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Die vorliegende Erfindung betrifft eine automatische Eintauchapparatur zur programmgesteuerten Durchführung eines Verfahrens zur Benetzung oder Beschichtung einer Oberfläche mit einer Flüssigkeit. Die erfindungsgemäße Eintauchapparatur ist dadurch gekennzeichnet, dass auf einer drehbar gelagerten Welle mindestens ein Träger zum Halten der Probenplatte wieder lösbar befestigt wird. Eine im Träger angeordnete Probenplatte wird durch den Betrieb der Welle kontrolliert durch die Flüssigkeit geführt und so eine Oberfläche mit einer Flüssigkeit benetzt oder beschichtet. Die erfindungsgemäße Eintauchapparatur kann sowohl als Laborgerät oder als Medizintechnikgerät angewendet werden.
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Im Stand der Technik sind unterschiedliche Apparaturen zur Beschichtung von Probenplatten, insbesondere von Objektträgern geläufig. Bei einer manuellen Beschichtung ist es nach wie vor die gängige Vorgehensweise eine Probe auf einen Objektträger zu überführen und die Probe dann manuell mit einer Flüssigkeit zu beschichten bzw. zu benetzen. Dabei wird durch das Spritzen der Flüssigkeit aus einer Pipette punktuell eine hohe Scherkraft auf die Probe ausgeübt und die Flüssigkeit ungleichmäßig verteilt. Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass die Probe durch die Scherkraft beschädigt werden kann und durch die ungleichmäßige Verteilung der Flüssigkeit auch eine ungleichmäßige Inkubation der Probe mit der Flüssigkeit erfolgt. Eine andere Variante ist das manuelle Dippen bzw. Eintauchen des Objektträgers in eine Lösung. Gängig ist hier das manuelle vertikale Eintauchen in eine Flüssigkeit. Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass durch ein ungleichmäßiges Eintauchen des Objektträgers die Probe einer ungleichmäßigen Inkubation mit der Flüssigkeit ausgesetzt ist. Die Punkte der Probe, die als erstes mit der Lösung in Kontakt kommen, weisen eine längere Inkubationszeit auf als alle übrigen Bereiche, da diese bei der Entnahme des Objektträgers die Flüssigkeit als letztes verlassen.
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Dabei kann die Flüssigkeit eine Färbelösung sein, eine biologische Lösung z. B. enthaltend Antikörper, RNS, DNS, Enzyme oder andere biologisch aktive Verbindungen, eine Matrix oder eine Nährstofflösung.
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Der Nachteil manueller Probenvorbereitungen für nachgeschaltete Analyse-/Diagnostizierverfahren, wie z. B. Mikroskopie, Spektroskopie, Photometrie, MADLI-Imaging, ist stets der fehlende Grad der Reproduzierbarkeit und die Fehlerrate durch den Anwender. Auch bei Verwendung von Stoppuhren und genormten Flüssigkeiten, sind Fehler und Beeinträchtigungen durch das manuelle Eintauchen nicht auszuschließen.
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Auf dem Gebiet der Histologie, und künftig auf dem Gebiet der klinischen Diagnostik, werden umfangreiche Gewebeanalysen durchgeführt, wobei die Gewebeproben auf einem Objektträger aufgebracht und anschließend mit einem Medium inkubiert werden. Ein Beispiel ist die histologische Diagnostik oder die Proteom- und Metabolomforschung, in denen eine bildgebende Massenspektroskopie (MALDI-MSI) durchgeführt wird. Durch diese Technik können Moleküle im Gewebe detektiert und ihre genaue Position bildlich dargestellt werden. Die Voraussetzung für eine funktionierende MALDI-MSI Analyse ist eine Probenvorbereitung.
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Bislang wird eine Probe, insbesondere eine Gewebeprobe, für eine MALDI-MSI Analyse mit einer Matrix mittels einer Düsensprühtechnologie besprüht. Andere Auftragungsverfahren nach dem Stand der Technik sind Vibrationsverdampfung, Tintenstrahldrucktechnologie und akustische Tröpfchentechnologie.
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Der Nachteil zumindest der Düsensprühtechnologie ist eine nicht-sensitive Wirkung eines hohen Gasvolumenstroms auf die Probe. Beispielsweise lassen sich pflanzliche Proben aufgrund ihrer chemischen Zusammensetzung nicht fest genug auf einem Objektträger fixieren. Dadurch reichen die Adhäsionskräfte nicht aus, um die Probe bei einem entsprechenden Gasvolumenstroms auf dem Objektträger fixiert zu halten. Zudem liegt eine gewisse Fehleranfälligkeit der Feinteile der Düsensprühtechnologie vor. Die Düsensprühtechnologie erlaubt beispielsweise keine Benutzung von partikelhaltigen Flüssigkeiten, da dies zu Verstopfungen führt. Des Weiteren erhöht sich die Rüstzeit je nach eingesetztem Medium und Komplexität der Apparatur erheblich.
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Bisher wurde ein Eintauchvorgang einer Probe für eine MALDI-MSI-Analyse in eine Matrix nicht berücksichtigt, weil davon ausgegangen wurde, dass es bei einem Eintauchverfahren zu einer Delokalisation der Moleküle kommen würde und so eine fehlerbehaftete Analyse in Form von Artefakten zustande käme. Mit der Eintauchapparatur konnte gezeigt werden, dass dieser Effekt mit geeigneter Matrix in Kombination mit geeignetem Lösemittel nicht auftritt. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Kristallbildung der Matrix. Die Kristallgröße kann mit der Auftragungsart variieren und bei zu großen Kristallen zu einem verringertem Auflösungsvermögen bei einer anschließenden MALDI-Imaging Analyse führen. Hier konnte gezeigt werden, dass mit geeigneter Matrix und Lösungsmittel kleine Kristalle oder sogar keine Kristalle ausgebildet werden. Qualitativ hochwertige Messergebnisse können auch ohne eine Kristallausbildung erzielt werden.
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Daher stellt sich die vorliegende Erfindung die Aufgabe eine Eintauchapparatur bereitzustellen, worin die vorgenannten Nachteile überwunden werden. Dazu soll eine Eintauchapparatur bereitgestellt werden, die eine gleichmäßige Benetzung einer Oberfläche, insbesondere einer Probe, gewährleistet. Ebenso soll eine Eintauchapparatur bereitgestellt werden, die eine gleichmäßige Beschichtung einer Oberfläche, insbesondere einer Probe, gewährleistet. Ferner soll eine Eintauchapparatur bereitgestellt werden, die eine gleichmäßige Benetzung oder Beschichtung einer Oberfläche, insbesondere einer Probenoberfläche mit einer Lösung gewährleistet. Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine automatische Eintauchapparatur bereitzustellen, welche programmierbar ist, automatisch gesteuert wird und somit eine reproduzierbare Anwendung gewährleistet. Ebenso soll eine reproduzierbare Durchführung eines Eintauchvorgangs ermöglicht werden und somit eine reproduzierbare Probenvorbereitung für nachgeschaltete Analysen und Diagnose-Verfahren. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung einer automatischen, programmierbaren Eintauchapparatur, welche die Anforderung an ein Qualitätsmanagement erfüllt und gleichzeitig einfach in der Anwendung für den Benutzer ist. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer automatischen Eintauchapparatur zur Durchführung eines Verfahrens zur Benetzung einer Probe mit einer Lösung, insbesondere Matrix. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur soll ein Verfahren zur Benetzung einer Probe mit einer Lösung, insbesondere Matrix, bereitgestellt werden, worin die Probe nicht beeinträchtigt oder beschädigt wird und keine Materialien einer vorherigen Probe auf die aktuelle Probe übertragen werden (Kreuzkontamination). Darüber hinaus soll ein Kit bereitgestellt werden, mit dem das vorgenannte Verfahren durchgeführt werden kann. Besonders soll eine Eintauchapparatur zur Benetzung einer Probe, insbesondere einer biologischen Probe, z. B. Gewebeschnitt, mit einer Matrix zur Probenvorbereitung für eine MALDI-MSI Analyse bereitgestellt werden. Dabei soll die Eintauchapparatur flexibel an alle gängigen Abmessung einer Probenplatte, insbesondere Objektträger, angepasst werden können, sodass die Eintauchapparatur die Benetzung einer Probe auf einer Probenplatte flexibel ermöglicht.
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Die vorgenannten Nachteile aus dem Stand der Technik sowie die Aufgaben werden durch die erfindungsgemäße automatische Eintauchapparatur gelöst.
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Daher ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine automatische Eintauchapparatur (1a-e) für eine Probenplatte, insbesondere einen Objektträger, wobei die Eintauchapparatur eine drehbar gelagerte Welle aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Welle mindestens ein Träger zum Halten der Probenplatte, insbesondere eines Objektträgers, angeordnet ist, wobei die Probenplatte einen Flächenvektor aufweist, welcher senkrecht zur Ebene der Probenplatte steht, wobei der Flächenvektor beim Einspannen in den Träger senkrecht zur Längsachse der Welle steht, wobei der mindestens eine Träger mindestens ein Verbindungselement Typ 1 aufweist, wobei das mindestens eine Verbindungselement Typ 1 dazu ausgebildet ist, den mindestens einen Träger an der Welle lösbar zu befestigen.
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Probenplatte im Sinne der Erfindung bedeutet eine Platte, auf der eine Probe auf einer Probenseite der Probenplatte angeordnet bzw. aufgebracht wurde. Die Probenplatte, vorzugsweise der Objektträger, weist somit eine Probenseite und eine Unterseite auf. In einer besonderen Ausführungsform im Sinne der Erfindung ist die Probenplatte ein Objektträger. Die Maße der Probenplatte bzw. des Objektträgers können gemäß der kommerziell erhältlichen Maße variieren. Zum Beispiel: 76 mm x 52 mm, 76 mm x 51 mm, 75 mm x 38 mm, 76 mm x 26 mm, 75 mm x 25 mm, 48 mm x 28 mm, 46 mm x 27 mm. Die Dicke der meisten kommerziell erhältlichen Objektträger liegt in Bereich von 0,9 bis 1,1 mm. Jedoch gibt es besondere Ausgestaltungen von Probenplatten mit einer Dicke in einem Bereich von 0,3 mm bis 2 mm.
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Wesentliche Eigenschaft der Probenplatte ist, dass diese sich in den erfindungsgemäßen Träger einspannen lässt bzw. befestigt werden kann. Somit ist die Probenplatte aus einem formstabilen Material umfassend Kunststoff, Edelstahl und/oder Glas. Bei Bedarf kann die Probenplatte besondere physikalische und/oder chemische Eigenschaften aufweisen, wie z. B. eine definierte elektrische Leitfähigkeit zumindest der Probenseite der Probenplatte und/oder Funktionalisierung zur besseren Anhaftung der Probe an der Probenseite der Probenplatte. Die elektrische Leitfähigkeit kann durch die Wahl des Materials erzielt werden oder durch eine Beschichtung der Probenseite und/oder Unterseite der Probenplatte mit einem elektrisch leitfähigen Material, wie Indiumzinnoxid (ITO) oder einem elektrisch leitfähigen Polymer. Bevorzugt ist mindestens die Probenseite elektrisch leitfähig, insbesondere eine ITO-beschichtete Probenseite eines Objektträgers.
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Daher wird in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung eine zumindest einseitig oder zweiseitig elektrisch leitfähige Probenplatte ausgewählt aus einem Edelstahl-Objektträger, ITO-beschichtete Glas-Objektträger oder mit elektrisch leitfähigen Polymeren beschichtete Kunststoff- oder Glas-Objektträger eingesetzt. Besonders bevorzugt ist die Probenplatte für eine MALDI-MSI-Untersuchung geeignet und somit zumindest einseitig elektrisch leitfähig.
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In einer besonderen Ausführungsform ist die erfindungsgemäßen automatische Eintauchapparatur dadurch gekennzeichnet, dass die der Welle zugwandte Seite des Trägers zur Welle formschlüssig ausgebildet ist, wie z. B. in 2 dargestellt. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Trägers, ist dieser als eine Rahmenstruktur ausgebildet, wie in 2 dargestellt. Bevorzugt ist die Rahmenstruktur an der Welle zugewandten Seite formschlüssig zu dieser Welle ausgebildet. In einer weiteren Ausführungsform die Rahmenstruktur quaderförmig.
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In einer besonderen Ausführungsform ist der Träger derart ausgestaltet, dass die mindestens eine Probenplatte in eine dafür vorgesehene Führrille eingeschoben wird (3).
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In einer besonderen Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Träger flexibel ausgestaltet, sodass dieser auf die unterschiedlichen Abmessungen der Probenplatte, wie oben beschrieben, arretiert werden kann. Bevorzugt ist der Träger entlang der zur Welle hin parallelen Längsachse verlängerbar bzw. kann entlang der zur Welle hin parallelen Längsachse gestaucht werden. Auf diese Weise kann der Träger an eine Probenplatte, insbesondere Objektträger, mit einer Längsachse von größer gleich 35 bis kleiner gleich 80 mm angepasst werden.
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In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen automatischen Eintauchapparatur ist der Träger temperierbar. Vorzugsweise ist der Träger in einer Temperaturspanne von größer gleich -30 °C bis kleiner gleich 60 °C temperierbar. Vorzugsweise wird die Temperatur feinstufig variiert und besonders bevorzugt an die Temperatur der verwenden Flüssigkeit in der Wanne angepasst. Dies hat den Vorteil, dass die Probe auf dem Träger keinen Temperaturschwankungen ausgesetzt wird und somit die Qualität der Probe und der nachgeschalteten Analytik optimiert wird. Vorzugsweise ist die Wanne in einem Bereich von größer gleich 18 °C bis kleiner gleich 60 °C temperierbar.
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In einer besonderen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße automatische Eintauchapparatur dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Verbindungselement des Typs 1 ausgewählt wird aus magnetischen Verbindungselementen, Bajonettverschluss, Nut-Feder-Verbindung, Passfeder, Schwalbenschwanzverbindung, Klemmvorrichtung und/oder einer Verschraubung. Die Wahl des am besten geeigneten Verbindungselementes kann der Fachmann treffen. Dabei können das Material der Probenplatte sowie die Abmessung der Probenplatte relevant sein. In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen automatischen Eintauchapparatur sind magnetischen Verbindungselemente besonders bevorzugt. Diese haben den Vorteil, dass die Anzahl von Vertiefungen, in denen sich Probenmaterial akkumulieren könnte, im Träger minimal gehalten wird. Des Weiteren ermöglichen magnetische Verbindungselemente eine einfache sowie schnelle Arretierung des Trägers an der Welle und schnelle Lösung von der Welle, sodass sich die Handhabung für den Anwender möglichst einfach darstellt.
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In einer besonderen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße automatische Eintauchapparatur dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Verbindungselement des Typs 2 zur Verbindung der mindestens einen Probenplatte mit dem Träger vorgesehen ist. Das mindestens eine Verbindungselement wird ausgewählt aus magnetischen Verbindungselementen, Bajonettverschluss, Nut-Feder-Verbindung, Passfeder, Schwalbenschwanzverbindung, Klemmvorrichtung und/oder einer Verschraubung. Die Wahl des am besten geeigneten Verbindungselementes kann der Fachmann treffen. Dabei können das Material der Probenplatte sowie die Abmessung der Probenplatte relevant sein. In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen automatischen Eintauchapparatur sind magnetischen Verbindungselemente besonders bevorzugt, deren Gegenstück eine magnetische Brücke ist. Die magnetischen Verbindungselemente haben den Vorteil, dass die Anzahl von Vertiefungen, in denen sich Probenmaterial akkumulieren könnte, im Träger minimal gehalten wird. Des Weiteren ermöglichen magnetische Verbindungselemente eine einfache sowie schnelle Arretierung der Brücke an dem Träger und schnelle Lösung von dem Träger, sodass sich die Handhabung für den Anwender möglichst einfach darstellt.
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In 1 ist eine mögliche Positionen der magnetischen Verbindungselemente des Typs 1 und des Typs 2 (1b) dargestellt.
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In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße automatische Eintauchapparatur dadurch gekennzeichnet, dass unterhalb des an der Welle lösbar befestigten Trägers mindestens eine Wanne zur Aufnahme einer Flüssigkeit, insbesondere eines Mediums, angeordnet ist, wobei die Wanne lösbar am Boden mindestens eines Probenraums der Eintauchapparatur befestigt wird. Die Abmessungen der Wanne sind derart ausgestaltet, dass diese in den Probenraum eingeführt werden kann und der Innenraum der Wanne dabei unter dem auf der Welle befestigen Träger angeordnet ist. Der Innenraum der Wanne ist mindestens so dimensioniert, dass der mindestens eine im Träger befestigte Objektträger während des Eintauchvorgangs (Rotation um die Achse der Welle) vollständig eintaucht.
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Erfindungsgemäß kann die Wanne (7) aus der Eintauchapparatur entnommen werden, um diese zu befüllen und/oder zu reinigen oder ggf. durch eine andere Wanne mit einem anderen Volumen auszutauschen. In einer besonderen Ausführungsform ist die Wanne zumindest im Innenraum, der mit der Flüssigkeit befüllt wird, mit einem nicht korrosiven Material beschichtet und/oder umfasst ein nicht korrosives Material. Die Wanne umfasst Materialien wie Glas, Edelstahl, Edelstahl-Legierungen wie Vanadium-, Nickel- und/oder Chrom-Legierung und/oder lösungsmittelbeständige Kunststoffe. Insbesondere bei Verwendung eines korrosiven Lösungsmittels, insbesondere Dichlormethan, Toluol, Chloroform, zur Herstellung einer Matrixlösung, insbesondere einer Matrix im Sinne der Erfindung, wird eine Wanne umfassend ein inertes (nicht korrosives) Material bevorzugt und besonders bevorzugt ist die Wanne aus Edelstahl und/oder einer Edelstahllegierung.
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In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen automatischen Eintauchapparatur umfasst die Wanne mindestens eine Ablaufvorrichtung. Diese kann bei einer viereckigen oder quadratischen Ausgestaltung der Wanne in/an einer der Ecken angeordnet sein und/oder in einer Seitenwand oder am Boden in Form eines mit einem Stopfen verschließbaren Ablaufs ausgestaltet sein.
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In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Wanne eine Vorrichtung zum automatischen Durchspülen und für einen automatischen Austausch einer Flüssigkeit, insbesondere Matrix oder Medium. Dazu wird ein Zufluss und ein Abfluss an der Wanne vorgesehen, wobei durch den Zufluss eine neue Flüssigkeit, z.B. eine Reinigungsflüssigkeit oder Matrix, eingeführt wird und durch den Abfluss, die vorhandene oder gebrauchte Flüssigkeit, abgeleitet wird. Vorzugsweise in einen Auffangbehälter.
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In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen automatischen Eintauchapparatur weist die Wanne ein Fassungsvermögen von größer gleich 5 ml bis kleiner gleich 150 ml auf. Bevorzugt größer gleich 10 ml, größer gleich 15 ml, größer gleich 20 ml, größer gleich 25 ml größer gleich 30 ml bis kleiner gleich 140 ml, kleiner gleich 135 ml, kleiner gleich 130 ml, kleiner gleich 125 ml, kleiner 120 ml, kleiner gleich 100 ml kleiner gleich 50 ml. Bevorzugt hat die Wanne erfindungsgemäß eine Fassungsvermögen von größer gleich 5 ml bis kleiner gleich 50 ml und besonders bevorzugt 30 ml +/- 5 ml.
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Erfindungsgemäß kann die Wanne aus der erfindungsgemäße Eintauchapparatur entnommen werden, um diese zu befüllen und/oder zu reinigen oder ggf. durch eine andere Wanne mit einem anderen Fassungsvermögen auszutauschen.
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In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen automatischen Eintauchapparatur ist die Wanne temperierbar. Vorzugsweise ist die Wanne in einem von größer gleich 18 °C bis kleiner gleich 60 °C temperierbar.
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Flüssigkeit im Sinne der Erfindung umfasst Färbelösungen, biologische Lösung z. B. enthaltend Antikörper, RNS, DNS, Enzyme, Sonden oder andere biologisch aktive Verbindungen, Nährstofflösung, Konservierungslösungen, flüssige Harze, flüssige Polymere oder chemische Lösungen. Bevorzugt ist die Lösung im Sinne der Erfindung eine Matrix zur Probenvorbereitung für eine MALDI-MSI Analyse.
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Vorzugsweise ist die Flüssigkeit eine Matrix, welche keine Kristalle bildet und besonders bevorzugt eine Matrix nach Charles et al. (Charles D. Swor, Lev N. Zakharov, and David R. Tyler „A Colorimetric Proton Sponge", J. Org. Chem., 2010, 75 (20), pp 6977-6979; DOI: 10.1021/jo101381r) und nach Giampa et al. (M. Giampa,a M. B. Lissel,a T. Patschkowski,a J. Fuchser,b V. H. Hans,cd O. Gembruch,e H. Bednarza and K. Niehaus „Maleic anhydride proton sponge as a novel MALDI matrix for the visualization of small molecules (< 250 m/z) in brain tumors by routine MALDI ToF imaging mass spectrometry.", Chemical Communications 52.63 (2016): 9801-9804, DOI: 10.1039/C6CC02387H). Dies hat den Vorteil, dass die Beschichtung der Probe nicht von der Ausbildung gleich großer Kristalle abhängig ist, um eine gleichmäßige Beschichtung und somit eine hohe Auflösung bei der MALDI-Messung zu erzielen.
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In einer besonderen Ausführungsform ist die automatische Eintauchapparatur dadurch gekennzeichnet, dass die Welle mindestens eine Verjüngung ihres Durchmesser aufweist, wobei die mindestens eine Verjüngung entlang der Längsachse auf der im Probenraum befindlichen Teilstrecke der Welle angeordnet ist und bevorzugt mindestens zwei Verjüngungen, wobei diese entlang der Längsachse derart zueinander beabstandet sind, dass der an der Welle lösbar befestigte mindestens eine Träger zwischen den mindestens zwei Verjüngungen angeordnet ist und insbesondere nicht über die Verjüngungen hinausragt. Eine Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Welle ist in 4 zu sehen. Die Verjüngungen dienen der Ableitung der Flüssigkeit, sodass das Eindringen der Flüssigkeit in den Antrieb bzw. in den Maschinenraum verhindert wird. Somit wird verhindert, dass die Flüssigkeit, insbesondere eine chemisch aggressive Flüssigkeit den Antrieb der Welle beschädigt und/oder den Probenraum außerhalb der Wanne verunreinigt.
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In einer besonderen Ausführungsform weist die Welle erfindungsgemäß mindestens eine, vorzugsweise, zwei Ausnehmung auf, wie in 4 zu sehen. Diese dienen dazu den Träger auf der Welle formschlüssig zu arretieren und mittels des mindestens einen Verbindungstyps 1 zu fixieren.
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In einer besonderen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße automatische Eintauchapparatur dadurch gekennzeichnet, dass
- - nach einer ersten Alternative der Antrieb der Welle integraler Bestandteil der Welle ist oder
- - nach einer zweiten Alternative der Antrieb der Welle in einem von einem Probenraum getrennten Maschinenraum angeordnet ist.
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In der ersten Alternative besteht die erfindungsgemäße automatische Eintauchapparatur aus mindestens einem Probenraum, durch den die Welle geführt wird und die Welle an bzw. in den Wänden des mindestens einen Probenraums derart befestigt wird, sodass mindestens eine Wanne unter der Welle angeordnet werden kann, wie bereits oben ausgeführt. Der Antrieb der Welle ist in dieser Ausführungsform außerhalb des mindestens einen Probenraums steuerbar, wobei die Steuerung das An- und Ausschalten der Apparatur, Starten, Steuern und Überwachen eines Programms zur Durchführung eines Eintauchvorgangs sowie das Starten, Steuern und Überwachen eines Reinigungsprogramms und/oder das Überwachen der Eintauchapparatur für ein Qualitätsmanagement umfasst.
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In einer besonderen Ausführungsform der ersten Alternative der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur sind mindestens zwei Probenräume in Reihe angeordnet und geschaltet, wobei die Welle die mindestens zwei Probenräume oder mehr verbindet und steuert. Dabei kann die Welle durch eine Verlängerung den mindestens einen Probenraum mit dem mindestens zweiten Probenraum koppeln, sodass die verlängerte Welle durch einen Antrieb gesteuert wird. Somit ist die erfindungsgemäße Eintauchapparatur modular aufgebaut. Somit umfasst die erfindungsgemäße Eintauchapparatur in einer besonderen Ausführungsform mindestens zwei oder mehrere Proberäume, welche parallel gesteuert werden können. Eine magnetische oder vorzugsweise elastische Kupplung verbindet einen ersten Probenraum mit einem zweiten, dritten, vierten usw., die zeitgleich/parallel betrieben werden. Vorzugsweise wird in allen Probenräumen derselbe Eintauchvorgang durchgeführt.
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In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur ist die Welle und der mindestens eine Probenraum derart ausgestaltet, dass mindestens zwei Träger oder mehr Träger an der einen Welle befestigt werden, die durch mindestens zwei Wannen oder mehr Wannen geführt werden. Die Länge der Welle kann variieren, sodass auch drei, vier, fünf usw. Träger in einem Probenraum beschichtet werden, wobei jeder Träger in die jeweilige Wanne geführt wird. Damit wird eine getrennte Beschichtung der jeweiligen Probe auf einem Träger ohne Kontamination zwischen den jeweiligen Wannen gewährleistet.
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In der zweiten Alternative der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur, worin der Antrieb der Welle in einem von einem Probenraum getrennten Maschinenraum angeordnet ist, kann ebenso ein modularer Aufbau mit mindestens zwei Probenräumen oder mehr vorgesehen werden.
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Vorzugsweise umfasst der mindestens eine Maschinenraum eine aktive Belüftung zur Erzielung eines Überdrucks, sodass keine ggf. im Probenraumentstehenden Gase oder Dämpfe aus dem Probenraum in den Maschinenraum eindringen können. Solche Gase oder Dämpfe können aus der verwendeten Flüssigkeit entstehen. Insbesondere bei der Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln, wie diese z. B. zur Herstellung einer Matrix zur Probenvorbereitung für MALDI-Imaging verwendet werden.
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Erfindungsgemäß ist der mindestens eine Probenraum der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur derart dimensioniert, sodass mindestens ein Träger für mindestens einen Objektträger auf einer Welle befestigt werden kann und das hierin beschrieben Verfahren zur Benetzung des mindestens einen Objektträgers, insbesondere der Probe, durchgeführt werden kann. Dabei wird die Probe bevorzugt in Form einer Rotationsbewegung um die Mittelachse der Welle um 360° bewegt und dabei in die Flüssigkeit, vorzugsweise Matrix, eingetaucht. Daher ist der mindestens eine Probenraum der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur derart dimensioniert, sodass der Träger einschließlich der Probenplatte um die Mittelachse der Welle bewegt werden kann, dabei in die Matrix eintaucht ohne in Berührung mit den Innenwänden des Probenraums zu kommen.
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In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße automatische Eintauchapparatur dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Probenraum eine Lüftung umfasst. In einer Ausführungsform ist die Lüftung in Form mindestens einer Ausnehmung in mindestens einer Wand des Gehäuses des Probenraums ausgestaltet, wie in 1b zu sehen. Alternativ kann die Lüftung in Form einer Absaugvorrichtung unter Beibehaltung eines vollständig geschlossenen Systems des mindestens einen Probenraums ausgestaltet sein (nicht gezeigt). Somit wird für den erfindungsgemäßen Probenraum zwischen einer passiven, insbesondere Lüftung zur Umgebung, und aktiven Lüftung, insbesondere durch eine steuerbare Vorrichtung, unterschieden. Die vorgenannten Varianten der Lüftung des mindestens einen Probenraums sind für beide Alternativen der Apparatur mit einem integralen Antrieb oder einem Maschinenraum geeignet und kombinierbar.
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In einer besonderen Ausführungsform nach einer ersten Alternative der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur, worin der Antrieb der Welle integraler Bestandteil der Welle ist, ist der mindestens eine Probenraum derart mit Dichtungen ausgestaltet, dass bei einem integralen Antrieb in der Welle keine ggf. im Probenraum entstehenden Gase oder Dämpfe aus dem Probenraum in den integralen Antrieb der Welle eindringen können.
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In einer besonderen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße automatische Eintauchapparatur dadurch gekennzeichnet, dass die Wanne integraler Bestandteil des mindestens einen Probenraums, vorzugsweise des Bodens des Probenraums bzw. der Grundplatte des mindestens einen Probenraums, ist. Somit ist in einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen automatischen Eintauchapparatur die Wanne, welche unterhalb des an der Welle lösbar befestigten Trägers angeordnet wird, derart lösbar am Boden des mindestens einen Probenraums befestigt, dass die in die Eintauchapparatur eingeführte Wanne die erfindungsgemäße Eintauchapparatur am Boden verschließt und so zumindest teilweise die Grundplatte ersetzt.
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Erfindungsgemäß kann die Wanne aus der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur entnommen werden, um diese zu befüllen und/oder zu reinigen oder ggf. durch eine andere Wanne mit einem anderen Fassungsvermögen auszutauschen.
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In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße automatische Eintauchapparatur dadurch gekennzeichnet, dass in dem mindestens einen Probenraum und/oder dem einen Maschinenraum mindestens ein Sensor A zur Überwachung und Ausrichtung des mindestens einen Trägers angeordnet ist, wobei der Träger einen Flächenvektor aufweist, welcher senkrecht zur Ebene des mindestens einen Trägers steht, wobei der Flächenvektor beim Verbinden auf der Welle senkrecht zur Längsachse der Welle steht. Vorzugsweise hat der Flächenvektor des Trägers im Stillstand der Eintauchapparatur, insbesondere im Stillstand des Antriebs, eine senkrechte Ausrichtung zur Längsachse der Welle.
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Alle Ausführungsformen in Bezug auf die Sensoren sind mit beiden Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur kombinierbar, sowohl mit einem separaten von einem Probenraum getrennten Maschinenraum oder mit einem integralen Antrieb in der Welle ohne Maschinenraum. Lediglich die Positionierung des jeweiligen Sensors ist durch die bauliche Ausgestaltung variabel. Jedoch bleibt die jeweilige Funktion unverändert erhalten.
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In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße automatische Eintauchapparatur dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Probenraum und/oder Maschinenraum mit mindestens einem Deckel verschließbar ist, wobei mindestens ein zweiter Sensor B die Position des mindestens einen Deckels während eines Eintauchvorgangs überwacht.
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Der mindestens eine Deckel kann mit einem Sichtfenster ausgestaltet sein, das für Wartungszwecke entnehmbar ist und dem Anwender die Beobachtung des Eintauchvorgangs ermöglicht, wie in 5 gezeigt, welche ein Modell mit vielen Ausführungsformen darstellt.
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Vorzugsweise ist der Deckel aus der Sicht des Anwenders derart ausgestaltet, dass dieser nach Hinten, also von dem Anwender weg, aufgeklappt wird. Dabei werden bevorzugt zwei Wände des Gehäuses der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur weggeklappt.
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Der mindestens eine Sensor A erfüllt die Funktion die korrekte Position des mindestens eines Trägers im Probenraum zu gewährleisten, wobei der Träger auf der Welle befestigt ist. Vorzugsweise ist der Flächenvektor des auf der Welle befestigten Trägers senkrecht zur Ebene des mindestens einen Trägers und steht senkrecht zur Längsachse der Welle.
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Der Sensor A umfasst eine Kontaktscheibe (synonym = Sensorscheibe oder Positionierungsscheibe), auf welcher ein Magnet fixiert ist. Dieser befindet sich in einer Wechselwirkung mit dem Sensor A, der die Position des Magneten ermittelt. Anhand der Position des Magneten wird die Ausrichtung der Kontaktscheibe ermittelt und korrigiert. Da die Kontaktscheibe an der Welle fixiert ist, korrigiert sich gleichzeitig die Position der Welle.
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Alternativ kann Sensor A ein optischer Sensor sein, welcher über eine Kamera die Position des Trägers aufnimmt und ggf. die Welle derart steuert bis der Flächenvektor des Trägers senkrecht zur Längsachse der Welle ausgerichtet ist.
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Der Sensor A steuert die Ausrichtung des Trägers vor und/oder nach einem Eintauchvorgang. Nach dem Eintauchvorgang, damit der Anwender den Träger mit der benetzten Träger einfacher aus der Eintauchapparatur entnehmen kann. Vor dem Eintauchvorgang, damit der Start- und Endpunkt der Rotationsbewegung des erfindungsgemäßen Eintauchvorgangs festgelegt wird, wie hierin beschrieben.
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Der mindestens eine Sensor B erfüllt die Funktion sicherzustellen, dass der mindestens eine Deckel geschlossen ist bzw. der Eintauchvorgang nicht startet, wenn der mindestens eine Deckel nicht geschlossen ist.
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Bevorzugte Sensoren sind Hall-Sensoren und magnetische Absolut-Drehgeber, da diese eine kontaktlose Überprüfung der Positionierung sowohl des Deckels als auch der Welle ermöglichen und somit verschleißfrei sind.
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In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße automatische Eintauchapparatur dadurch gekennzeichnet, dass diese mindestens eine Schnittstelle für einen digitalen Datentransfer aufweist, In einer besonderen Ausführungsform ist die mindestens eine Schnittstelle erfindungsgemäß ein Anschluss für ein LAN-Kabel, Anschluss für einen USB-Stecker, Steckplatz für eine Karte (SD-Karten diverser Formate) oder Chip, Adapter für W-LAN, ein W-LAN Empfänger und/oder eine Bluetooth Schnittstelle. Jede der vorgenannten Schnittstellen ist für die Übertragung eines Programms auf die erfindungsgemäße Eintauchapparatur vorgesehen und/oder zur Übertragung von Daten von der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur auf ein externes Speichermedium. Dabei umfassen Daten gerätebezogene Daten zwecks Wartung des Gerätes, Daten im Zusammenhang mit dem Eintauchvorgang und/oder Daten im Zusammenhang mit Parametern des Probenraums (pH, Temperatur, Gase, Dämpfe usw.).
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Vorzugsweise wird über die mindestens eine Schnittstelle mindestens ein Programm auf die Eintauchapparatur übertragen, welches alle relevanten Parameter des gewünschten Eintauchvorgangs definiert. Daher ist die erfindungsgemäße automatische Eintauchapparatur in einer weiteren Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass diese mindestens eine Steuerungseinheit zur Steuerung der Eintauchapparatur und insbesondere des Eintauchvorgangs umfasst. Bevorzugt umfasst die Steuerungseinheit einen Prozessor zur Verarbeitung eines Programms zur Steuerung des Eintauchvorgangs.
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Eine besonders bevorzugt Ausführungsform der erfindungsgemäße Eintauchapparatur ist in 6 dargestellt.
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Die besonderen Vorteile der erfindungsgemäßen automatischen Eintauchapparatur sind
- - ein automatisiertes Eintauchen einer Probe mit einer motorbetriebenen und Programm überwachten/gesteuerten Eintauchgeschwindigkeit
- - eine gleichmäßig und gering ausgeübte Scherkraft auf die Probe
- - ein kompaktes portables Gerät
- - eine einfache und intuitive Handhabung
- - eine schnelle Probenvorbereitung
- - geringe Fehleranfälligkeit durch Simplizität
- - kompatibel für diverse Schnittstelle
- - digitale Verbindung
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit umfassend
- - die erfindungsgemäße Eintauchapparatur nach einer ersten Alternative, worin der Antrieb der Welle integraler Bestandteil der Welle ist oder nach einer zweiten Alternative, worin der Antrieb der Welle in einem von einem Probenraum getrennten Maschinenraum angeordnet ist,
- - mindestens eine geeignete Probenplatte, vorzugsweise einen für eine MALDI-MSI-Analyse geeignete Probenplatte und
- - eine zur Benetzung geeignete Flüssigkeit, vorzugsweise eine Matrix für eine MALDI-MSI-Analyse, bevorzugt eine Matrix nach Charles et al und Giampà et al.
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Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Kit
- - die erfindungsgemäße Eintauchapparatur nach einer zweiten Alternative, worin der Antrieb der Welle in einem von einem Probenraum getrennten Maschinenraum angeordnet ist, der Maschinenraum von dem mindestens einen Probenraum durch eine Trennwand getrennt ist, der Probenraum durch einen Deckel verschließbar ist und die Eintauchapparatur mindestens einen Sensor A und mindestens einen Sensor B aufweist,
- - mindestens einen zumindest einseitig elektrisch leitfähigen Objektträger, vorzugsweise ein ITO-beschichteter Glasobjektträger, mit den Abmessungen 25 x 75 x 1,1 mm (Breite x Länge x Höhe),
- - eine Matrix nach Charles et al. und Giampà et al. mit mindestens einer einfachen Anwendermenge von größer gleich 150 mg, wobei das Matrix-Aliquot in einer mitgelieferten Flasche bereitgestellt wird, und
- - einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise Dichlormethan, Toluol oder Chloroform, mit mindestens einem einfachen Volumen von 30 ml, wobei das Lösungsmittel-Aliquot in einer mitgelieferten Flasche bereitgestellt wird.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Benetzung einer Probenplatte mit einer Lösung (synonym = Eintauchvorgang), vorzugsweise mit einer Matrix, unter Verwendung der erfindungsgemäßen automatischen Eintauchapparatur umfassend die Schritte
- - Befestigen der Probenplatte, vorzugsweise eines Objektträgers, an dem Träger, vorzugsweise mittels einer Brücke und magnetischen Verbindungselementen, wobei die Probenplatte vorzugsweise mit der Probenseite zur Welle hin ausgerichtet ist. Vorzugsweise ist die Probenplatte ein Objektträger
- - Einbringen einer Lösung, vorzugsweise einer Matrix, in die Wanne
- - Befestigen des Trägers auf der Welle mit mindestens einem wieder lösbaren Verbindungselement, vorzugsweise mit magnetischen Verbindungselementen des Typ 1
- - Starten des Eintauchvorgangs.
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Vorzugsweise befindet sich auf der Probenseite eine Probe ausgewählt aus Gewebeschnitten humanen oder tierischen Ursprungs. Bevorzugt ist die Probenseite elektrisch leitfähig, insbesondere eine ITO-beschichtete Probenseite eines Objektträgers.
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In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass
- - der Füllstand der Lösung, vorzugsweise Matrix, in der Wanne ausreichend ist, dass die Probenplatte während des Eintauchvorgangs in die Lösung, vorzugsweise Matrix vollständig bedeckt ist,
- - die Probenplatte in dem Träger während des Eintauchvorgangs mindestens einmal vollständig in die Lösung, vorzugsweise in die Matrix, eintaucht,
- - der Eintauchvorgang automatisch erfolgt und endet und/oder
- - nach Beendigung des Eintauchvorgangs der Träger wieder in seiner Ausgangsposition steht.
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Besondere Vorteil des automatischen Eintauchvorgangs im Sinne der Erfindung ist, dass durch das automatisierte Eintauchen der Probe auf der Probenplatte in Form einer Rotation gewährleistet wird, dass jeder Punkt auf der Probenplatte, insbesondere auf der Probe, gleich lange der Flüssigkeit ausgesetzt wird. Die Automatisierung ermöglicht somit eine gleichmäßige Auftragung der Flüssigkeit, insbesondere einer Matrix, und begünstigt die Reproduzierbarkeit der Matrix-Auftragung auf eine Probe für eine optimale MALDI-MSI-Analyse.
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In einer besonderen Ausführungsform wird der Eintauchvorgang mehrfach wiederholt, vorzugsweise mindestens zwei, drei, vier, fünf und besonders bevorzugt sechs Mal, umfassend die Schritte
- - Auflegen eines Objektträgers auf den Träger, wobei der Objektträger mit seiner Probenseite zur Welle hin ausgerichtet ist. Vorzugsweise mit einem Gewebeschnitt auf der Probenseite des Objektträgers.
- - Arretieren des Objektträgers auf den Träger, vorzugsweise mit einer Brücke
- - Öffnen des mindestens einen Deckels, vorzugsweise Öffnen des mindestens einen Probenraums
- - Befestigen des Trägers auf der Welle
- - Befüllen der Wanne mit einer Matrix
- - Schließen des mindestens einen Probenraums
- - Betätigen eines Startkopfs zum Starten des Antriebs der Welle
- - Rotation der Welle um 360°
- - optional wiederholten der Rotation
- - automatisches beenden des Antriebs der Welle
- - Öffnen des mindestens einen Probenraums
- - Entnehmen der Wanne aus dem Probenraum und
- - Entnehmen des Trägers mit dem Objektträger aus dem Probenraum
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Vor einer MALDI-MSI Analyse muss der Objektträger getrocknet werden. Vor einem neuen Eintauchvorgang mit einer neuen Probe muss die Flüssigkeit, vorzugsweise die Matrix ausgetauscht werden. Die Eintauchapparatur, insbesondere der Probenraum, wird von innen gereinigt.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Eintauchapparatur
- 2
- Probenraum (synonym = Matrixraum, Probenkammer)
- 3
- Maschinenraum
- 4
- Deckel
- 15
- Welle
- 16 (a, b)
- Probenplatte: 16a = Probenseite der Probenplatte, 16b = Unterseite der Probenplatte
- 17
- Träger
- 18
- Grundplatte (snyonym = Boden des Probenraums)
- 19
- Wanne (snyonym = Becken, Matrixwanne, Matrixbecken)
- 20
- Seitenwand rechts
- 21
- Mittelsteg (snyonym = Trennwand zwischen Maschinenraum und Probenraum und/oder zwischen zwei Probenräumen
- 22
- Rückwand
- 23
- Seitenwand Motor
- 24
- Kontaktscheibe
- 25
- Motorhalterung
- 28
- Sicherheitsglasrahmen
- 29
- Sicherheitsglas
- 30
- Brücke
- 33
- Elastische Kupplungen RNK
- 34
- Lüfter (synonym = Lüftung, aktive Lüftung, passive Lüftung)
- 35
- LED-Signalleuchte blau
- 36
- LED-Signalleuchte rot
- 37
- Motor (Antrieb)
- 38
- Drucktaster
- 40
- Magnetklebeplättchen
- 41
- Leiterplatte
- 42
- Magnet Typ 1
- 43
- Magnet Typ 2
- 44
- Gehäusefuß
- 45
- Netzschalter
- 46
- Sensor A
- 47
- Verbindungselement Typ 1
- 48
- Sensor B
- 49
- Verbindungselement Typ 2
- 50
- Verjüngung Welle
- 51
- Ausnehmung Welle
- 52
- Ausnehmung Lüftung
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Figurenliste
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Alle Maßangaben erfolgen in [mm].
- 1a) Übersichtsdarstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur (1) mit einem Probenraum (2) mit einem Deckel (4) des mindestens einen Probenraums (2), einem Maschinenraum (3) und einer Grundplatte (18). Die Tiefe der Eintauchapparatur (1) beträgt in dieser Ausführungsform 140 mm und die Länge 260 mm.
- 1b) Frontalansicht einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur (1) mit einer Welle (15), einem Träger (17) für eine Probenplatte (16) und einer Brücke (30), einer Grundplatte (18), einer Wanne (19), einer Seitenwand rechts (20), einem Mittelsteg (21), einer Rückwand (22), einer Seitenwand Motor (23), einer Kontaktscheibe (24), einer Motorhalterung (25), einem Sicherheitsglasrahmen (28), einer elastischen Kupplung RNK (33), einem Lüfter (34), einer LED-Signalleute rot (36), einem Motor/ Antrieb (37), einem Drucktaster (38), Magnetklebeplättchen (40), einer Leiterplatte (41), einem Magnet Typ 1 (42), einem Verbindungselement Typ 1 (47), einem Verbindungselement Typ 2 (49) und einer Ausnehmung (52) als Lüftung. Die Länge der Eintauchapparatur (1) beträgt in dieser Ausführungsform 260 mm.
- 1 c)Aufsicht einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur (1) mit Sicherheitsglas (29), einer LED-Signalleute blau (35), einem Magnet Typ 2 (43), einem Sensor A (46) und einem Sensor B (48). Die Länge der Eintauchapparatur (1) beträgt in dieser Ausführungsform 260 mm.
- 1 d)Unteransicht einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur (1) mit einem Gehäusefuß (44) und einem Netzschalter (45). Die Länge der Eintauchapparatur (1) beträgt in dieser Ausführungsform 260 mm.
- 1 e)Seitenansicht einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur (1) mit einer Höhe von 111 mm, einer Tiefe von 140 mm ohne Netzschalter und 155 mm mit Netzschalter.
- 2 2 ist eine Abbildung des Trägers mit verschiedenen Perspektiven. Der Träger ist an der Welle zugwandte Seite formschlüssig zur Welle ausgebildet. Die Länge des Trägers beträgt in dieser Ausführungsform 80 mm und die Höhe 20 mm.
- 3 3 ist eine besondere Ausführungsform des Trägers, der eine Führrille für das Einschieben einer Probenplatte aufweist. Die Länge der Probenplatte beträgt in dieser Ausführungsform 75 mm.
- 4 4 ist eine Abbildung der Welle mit verschiedenen Perspektiven. Die Welle weist zwei Verjüngungen (50) ihres Durchmesser auf und zwei Ausnehmungen (51) für die formschlüssige Befestigung des Trägers. Die Länge der Welle beträgt in dieser Ausführungsform 182 mm und der Durchmesser 12 mm.
- 5 5 ist ein Modell, das einige mögliche Ausführungsformen der Ausgestaltung des Sichtfensters darstellt.
- 6 6 stell ein Modell einer besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Eintauchapparatur (1) gemäß der technischen Zeichnung (siehe 1) dar. Die Länge der Eintauchapparatur (1) beträgt in dieser Ausführungsform 260,0 mm.
- 7 7 ist eine Abbildung einer viereckig ausgestalteten Wanne mit einer Ablaufvorrichtung in jeder Ecke. Die Länge der Wanne in dieser Ausführungsform beträgt 140,0 mm.
- 8 Die MALDI-TOF-Imaging Bilder zeigen die Signalverteilung sowie die Signalintensitäten des „Overal Average Spectrums“ (TIC normalisiert). Verwendet wurde Mäuseherzgewebe (10 µm), das mit der Matrix MAPS (5 mg/ml; gelöst in Toluol) mittels der Düsensprühtechnologie oder mittels des automatisierten Eintauchens benetzt wurde, wobei beispielhaft die Massenkanäle 65,0 Da ± 0,1 Da (a), 98,0 Da ± 0,1 Da (e) und 124,0 Da ± 0,1 Da (i) ausgewählt wurden. Zusätzlich werden die MALDI-TOF-Imaging Bilder von Mäuseherzgeweben gezeigt, die in Matrixlösungen mit drei verschiedenen Lösungsmitteln, Toluol (b, f, j), Dichlormethan (c, g, k) und Chloroform (d, h, I), getaucht wurden. Die Farbe der Pixel wird durch die lonenintensität bestimmt (Skala von 5% bis 60%). Der Maßstab ist in 1000 µm angegeben.
- 9 Vergleichende Darstellung der Peakanzahl und -intensitäten der TIC-normalisierten MALDI-TOF-Massenspektren des Mäuseherzgewebes, das mit in Toluol gelöstem MAPS besprüht (grau) oder getaucht (schwarz) wurde. Dargestellt ist das Masse-zuLadung-Verhältnis (m/z) zur absoluten Intensität (a.i.).
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Beispiel
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METHODEN
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Gewebeschnitte
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Mäuseherzgewebe wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert. Das gefrorene Gewebe wurde mit einem Kryomikrotom bei -20 °C sequentiell 10 µm dünn geschnitten, auf einen leitfähigen Objektträger (Indiumzinnoxid (ITO)-beschichteter Glasträger) übertragen und anschließend in einem Vakuum-Exsikkator getrocknet. Vor der Matrixbeschichtung wurden optische Bilder mit einem Scanner aufgenommen, um die Position der Gewebeschnitte zu identifizieren.
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MAPS-Synthese
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Probenvorbereitung für MALDI-MSI unter Verwendung der Eintauchapparatur
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Die Eintauchapparatur wurde entwickelt, um eine reproduzierbare und gleichmäßige Matrixbeschichtung der Gewebe zu ermöglichen. Zum Vergleich wurde die Matrixauftragung von in Toluol gelöstem MAPS mit dem HTX Imaging Sprayer (HTX Technologies) durchgeführt. Bis zur Analyse wurden die Objektträger in einem Exsikkator gelagert. Die Messungen wurden mit einem Bruker Daltonics ultrafleXtreme MALDI Time-of-Flight-Massenspektrometer durchgeführt, das mit der Smartbeam-Lasertechnologie (Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland) ausgestattet ist.
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MALDI-TOF MS
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Die Massenspektren der MALDI-TOF-Analysen wurden im Negativ-Ionen-Reflektormodus im m/z-Bereich zwischen 10 und 1900, 250 Laserschüssen und einer Frequenz von 1000 gemessen. Die Lasergröße „small“ wurde mit einem Raster von 20 µm verwendet. Der „global attenuator offset“ wurde auf 72 % eingestellt und eine Laserintensität von 70 % verwendet. Die externe Massenkalibrierung erfolgte mit rotem Phosphor. Für die Bilderzeugung, Steuerung und Datenanalyse wurden flexlmaging ver. 4.1 (Bruker, Deutschland), flex Control ver. 3.4 (Bruker, Deutschland) und CoralDraw verwendet. Die erhaltenen Massenspektren wurden mit mMass ver. 5.5.0 verglichen.
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ERGEBNISSE
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Vergleich zwischen der Eintauch- und der Düsensprühtechnologie
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Die Eintauch- und Düsensprühtechnologie wurde mit der Matrix MAPS unter Verwendung der Eintauchapparatur und des HTX Imaging Sprayers vergleichend getestet. Hierzu wurde die Qualität der MALDI-TOF-MSI Ergebnisse von Mäuseherzgewebe nach Eintauchen oder Düsensprühen von in Toluol gelöstem MAPS verglichen. Es wurden die Signalintensitäten des „Overal Average Spectrums“ (TIC normalisiert) und die laterale Auflösung vergleichen. Beispielhaft wurden die Massenkanäle 65,0 Da ± 0,1 Da, 98,0 Da ± 0,1 Da und 124,0 Da ± 0,1 Da ausgewählt. Die Gewebe, die mit in Toluol gelöstem MAPS besprüht oder gedippt worden sind, zeigen keine offensichtlichen Unterschiede in den MALDI-TOF-MSI Intensitäten und der laterale Auflösungen (8a, b; 8e, f; 8i, j). MALDI-Analysen der Matrixlösung alleine als Kontrolle zeigten keine Hintergrundsignale (8).
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Vergleich zwischen drei verschiedenen Lösungsmitteln
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Zusätzlich wurde die Matrixauftragung mit MAPS mittels Eintauchen mit drei verschiedenen Lösungsmitteln durchgeführt. Bei dem Vergleich der MALDI-TOF-MSI Intensitäten der Mäuseherzgewebe lässt sich feststellen, dass die Intensität nach Verwendung von Dichlormethan als Lösungsmittel am höchsten ist (8b; 1f; 1j), nachfolgend der MALDI-TOF-MSI Intensitäten der Gewebe, die in Toluol gedippt wurden (8c; 1g; 1k) und am niedrigsten sind die MALDI-TOF-MSI Intensitäten der Gewebe, bei denen Chloroform zum Dippen verwendet wurde (8d; 1h; 11). MALDI-Analysen der Matrixlösung alleine als Kontrolle zeigten keine Hintergrundsignale (8).
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Vergleich von Massenspektren nach Eintauchen und Düsensprühen
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Darüber hinaus wurden die beiden MALDI-TOF-Massenspektren des Mäuseherzgewebes verglichen, das mit in Toluol gelöstes MAPS besprüht oder getaucht wurde. Die Massenspektren zeigen keinen signifikanten Unterschied in der Peakanzahl oder der Peakintensitäten innerhalb des gescannten Bereiches (9).
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DISKUSSION
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Die MALDI-MSI-Messungen zeigen, dass die Eintauchtechnologie zur Matrixauftragung von MAPS geeignet ist. Grundsätzlich ist denkbar, dass auch andere Matrices zum Eintauchen mit dem Gerät verwendet werden können. Mehrere Faktoren müssen berücksichtigt werden, wie die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Analyten, die Komplexität der biomolekularen Wechselwirkungen in einem Gewebe, die Löslichkeit der Matrix und der Prozess der Lösungsmittelverdampfung sowie der Matrixkristallisation. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die neue Eintauchtechnologie als Matrixauftragung funktioniert, gewebeschonend ist und im Vergleich mit der Düsensprühtechnologie mindestens die gleiche Qualität der MALDI-MSI-Analysen zeigt. Im Unterschied zur Düsentechnologie ist das Verfahren aber einfacher und schneller.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Charles D. Swor, Lev N. Zakharov, and David R. Tyler „A Colorimetric Proton Sponge“, J. Org. Chem., 2010, 75 (20), pp 6977-6979; DOI: 10.1021/jo101381r [0030]
- Giampa et al. (M. Giampa,a M. B. Lissel,a T. Patschkowski,a J. Fuchser,b V. H. Hans,cd O. Gembruch,e H. Bednarza and K. Niehaus „Maleic anhydride proton sponge as a novel MALDI matrix for the visualization of small molecules (< 250 m/z) in brain tumors by routine MALDI ToF imaging mass spectrometry.“, Chemical Communications 52.63 (2016): 9801-9804, DOI: 10.1039/C6CC02387H [0030]
- Charles et al. und Giampà et al. mit mindestens einer einfachen Anwendermenge von größer gleich 150 [0060]
- Charles D. Swor, Lev N. Zakharov, and David R. Tyler „A Colorimetric Proton Sponge“, J. Org. Chem., 2010, 75 (20), pp 6977-6979; DOI: 10.1021/jo101381r und Giampa, Marco, et al. „Maleic anhydride proton sponge as a novel MALDI matrix for the visualization of small molecules (< 250 m/z) in brain tumors by routine MALDI ToF imaging mass spectrometry.“ Chemical Communications 52.63 (2016): 9801-9804. [0069]
