DE102019202524B3

DE102019202524B3 - Verfahren zur Herstellung eines Protein-funktionalisierten vernetzten Copolymers, vernetztes Copolymer, Gel sowie Verwendung des Gels

Info

Publication number: DE102019202524B3
Application number: DE102019202524.2A
Authority: DE
Inventors: Stefan Reinicke; Murat TUTUS; Thilo Fischer
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2020-02-20
Anticipated expiration: 2039-02-26

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Protein-funktionalisierten vernetzten Copolymers, bei dem ein Reaktionsgemisch, das mindestens zwei Comonomere sowie einen reaktiven Vernetzer beinhaltet, initiiert und (co)-polymerisiert wird. Hierbei erfolgt simultan eine Polymerisation sowie eine Vernetzung. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein entsprechend hergestelltes vernetztes Copolymer sowie ein dieses Copolymer enthaltende Gel. Des Weiteren werden Verwendungsmöglichkeiten des Gels benannt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Protein-funktionalisierten vernetzten Copolymers, bei dem ein Reaktionsgemisch, das mindestens zwei Comonomere sowie einen reaktiven Vernetzer beinhaltet, initiiert und (co)-polymerisiert wird. Hierbei erfolgt simultan eine Polymerisation sowie eine Vernetzung. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein entsprechend hergestelltes vernetztes Copolymer sowie ein dieses Copolymer enthaltende Gel, das insbesondere als Nanogel oder nanoskaliges Gel ausgebildet ist. Des Weiteren werden Verwendungsmöglichkeiten des Gels benannt.
In vielen Fällen, in denen Enzyme industriell genutzt werden, ist es notwendig diese zu immobilisieren um eine ausreichende Stabilität zu gewährleisten oder die Möglichkeit zu haben, den Biokatalysator am Ende des Prozesses vom Reaktionsmedium ohne großen Aufwand abzutrennen. Gerade letzteres ist von Belang, da in biotechnologischen Prozessen die Aufreinigung oft bis zu 80 % der anfallenden Prozesskosten ausmacht (Storhas, W. Bioverfahrensentwicklung; Wiley-VCH Verlag GmbH, 2003).
Oft werden nanoskalige Materialien mit hoher spezifischer Oberfläche eingesetzt um eine hohe Enzymaktivität sowie eine gute Dispergierbarkeit zu gewährleisten während Diffusionslimitierungen möglichst ausgeschlossen werden sollen.
Eine große Zahl an Immobilisierungsverfahren existiert bereits, wobei man sich in der Regel auf anorganische Partikel wie Kieselgele oder magnetische Nanopartikel oder auf organisches Material wie Polymerlatices oder -hydrogele stützt. In der Regel wird dabei das Trägermaterial zuerst hergestellt und das Enzym erst im Nachgang im eigentlichen Immobilisierungsschritt angebunden, was einen mehrstufigen Syntheseprozess nach sich zieht (Sheldon, R. A.; van Pelt, S. Enzyme immobilisation in biocatalysis: why, what and how. Chemical Society Reviews 2013, 42, 6223-6235, DOI: 10.1039/C3CS60075K;
Min, K.; Yoo, Y. J. Recent progress in nanobiocatalysis for enzyme immobilization and its application. Biotechnology and Bioprocess Engineering 2014, 19, 553-567, DOI: 10.1007/s12257-014-0173-7; Chauhan, G. S. Evaluation of nanogels as supports for enzyme immobilization. Polym. Int. 2014, 63, 1889-1894, DOI: 10.1002/pi.4734). Zwar wird das Enzym oft auch direkt im Zuge der Herstellung des Trägermaterial in dieses eingebettet (Sheldon, R. A.; van Pelt, S. Enzyme immobilisation in biocatalysis: why, what and how. Chemical Society Reviews 2013, 42, 6223-6235, DOI: 10.1039/C3CS60075K; Yan, M.; Ge, J.; Liu, Z.; Ouyang, P. Encapsulation of Single Enzyme in Nanogel with Enhanced Biocatalytic Activity and Stability. Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 11008-11009, DOI: 10.1021/ja064126t), jedoch muss es dafür im Vorfeld oft noch mit entsprechenden reaktiven Gruppen versehen oder mit geeigneten Verbindungen stabilisiert werden. Darüber hinaus sind für die Synthese nanoskaliger Trägermaterialien in der Regel Zusätze zur Erzeugung und Stabilisierung der kolloidalen Teilchen nötig, wie etwa Tenside oder lipophile Substanzen zur Herstellung eines Zweiphasensystems (Schachschal, S.; Adler, H.-J.; Pich, A.; Wetzel, S.; Matura, A.; van Pee, K.-H. Encapsulation of enzymes in microgels by polymerization/cross-linking in aqueous droplets. Colloid and Polymer Science 2011, 289, 693-698, DOI: 10.1007/s00396-011-2392-; Beldengrün, Y.; Aragon, J.; Prazeres, S. F.; Montalvo, G.; Miras, J.; Esquena, J. Gelatin/Maltodextrin Water-in-Water (W/W) Emulsions for the Preparation of Cross-Linked Enzyme-Loaded Microgels. Langmuir 2018, 34, 9731-9743, DOI: 10.1021/acs.lang-muir.8b01599). Weitere negative Aspekte können das Anfallen von Nebenprodukten oder unvollständig umgesetzten Ausgangsstoffen sein sowie der Einsatz von komplexen und damit teuren Reaktionshilfsmitteln wie etwa Kopplungsagenzien (z.B. EDC). Soll das resultierende Nanoaggregat noch zusätzlich besondere Eigenschaften aufweisen, wie etwa eine Thermoresponsivität mit der die Enzymaktivität beeinflusst werden kann, muss dies entsprechend in der Auswahl der beteiligten Materialien berücksichtigt werden, wodurch ein weiterer Grad an Komplexität eingeführt wird.
Eines der häufigsten Syntheseverfahren für nanoskalige, enzymhaltige Aggregate ist beispielsweise die Adsorption eines Enzyms auf der Oberfläche bzw. in den Poren von Kieselgel-Nanopartikeln, aufgrund der Einfachheit der Synthese und des geringen Preises der Ausgangsstoffe (Petri, A.; Marconcini, P.; Salvadori, P. Efficient immobilization of epoxide hydrolase onto silica gel and use in the enantioselective hydrolysis of racemic para-nitrostyrene oxide. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2005, 32, 219-224, DOI: 10.1016/j.molcatb.2004.12.001). Aber auch hier liegt ein zweistufiges Verfahren zugrunde, während das Enzym ohne vorangehende Modifikation oder des zusätzlichen Einsatzes von Linkermolekülen nur physikalisch an den Träger gebunden ist. In einem anderen Verfahren, welches ebenso Kieselgel als Träger beinhaltet, kann das Enzym in einer Ein-Topf-Reaktion direkt in die entstehenden Nanoaggregate eingebunden werden.9 Hierbei ist dann jedoch zu beachten, dass die Reaktionsbedingungen nur mit wenigen Enzymen kompatibel sind. Zudem weisen die fertigen Nanoaggregate keine Zusatzeigenschaften wie eine Thermoresponsivität auf. Es besteht die Möglichkeit, Enzyme durch Ausfällen und simultanes Vernetzen ohne Trägermaterial in einem reinen Enzymaggregat zu immobilisieren. Diese Aggregate zeigen aber kein responsives Verhalten wie einige polymere Nanogele und sind in der Regel in Größe und Form auch nicht so einheitlich. Zudem sind hier in der Regel toxikologisch bedenkliche Vernetzer im Einsatz.
Die Fällungspolymerisation von NIPAm in Wasser verspricht eine Möglichkeit, das Enzym direkt in ein Nanogel bei dessen Entstehung einzubauen. Ein Problem hierbei ist jedoch die Tatsache, dass NIPAm in Wasser sehr schnell und unkontrolliert polymerisiert, was normalerweise undefinierte Aggregate zur Folge hat. Die Polymerisation des Monomers oberhalb der LCST von PNIPAm erhöht die Kontrolle deutlich, da die entstehenden Ketten sofort einer Phasenseparation unterworfen sind, wodurch auch der Zugang zu den aktiven, radikalischen Kettenenden erschwert wird. So werden entsprechende Nebenreaktion unterdrückt. Leider führt dies dann auch wieder zu einer deutlich verlangsamten Reaktionsgeschwindigkeit und damit auch zu einer unvollständigen Umsetzung des Monomers. Bedingungen unter denen zum Start der Reaktion in sehr kurzer Zeit sehr viele Radikale generiert werden, würden dem wieder entgegenwirken, jedoch käme es hier erneut zu einem Kontrollverlust der Reaktion und damit der Definiertheit der resultierenden Nanogele.
Der Einbau bioaktiver Moleküle in ein polymeres Nanogel durch Fällungspolymerisation von NIPAm oder anderer geeigneter Monomere wurde bereits gezeigt, jedoch ging es dabei entweder nicht um den Einbau von Enzymen, also Proteinen, sondern katalytisch aktiven DNA-Strängen, oder gewisse Nachteile, wie die lange Reaktionszeit oder die Notwendigkeit, ein zweiphasiges Reaktionsmedium zu etablieren, mussten in Kauf genommen werden (Schachschal, S.; Adler, H.-J.; Pich, A.; Wetzel, S.; Matura, A.; van Pee, K.-H. Encapsulation of enzymes in microgels by polymerization/cross-linking in aqueous droplets. Colloid and Polymer Science 2011, 289, 693-698, DOI: 10.1007/s00396-011-2392-1; Gau, E.; Flecken, F.; Ksiazkiewicz, A. N.; Pich, A. Enzymatic synthesis of temperature-responsive poly(N-vinylcaprolactam) microgels with glucose oxidase. Green Chemistry 2018, 20, 431-439, DOI: 10.1039/C7GC03111D; Li, F.; Wang, C.; Guo, W. Multifunctional Poly- N - Isopropylacrylamide/DNAzyme Microgels as Highly Efficient and Recyclable Catalysts for Biosensing. Adv. Funct. Mater. 2018, 28, 1705876, DOI: 10.1002/adfm.201705876). In keinem der Fälle wurde eine breite Anwendbarkeit demonstriert, während Reaktionszeiten zum Teil lang waren und verbleibende Nebenprodukte abgetrennt werden mussten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, eine Synthese eines definierten, enzymhaltigen Nanogels durch einfaches Mischen der beteiligten Agenzien ohne Vorbehandlungsschritte, in kurzer Reaktionszeit sowie ohne die Verwendung teurer Spezialchemikalien und/oder abzutrennender Nebenprodukte bzw. Restbestandteile. Gleichzeitig soll eine hohe Immobilisierungsausbeute gewährleistet sein sowie die breite Anwendbarkeit auf verschiedenste Enzyme / biokatalytische Anwendungen. Ein solches Prozedere soll sich zudem kostengünstig im großen Maßstab für viele Enzyme ohne große Anpassung des Syntheseprotokolls an den jeweiligen Anwendungsfall abbilden lassen und damit zur erheblichen Reduzierung der Kosten beitragen, die eine Enzymimmobilisierung üblicherweise mit sich bringt.
Diese Aufgabe wird bezüglich eines Verfahrens zur Herstellung eines Protein-funktionalisierten vernetzten Copolymers mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1, bezüglich eines vernetzten Copolymers mit den Merkmalen des Patentanspruchs 15, bezüglich eines Gels enthaltend ein vernetztes Copolymer mit den Merkmalen des Patentanspruchs 21 sowie bezüglich Verwendungsmögichkeiten des Gels mit den Merkmalen des Patentanspruchs 23 gelöst. Die jeweiligen abhängigen Patentansprüche stellen dabei vorteilhafte Weiterbildungen dar.
Die Erfindung betrifft somit in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Protein-funktionalisierten vernetzten Copolymers, bei dem ein Reaktionsgemisch, enthaltend

- mindestens ein erstes Protein,
- mindestens eine Verbindung der nachfolgenden allgemeinen Formel I,
wobei jeweils unabhängig voneinander

X

NH, O oder NR1

Y

einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl

R¹

einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einen linearen oder verzweigten Alkyletherrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Wasserstoff und

y

0 oder 1

bedeuten,
- mindestens ein mit der mindestens einen Verbindung gemäß Formel I reaktives, eine unhydrolysierte und/oder hydrolysierte Thiolacton-Funktionalisierung aufweisendes Comonomer, sowie
- mindestens ein mit der mindestens einen Verbindung gemäß Formel I und dem mindestens einen Comonomer reaktiven Vernetzer

Besondere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in seiner Einfachheit, Schnelligkeit und breiter Anwendbarkeit zu sehen, so dass spezifische Eigenschaften der herzustellenden vernetzten Copolymere eingestellt werden können.
Insbesondere zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren durch die nachfolgenden Vorteile aus:

• Einfach und effektiv
• Ein-Topf-Reaktion
• Einfaches Vermischen der beteiligten Komponentenohne aufwendige Vorkonditionierungsschritte
• Kurze Reaktionszeit (< 10 min)
• Hohe Immobilisierungsausbeute
• Steuerbare(r) Enzymgehalt, Partikelgröße und Quellgrad Verwendung kommerziell erhältlicher, günstiger Materialien Anwendbar auf viele verschiedene Enzyme

Der Hauptvorteil liegt in der Kombination der sehr einfachen Syntheseprozedur gekoppelt mit ihrer breiten Anwendbarkeit und dem quasi abwesenden Aufreinigungsaufwand sowie den besonderen Eigenschaften der Nanogele. Die Reaktionsbedingungen sind so gewählt, dass die Reaktion sehr schnell und vollständig von statten geht, während gleichzeitig die resultierenden Nanogele vom Durchmesser her einheitlich und der internen Struktur her homogen sind. Das Syntheseprotokoll kann für verschiedenste Anwendungsfälle verwendet werden und bleibt insgesamt kostengünstig. Zu letzterem trägt auch bei, dass die Immobilisierungsausbeute hoch ist und die Nanogele leicht recycelt und dadurch mehrmalig eingesetzt werden können. Die breite Anwendbarkeit unseres Konzepts auf verschiedene Enzyme erlaubt darüber hinaus prinzipiell die Immobilisierung mehrerer Enzymtypen in ein und demselben Nanogel, wodurch biokatalytische Kaskadenreaktionen abgebildet werden können.
Technisches Anwendungsgebiet sind biokatalysierte Synthese- und Raffinationsprozesse in denen die Immobilisierung eines Enzyms in Frage kommt. Dies ist immer dann der Fall, wenn aufwendige Reinigungsschritte vermieden werden sollen oder das Enzym aufgrund hoher Herstellungskosten besonders langzeitstabil bzw. wiederverwendbar sein soll. Letzteres ist zum Beispiel bei Spezialenzymen für die Feinchemikaliensynthese der Fall, da diese in ihrer oft noch relativ teuer sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das mindestens eine Comonomere eine Verbindung der nachfolgenden allgemeinen Formel II darstellt

wobei jeweils unabhängig voneinander

X: NH, O oder NR1
Y: einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl
y: 0 oder 1 und
R²: eine unhydrolysierte Thiolacton-Funktionalisierung ausgewählt aus der Gruppe aus Resten mit der nachfolgend abgebildeten allgemeinen Formel III oder eine hydrolysierte Thiolacton-Funktionalisierung ausgewählt aus der Gruppe aus Resten mit der nachfolgend abgebildeten allgemeinen Formel IV
wobei jeweils unabhängig voneinander
R: Wasserstoff oder einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und
x: 1 bis 6

Weiterhin ist es möglich, dass bei der Verbindung gemäß Formel I X=NH oder O und R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus linearen oder verzweigten Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder linearen oder verzweigten Alkyletherresten mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, insbesondere die Verbindung gemäß Formel I N-Isopropylacrylamid oder Di(ethylenglykol)-methylethermethacrylat ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sieht vor, dass der mindestens eine Vernetzer eine mindestens zwei radikalisch reaktive Funktionalitäten aufweisende Verbindung, bevorzugt eine mindestens zwei (Meth)acrylamid-Funktionalitäten oder (Meth)acrylat-Funktionalitäten aufweisende Verbindung, insbesondere N,N'-Methylenbisacrylamid ist.
Ebenso ist es möglich, dass der Initiator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anorganischen Peroxiden, insbesondere anorganischen Peroxodisulfaten, z.B. Kaliumperoxodisulfat und/oder Ammonium-peroxodisulfat sowie Mischungen oder Kombinationen hiervon.
Insbesondere ist das mindestens eine erste Protein ein Enzym, insbesondere ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aldolasen (z.B. 2-Deoxy-D-ribose-5phosphataldolase), Oxidasen (z.B. Glucoseoxidase), Peroxidasen (z.B. Meeettichperoxidase), Hydrolasen, wie z.B. Lipasen, Proteasen, Amidasen, Acylasen, Nitrilasen, Dehalogenasen, Isomerasen, Transferasen, oder ein Protein mit nicht-enzymatischer Funktion, insbesondere Kanalproteine und Antikörper sowie Kombinationen hiervon.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das Reaktionsgemisch zusätzlich ein nicht mit dem ersten Protein identisches zweites Protein, insbesondere bovines Serumalbumin, das über die unhydrolysierte oder hydrolysierte Thiolacton-Funktionalisierung kovalent an das mindestens eine Comonomer bzw. das Copolymer angebunden wird.
Dieses zweite Protein kann zur Stabilisierung des hergestellten Copolymers beitragen. Insbesondere bei Herstellung eines Gels, beispielsweise eines Nanogels aus den erfindungsgemäß resultierenden Copolymeren können die Gelteilchen, beispielsweise die Nanogelteilchen bei Anwesenheit des zweiten Proteins stabilisiert werden, so dass eine Agglomeration zu größeren Partikeln unterbunden werden kann.
Bevorzugt liegt das Reaktionsgemisch als wässrige Lösung oder Dispersion vor.
Die Initiierung sowie die Polymerisation können durch Erwärmen auf Temperaturen von mindestens 30 °C, bevorzugt mindestens 35 °C bis 70 °C, insbesondere mindestens 35 bis 50 °C erfolgen.
Eine weiter bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, dass vor Bereitstellung des Reaktionsgemisches eine Inkubation des mindestens einen Enzyms und des mindestens einen Comonomers durchgeführt wird, wobei die Inkubation bevorzugt in basischer Lösung durchgeführt wird.
Ferner kann dem Reaktionsgemisch mindestens eine Verbindung zur Herabsetzung der Initiationstemperatur, die bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus organischen Aminen, insbesondere N,N,N',N'-Tetramethylendiamin (TMEDA), N,N,N',N",N"-Pentamethyldiethylenetriamin (PMDETA) oder Tris[2-(dimethylamino)ethyl]amin (Me6TREN) zugesetzt werden.
Hinsichtlich der Gewichtsmengen der im Reaktionsgemisch vorhandenen Reaktanden wird bevorzugt, wenn diese in den folgenden Gewichtsmengen eingesetzt werden:

0,1 bis 5,0 Gew.-%, bevorzugt 0,2 bis 2,0 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,3 bis 1,0 Gew.-% des mindestens einen ersten Proteins,
50,0 bis 98,4 Gew.-%, bevorzugt 64,0 bis 93,8 Gew.-%, besonders bevorzugt 76,3 bis 88,7 Gew.-% der mindestens einen Verbindung gemäß Formel I,
1,0 bis 15,0 Gew.-%, bevorzugt 3,0 bis 10,0 Gew.-%, besonders bevorzugt 5,0 bis 7,5 Gew.-% des mindestens einen Comonomers,
0,5 bis 10,0 Gew.-%, bevorzugt 1,0 bis 8,0 Gew-%, besonders bevorzugt 2,0 bis 5,0 Gew.-% des mindestens einen Vernetzers,
0 bis 10,0 Gew.-%, bevorzugt 1,0 bis 8,0 Gew.-%, besonders bevorzugt 2,0 bis 5,0 Gew.-% des mindestens einen zweiten Proteins, sowie
0 bis 10,0 Gew.-%, bevorzugt 1,0 bis 8,0 Gew.-%, besonders bevorzugt 2,0 bis 5,0 Gew.-% der mindestens einen Verbindung zur Herabsetzung der Initiationstemperatur.

Die Polymerisation wird zweckmäßigerweise als Fällungspolymerisation durchgeführt.
Nach Abschluss der erfolgten Polymerisation kann das entstandene Copolymer bevorzugt durch Zentrifugation, Sedimentation oder Filtration vom Reaktionsgemisch abgetrennt werden.
Die Erfindung betrifft zudem ein vernetztes Copolymer, enthaltend vernetzte Copolymerketten, wobei die Copolymerketten die nachfolgenden Wiederholungseinheiten a) und b) umfassen

a)
wobei jeweils unabhängig voneinander

X

NH, O oder NR¹

Y

einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl

y

0 oder 1 und

R¹

einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einen linearen oder verzweigten Alkyletherrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Wasserstoff

bedeuten, und
b) eine vom mindestens einen Comonomer nach einem der vorhergehenden Ansprüche durch radikalische Polymerisation abgeleitete Wiederholungseinheit, wobei das mindestens eine erste Protein über die unhydrolysierte oder hydrolysierte Thiolacton-Funktionalisierung kovalent an diese Wiederholungseinheit angebunden ist,

Das erfindungsgemäße vernetzte Copolymer erlaubt insbesondere die Herstellung eines Gels, beispielsweise eines Nanogels, das ebenso als Gegenstand der vorliegenden Erfindung anzusehen ist. Insbesondere ist es mit dem erfindungsgemäßen vernetzten Copolymer möglich, ein Gel, insbesondere ein Nanogel herzustellen, das eine enge Größenverteilung aufweist, thermoresponsive Eigenschaften (= temperaturgesteuerte Enzymaktivität) aufweist, redispergierbar ist, sowie langzeitstabil und wiederverwendbar ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform des vernetzten Copolymers sieht vor, dass die Wiederholungseinheit b) die nachfolgende Wiederholungseinheit ist
wobei jeweils unabhängig voneinander

X: NH, O oder NR1, insbesondere NH
Y: einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl
y: 0 oder 1, und
R³: eine Gruppierung gemäß den nachfolgend abgebildeten allgemeinen Formeln V und VI darstellt,

R: Wasserstoff oder einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Wasserstoff
x: 1 bis 6, bevorzugt 2 oder 3, insbesondere 2 und
P₁: das mindestens eine erste Protein wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert

Eine bevorzugte Ausführungsform sieht vor, dass bei der Wiederholungseinheit a) X=NH oder O und R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus linearen oder verzweigten Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder linearen oder verzweigten Alkyletherresten mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, insbesondere ein Isopropyl- oder Di(ethylenglykol)methyletherrest ist.
Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die vernetzende Gruppierung auf eine mindestens zwei radikalisch reaktive Funktionalitäten aufweisende Verbindung, bevorzugt eine mindestens zwei (Meth)acrylamid-Funktionalitäten oder (Meth)acrylat-Funktionalitäten aufweisende Verbindung, insbesondere N,N'-Methylenbisacrylamid zurückgeht.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sieht vor, dass das Copolymer zusätzlich zu den Wiederholungseinheiten a) und b) eine Wiederholungseinheit c) umfasst, die die nachfolgende Wiederholungseinheit ist
wobei jeweils unabhängig voneinander

X: NH, O oder NR1, insbesondere NH
Y: einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl
y: 0 oder 1, und
R⁴: eine Gruppierung gemäß den nachfolgend abgebildeten allgemeinen Formeln V und VI darstellt,

R: Wasserstoff oder einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Wasserstoff
x: 1 bis 6, bevorzugt 2 oder 3, insbesondere 2 und
P₂: ein nicht mit dem ersten Protein identisches zweites Protein, insbesondere bovines Serumalbumin

Im vernetzten Copolymer sind die einzelnen Wiederholungseinheiten bzw. die vernetzten Gruppierungen bevorzugt in den nachfolgenden Gewichtsmengen enthalten.
1,1 bis 20,0 Gew.-%, bevorzugt 3,2 bis 12,0 Gew.-%, besonders bevorzugt 5,0 bis 8,5 Gew.-% der Wiederholungseinheit b),
50,0 bis 98,4 Gew.-%, bevorzugt 64,0 bis 93,8 Gew.-%, besonders bevorzugt 76,5 bis 91,0 Gew.-% der Wiederholungseinheit a),
0,5 bis 10,0 Gew.-%, bevorzugt 1,5 bis 8,0 Gew-%, besonders bevorzugt 2,0 bis 5,0 Gew.-% der mindestens einen vernetzenden Gruppierung,
0 bis 20,0 Gew.-%, bevorzugt 1,5 bis 16,0 Gew.-%, besonders bevorzugt 2,0 bis 10,0 Gew.-% der Wiederholungseinheit c).
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung ein Gel, insbesondere Nanogel, umfassend mindestens ein in Wasser gequollenes vernetztes Copolymer gemäß der vorliegenden Erfindung wie zuvor definiert.
Das Gel zeichnet sich durch Partikel des vernetzten Copolymers aus, die bevorzugt eine mittels dynamischer Lichtstreuung (Dynamic Light Scattering, DLS) gemessenen Partikelgröße von 10 bis 10.000 nm, bevorzugt 100 bis 1.000 nm aufweisen.
Zur Bestimmung der dynamischen Lichtstreuung wird dabei mit einem Messgerät „Malvern MAL 1083122 Zetasizer“, bei einer Laserwellenlänge von 633 nm und einer Detektorposition von173° ermittelt. Es wurde jeweils der Mittelwert aus drei Messungen gebildet, wobei die Messdauer durch das Gerät automatisch justiert wurde. Die Auswertung erfolgt hier durch Kumulant-Analyse.
Die Erfindung betrifft zudem die Verwendung eines erfindungsgemäßen Gels als biokatalytisches Gel, zur Immobilisierung/Stabilisierung von biokatalytisch aktiven Verbindungen, als wiederverwertbarer Katalysator, biokatalytisch aktives Material zum Einsatz in kontinuierlichen Synthese- oder Raffinationsprozessen.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Ausführungen näher beleuchtet, ohne die Erfindung auf die dargestellten bevorzugten Ausführungen zu beschränken.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein neues Syntheseverfahren für enzymhaltige Nanogele, das sich vor allem durch die Einfachheit der verwendeten Ausgangsstoffe sowie des grundsätzlichen Prozederes auszeichnet. Die Nanogele sind dabei von einheitlicher Größe und weisen einen signifikanten Temperaturschalteffekt auf, mit Hilfe dessen die Enzymaktivität abhängig vom konkreten Fall moduliert werden kann.
Die Synthese basiert bevorzugt auf der Fällungspolymerisation von N-Isopropylacrylamid (NIPAm) oder anderen Monomeren, aus denen thermoresponsive Polymere resultieren. Die Polymerisation erfolgt dabei oberhalb der Übergangstemperatur des resultierenden Polymers im Beisein eines oder mehrerer Enzyme, sowie weiterer (z.T. proteinischer) Verbindungen zur Stabilisierung und Vernetzung des Nanogels. Alle verwendeten Materialien sind kommerziell erhältlich und bedürfen keiner weiteren Konditionierung/Modifizierung im Vorfeld der Polymerisation.
Im Folgenden ist ein beispielhafter Syntheseweg im Detail beschrieben. Schema 1 zeigt alle beteiligten Bestandteile zusammen mit der Funktion, die sie jeweils übernehmen.
Die Reaktionsmischung beinhaltet ein Enzym (hier: DERA, 1,95 mg), stabilisierendes bovines Serum albumin (BSA), 17,55 mg), das Hauptmonomer N-Isopropylacrylamid (NIPAm, 360 mg), den Vernetzer N, A/‚-Methylenbisacrylamid (Bis, 15 mg) sowie ein Protein-reaktives, Thivolokton-basiertes Conomer (TlaAm, 29,5 mg). Des Weiteren beinhaltet die Reaktionsmischung Kaliumperoxodisulfat (2, 5 mg/0,5 ml destilliertes Wasser sowie N, N, N‘-Tetramethylendiamin (TEMED, 20 µl).
Die Zutaten werden (bis auf den Initiator) vermischt, auf eine bestimmte Temperatur erwärmt sowie entgast und dann mit dem Initiator versetzt. Nach wenigen Minuten ist die Synthese bereits beendet und es liegt eine enzymhaltige Nanogeldispersion vor (siehe 1: Abbildung der fertigen Nanogeldispersion).
Der beschriebene Synthesevorgang kann mit verschiedenen Enzymen, zum Beispiel Glucose Oxidase (GOx), Meerrettich Peroxidase (HRP), 2-Deoxy-D-ribose-5-phosphat-aldolase (DERA), durchgeführt werden.
Nachfolgend wird ein beispielhafter Syntheseweg beschrieben.
Syntheseablauf
Zunächst werden das Enzym und BSA mit TlaAm in basischer Lösung für einige Stunden inkubiert. Nach anschließender Umpufferung zu deionisiertem Wasser erfolgt die Zugabe der anderen Komponenten bis auf den Initiator. Dieser wird nach Erhitzen auf mindestens 35 °C und Entgasen mit Stickstoff zugegeben. In wenigen Sekunden wird die Reaktionslösung milchig trüb. Nach einigen Minuten wird die Dispersion mit warmem, deionisierten Wasser auf das doppelte Volumen verdünnt gefolgt von mehrminütiger Begasung mit Druckluft. Im letzten Schritt wird die Mixtur durch Zugabe kalten, deionisierten Wassers abgekühlt und weiter verdünnt. Überschüssiges Enzym kann entfernt werden durch wiederholtes Abzentrifugieren und Redispergieren des Nanogels. Der grundsätzliche Ablauf der Synthese bleibt immer der gleiche, unabhängig vom gewählten Enzym. Anpassungen an letzteres finden nur im Detail statt. Hier wird etwa die Temperatur geringfügig verändert oder leicht veränderte Konzentrationen der Reaktionskomponenten eingesetzt.
Rolle der einzelnen Komponenten
NIPAm stellt das Hauptmonomer dar, welches später das Rückgrat das Nanogelnetzwerks bildet. Das aus NIPAm entstehende Polymer, PNIPAm, durchläuft in Wasser einen abrupten Phasenübergang bei einer Temperatur von etwa 32 °C. Hierbei gehen die Ketten von einem gequollenen, solubilisierten Zustand in einen kollabierten Zustand über - das Polymer fällt quasi aus. Diesen Effekt macht man sich bei der sogenannten Fällungspolymersation zunutze (Pich, A.; Richtering, W. Microgels by Precipitation Polymerization: Synthesis, Characterization, and Functionalization. Adv. Polym. Sci. 2010, 234, 1-37, DOI: 10.1007/12_2010_70). Sobald die Ketten entstehen, fallen sie aus Lösung aus und bilden kolloidale Teilchen, die die Basis des Nanogels bilden. Um letztlich ein stabiles Gelnetzwerk zu erhalten, ist der Einsatz eines Vernetzers notwendig, in unserem Fall Bis. Die Stabilisierung der Nanogeldispersion erreicht man üblicherweise über den wasserlöslichen Initiator Kaliumperoxodisulfat. Dessen Fragmente bilden den Ausgangspunkt für das entstehende Gelnetzwerk und sind gleichzeitig geladen. Letzteres sorgt dafür, dass sich die gebildeten Gelteilchen abstoßen und sich nicht zu größeren Aggregaten zusammenlagern. Auf diese Weise ist kein Einsatz eines zusätzlichen Stabilisierungsmittels notwendig. Im erfindungsgemäßen Fall genügt die Präsenz der Initiatorfragmente jedoch nicht, da die Reaktionsbedingungen so gewählt sind, dass sich beim Start der Reaktion sehr schnell sehr viele Radikale bilden, wodurch die Reaktion prinzipiell erst einmal sehr unkontrolliert ist, was ohne zusätzlichen Stabilisierungseffekt nicht zu definierten Nanogelen führt. Die Polymerisation/ Gelbildung findet aber im Beisein von einem Enzym, also einem Protein statt. Letzteres zeigt Grenzflächenaktivität und kann daher ebenso die Dispersion stabilisieren. Grundsätzlich ist es daher möglich, ausschließlich das ohnehin einzusetzende Enzym zu verwenden, womit unser Ansatz ebenso frei von zusätzlichen Stabilisierungsmitteln ist. Aus Kostengründen wird jedoch eine Proteinmischung ein, die das Enzym und BSA enthält. BSA ist relativ billig und zeigt in der Regel eine etwas bessere Oberflächenaktivität als die verwendeten Enzyme. Chemisch unterscheiden sich das BSA und das eingesetzte Enzym aber letztlich praktisch nicht. Zuguterletzt enthält die Reaktionsmischung noch TlaAm. Dieses Comonomer übernimmt zwei Funktionen. Die Thiolactongruppe ist reaktiv gegenüber den Lysinen der eingesetzten Proteine. Auf diese Weise werden letztere kovalent ans Gelnetzwerk angebunden. Variation des TlaAm-Anteils in der Reaktionsmischung erlaubt es daher auch, die Menge an immobilisiertem Protein anzupassen (siehe 2: dargestellt ist die gemessene Fluoreszenz von Nanogeldispersionen in Abhängigkeit des bei der Synthese verwendeten TlaAm-Anteils. Es wurde entsprechend gelabeltes BSA eingesetzt. Die Werte für den TlaAm-Anteil sind auf den Wert der Standard-Rezeptur (TlaAm content = 1) normiert. Die Fluoreszenz ist in arbiträren Einheiten angegeben).
Des Weiteren sind die Thiolgruppen, die sowohl im Zuge der Reaktion des Tla mit den Lysinen als auch durch dessen Hydrolyse entstehen, Kettenüberträger und wirken daher der prinzipiellen Unkontrolliertheit der Polymerisation entgegen. Dies führt wiederum zu definierteren Nanogelen mit weniger strukturellen Inhomogenitäten und somit zu einer verbesserten Quellkinetik des Nanogels. TEMED zuguterletzt ist eine Verbindung, die die Zersetzung von Kaliumperoxodisulfat katalysiert und somit die Polymerisationstemperatur auf das gewünschte Niveau herabsetzt.
Die Besonderheit beim erfindungsgemäßen Ansatz besteht im kombinierten Einsatz eines oberflächenaktiven Proteins zusammen mit TlaAm, welches nicht nur das Protein kovalent an das Gelnetzwerk anbindet, sondern auch als Kettenüberträger wirkt. Dies erlaubt eine sehr schnelle Polymerisation bei gleichzeitiger Kontrolle derselbigen.
Eigenschaften der Nanogele
Die Größe der Nanogele kann zwischen etwa 100 und 1000 nm eingestellt werden durch Variation des Verdünnungsgrads der Reaktionslösung sowie durch Steuerung des Anteils einzelner Reaktionskomponenten, vor allem TlaAm und Bis. Die Größenverteilung ist sehr eng (siehe 3, in der ein CONTIN Plot eines repräsentativen, GOx-haltigen Nanogels, erhalten per Messung der dynamischen Lichtstreuung dargestellt ist).
Die Nanogele lassen sich leicht durch Zentrifugation aus der Dispersion abtrennen und im Anschluss wieder redispergieren. Sie sind in Puffersystemen dispergierbar und langzeitstabil. Die Nanogele zeigen eine deutliche Thermoresponsivität, (siehe 4, in der der temperaturabhängige Verlauf der Streuintensität einer repräsentativen Dispersion eines GOx-haltigen Nanogels gemessen via Dynamische Lichtstreuung dargestellt ist), die auch die Enzymaktivität deutlich beeinflusst. Im Falle von HRP beispielsweise erfolgt eine nahezu komplette Deaktivierung unterhalb der Übergangstemperatur, d.h. wenn das Gel gequollen ist (siehe 5, in der die Enzymaktivitäten eines HRP-haltigen Nanogels im Vergleich zu einer äquivalenten Menge des Enzyms in Lösung (pos) dargestellt sind. Der Betrag des Anstiegs im linearen Bereich der Kurven ist dabei ein Maß für die spezifische Aktivität des Enzyms/enzymhaltigen Nanogels. Der linke Graph zeigt die Messung unterhalb bzw. in der Nähe der Phasenübergangstemperatur des Nanogels, während der rechte Graph eine Messung zeigt, die bei einer Temperatur oberhalb des Phasenübergangs aufgenommen wurde).

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Protein-funktionalisierten vernetzten Copolymers, bei dem ein Reaktionsgemisch, enthaltend - mindestens ein erstes Protein, - mindestens eine Verbindung der nachfolgenden allgemeinen Formel I,
wobei jeweils unabhängig voneinander X NH, O oder NR¹ Y einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl R¹ einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einen linearen oder verzweigten Alkyletherrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Wasserstoff und y 0 oder 1 bedeuten, - mindestens ein mit der mindestens einen Verbindung gemäß Formel I reaktives, eine unhydrolysierte und/oder hydrolysierte Thiolacton-Funktionalisierung aufweisendes Comonomer, sowie - mindestens ein mit der mindestens einen Verbindung gemäß Formel I und dem mindestens einen Comonomer reaktiven Vernetzer bereitgestellt und anschließend durch Zugabe mindestens eines Initiators oder eines den mindestens einen Initiator enthaltenden Gemisches initiiert und polymerisiert wird, wobei das mindestens eine erste Protein über die unhydrolysierte oder hydrolysierte Thiolacton-Funktionalisierung kovalent an das mindestens eine Comonomer bzw. das Copolymer angebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Comonomere eine Verbindung der nachfolgenden allgemeinen Formel II darstellt
wobei jeweils unabhängig voneinander X NH, O oder NR¹ Y einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl y 0 oder 1 und R² eine unhydrolysierte Thiolacton-Funktionalisierung ausgewählt aus der Gruppe aus Resten mit der nachfolgend abgebildeten allgemeinen Formel III oder eine hydrolysierte Thiolacton-Funktionalisierung ausgewählt aus der Gruppe aus Resten mit der nachfolgend abgebildeten allgemeinen Formel IV
wobei jeweils unabhängig voneinander R Wasserstoff oder einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und x 1 bis 6 bedeuten und bevorzugt R Wasserstoff und x 2 oder 3 ist und insbesondere das mindestens eine Comonomer N-Thiolactonacrylamid oder Thiolactonmethacrylamid ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Verbindung gemäß Formel I X=NH oder O und R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus linearen oder verzweigten Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder linearen oder verzweigten Alkyletherresten mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, insbesondere die Verbindung gemäß Formel I N-Isopropylacrylamid oder Di(ethylenglykol)methylethermethacrylat ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Vernetzer eine mindestens zwei radikalisch reaktive Funktionalitäten aufweisende Verbindung, bevorzugt eine mindestens zwei (Meth)acrylamid-Funktionalitäten oder (Meth)acrylat-Funktionalitäten aufweisende Verbindung, insbesondere N,N'-Methylenbisacrylamid ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Initiator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anorganischen Peroxiden, insbesondere anorganischen Peroxodisulfaten, z.B. Kaliumperoxodisulfat und/oder Ammonium-peroxodisulfat sowie Mischungen oder Kombinationen hiervon.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine erste Protein ein Enzym ist, insbesondere ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aldolasen (z.B. 2-Deoxy-D-ribose-5phosphataldolase), Oxidasen (z.B. Glucoseoxidase), Peroxidasen (z.B. Meeettichperoxidase), Hydrolasen, wie z.B. Lipasen, Proteasen, Amidasen, Acylasen, Nitrilasen, Dehalogenasen, Isomerasen, Transferasen, oder ein Protein mit nicht-enzymatischer Funktion, insbesondere Kanalproteine und Antikörper sowie Kombinationen hiervon.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgemisch zusätzlich ein nicht mit dem ersten Protein identisches zweites Protein, insbesondere bovines Serumalbumin beinhaltet, das über die unhydrolysierte oder hydrolysierte Thiolacton-Funktionalisierung kovalent an das mindestens eine Comonomer bzw. das Copolymer angebunden wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgemisch als wässrige Lösung oder Dispersion vorliegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Initiierung sowie die Polymerisation durch Erwärmen auf Temperaturen von mindestens 30 °C, bevorzugt mindestens 35 °C bis 70 °C, insbesondere mindestens 35 bis 50 °C erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor Bereitstellung des Reaktionsgemisches eine Inkubation des mindestens einen Enzyms und des mindestens einen Comonomers durchgeführt wird, wobei die Inkubation bevorzugt in basischer Lösung durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dem Reaktionsgemisch mindestens eine Verbindung zur Herabsetzung der Initiationstemperatur, die bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus organischen Aminen, insbesondere N,N,N',N'-Tetramethylendiamin (TMEDA), N,N,N',N",N"-Pentamethyldiethylenetriamin (PMDETA) oder Tris[2-(dimethylamino)-ethyl]amin (Me6TREN) zugesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bezogen auf die Gesamtmenge des im Reaktionsgemische vorhandenen mindestens einen ersten Proteins, der mindestens einen Verbindung gemäß Formel I, des mindestens einen Comonomers, des mindestens einen Vernetzers, des mindestens einen zweiten Proteins sowie der mindestens einen Verbindung zur Herabsetzung der Initiationstemperatur diese jeweils zu 0,1 bis 5,0 Gew.-%, bevorzugt 0,2 bis 2,0 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,3 bis 1,0 Gew.-% des mindestens einen ersten Proteins, 50,0 bis 98,4 Gew.-%, bevorzugt 64,0 bis 93,8 Gew.-%, besonders bevorzugt 76,3 bis 88,7 Gew.-% der mindestens einen Verbindung gemäß Formel I, 1,0 bis 15,0 Gew.-%, bevorzugt 3,0 bis 10,0 Gew.-%, besonders bevorzugt 5,0 bis 7,5 Gew.-% des mindestens einen Comonomers, 0,5 bis 10,0 Gew.-%, bevorzugt 1,0 bis 8,0 Gew-%, besonders bevorzugt 2,0 bis 5,0 Gew.-% des mindestens einen Vernetzers, 0 bis 10,0 Gew.-%, bevorzugt 1,0 bis 8,0 Gew.-%, besonders bevorzugt 2,0 bis 5,0 Gew.-% des mindestens einen zweiten Proteins, sowie 0 bis 10,0 Gew.-%, bevorzugt 1,0 bis 8,0 Gew.-%, besonders bevorzugt 2,0 bis 5,0 Gew.-% der mindestens einen Verbindung zur Herabsetzung der Initiationstemperatur enthalten sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerisation als Fällungspolymerisation durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das entstandene Copolymer vom Reaktionsgemisch abgetrennt wird, insbesondere durch Zentrifugation, Sedimentation oder Filtration.
Vernetztes Copolymer, enthaltend vernetzte Copolymerketten, wobei die Copolymerketten die nachfolgenden Wiederholungseinheiten a) und b) umfassen a)
wobei jeweils unabhängig voneinander X NH, O oder NR¹ Y einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl y 0 oder 1 und R¹ einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einen linearen oder verzweigten Alkyletherrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Wasserstoff bedeuten, und b) eine vom mindestens einen Comonomer nach einem der vorhergehenden Ansprüche durch radikalische Polymerisation abgeleitete Wiederholungseinheit, wobei das mindestens eine erste Protein über die unhydrolysierte oder hydrolysierte Thiolacton-Funktionalisierung kovalent an diese Wiederholungseinheit angebunden ist, wobei die Wiederholungseinheiten a) und b) statistisch verteilt im vernetzten Copolymeren vorliegen und die Vernetzung mittels mindestens einer die Copolymerketten vernetzenden Gruppierung erfolgt, die keine Disulfidbrücke ist.
Vernetztes Copolymer nach vorhergehendem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Wiederholungseinheit b) die nachfolgende Wiederholungseinheit ist
wobei jeweils unabhängig voneinander X NH, O oder NR¹, insbesondere NH Y einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl y 0 oder 1, und R³ eine Gruppierung gemäß den nachfolgend abgebildeten allgemeinen Formeln V und VI darstellt,
wobei jeweils unabhängig voneinander R Wasserstoff oder einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Wasserstoff x 1 bis 6, bevorzugt 2 oder 3, insbesondere 2 und P₁ das mindestens eine erste Protein wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert bedeuten.
Vernetztes Copolymer nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Wiederholungseinheit a) X=NH oder O und und R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus linearen oder verzweigten Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder linearen oder verzweigten Alkyletherresten mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, insbesondere ein Isopropyl- oder Di(ethylenglykol)-methyletherrest ist.
Vernetztes Copolymer nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die vernetzende Gruppierung auf eine mindestens zwei radikalisch reaktive Funktionalitäten aufweisende Verbindung, bevorzugt eine mindestens zwei (Meth)acrylamid-Funktionalitäten oder (Meth)acrylat-Funktionalitäten aufweisende Verbindung, insbesondere N,N'-Methylenbisacrylamid zurückgeht.
Vernetztes Copolymer nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Copolymer zusätzlich zu den Wiederholungseinheiten a) und b) eine Wiederholungseinheit c) umfasst, die die nachfolgende Wiederholungseinheit ist
wobei jeweils unabhängig voneinander X NH, O oder NR¹, insbesondere NH Y einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl y 0 oder 1, und R⁴ eine Gruppierung gemäß den nachfolgend abgebildeten allgemeinen Formeln V und VI darstellt,
wobei jeweils unabhängig voneinander R Wasserstoff oder einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Wasserstoff x 1 bis 6, bevorzugt 2 oder 3, insbesondere 2 und P₂ ein nicht mit dem ersten Protein identisches zweites Protein, insbesondere bovines Serumalbumin bedeuten.
Vernetztes Copolymer nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass bezogen auf die Gesamtmenge der vernetzten Copolymeren vorhandenen Wiederholungseinheiten a) bis c) sowie der vernetzenden Gruppierung diese jeweils zu 1,1 bis 20,0 Gew.-%, bevorzugt 3,2 bis 12,0 Gew.-%, besonders bevorzugt 5,0 bis 8,5 Gew.-% der Wiederholungseinheit b), 50,0 bis 98,4 Gew.-%, bevorzugt 64,0 bis 93,8 Gew.-%, besonders bevorzugt 76,5 bis 91,0 Gew.-% der Wiederholungseinheit a), 0,5 bis 10,0 Gew.-%, bevorzugt 1,5 bis 8,0 Gew-%, besonders bevorzugt 2,0 bis 5,0 Gew.-% der mindestens einen vernetzenden Gruppierung, 0 bis 20,0 Gew.-%, bevorzugt 1,5 bis 16,0 Gew.-%, besonders bevorzugt 2,0 bis 10,0 Gew.-% der Wiederholungseinheit c) enthalten sind.
Gel, insbesondere Nanogel, umfassend mindestens ein in Wasser gequollenes vernetztes Copolymer nach einem der Ansprüche.
Gel nach vorhergehendem Anspruch, gekennzeichnet durch eine mittels dynamischer Lichtstreuung (Dynamic Light Scattering, DLS) gemessenen Partikelgröße von 10 bis 10.000 nm, bevorzugt 100 bis 1.000 nm.
Verwendung eines Gels nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche als biokatalytisches Gel, zur Immobilisierung/Stabilisierung von biokatalytisch aktiven Verbindungen, als wiederverwertbarer Katalysator, biokatalytisch aktives Material zum Einsatz in kontinuierlichen Synthese- oder Raffinationsprozessen.