DE102020200567B4

DE102020200567B4 - Verfahren zur Analyse der Keimfähigkeit von Pflanzensamen

Info

Publication number: DE102020200567B4
Application number: DE102020200567.2A
Authority: DE
Inventors: Klaus Mummenhoff; Said Mohammed; Samik Bhattacharya
Original assignee: OSNABRUECK, University of; Universitat Osnabrueck
Current assignee: OSNABRUECK, University of; Universitat Osnabrueck
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2024-03-07
Anticipated expiration: 2040-01-18
Also published as: DE102020200567A1

Abstract

Verfahren zur Analyse der Keimfähigkeit von einzelnen Pflanzensamen mit den Schritten:Kontaktieren einer vorbestimmten Anzahl einzelner Pflanzensamen, jeweils in getrennten Gefäßen, mit einem vorbestimmten Volumen einer Testlösung, die Resazurin und Hefe aufweist, Inkubieren der Pflanzensamen mit der Testlösung unter Lichtausschluss, Entfernen der Pflanzensamen aus der Testlösung, für jeden Pflanzensamen getrenntes Ermitteln der Absorption der Testlösung bei 570 nm, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der zu testenden Pflanzensamen für jeden einzelnen Pflanzensamen bestimmt wird und das Volumen der Testlösung abhängig vom berechneten Volumen des Pflanzensamens vorbestimmt wird, wobei das Volumen der Testlösung zumindest das Zweifache des Volumens des einzelnen Pflanzensamens beträgt, dass die gemessene Absorption der Testlösung durch Subtrahieren der Absorption einer Testlösung ohne Pflanzensamen zur Erzeugung eines ersten Differenzwertes und anschließendes Dividieren des ersten Differenzwertes durch den dekadischen Logarithmus des Volumens des einzelnen Pflanzensamens normalisiert wird, um einen normalisierten Absorptionswert zu bestimmen, und dass der normalisierte Absorptionswert der Testlösung in eine für die Spezies des Pflanzensamens vorbestimmte erste Regression eingeordnet wird, die den normalisierten Absorptionswert auf die Keimungsrate der Pflanzensamen abbildet, und dass bei einer daraus bestimmten Keimungsrate von zumindest 30 ± 10 % das Verfahren mit demselben Pflanzensamen in zeitlichem Abstand wiederholt wird, wobei der Pflanzensamen bis zur Wiederholung des Verfahrens weiter gelagert wird, und bei einer bestimmten Keimungsrate unterhalb von 30 ± 10 % der Pflanzensamen innerhalb von maximal einer Woche zur Vermehrung gekeimt wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse der Keimfähigkeit von Pflanzensamen durch Nachweis der Redoxreaktivität in einer Resazurin und Hefe enthaltenden Testlösung.
Das Verfahren hat den Vorteil, dass es die Reaktion des für Pflanzensamen ungiftigen Farbstoffs Resazurin nachweist und daher die wiederholte Testung derselben Samen, z.B. im Rahmen regelmäßiger Keimfähigkeitskontrollen, ermöglicht. Das Verfahren hat den Vorteil, dass z.B. Variationen in der Größe der Pflanzensamen das Ergebnis nicht beeinträchtigen. Es hat sich gezeigt, dass die Keimfähigkeit von Pflanzensamen mit dem Verfahren genauer vorhergesagt werden kann als mit anderen Keimfähigkeitstests, da erfindungsgemäß das Volumen der Testlösung an die Größe der zu testenden Pflanzensamen angepasst wird und die erhaltenen Messwerte auf die Größe der Pflanzensamen normalisiert werden. Das Verfahren hat den Vorteil, dass es die Analyse der Keimfähigkeit von Pflanzensamen einer großen Anzahl verschiedener Pflanzenarten erlaubt, da die erhaltenen Messwerte mittels einer speziesspezifischen Regression ausgewertet werden können.
In der Ausführungsform, in der die Hefe Bäckerhefe ist, z.B. Trockenhefe oder Frischhefe, hat das Verfahren den Vorteil, dass es sehr preisgünstig ist. Das Verfahren hat weiterhin den Vorteil, dass es im Hochdurchsatz durchführbar ist.
Stand der Technik
Aus der Veröffentlichung Min, T.G. und Kang, W.S. (2011, Hort. Environ. Biotechnol. 52, 240-245) ist bekannt, dass die Keimfähigkeit von Pflanzensamen mit zunehmender Beschädigung der Samenhülle, die einen Austritt von Glucose und anderen reduzierenden Stoffen aus dem Sameninneren in die umgebende Testlösung zur Folge hat, sinkt. Beim Keimfähigkeitstest eines Pflanzensamens mit beschädigter Samenhülle in einer Resazurin enthaltenden Testlösung wird Resazurin zu Resorufin bzw. Dihydroresorufin umgesetzt und erzeugt einen Farbumschlag von blau über rosa zu farblos. Weiterhin ist in der Testlösung Hefe enthalten. Pflanzensamen mit intakter Hülle erzeugen keinen Farbumschlag in der Testlösung und können weiterhin gelagert werden. Alternde Pflanzensamen mit teilweise beschädigter Hülle erzeugen durch das Verfahren einen Farbumschlag nach rosa und sollten einer regelmäßigen Wiederholung des Tests unterzogen werden. Beschädigte oder tote Pflanzensamen erzeugen durch das Verfahren einen Farbumschlag zu einer farblosen Testlösung und sollten unmittelbar zur Vermehrung gekeimt werden. Durch Messen der Absorption bzw. Farbe der Testlösung wird der Farbumschlag quantifiziert.
Es ist bekannt, die Keimfähigkeit von Saatgut unter Zerstörung des Pflanzensamens zu prüfen, bspw. durch Keimungstests oder mittels Tetrazolium-Färbung.
Die EP 2 245 176 B1 beschreibt ein Verfahren zur Analyse der Keimfähigkeit von Pflanzensamen durch Kontaktieren mit einem festgelegten Volumen einer Testlösung, die Resazurin und Hefe aufweist, und Messen des Farbumschlags der Testlösung nach einer Inkubationszeit.
Mohammed et al., Trends in Plant Science (2019) beschreibt ein Verfahren zur Analyse der Keimfähigkeit von Pflanzensamen, wobei zur genaueren Bestimmung der Keimfähigkeit die gemessene Absorption in eine speziesspezifische Regression eingeordnet wird.
Die WO 2018/015495 beschreibt eine Analyse der Keimfähigkeit von Maissamen mittels Niederfeld-Magnetresonanz unter Verwendung eines mathematischen Modells.
Aufgabe der Erfindung
Der Erfindung stellt sich die Aufgabe, ein alternatives Verfahren zur Analyse der Keimfähigkeit von Pflanzensamen bereitzustellen. Eine bevorzugte Aufgabe ist das Bereitstellen eines kostengünstigen und mit demselben Pflanzensamen wiederholbaren Verfahrens zur Analyse der Keimfähigkeit, das auf eine große Anzahl verschiedener Pflanzenarten und Pflanzensamengrößen angewendet werden kann und mittels dessen die Keimfähigkeit genauer bestimmt werden kann.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung löst die Aufgabe mit den Merkmalen der Ansprüche und stellt insbesondere ein Verfahren zur Analyse der Keimfähigkeit von Pflanzensamen bereit, das die Schritte Kontaktieren einer vorbestimmten Anzahl zu testender einzelner Pflanzensamen, jeweils in getrennten Gefäßen, mit einem vorbestimmten Volumen einer Testlösung, Inkubieren der Pflanzensamen mit der Testlösung unter Lichtausschluss, Entfernen der Pflanzensamen aus der Testlösung, für jeden Pflanzensamen getrenntes Messen der Farbe der Testlösung und, je nach Messwert, Lagern des Pflanzensamens, Wiederholen des Verfahrens in zeitlichem Abstand oder Keimen zur Vermehrung des Pflanzensamens, aufweist oder daraus besteht.
Die Keimfähigkeit von Pflanzensamen wird durch die Keimungsrate beschrieben, die in einem Keimungsexperiment ermittelt wird. Die Keimungsrate ist der prozentuale Anteil von Samen, die in einem Keimungsverfahren, z.B. nach dem ISTA-Protokoll (International Rules for Seed Testing 2017, Kapitel 5), keimen. Eine reduzierte Keimungsrate wird durch eine reduzierte Keimfähigkeit der Pflanzensamen erzeugt.
In einer Ausführungsform kann das Verfahren die Schritte

a) Kontaktieren einer vorbestimmten Anzahl einzelner Pflanzensamen, jeweils in getrennten Gefäßen, mit einem vorbestimmten Volumen einer Testlösung, die Resazurin und Hefe aufweist oder daraus besteht,
b) Inkubieren der Pflanzensamen mit der Testlösung unter Lichtausschluss,
c) Entfernen der Pflanzensamen aus der Testlösung,
d) für jeden Pflanzensamen getrenntes Messen der Farbe der Testlösung, wobei die Farbe der Testlösung durch Ermitteln der Absorption der Testlösung bei 570 nm gemessen wird,
e) Normalisieren der in Schritt d) gemessenen Absorption der Testlösung durch Subtrahieren der Absorption einer Testlösung ohne Pflanzensamen zur Erzeugung eines ersten Differenzwertes und anschließendes Dividieren des ersten Differenzwertes durch den dekadischen Logarithmus des Volumens des einzelnen Pflanzensamens, um einen normalisierten Absorptionswert zu bestimmen,
f) bei einem normalisierten Absorptionswert von zumindest 4: weiteres Lagern des Pflanzensamens, bei einem normalisierten Absorptionswert zwischen 2 und 4: Wiederholen des Verfahrens mit demselben Pflanzensamen in zeitlichem Abstand und bei einem normalisierten Absorptionswert von höchstens 2: Keimen des Pflanzensamens zur Vermehrung,

Alternativ kann das Verfahren derart durchgeführt werden, dass in Schritt f) der normalisierte Absorptionswert der Testlösung in eine für die Spezies des Pflanzensamens vorbestimmte erste Regression eingeordnet wird, die den normalisierten Absorptionswert auf die Keimungsrate der Pflanzensamen abbildet, und dass bei einer daraus bestimmten Keimungsrate von zumindest 30 ± 10 %, z.B. von zumindest 20 %, das Verfahren mit demselben Pflanzensamen in zeitlichem Abstand wiederholt wird, wobei der Pflanzensamen bis zur Wiederholung des Verfahrens weiter gelagert wird, und bei einer bestimmten Keimungsrate unterhalb von 30 ± 10 %, z.B. unterhalb von 20 %, der Pflanzensamen innerhalb von maximal einer Woche, bevorzugt innerhalb von maximal drei Tagen, z.B. noch am selben Tag, zur Vermehrung gekeimt wird.
In einer vereinfachten Ausführungsform kann das Verfahren die Schritte

a) Kontaktieren einer vorbestimmten Anzahl einzelner Pflanzensamen, jeweils in getrennten Gefäßen, mit einem vorbestimmten Volumen einer Testlösung, die Resazurin und Hefe aufweist,
b) Inkubieren der Pflanzensamen mit der Testlösung unter Lichtausschluss,
c) Entfernen der Pflanzensamen aus der Testlösung,
d) für jeden Pflanzensamen getrenntes Messen der Farbe der Testlösung durch visuelles Bestimmen, ob die Testlösung blau, rosa oder farblos ist, wobei bei einer blauen Farbe der Testlösung der Pflanzensamen für bis zu 5 Jahre weiter gelagert wird, bei einer rosa Farbe der Testlösung das Verfahren mit demselben Pflanzensamen in zeitlichem Abstand von zumindest 3 Monaten bis zu 1 Jahr wiederholt wird, und bei einer farblosen Testlösung der Pflanzensamen innerhalb von maximal einer Woche, bevorzugt innerhalb von maximal drei Tagen, z.B. noch am selben Tag, zur Vermehrung gekeimt wird,

Pflanzensamen können eine runde oder längliche Form haben, oder können unregelmäßig geformt sein. Bevorzugt werden für die Analyse mit dem Verfahren Pflanzensamen ausgewählt, die einen Durchmesser von zumindest 1 mm, bevorzugt zumindest 2mm, zumindest 2,5 mm, bis zu 30 mm, bevorzugt bis zu 25 mm oder bis zu 20 mm, z.B. 5 mm oder 10 mm, aufweisen.
Bevorzugt werden für die Analyse mit dem Verfahren Pflanzensamen ausgewählt, die maximal 5 Gew.-%, bevorzugt maximal 3,5 Gew.-%, bevorzugter maximal 3 Gew.-% Glucose, Stärke, reduzierende Zucker oder Kombinationen daraus enthalten. Es hat sich gezeigt, dass ein hoher Gehalt von z.B. zumindest 3,5 Gew.-% an reduzierendem Zucker im Pflanzensamen zu falsch-positiven Ergebnissen in Nachweisverfahren mit Resazurin führen kann.
Die Testlösung weist Resazurin und Hefe in Wasser auf, wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae von Reinzuchtqualität sein kann, z.B. Hefe des Typs YSC2, oder bevorzugt mit Bakterien kontaminierte Trockenhefe, die auch als Bäckerhefe bezeichnet wird, sein kann. Es hat sich gezeigt, dass sich mit dem Verfahren unter Einsatz von Bäckerhefe bei geringeren Kosten des Verfahrens verlässliche Vorhersagen über die Keimfähigkeit von Pflanzensamen treffen lassen.
Die Testlösung weist 0,001 bis 0,05 Gew.-%, bevorzugt 0,005 bis 0,02 Gew.-%, bevorzugt 0,01 Gew.-% Resazurin, sowie 0,1 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt 0,5 bis 1,3 Gew.-%, bevorzugter 0,8 Gew.-% Hefe, in Wasser auf oder besteht daraus.
Die Testlösung wird bevorzugt durch Einmischen des Resazurins und der Hefe in Wasser bei Raumtemperatur hergestellt.
Das Wasser ist bevorzugt destilliertes Wasser.
Optional werden die Pflanzensamen vor dem Kontaktieren mit der Testlösung mit destilliertem Wasser gewaschen. Es hat sich gezeigt, dass insbesondere kommerziell erhältliche Pflanzensamen Chemikalien auf ihrer Oberfläche aufweisen, die das Verfahren stören können und die durch Waschen entfernbar sind.
Generell wird vor Schritt a) des Verfahrens die Größe bzw. das Volumen der zu testenden Pflanzensamen für jeden einzelnen Pflanzensamen bestimmt. Das Messen der Größe bzw. des Volumens der Pflanzensamen kann z.B. durch Messen des Durchmessers d des Pflanzensamens oder der Höhe h, Breite b und Tiefe t des Pflanzensamens mittels eines Messschiebers oder mittels Laserabtastung und daraus Berechnen des Volumens des Pflanzensamens erfolgen, oder kann z.B. durch Messen der Volumenverdrängung in einer Flüssigkeit erfolgen.
Das Volumen V eines kugelförmigen Pflanzensamens kann aus dem gemessenen Durchmesser d des Pflanzensamens nach der Formel V = 1/6 × π × d³ berechnet werden. Alternativ kann das Volumen V eines länglichen Pflanzensamens aus der gemessenen Höhe h, Breite b und Tiefe t des Pflanzensamens nach der Formel V = 1/6 × π × h × b × t berechnet werden.
Das Volumen der Testlösung, die mit dem Pflanzensamen kontaktiert wird, um die Keimfähigkeit des Pflanzensamens zu analysieren, wird abhängig vom berechneten Volumen des Pflanzensamens vorbestimmt. Bevorzugt optional beträgt das Volumen der Testlösung zumindest das Zweifache, bevorzugt zumindest das Dreifache bis maximal das Fünffache oder maximal das Zehnfache des Volumens des Pflanzensamens, wobei bevorzugt das Verhältnis aus Volumen der Testlösung und Samenvolumen konstant für alle im selben Versuch getesteten Pflanzensamen ist, oder das Volumen der Testlösung beträgt alternativ optional 150 µL für Pflanzensamen eines Durchmessers unterhalb von 5mm, 500 µL für Pflanzensamen eines Durchmessers zwischen 5 und 10 mm, und 1500 µL für Pflanzensamen eines Durchmessers oberhalb von 10 mm. Es hat sich gezeigt, dass ein Anpassen des Volumens der Testlösung an das Volumen des Pflanzensamens zu genaueren Vorhersagen über die Keimfähigkeit der Pflanzensamens führen kann.
Das Kontaktieren der Pflanzensamen mit der Testlösung erfolgt bevorzugt durch Vorlegen des vorbestimmten Volumens der Testlösung in ein für die Analyse geeignetes Gefäß und anschließende Zugabe der einzelnen Pflanzensamen, jeweils in getrennten Gefäßen. Ein geeignetes Gefäß kann z.B. eine Küvette sein, oder kann ein Reaktionsröhrchen oder ein Napf einer Analyseplatte mit mehreren Näpfen sein.
Bevorzugt wird mit dem Verfahren eine vorbestimmte Anzahl zu testender Pflanzensamen auf ihre Keimfähigkeit getestet. Durch Mitteln der Messwerte mehrerer Pflanzensamen, bevorzugt von zumindest 3 oder zumindest 5 bis zu 150 oder bis zu 500 Pflanzensamen, z.B. von 96 Pflanzensamen, kann die Keimfähigkeit genauer bestimmt werden. Alternativ kann die Keimfähigkeit auch für eine geringe Anzahl von z.B. 1 Pflanzensamen bestimmt werden.
Die vereinzelten Pflanzensamen werden in Schritt b) des Verfahrens mit der Testlösung für zumindest 1 Stunde, bevorzugt zumindest 2 Stunden, zumindest 3 Stunden, bis zu 6 Stunden, z.B. für 4 Stunden inkubiert. Es hat sich gezeigt, dass eine davon abweichende Inkubationszeit zu fehlerhaften Vorhersagen über die Keimfähigkeit der Pflanzensamen führen kann.
Die Inkubation der Pflanzensamen mit der Testlösung in Schritt b) des Verfahrens erfolgt generell unter Lichtausschluss, da das Resazurin unter Lichteinfluss ausbleichen kann, was zu fehlerhaften Vorhersagen über die Keimfähigkeit der Pflanzensamen führen kann.
Die Inkubation der Pflanzensamen mit der Testlösung in Schritt b) des Verfahrens erfolgt in jeweils getrennten Gefäßen, z.B. in separaten Näpfen einer Analyseplatte mit mehreren Näpfen, bei einer Temperatur von bevorzugt zumindest 25 °C oder zumindest 30 °C bis zu 37 °C, z.B. bei 35 °C.
Generell werden die Pflanzensamen in Schritt c) des Verfahrens vor dem Messen der Absorption der Testlösung aus der Testlösung entfernt, um eine fehlerfreie Messung zu ermöglichen.
Das Messen der Farbe der Testlösung in Schritt d) des Verfahrens kann durch visuelles Bestimmen der Farbe, d.h. ob die Testlösung blau, rosa oder farblos ist, erfolgen, oder kann bevorzugt durch Ermitteln der Absorption der Testlösung bei 570 nm erfolgen. Generell erfolgt das Messen für jeden Pflanzensamen getrennt.
In der Ausführungsform, in der das Messen durch visuelles Bestimmen, ob die Testlösung blau, rosa oder farblos ist, erfolgt, hat das Verfahren den Vorteil, dass kein Messgerät zur Analyse der Keimfähigkeit der Pflanzensamen notwendig ist.
In der Ausführungsform, in der das Messen in Schritt d) des Verfahrens durch Ermitteln der Absorption der Testlösung bei 570 nm erfolgt, hat das Verfahren den Vorteil, dass die mit dem Verfahren ermittelten Vorhersagen zur Keimfähigkeit der analysierten Pflanzensamen aussagekräftiger sind als in anderen Verfahren, z.B. mittels visuellen Bestimmens, ermittelte Vorhersagen. In dieser Ausführungsform erfolgt das Messen in einem Messgerät, das eingerichtet ist, die Absorption einer Lösung bei 570 nm zu bestimmen. Bevorzugt ist das Messgerät ein Photometer und eingerichtet, alle Näpfe einer Analyseplatte, die mehrere Näpfe umfasst, gleichzeitig oder nacheinander in einer Messung zu messen und die Messwerte als Absorption der Testlösung bei 570 nm auszugeben.
In der Ausführungsform, in der das Messen in Schritt d) des Verfahrens durch Ermitteln der Absorption der Testlösung bei 570 nm erfolgt, kann die gemessene Absorption der Testlösung bei 570 nm (Rohdaten) durch Subtrahieren der Absorption bei 570 nm einer Testlösung ohne Pflanzensamen zur Erzeugung eines Differenzwertes und anschließendes Dividieren des Differenzwertes durch den dekadischen Logarithmus des Volumens des einzelnen Pflanzensamens normalisiert werden, um einen normalisierten Absorptionswert zu erzeugen. Es hat sich gezeigt, dass durch die Normalisierung der Messwerte eine genauere Vorhersage über die Keimfähigkeit der analysierten Pflanzensamen getroffen werden kann als mit bekannten Verfahren zur Analyse der Keimfähigkeit von Pflanzensamen, wie z.B. dem in der EP 2 245 176 B1 beschriebenen Verfahren, da Keimfähigkeit und Alter der Pflanzensamen zwar signifikant mit den normalisierten Absorptionswerten korrelieren, aber nicht mit den Rohdaten.
In Schritt e) des Verfahrens wird die Absorption einer Testlösung ohne Pflanzensamen dadurch bestimmt, dass die Absorption für die in Schritt a) eingesetzte Testlösung bestimmt wird, die ohne Pflanzensamen für dieselbe Zeit unter den gleichen Bedingungen inkubiert wurde wie die Testlösung mit Pflanzensamen in Schritt b) des Verfahrens.
Bevorzugt wird im Verfahren bei einem normalisierten Absorptionswert von zumindest 4 der Pflanzensamen für einen Zeitraum von bis zu 5 Jahren weiter gelagert, bei einem normalisierten Absorptionswert zwischen 2 und 4 das Verfahren mit demselben Pflanzensamen in zeitlichem Abstand von zumindest 3 Monaten bis zu 1 Jahr wiederholt und bei einem normalisierten Absorptionswert von höchstens 2 der Pflanzensamen innerhalb von maximal einer Woche, bevorzugt innerhalb von maximal drei Tagen, z.B. noch am selben Tag, zur Vermehrung gekeimt.
Pflanzensamen, mit denen das Verfahren in zeitlichem Abstand wiederholt wird, werden bis zur Wiederholung des Verfahrens weiter gelagert.
Pflanzensamen, die weiter gelagert werden, werden bevorzugt getrocknet, vakuumiert und bei -20 °C unter Lichtausschluss gelagert.
In einer Ausführungsform des Verfahrens wird der normalisierte Absorptionswert der Testlösung in eine für die Spezies des Pflanzensamens vorbestimmte, d.h. speziesspezifische, erste Regression eingeordnet, die durch eine erste Regressionskurve definiert ist, die den normalisierten Absorptionswert auf die Keimungsrate der Pflanzensamen abbildet. Anhand der ersten Regression kann eine speziesspezifische Vorhersage über die Keimfähigkeit des untersuchten Pflanzensamens getroffen werden. In dieser Ausführungsform wird bei einer aus der Regression bestimmten Keimungsrate von zumindest 30 ± 10 % das Verfahren mit demselben Pflanzensamen in zeitlichem Abstand wiederholt, wobei der Pflanzensamen bis zum Wiederholen des Verfahrens gelagert wird, und bei einer bestimmten Keimungsrate unterhalb von 30 ± 10 % der Pflanzensamen innerhalb von maximal einer Woche, bevorzugt innerhalb von maximal drei Tagen, z.B. noch am selben Tag, zur Vermehrung gekeimt.
Alternativ optional kann die erste Regression eine für alle Spezies der Pflanzensamen zusammen vorbestimmte, d.h. speziesunspezifische und als „Zusammen“ dargestellte, Regression sein.
In einer weiteren Ausführungsform kann der normalisierte Absorptionswert der Testlösung in eine für die Spezies des Pflanzensamens vorbestimmte zweite Regression eingeordnet werden, die den normalisierten Absorptionswert auf das Alter der Pflanzensamen abbildet, um einen Wert für das Alter (Messalter) des Pflanzensamens zu erzeugen.
Die erste Regression kann durch Parallelansätze im selben Versuch mit Pflanzensamen bekannter Spezies und bekannter Keimungsrate gebildet sein, oder kann durch Entnehmen einer vorbekannten Regressionskurve, z.B. aus einer Datenbank, gebildet sein.
Mittels der ersten Regression wird bevorzugt derjenige Absorptionswert bestimmt, der einer Grenzkeimungsrate von 30 ± 10 % zugeordnet ist, um einen Grenzabsorptionswert zu erzeugen.
Bevorzugt wird in einer Ausführungsform der zeitliche Abstand bis zum Wiederholen des Verfahrens durch Bestimmen jenes Alters des Pflanzensamens, zu dem mittels der zweiten Regression der Grenzabsorptionswert zugeordnet ist, zur Erzeugung des Wertes für ein Grenzalter des Pflanzensamens, Subtrahieren des Messalters des Pflanzensamens vom Grenzalter des Pflanzensamens zur Erzeugung eines zweiten Differenzwertes, und Multiplizieren des zweiten Differenzwertes mit einem Faktor bestimmt.
Der Grenzabsorptionswert kann mittels der zweiten Regression zu jenem Alter des Pflanzensamens zugeordnet werden, bei dem der Pflanzensamen eine Keimungsrate von 30 ± 10 % aufweist, um ein Grenzalter des Pflanzensamens zu bestimmen. Altert der Pflanzensamen, z.B. bei fortgesetzter Lagerung über das Grenzalter hinaus, sinkt die Wahrscheinlichkeit seiner erfolgreichen Keimung in einem Keimungsversuch unter die Grenzkeimungsrate.
Durch Subtrahieren des Messalters vom Grenzalter des Pflanzensamens wird ein zweiter Differenzwert erzeugt. Der zweite Differenzwert beschreibt den Zeitraum, der verbleibt, bis die Keimungsrate des Pflanzensamens unter die Grenzkeimungsrate fällt.
Um den Alterungsprozess des Pflanzensamens zu überwachen, kann das Verfahren mit demselben Samen wiederholt werden. Es hat sich gezeigt, dass dadurch die Keimfähigkeit des Pflanzensamens nicht abnimmt.
Der zeitliche Abstand zwischen zwei Wiederholungen des Verfahrens wird bevorzugt durch Multiplizieren des zweiten Differenzwertes mit einem Faktor berechnet. Es hat sich gezeigt, dass durch Wahl eines geeigneten Faktors Schwankungen im Alterungsprozess des Pflanzensamens rechtzeitig berücksichtigt werden können.
Der Faktor ist bevorzugt ein Faktor von zumindest 0,2, bevorzugter zumindest 0,5 oder zumindest 0,8, bis maximal Faktor 1, bevorzugt maximal 0,95, z.B. 0,66 oder 0,75.
Die zweite Regression kann durch Parallelversuche mit Pflanzensamen bekannten Alters gebildet sein, oder kann durch Entnehmen einer vorbekannten Regressionskurve, z.B. aus einer Datenbank, gebildet sein.
Die Regressionskurve der ersten bzw. zweiten Regression kann eine Gerade sein, oder kann gebogen sein, z.B. eine sigmoide Form haben. Bevorzugt sind erste und/oder zweite Regression lineare Regressionen.
Die Erfindung wird nun genauer anhand von Beispielen und mit Bezug auf die Figuren beschrieben, die in

- 1a die Zuordnung des normalisierten Absorptionswertes zur Keimungsrate von Pflanzensamen
- 1b die Zuordnung der gemessenen Absorption bei 570 nm (Rohdaten) zur Keimungsrate von Pflanzensamen
- 2a die Zuordnung des normalisierten Absorptionswertes zum Alter von Pflanzensamen
- 2b die Zuordnung der gemessenen Absorption bei 570 nm (Rohdaten) zum Alter von Pflanzensamen
- 3a speziesspezifische Zuordnungen des normalisierten Absorptionswertes zur Keimungsrate von Pflanzensamen einer großen Zahl von Pflanzenfamilien aus einer ex situ Samenbank
- 3b eine allgemeine Zuordnung des normalisierten Absorptionswertes zur Keimungsrate von Pflanzensamen einer großen Zahl von Pflanzenfamilien aus einer ex situ Samenbank
- 3c speziesspezifische Zuordnungen des normalisierten Absorptionswertes zur Keimungsrate von kommerziell erhältlichen Pflanzensamen einer großen Zahl von Pflanzenfamilien
- 3d eine allgemeine Zuordnung des normalisierten Absorptionswertes zur Keimungsrate von kommerziell erhältlichen Pflanzensamen einer großen Zahl von Pflanzenfamilien
- 3e die speziesspezifischen Zuordnungen der 3a ohne Messwertsymbole
- 3f die speziesspezifischen Zuordnungen der 3c ohne Messwertsymbole
- 4a den Einfluss der mehrfachen Wiederholung des Verfahrens auf die Keimungsrate der getesteten Pflanzensamen
- 4b den Einfluss der mehrfachen Wiederholung des Verfahrens auf die normalisierten Absorptionswerte der getesteten Pflanzensamen

Beispiel 1: Verbesserung der Aussagekraft der Analyse durch Normalisierung der Messwerte
Pflanzensamen von Brassica napus, Brassica oleracea, Lepidium campestre und Lepidium draba eines Alters zwischen 10 und 35 Jahren aus einer ex situ Samenbank wurden vereinzelt und in Analyseplatten mit je 96 Näpfen auf ihre Keimfähigkeit analysiert. Dabei wurden die einzelnen Pflanzensamen, jeweils in getrennten Gefäßen, mit einem vorbestimmten Volumen einer Testlösung kontaktiert, mit der Testlösung unter Lichtausschluss für 4 Stunden bei 35 °C inkubiert und anschließend aus der Testlösung entfernt. Für jeden Pflanzensamen wurde die Farbe der Testlösung durch Ermitteln des Absorptionswertes bei 570 nm in einem Photometer gemessen.
Die ermittelten Absorptionswerte wurden in 144 speziesspezifische und altersspezifische Gruppen zu je 15 Pflanzensamen zusammengefasst, ggf. normalisiert und für jede Gruppe Pflanzensamen gemittelt. Die prozentuale Keimungsrate wurde durch Keimen der analysierten Pflanzensamen festgestellt.
Die 1 zeigt die Zuordnung der normalisierten Absorptionswerte (1a) bzw. der Rohdaten der gemessenen Absorptionen bei 570 nm (1b) zur Keimungsrate von Pflanzensamen der Spezies Brassica napus, Brassica oleracea, Lepidium campestre und Lepidium draba. Der normalisierte Absorptionswert ist gegen die prozentuale Keimungsrate aufgetragen. Mittels einer ersten linearen Regression wurden Zusammenhänge zwischen normalisiertem Absorptionswert und Keimungsrate beschrieben. Das Bestimmtheitsmaß R² beschreibt die Güte der Regression. Eine Regression beschreibt gemessene Messwerte besser, wenn sie eine höhere Güte der Regression, d.h. Zuverlässigkeit der Beschreibung der Messwerte durch die Regression, ausgedrückt durch einen höheren R²-Wert, aufweist. R²-Werte oberhalb von 0,6 sind statistisch signifikant; zugehörige Regressionen können einen Zusammenhang, bspw. zwischen Absorption und Keimungsrate, zuverlässig beschreiben.
Die ermittelten R²-Werte der in 1a jeweils als Punktlinien gezeigten linearen Regressionen betragen für Brassica napus 0,93, für Brassica oleracea 0,99, für Lepidium campestre 0,91 und für Lepidium draba 0,71. Die entsprechenden R²-Werte der 1b betragen für Brassica napus 0,094, für Brassica oleracea 0,4, für Lepidium campestre 0,36 und für Lepidium draba 0,23. Die Bestimmtheitsmaße in 1a sind höher als in 1b und sind höher als der Schwellenwert 0,6 für statistische Signifikanz.
Der Vergleich der Bestimmtheitsmaße zeigt, dass durch die erfindungsgemäße Normalisierung der gemessenen Absorption bei 570 nm (Rohdaten) durch Subtrahieren der Absorption einer Testlösung ohne Pflanzensamen zur Erzeugung eines ersten Differenzwertes und anschließendes Dividieren des ersten Differenzwertes durch den dekadischen Logarithmus des Volumens des Pflanzensamens die Aussagekraft der Keimfähigkeitsanalyse erhöht wurde, und dass die resultierende erste Regression die normalisierten Messwerte mit höherer statistischer Signifikanz beschreibt als im Verfahren ohne Normalisierung der Messwerte.
Die Messwerte des Versuches wurden außerdem für die Erzeugung speziesspezifischer linearer zweiter Regressionen verwendet, die die normalisierten Absorptionswerte zum Alter der Pflanzensamen zuordnen.
2 zeigt die Zuordnung der normalisierten Absorptionswerte (2a) bzw. der Rohdaten der gemessenen Absorptionen bei 570 nm (2b) zum Alter von Pflanzensamen der Spezies Brassica napus, Brassica oleracea, Lepidium campestre und Lepidium draba.
Die ermittelten Bestimmtheitsmaße der in 2a jeweils als Punktlinien gezeigten linearen Regressionen betragen für Brassica napus 0,76, für Brassica oleracea 0,98, für Lepidium campestre 0,91 und für Lepidium draba 0,61. Die ermittelten Bestimmtheitsmaße der in 2b aus Rohdaten ermittelten jeweils als Punktlinien gezeigten Regressionen betragen für Brassica napus 0,13, für Brassica oleracea 0,35, für Lepidium campestre 0,48 und für Lepidium draba 0,22. Die Bestimmtheitsmaße in 2a sind höher als in 2b und sind höher als der Schwellenwert 0,6 für statistische Signifikanz.
Der Vergleich der Bestimmtheitsmaße zeigt, dass durch die erfindungsgemäße Normalisierung der Absorptionswerte das Messalter von Pflanzensamen mit größerer Zuverlässigkeit bestimmt werden kann.
Beispiel 2: Verfahren mit Pflanzensamen verschiedener Arten
Pflanzensamen aus einer ex situ Samenbank wurden vereinzelt und mit dem Verfahren, wie für Beispiel 1 beschrieben, in Analyseplatten mit je 96 Näpfen analysiert. Erhaltene Absorptionswerte wurden in 45 speziesspezifische Gruppen zu je 15 Pflanzensamen zusammengefasst, normalisiert und für jede Gruppe Pflanzensamen gemittelt. Die prozentuale Keimungsrate wurde durch Keimen der analysierten Pflanzensamen festgestellt. Analog zu Beispiel 1 wurden speziesspezifische Regressionskurven erstellt und für jede Regression das Bestimmtheitsmaß berechnet.
Die 3 zeigt die Zuordnung der normalisierten Absorptionswerte zur prozentualen Keimungsrate von Pflanzensamen aus einer ex situ Samenbank (3a und 3b) bzw. von kommerziell erhältlichen Pflanzensamen (3c und 3d) der Familien Amaryllidaceae, Apiaceae, Asteraceae, Caprifoliaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Ranunculaceae, Rosaceae, Rubiaceae und Solanaceae.

Die Bestimmtheitsmaße der in 3a jeweils als Linie dargestellten linearen Regressionen nach Analyse der normalisierten Absorptionswerte von Pflanzensamen aus einer ex situ Samenbank betragen für Apiaceae (stellvertreten durch Apium graveolens) 0,61, für Asteraceae (stellvertreten durch Achillea ptarmica) 0,91, für Chenopodiaceae (stellvertreten durch Chenopodium foliosum) 0,76, für Cucurbitaceae (stellvertreten durch Bryonia dioica) 0,82, für Fabaceae (stellvertreten durch Trifolium campestre) 0,96, für Lamiaceae (stellvertreten durch Ajuga reptans) 0,97, für Plantaginaceae (stellvertreten durch Plantago lanceolata) 0,8, für Poaceae (stellvertreten durch Hordeum jubatum) 0,93, für Rosaceae (stellvertreten durch Filipendula ulmaria) 0,74 und für Rubiaceae (stellvertreten durch Galium verum) 0,85. 3e zeigt die speziesspezifischen Regressionsgeraden mit zugeordnetem Symbol der Pflanzenfamilie ohne Messwertsymbole. Tab. 1

Familie	Gleichung der Regression	Bestimmtheitsmaß R ²
Apiaceae	y = 0,025 x + 2,1	0,61
Asteraceae	y = 0,059 x - 0,059	0,91
Chenopodiaceae	y = 0,058 x - 0,74	0,76
Cucurbitaceae	y = 0,11 x - 1,3	0,82
Fabaceae	y = 0,083 x - 2,5	0,96
Lamiaceae	y = 0,098 x - 0,44	0,97
Plantaginaceae	y = 0,024 x + 3,2	0,8
Poaceae	y = 0,027 x + 3,2	0,93
Rosaceae	y = 0,027 x + 3	0,74
Rubiaceae	y = 0,062 x + 0,87	0,85
Zusammen	y = 0,04 x + 1,5	0,88

Die Funktionsgleichungen der Regressionsgeraden sind in Tab. 1 aufgeführt. Die Variable y bezieht sich auf den normalisierten Absorptionswert, x auf die Keimungsrate in (%).
Die Bestimmtheitsmaße der in 3c jeweils als Linie dargestellten linearen Regressionen nach Analyse der normalisierten Absorptionswerte von kommerziell erhältlichen Pflanzensamen betragen für Amaryllidaceae (stellvertreten durch Allium cepa) 0,89, für Apiaceae I (stellvertreten durch Petroselinum crispum) 0,76, für Apiaceae_II (stellvertreten durch Daucus carota) 0,9, für Caprifoliaceae (stellvertreten durch Valerianella locusta) 0,87, für Caryophyllaceae (stellvertreten durch Dianthus barbatus) 0,84, für Cucurbitaceae (stellvertreten durch Cucumis sativus) 0,85, für Fabaceae (stellvertreten durch Lathyrus odoratus) 0,92, für Lamiaceae (stellvertreten durch Lavandula angustifolia) 0,89, für Poaceae (stellvertreten durch Zea mays) 0,69, für Ranunculaceae (stellvertreten durch Delphinum cultorum) 0,94, für Rosaceae (stellvertreten durch Fragaria vesca) 0,82, und für Solanaceae (stellvertreten durch Solanum lycopersicum) 0,88. 3f zeigt die speziesspezifischen Regressionsgeraden mit zugeordnetem Symbol der Pflanzenfamilie ohne Messwertsymbole.
Die Funktionsgleichungen der Regressionsgeraden sind in Tab. 2 aufgeführt. Die Variable y bezieht sich auf den normalisierten Absorptionswert, x auf die Keimungsrate in (%).

Eine über alle Pflanzenfamilien ermittelte speziesunspezifische lineare Regression ist jeweils in der 3b und 3d dargestellt und weist für Pflanzensamen aus einer ex situ Samenbank ein Bestimmtheitsmaß von 0,88 und für kommerziell erhältliche Pflanzensamen ein Bestimmtheitsmaß von 0,86 auf. Die zugehörigen Funktionsgleichungen sind als „Zusammen“ in Tab. 1 (3b) und Tab. 2 (3d) aufgeführt. Tab. 2

Familie	Gleichung der Regression	Bestimmtheitsmaß R ²
Amaryllidaceae	y = 0,073 x - 1,7	0,89
Apiaceae_I	y = 0,036 x + 2,5	0,76
Apiaceae_II	y = 0,12 x - 5,5	0,9
Caprifoliaceae	y = 0,022 x + 3,2	0,87
Caryophyllaceae	y = 0,15 x - 7,2	0,84
Cucurbitaceae	y = 1,3 x - 7,7	0,85
Fabaceae	y = 0,082 x + 0,51	0,92
Lamiaceae	y = 0,35 x - 8,3	0,89
Poaceae	y = 0,029 x + 2,1	0,69
Ranunculaceae	y = 0,06 x + 1,2	0,94
Rosaceae	y = 0,13 x - 1,6	0,82
Solanaceae	y = 0,081 x + 0,46	0,88
Zusammen	y = 0,031 x + 2,3	0,86

Für alle Pflanzenfamilien sind die ermittelten Bestimmtheitsmaße höher als der Grenzwert für statistische Signifikanz von 0,6.
Das Beispiel zeigt, dass das Verfahren durch Normalisieren der Absorptionsdaten auf eine große Zahl verschiedener Pflanzenfamilien anwendbar ist.
Beispiel 3: Wiederholung des Verfahrens mit demselben Pflanzensamen
Pflanzensamen von Brassica napus und Lepidium campestre wurden vereinzelt und mit dem Verfahren, wie für Beispiel 1 beschrieben, in Analyseplatten mit je 96 Näpfen analysiert. Erhaltene Messwerte für Absorption bei 570 nm und Keimungsrate wurden in speziesspezifische Gruppen zu je 75 Pflanzensamen zusammengefasst und gemittelt. Das Verfahren wurde mit denselben Pflanzensamen insgesamt 3-mal wiederholt. Im Parallelversuch wurden Pflanzensamen nicht mit dem Verfahren behandelt.
Die 4a zeigt die Keimungsraten der Pflanzensamen nach anschließender Lagerung für 0, 1, 2 oder 3 Monate und Keimung der Pflanzensamen. Mit (+) sind diejenigen Pflanzensamen markiert, die bereits 3-mal getestet worden waren, mit (-) die vorher ungetesteten Pflanzensamen.
Die Keimungsraten der Pflanzensamen von Brassica napus sind circa 100 %. Das Verfahren hat keinen Einfluss auf die Keimungsrate der Pflanzensamen.
Die 4b zeigt die normalisierten Absorptionswerte bei erneutem Test der Pflanzensamen nach einer Lagerzeit von 4 Wochen. Mit (+) sind diejenigen Pflanzensamen markiert, die bereits 3-mal getestet worden waren, mit (-) die vorher ungetesteten Pflanzensamen.
Die normalisierten Absorptionswerte der ungetesteten Pflanzensamen unterscheiden sich nicht von den normalisierten Absorptionswerten der getesteten Pflanzensamen.
Das Beispiel zeigt, dass das Verfahren die Keimfähigkeit der Pflanzensamen nicht verringert, und die Aussagekraft des Verfahrens auch dann nicht sinkt, wenn es mit demselben Pflanzensamen mehrfach wiederholt wird.

Claims

Verfahren zur Analyse der Keimfähigkeit von einzelnen Pflanzensamen mit den Schritten: Kontaktieren einer vorbestimmten Anzahl einzelner Pflanzensamen, jeweils in getrennten Gefäßen, mit einem vorbestimmten Volumen einer Testlösung, die Resazurin und Hefe aufweist, Inkubieren der Pflanzensamen mit der Testlösung unter Lichtausschluss, Entfernen der Pflanzensamen aus der Testlösung, für jeden Pflanzensamen getrenntes Ermitteln der Absorption der Testlösung bei 570 nm, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der zu testenden Pflanzensamen für jeden einzelnen Pflanzensamen bestimmt wird und das Volumen der Testlösung abhängig vom berechneten Volumen des Pflanzensamens vorbestimmt wird, wobei das Volumen der Testlösung zumindest das Zweifache des Volumens des einzelnen Pflanzensamens beträgt, dass die gemessene Absorption der Testlösung durch Subtrahieren der Absorption einer Testlösung ohne Pflanzensamen zur Erzeugung eines ersten Differenzwertes und anschließendes Dividieren des ersten Differenzwertes durch den dekadischen Logarithmus des Volumens des einzelnen Pflanzensamens normalisiert wird, um einen normalisierten Absorptionswert zu bestimmen, und dass der normalisierte Absorptionswert der Testlösung in eine für die Spezies des Pflanzensamens vorbestimmte erste Regression eingeordnet wird, die den normalisierten Absorptionswert auf die Keimungsrate der Pflanzensamen abbildet, und dass bei einer daraus bestimmten Keimungsrate von zumindest 30 ± 10 % das Verfahren mit demselben Pflanzensamen in zeitlichem Abstand wiederholt wird, wobei der Pflanzensamen bis zur Wiederholung des Verfahrens weiter gelagert wird, und bei einer bestimmten Keimungsrate unterhalb von 30 ± 10 % der Pflanzensamen innerhalb von maximal einer Woche zur Vermehrung gekeimt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der normalisierte Absorptionswert der Testlösung in eine für die Spezies des Pflanzensamens vorbestimmte zweite Regression eingeordnet wird, die den normalisierten Absorptionswert auf das Alter der Pflanzensamen abbildet, um ein Messalter des Pflanzensamens zu erzeugen, dass mittels der ersten Regression derjenige Absorptionswert bestimmt wird, der einer Keimungsrate von 30 ± 10 % zugeordnet ist, um einen Grenzabsorptionswert zu erzeugen, und dass der zeitliche Abstand durch Bestimmen jenes Alters des Pflanzensamens, zu dem mittels der zweiten Regression der Grenzabsorptionswert zugeordnet ist, zur Erzeugung eines Grenzalters des Pflanzensamens, Subtrahieren des Messalters des Pflanzensamens vom Grenzalter des Pflanzensamens zur Erzeugung eines zweiten Differenzwertes, und Multiplizieren des zweiten Differenzwertes mit einem Faktor von zumindest 0,2 bis maximal 1 bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass erste und/oder zweite Regression lineare Regressionen sind.
Verfahren zur Analyse der Keimfähigkeit von einzelnen Pflanzensamen mit den Schritten: Kontaktieren einer vorbestimmten Anzahl einzelner Pflanzensamen, jeweils in getrennten Gefäßen, mit einem vorbestimmten Volumen einer Testlösung, die Resazurin und Hefe aufweist, Inkubieren der Pflanzensamen mit der Testlösung unter Lichtausschluss, Entfernen der Pflanzensamen aus der Testlösung, für jeden Pflanzensamen getrenntes Ermitteln der Absorption der Testlösung bei 570 nm, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der zu testenden Pflanzensamen bestimmt wird und das Volumen der Testlösung zumindest das Dreifache des Volumens des einzelnen Pflanzensamens beträgt, und die gemessene Absorption der Testlösung durch Subtrahieren der Absorption einer Testlösung ohne Pflanzensamen zur Erzeugung eines ersten Differenzwertes und anschließendes Dividieren des ersten Differenzwertes durch den dekadischen Logarithmus des Volumens des einzelnen Pflanzensamens normalisiert wird, um einen normalisierten Absorptionswert zu bestimmen, und dass bei einem normalisierten Absorptionswert von zumindest 4 der Pflanzensamen für bis zu 5 Jahre weiter gelagert wird, bei einem normalisierten Absorptionswert zwischen 2 und 4 das Verfahren mit demselben Pflanzensamen in zeitlichem Abstand von zumindest 3 Monaten bis zu 1 Jahr wiederholt wird und bei einem normalisierten Absorptionswert von höchstens 2 der Pflanzensamen innerhalb von maximal einer Woche zur Vermehrung gekeimt wird.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der zu testenden Pflanzensamen für jeden einzelnen Pflanzensamen durch Messen des Durchmessers d des Pflanzensamens und Berechnen des Volumens V des Pflanzensamens nach der Formel V = 1/6 × π × d³ bestimmt wird, oder durch Messen der Höhe h, Breite b und Tiefe t des Pflanzensamens und Berechnen des Volumens V des Pflanzensamens nach der Formel V = 1/6 × π × h × b × t bestimmt wird.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Pflanzensamen ausgewählt werden, die einen Durchmesser von zumindest 1 mm bis zu 30 mm aufweisen.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass beim Inkubieren der Pflanzensamen mit der Testlösung die Inkubationszeit 4 Stunden und die Inkubationstemperatur 35 °C betragen.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Testlösung aus 0,01 Gew.-% Resazurin und 0,8 Gew.-% Hefe in destilliertem Wasser besteht.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Pflanzensamen ausgewählt werden, die maximal 5 Gew.-% Glucose, Stärke, reduzierende Zucker oder Kombinationen daraus enthalten.
Verwendung einer Testlösung in einem Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, die 0,01 Gew.-% Resazurin und 0,8 Gew.-% Bäckerhefe in destilliertem Wasser aufweist oder daraus besteht.