只能从要分析的发出荧光的物质层中接收荧光光线。从而有效地遮挡了由其它范围产生的荧光波长范围的光线。由此保证了只从受分析的范围内接受荧光光线。但是为了此优点付出的代价是相应的显微镜仪器设备成本,因为为了在显微镜中形成共焦所需要的可聚焦性一般地只有通过激光才能达到。此外对于光源的选择也有很强的限制。
另一种想法是,在不同的物像景深处取多个位置分辨的图像,接着对其进行数学处理。这种想法却要求大量的计算,从而取得一个图像所用时间漫长。此外还可能降低检测灵敏度。
一般地这种公知的方法只是在某种条件下才适用于进行时间分辨的处理,因为取得需要进行随后的数学处理的多个图像要求一定的时间。
如果由于成本而不使用共焦测量显微镜及所述的数学校正,就要承受误差或者降低测量灵敏度。
在2001年11月20日[电子显微镜科学目录]在因特网址www.emsdiasum.con/ems/histology/slides.html上公布了订货号为71876-0的载玻片,其下侧通过喷砂处理粗糙化。在号码3的说明书中表明,这种粗糙化处理的作用是保证载玻片下侧更好的可书写性。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种不用提高设备或者方法技术的复杂性就可以提高测量精确度的荧光显微装置。
根据本发明此目的通过不显示自身荧光的,平板形构成的载玻片完成,这种载玻片至少在一个平板侧有荧光吸收特性,或者设有荧光光线的抗反射层。
本发明的目的还通过具有载玻片支座的荧光显微镜实现,所述的载玻片支座上侧可以安置载玻片,并且入射到所述上侧的荧光光线不向所述上侧反射,以及通过使用平板形构成的并且入射在平板侧上的荧光光线不向此平板侧反射的载玻片,以达到非共焦荧光显微镜的荧光显微。
本发明从这样的认识出发:测量精确度主要地是由于受观察层的相邻区域之间的光串扰而削弱。这种串扰除了其它的影响之外还导致在对处于面向着物镜的载玻片上侧上的荧光物质进行光度测量时位置分辨率受限。这里,事实表明是由于在玻璃/空气界面上的荧光反射造成串扰,其中在荧光物质下总是出现反射。
有两个过程具有意义:一个是从具有荧光分子的载玻片物面发出从而进入载玻片的荧光,在对侧于载玻片/空气界面上至少部分地受反射然后返回其上有荧光物质层的物镜一侧的表面。在此荧光光线在显微镜中受测量并且导致测量的光强的误差。另一个过程则是载玻片上具有荧光分子的物面发出的荧光,在所述具有荧光分子的物面与显微镜物镜之间的盖玻片上受到反射,然后通过在载玻片上再次反射返回显微镜。这也同样导致了光串扰形式的误差。
本发明排除了这两个过程,要么在荧光层下设有荧光吸收层,要么设法使之不可能有向上侧的返回反射,也就不可能有向显微镜物镜的返回反射。从而阻断了相邻区域之间的串扰。
在此,吸收荧光或阻止返回反射可以在载玻片自身进行,其中在设计用于容纳荧光物质层的表面下方设置具有适当的荧光吸收特性的载玻片。变通地也可通过在与载玻片的用于容纳荧光物质层的上侧相对的下侧上设置抗反射层以使进入载玻片的荧光在其下侧离开,而不在此反射。用这样的载玻片时,必须在承放载玻片的支座上采取适当的措施,使得荧光光线不再不利地反射回载玻片。
因此这样地扩展根据本发明的荧光显微镜,使得入射在载玻片支座上的荧光光线不反射回载玻片。最简单的做法是吸收地或者不反射地构成载玻片支座上侧就足以完成此任。
一般地,荧光显微镜的载玻片支座由玻璃体构成。为了如所希望地避免荧光光线在其上侧的反射,就必须在其上设抗反射层。变通地还可以在支承载玻片的支座和载玻片之间设置具有折光率近于载玻片或者玻璃块的液体层。这种浸油在显微方法中公知地用在盖玻片与显微镜物镜之间。如果打算避免使用按照本发明观点难于自动化运用的液体,可以使用透明的,固态却又有挠性的具有所要求的光学特性的材料,也就是说可以避免界面反射。这样的材料说明于US5.313.264。
如果致力于不让荧光光线在载玻片支座上侧反射,可以用不同的适当手段达到使入射到载玻片支座上的光线不反射向载玻片。最简单的做法是所述的荧光吸收特性足担此任。
在荧光显微镜的一个特别有利的扩展中,让载玻片支座的与其上承载载玻片的上侧相对置的下侧具有反射特性,并且构成得使反射的光线从载玻片移开。对于此变形,优选地是其载玻片支座有与上侧不平行地安排的与上侧对置的下侧,特别是所述的下侧与上侧有大于45度的夹角。
这样设计的载玻片支座在对入射的荧光光线进行反射时而不会使其再返回载玻片,也就不会再返回显微镜物镜。
尽管所述的显微镜具有用常规的载玻片就能够提高位置分辨率的优点,但根据本发明的载玻片的优点却在于,它可以用常规的标准显微镜来明显改善分辨率,因为荧光的反射在载玻片自身中就被阻断了。
阻止反射的最简单的技术是适当的吸收层。为了达到所希望的本发明所述的效果,所述的吸收层应当只在具有荧光发射特性的物质层的下面,其中,“下面”的概念参照的是通过显微镜物镜的观察方向。对于这个扩展安排,优选地对平板形的载玻片上在平板侧进行吸光涂层。
对于在荧光显微中的应用,重要的是载玻片上没有不符合要求的自身荧光发射。因为,视应用不同在荧光显微中激发和检测宽频带的荧光光线,一般的是在300至700nm的波长范围,所以载玻片的材料在此波长范围内不应当显示出自身的荧光发射。其中根据本发明,“没有自身荧光发射”的概念理解成自身荧光发射只以微小到不由此而影响通常的荧光分析的规模出现。不然的话就不会如所希望的那样适于荧光显微,因为发射荧光的载玻片会掩盖测量信号。因此在所述的荧光显微中适于用玻璃作材料,因为玻璃没有自身荧光发射。
所以在一个特别简单地成功的实现中,在平板形的玻璃体上于平板侧进行光吸收涂层,例如涂黑。所述的涂层可以通过各种适合的方法进行,例如上漆、蒸镀、喷涂、蚀刻、等离子处理、UV照射、聚合物涂层(例如用赛珞珞产品涂层)或者铝阳极氧化处理。涂层的一面可以用在载玻片后来的下侧,还可以用在上侧,在上侧上然后再设荧光发射层。不论在什么情况下它都在荧光发射物质层的下方。但是出于干净的理由人们一般地把荧光发射物质层设在玻璃体的非涂层平板侧,以避免在荧光发射物质与涂层之间出现不利的相互作用。
荧光发射物质放在透明的载玻片上侧的构成方式的优点是,对于自动聚焦系统还提供了适于聚焦到界面上的空气/基质过渡。
变通地,所述载玻片还可以有吸收荧光的实心体,在此整个载玻片可以构成为实心体。对于所述的实心体同样也可以考虑采用具有填充了吸收荧光的金属氧化物的玻璃。
这样的物质也适用于光吸收层。因此优选地,所述的载玻片具有吸收荧光的物质,特别是金属氧化物。
如果采用其载玻片支座不反射荧光光线的显微镜,必须要设法使载玻片的下侧不出现荧光反射。这可以例如通过适当的抗反射层达到,所述的抗反射层优选地是宽带的,以对不同的荧光团的荧光起作用。
载玻片的吸收特性越好,其抑制光串扰的能力就越强。事实表明,把返回反射抑制约20%就可以显著改善测量质量。因此也就相应地提高了位置分辨率。如果把平板下侧除了涂上光吸收涂层之外还附加地构成为散射地反射荧光光线,就达到对光吸收的改善。这可以通过适当地粗糙化达到。否则尽管有吸收层也有可能不能够排除干扰性的反射部分。
为了与材料无关地达到对受分析的物体的良好附着性和良好的生物相容性,在载玻片的上侧涂覆以改善附着性或者生物相容性的层,例如二氧化硅层是有利的。这样在选择载玻片材料上有较大的自由度。
根据本发明,不反射入射到平板侧上的荧光光线的载玻片可以不再使用共焦荧光显微镜,而又不放弃对位置分辨率的要求。因此,根据本发明采用平板形构成的并且不把入射在平板侧的荧光光线向此平板侧反射回去的载玻片,以设计非共焦荧光显微镜的荧光显微。令人惊喜地,采用这样的载玻片使之达到了能够避开至今被认为不可放弃使用的,不仅价格不菲而且保养、维修和操作成本也较高的共焦荧光显微镜。从而可以用简单的荧光显微镜达到至今不可能达到的位置分辨率和测量灵敏度,因为采用所述的载玻片减少了光学串扰并且从而提高了位置分辨率。在此可以考虑前述的载玻片用作为载玻片;然而基本上重要的仅在于,所述的载玻片要尽可能地抑制并非直接地从物层发出的、而是经反射达到物镜的荧光光线。
附图说明
下面参照附图示例更加详细地说明本发明。在附图中,
图1为载玻片的透视图,
图2至图5是经载玻片的剖面图,
图6为一种非共焦荧光显微镜的示意图,
图7为经荧光显微镜的载玻片支座的示意性剖面图,而
图8和图9为说明载玻片对位置分辨率的影响的强度曲线图。
具体实施方式
图1为载玻片1的透视图,所述载玻片1具有上侧2,在上侧2上设有荧光发射层3。为了用显微镜进行分析,把载玻片1的下侧4放在载玻片支座上,并且在上侧2用激发光照射。通过激发发射出的荧光光线用安排在上侧2上方的显微镜物镜位置分辨地测量。
载玻片1是吸收荧光的实心体,所述实心体由在300至700nm之间的范围内不显示显著的自身荧光发射的底物构成。这种底物与吸收荧光的物质例如基于金属氧化物的物质混合成使得底物在模制成平板形的载玻片1后完全地着色。其中完全着色使得在平行于上侧2的整个载玻片1的横截面上都达到吸收要求。
染色优选地是黑色的,但是用吸收荧光光线的其它各种颜色进行染色也是适合的。
这种光吸收的特性导致没有多少荧光光线可以穿过平板,从而也不会再反射回上侧2。还有由放在荧光发射层3上的盖玻片(未示)反射的光线也会由染色的载玻片1吸收从而不能够达到显微镜物镜。
图2所示为载玻片1的另一种实施形式,其中与图1的载玻片的元件相应的元件用相同的标号标出。在图2的载玻片1的上侧2上同样地有荧光发射层3。然而在荧光发射层3的下面,在载玻片1的体5中间有吸收荧光光线的涂层6。所述的涂层通过各种适合的方法进行,例如上漆、蒸镀、喷涂、蚀刻、等离子处理、或者铝阳极氧化处理产生,从而使没有多少荧光光线可以穿过平板形的载玻片1,从而也不会再反射回下侧4。由盖玻片反射的光也由涂层6吸收。在涂层6的光学特性方面,这与图1所述的载玻片染色相当。所述载玻片也可以是不透明的。
图3所示为图2的构成形式的变形,其中吸收荧光的涂层6处在透明的载玻片1的体5的下侧4上。其余部分与图2的实施在意义上是相同的。
图4示出基本上与图3的载玻片相当的载玻片1。然而,取代吸收荧光的涂层6的是在载玻片1的下侧4上设有抗反射层7。这对于用于荧光分析的荧光团出现荧光发射性的整个频带来说是宽带的。可选择地,它们也可以是用于一或者多个在波长上典型的荧光团(例如,Cy3、C5、FGTC)的频带。抗反射层7的作用是,从上侧2的荧光发射层3向平板形载玻片1入射的荧光,在下侧4离开载玻片1而不反射回上侧2。
图5示出图3的构成形式的变型。在此在下侧4上的涂层被复合结构8替代,所述的复合结构8由粗糙化的下侧4和而后设置的荧光吸收层构成。所述的粗糙化起把从上侧2上的荧光发射层3射入的荧光在下侧4上加以更加良好地吸收的作用;通过复合结构8的粗糙化避免了各种情况下的反向漫射。顶多就出现散射的反向漫射,它可以达到较强地抑制在上侧2上的照射强度。
所述的载玻片使在荧光显微镜上不用共焦映射成为可能,而不必因此承受在位置分辨率和测量灵敏度上的损失。因此所述载玻片优选地用在非共焦的荧光显微镜中,如图6所示意。这样的荧光显微镜9一般地具有光源10,所述的光源10经过激发照射光路12中镜头11为激发滤光器13照明。在此光源10是宽带的光源,例如象卤光灯或者弧光灯那样的白炽光源。激发滤光器13只透射射入激发照射光路中的设计用于激发荧光的光谱部分。如果光源10采用窄带的光源,例如激光或者LED时可以取消激发滤光器13。
激发光线入射在分光器14上,所述的分光器在激发波长范围内是反射性的。它把产生的激发光线引导到物镜15上,从而照明载玻片1,所述的荧光发射层(图1中未示)处在此载玻片1上。变通地,激发光也可以不由物镜引导,而是斜向物镜15的侧面通过并射入到载玻片1中。
物镜15接收发射到载玻片1上的荧光发射,并且把此荧光发射引导进观测光路16中。其中分光器14构成为能透射过荧光波长的辐射。通过发射滤光器17和镜头18把荧光光线映射到摄像机19上,例如CCD接收器上,所述的发射滤光器17起消除在观测光路16中可能出现的激发光的作用。
尽管相对大面积地激发和映射荧光团,由于采用了设计以不把射入其上侧的荧光反射回显微镜的载玻片,所以可以不出现光串扰。因此可以在荧光显微镜9中取消采用否则就必须使用的共焦映射,而不用承受位置分辨率或者测量灵敏度的损失。与共焦显微镜相比,通过较大面积地扫描载玻片1还可以明显地提高测量速度。
所述的荧光显微镜可以用作生物芯片的专门的光读出器。
图7为经测量显微镜的剖面图,所述显微镜的载玻片确保不向显微镜物镜15反射入射到载玻片中的荧光光线。为此,显微镜有由玻璃体制造的载玻片支撑块20。所述的载玻片支撑块20有上侧21,上侧上有折光层22,所述折光层22确保从荧光层3入射到载玻片1中的荧光光线不在上侧21上反射。所述的折光层22例如可以采用油浸或者具有相似光学特性的有弹性的透明固体。所述的载玻片支撑块20的下侧23在第一变型中是反光地构成的。从载玻片1射入所述的载玻片支撑块20中的光线26由此受到偏转并且作为光线27达到出光面24,从而不反射回载玻片1。如果不设反射膜层25,还可以设吸收层。在总体上,所述的载玻片支撑块20与图1至图5为载玻片1所描述的情况相似;在那些图中为了阻止荧光光线在上侧21上反射所实施的可能性,都可以用在所述的载玻片支撑块20上。特别是下侧23不必须是对于上侧21倾斜的,但为了构成把光线26偏转成向着出光面24的光线27,有必要采用倾斜的反射面25。
图8和图9为说明避免入射在载玻片上荧光光线向回反射的设想对位置分辨率及检测灵敏度的影响的强度曲线图。在此于图8和图9中把强度I一维地在座标X上表示。
图8示出在出现返回反射时的强度曲线。这用曲线28表示。可以看到,荧光发射成分的实际宽度沿X方向为500个单位。这个宽度却仅在约1200个强度单位或者更加高的强度阈值29的基础上获得。这里较高阈值29却同时意味着灵敏度较低。有鉴于此,当然值得追求尽可能地大幅度降低强度阈值。然而在降低强度阈值29的同时却降低了位置分辨率,这是因为对荧光发射范围的宽度的感觉比实际要宽。例如如果选择用30标示出的强度阈值,就会出现沿X方向上几乎900个长度单位的宽度B。也就是说位置分辨率下降了近于一半。
如果如前所述,阻断了入射在载玻片的上侧的荧光光线的返回反射,就会得出图9中曲线31所示的强度曲线。如图所示,曲线31在0至500的长度单位上的上升缘比曲线28平缓得多。结果在较低的,强度单位为300的阈值30下测到校正的宽度B。从而在保持同样的位置分辨率的情况下通过将强度阈值从500降低到300个强度单位从而把检测极限降低了一半。这里甚至图9的曲线31还不是在其吸收特性方面取其最优化的原型下取得的。
Claims (12)
1.一种载玻片,包括:
两个平行的表面,所述两个平行的表面间具有一定的厚度从而形成一个平板,其中所述平板没有自身荧光发射,并且
对所述表面中的至少一个表面进行处理以吸收荧光光线,或者
所述表面中的至少一个表面至少部分地涂覆有抗反射层,该抗反射层用来防止荧光光线的镜面反射。
2.如权利要求1所述的载玻片,其特征在于,所述平板由玻璃制成。
3.如权利要求1所述的载玻片,其特征在于,所述表面中的至少一个表面涂成黑色。
4.如权利要求1所述的载玻片,其特征在于,所述的平板具有荧光吸收物质。
5.如权利要求1所述的载玻片,其特征在于,所述的至少一个表面通过被粗糙化对荧光光线散射地反射。
6.如权利要求1所述的载玻片,其特征在于,所述表面中的至少一个表面设有改善附着性的或者提高生物相容性的层。
7.一种使用载玻片的方法,包括:
提供载玻片,该载玻片包括:彼此平行的第一表面和第二表面,两个表面间具有一定的厚度从而形成一个平板,其中所述第二表面设有吸收荧光光线的涂层、或者防止荧光光线的镜面反射的涂层,使得入射到第二表面上的荧光光线不会被所述平板反射回第一表面,和
使用该载玻片用于非共焦荧光显微镜中的荧光显微。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述平板由玻璃制成。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述表面中的至少一个表面涂成黑色。
10.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的平板具有荧光吸收物质。
11.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的平板具有金属氧化物。
12.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述表面中的至少一个表面通过被粗糙化对荧光光线散射地反射。
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