DE102015210224A1

DE102015210224A1 - Neuer wirkstoff zur behandlung von krebs

Info

Publication number: DE102015210224A1
Application number: DE102015210224.6A
Authority: DE
Inventors: Alexander El Gammal; Jakob R. Izbicki; Leonie Konczalla; Daniel Perez
Original assignee: Universitatsklinikum Hamburg Eppendorf
Current assignee: Universitatsklinikum Hamburg Eppendorf
Priority date: 2015-06-02
Filing date: 2015-06-02
Publication date: 2016-12-08
Also published as: EP3302472A1; US20180153870A1; WO2016193339A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Verbindung Biperiden als MALT1-Inhibitor bei der Behandlung einer Krebserkrankung. Die Erfindung betrifft insbesondere eine Kombination von Biperiden und einem Phenothiazin zur Verwendung bei der Behandlung einer Krebserkrankung. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung einer Krebserkrankung, die Biperiden als MALT1-Inhibitor umfasst. Es wird ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung offenbart, die Biperiden und mindestens ein Phenothiazin umfasst. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von Biperiden bei der Behandlung einer Krebserkrankung. Die Erfindung stellt ferner einen Kit bereit, der ein Behältnis umfasst, das Biperiden enthält und mindestens ein Behältnis, das eine Phenothiazin-Verbindung enthält.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Verbindung Biperiden als MALT1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1)-Inhibitor bei der Behandlung einer Krebserkrankung. Die Erfindung betrifft insbesondere eine Kombination von Biperiden und einem Phenothiazin zur Verwendung bei der Behandlung einer Krebserkrankung. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung einer Krebserkrankung, die Biperiden als MALT1-Inhibitor umfasst. Es wird ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung offenbart, die Biperiden und mindestens ein Phenothiazin umfasst. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von Biperiden bei der Behandlung einer Krebserkrankung. Die Erfindung stellt ferner einen Kit bereit, der ein Behältnis umfasst, das Biperiden enthält und mindestens ein Behältnis, das eine Phenothiazin-Verbindung enthält.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Neoplastische Erkrankungen zeichnen sich durch ein unkontrolliertes Wachstum anormaler Zellen aus, wobei sich diese Zellen unkontrolliert vermehren und unter bestimmten Bedingungen Metastasen in anderen Organen bilden können. In den Industriestaaten lassen sich etwa 20% aller Todesfälle auf Krebserkrankungen zurückführen. Die gegenwärtig verwendeten Therapiekonzepte beruhen entweder auf einer chirurgischen Entfernung des neoplastischen Gewebes, Bestrahlung oder Chemotherapie. Chemotherapeutisch wirksame Substanzen, die sich für die Behandlung bestimmter neoplastischer Erkrankungen eignen, sind im Stand der Technik in großer Zahl beschrieben worden. Einen Überblick bietet die Literaturstelle [1].
Allerdings sprechen etwa die Hälfte aller neoplastischen Gewebe nicht mehr oder nur unzureichend auf eine Behandlung mit gegenwärtig verfügbaren Chemotherapeutika an. Dies gilt insbesondere für Tumore, die sich von Lunge, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse, Leber oder Niere ableiten. Diese Tumore sind oftmals gegen die derzeit zur Verfügung stehenden Chemotherapeutika unempfindlich, da sie über Mechanismen verfügen, die eine Resistenz gegen diese Substanzen bewirken. Darüber hinaus verlieren viele Tumore, die zunächst empfindlich gegenüber den eingesetzten chemotherapeutischen Mitteln sind, während der Behandlung mit einem bestimmten Wirkstoff die Empfindlichkeit gegenüber diesem Wirkstoff und werden resistent. Dies kann zur Folge haben, dass ein Wirkstoff nach mehreren Behandlungszyklen den betreffenden Tumor hinsichtlich seines Wachstums nicht mehr hemmen kann. Aus diesem Grund ist es von großem Interesse, neue therapeutische Wirkstoffe zu identifizieren, die insbesondere auch für die Behandlung von solchen Tumoren eingesetzt werden können.
Die Hemmung der Apoptose stellt einen besonders gut erforschten Mechanismus dar, durch den Tumorzellen ihr Absterben verhindern und die unkontrollierte Proliferation auslösen können. Es wird vermutet, dass die meisten Zellen, deren Zellzyklus durch onkogene Mutationen gestört ist, normalerweise durch Apoptose entfernt werden. Bei der Apoptose kommt den Caspasen und Paracaspasen eine zentrale Bedeutung zu. Mehrere dieser proteolytischen Enzyme interagieren miteinander in komplexen Signaltransduktionswegen, um ein Absterben der Zellen in Reaktion auf äußere oder innere Signale zu vermitteln. So wurde z.B. gezeigt, dass durch Hemmung bestimmter Caspasen die Apoptose in Tumorzellen ausgelöst werden kann.
Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung somit die Aufgabe zugrunde, neue pharmazeutisch wirksame Verbindungen und Zusammensetzungen bereitzustellen, mit deren Hilfe eine effektive Behandlung verschiedener Krebserkrankungen ermöglicht wird. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Verbindungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen nach den anliegenden Ansprüchen gelöst.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass der Wirkstoff Biperiden in bestimmten Tumoren, wie z.B. beim Pankreaskarzinom, die Zellproliferation hemmen und darüber hinaus die Apoptose auslösen kann und die Zellen eines Tumors dem Zelltod zuführen kann. Biperiden wird seit mehreren Jahrzehnten als Antiparkinsonmittel eingesetzt. Darüber hinaus wird Biperiden auch in der Antipsychotika-Therapie zur Verringerung medikamentös bedingter extrapyramidaler Nebenwirkungen, wie beispielsweise Körpersteifheit und Blickstarre, verwendet. Eine Verwendung von Biperiden in der Krebstherapie wurde im Stand der Technik bislang nicht vorgeschlagen.
Darüber hinaus wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass die kombinierte Verabreichung von Biperiden mit einem Phenothiazin, wie z.B. Mepazin, zu einer verbesserten therapeutischen Wirkung führt, die sich nicht durch additive Effekte erklären lässt.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung schlägt die Verwendung des Wirkstoffs Biperiden zur Behandlung einer Krebserkrankung vor. Die Wirkung von Biperiden beruht auf der im Rahmen der Erfindung nachgewiesenen Inhibierung der MALT1-Aktivität in den Tumorzellen. Biperiden ist ein im Stand der Technik hinreichend beschriebener Wirkstoff aus der Gruppe der Anticholinergika, der verbreitet gegen Parkinson eingesetzt wird. Bei dem Wirkstoff Biperiden handelt es sich um ein Racemat aus den beiden Enantiomeren (1S)-1-[(1S,2R,4S)-Bicyclo[2.2.1]hept-5-en-2-yl]-1-phenyl-3-(1-piperidinyl)-1-propanol (Formel Ia; im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch als (–)-Biperiden bezeichnet) und (1R)-1-[(1R,2S,4R)-Bicyclo[2.2.1]hept-5-en-2-yl]-1-phenyl-3-(1-piperidinyl)-1-propanol (siehe Formel Ib; im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch als (+)-Biperiden bezeichnet).
Während Biperiden im Rahmen der Erfindung vorzugsweise als Racemat aus (–)-Biperiden und (+)-Biperiden verwendet wird, ist auch die isolierte Verwendung der jeweiligen Enantiomere (–)-Biperiden oder (+)-Biperiden für die genannte therapeutische Applikation erfindungsgemäß umfasst. Somit betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt eine Verbindung der Formel
oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz oder Solvat davon zur Verwendung als MALT1-Inhibitor in einem Verfahren zur Behandlung einer Krebserkrankung.
Für den Fachmann wird ersichtlich sein, dass die oben dargestellten Strukturen (–)-Biperiden oder (+)-Biperiden an einer oder an mehreren Stellen substituiert oder anderweitig modifiziert werden können, solange diese Veränderungen die inhibierende Wirkung von Biperiden auf die MALT1-Aktivität nicht wesentlich beeinträchtigen und auch unter toxischen Gesichtspunkten nicht zu nachteiligen Ergebnissen führen. Beispielsweise können eine oder mehrere Wasserstoffatome der C-H Bindungen der heterocyclischen Ringsysteme durch Halogenatome, wie beispielsweise Chlor-, Brom- oder Iod-Atome, substituiert sein. Ferner kann der Wasserstoff der C-H Bindungen auch gegen eine Alkylgruppe, wie beispielsweise Methyl, Ethyl oder Propyl ersetzt werden.
Neben (–)-Biperiden oder (+)-Biperiden, racemischen Mischungen derselben oder substituierten Derivaten derselben können auch pharmazeutisch geeignete Salze der jeweiligen Enantiomere Verwendung finden. Der Ausdruck "pharmazeutisch geeignetes Salz" bezeichnet nicht-toxische, Säure-Additionssalze sowie Alkalimetall- bzw. Erdalkalimetallsalze. Beispielhafte Säure-Additionssalze umfassen Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Bisulfat, Acetat, Oxalat, Phosphat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat und Laurylsulfat. Beispielhafte Alkalimetall- bzw. Erdalkalimetallsalze umfassen Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesium-Salze. Darüber hinaus können erfindungsgemäß auch Ammoniumsalze und Salze mit organischen Aminen verwendet werden. Neben dem Kalziumsalz kann auch jedes andere pharmazeutisch geeignete, kationische Salz eingesetzt werden. Diese Salze sind beispielsweise solche, die durch Reaktion der freien Säureform des Biperidens mit einer geeigneten Base, wie beispielsweise Natriumhydroxid, Natriummethoxid, Natriumethoxid, Natriumhydrid, Kaliummethoxid, Magnesiumhydroxid, Calciumhydroxid, Cholin, Diethanolamin und weiteren, die im Stand der Technik bekannt sind, erhalten werden.
Solvate von (–)-Biperiden und (+)-Biperiden sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. Solvate entstehen durch die Anlagerung von einem oder mehreren Lösungsmittelmolekülen an eine erfindungsgemäß vorgeschlagene Wirkstoffverbindung (d.h. an Biperiden). Ist es das Lösungsmittel Wasser, so handelt es sich um eine Hydratation. Solvate der vorgeschlagenen Wirkstoffverbindung können durch Ionenbindungen und/oder kovalente Bindungen zusammengehalten werden.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass im Rahmen der Behandlung beide Enantiomere von Biperiden, d.h. sowohl die Verbindung nach Formel (Ia) als auch die Verbindung nach Formel (Ib), verabreicht werden. Vorzugsweise wird ein Racemat verwendet, das (–)-Biperiden und (+)-Biperiden im Verhältnis von etwa 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, oder 1:10 umfasst. Ein Verhältnis von (–)-Biperiden zu (+)-Biperiden von etwa 1:1 ist besonders bevorzugt.
Die vorliegend vorgeschlagene Biperiden-Verbindung, d.h. (–)-Biperiden, (+)-Biperiden, ein Racemat der beiden Enantiomere, oder Salze, Solvate oder Derivate davon, können erfindungsgemäß im Rahmen der Behandlung einer Vielzahl von Krebserkrankungen eingesetzt werden. Krebserkrankungen, die wirksam durch eine wie vorliegend vorgeschlagene Biperiden-Verbindung behandelt werden können, umfassen Bronchialkarzinome, wie das kleinzellige oder das großzellige Bronchialkarzinom, Dickdarmkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, Leberkrebs, Pankreaskrebs, Blasenkrebs, Hautkrebs, Eierstockkrebs, hämatologische Krebserkrankungen, Krebsarten des Urogenitaltraktes beim Mann und der Frau, Nebennierenrindenkrebs (Phäochromozytom), Krebserkrankungen des Gehirns, Magenkrebs, Nierenkrebs, Uteruskrebs, Knochenkrebs, Ösophaguskrebs, Kaposi-Sarkom, oropharyngale Krebserkrankungen, Hodenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Lymphome, adenokortikale Krebserkrankungen, Gallenblasenkrebs, multiples Myelom, Dünndarmkrebs, Analkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Burkitt-Lymphom, Gallengangkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Gebärmutterkörperkrebs, Harnröhrenkrebs, Kehlkopfkrebs, Knochenkrebs, Morbus Hodgkin, Non-Hodgkin-Lymphom, Wilms-Tumor, Plasmocytom oder Retionblastom.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die zu behandelnde Krebserkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pankreaskarzinom, Lungenkarzinom, Bronchialkarzinom und/oder Ösophaguskarzinom. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die zu behandelnde Krebserkrankung eine Erkrankung der Bauchspeicheldrüse. Pankreaskarzinome stellen eine der aggressivsten Krebsarten dar, bei denen nur wenige Patienten einen Zeitraum von 5 Jahren nach Diagnosestellung überleben [2–3]. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Pankreaskarzinom um ein Pankreasadenokarzinom, wie z.B. ein duktales Pankreasadenokarzinom (PDAC) oder um einen neuroendokrinen Tumor.
Vorzugsweise handelt es ich bei der Krebserkrankung um eine MALT1-abhängige Erkrankung, d.h. um eine Krebserkrankung, bei der die Tumorzellen die Protease MALT1 exprimieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der Krebserkrankung um eine solche, bei der die Tumorzellen MALT1 stärker exprimieren als die entsprechenden nicht-kanzerogenen Zellen des entsprechenden Gewebes. Die MALT1-Expression in den Tumorzellen wird in der Regel mindestens 50% stärker sein als in den nicht-kanzerogenen Zellen, vorzugsweise mindestens 100% stärker, 200% stärker, 300% stärker, 400% stärker oder 500% stärker. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Krebserkrankung um eine solche, bei der in den Tumorzellen MALT1 kontinuierlich oder durch einen Signaltransduktionsweg aktiviert ist, während eine solche Aktivierung in den entsprechenden nicht-kanzerogenen Zellen nicht vorliegt. Die Verbindung nach Formel (Ia) und/oder die Verbindung nach Formel (Ib) wird vorzugsweise in einer Konzentration verabreicht, die ausreicht, um eine Inhibierung der MALT1-Protease in den Tumorzellen zu bewirken.
Die vorliegend vorgeschlagene Biperiden-Verbindung und entsprechende pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Biperiden-Verbindung enthalten, können mit bekannten chemotherapeutischen Mitteln kombiniert werden, um eine verbesserte Wirksamkeit zu erzielen. Die Biperiden-Verbindung kann beispielsweise mit alkylierenden Mitteln; Alkylsulfonaten; Aziridinen, wie z.B. Thiotepa; Ethylenimine; Anti-Metaboliten; Folsäure-Analoga, wie z.B. Methotrexat (Farmitrexat^®, Lantarel^®, METEX^®, MTX Hexal^®); Purin-Analoga, wie z.B. Azathioprin (Azaiprin^®, AZAMEDAC^®, Imurek^®, Zytrim^®), Cladribin (Leustatin^®), Fludarabinphosphat (Fludara^®), Mercaptopurin (MERCAP^®, Puri-Nethol^®), Pentostatin (Nipent^®), Thioguanin (Thioguanin-Wellcome^®) oder Fludarabin; Pyrimidin-Analoga, wie z.B. Cytarabin (Alexan^®, ARA-cell^®, Udicil^®), Fluorouracil, 5-FU (Efudix^®, Fluoroblastin^®, Ribofluor^®), Gemcitabin (Gemzar^®), Doxifluridin, Azacitidin, Carmofur, 6-Azauridin, Floxuridin; Stickstoff-Lost-Derivaten, wie z.B. Chlorambucil (Leukeran^®), Melphalan (Alkeran^®), Chlornaphazin, Estramustin, Mechlorethamin; Oxazaphosphorinen, wie z.B. Cyclophosphamid (CYCLO-cell^®, Cyclostin^®, Endoxan^®), Ifosfamid (Holoxan^®, IFO-cell^®) oder Trofosfamid (Ixoten^®); Nitrosoharnstoffen, wie z.B. Bendamustin (Ribomustin ^®), Carmustin (Carmubris^®), Fotemustin (Muphoran^®), Lomustin (Cecenu^®, Lomeblastin^®), Carmustin, Chlorozotocin, Ranimustin oder Nimustin (ACNU^®); Hydroxyharnstoffen (Litalir^®); Vincaalkaloiden und Taxenen, wie z.B. Vinblastin (Velbe^®), Vindesin (Eldisine^®), Vinorelbin (Navelbine^®), Docetaxel (Taxotere^®), oder Paclitaxel (Taxol^®); Platin-Verbindungen, wie z.B. Cisplatin (Platiblastin^®, Platinex^®) oder Carboplatin (Carboplat^®, Ribocarbo^®); Sulfonsäureestern, wie z.B. Busulfan (Myleran^®), Piposulfan oder Treosulfan (Ovastat^®); Anthrazyklinen, wie z.B. Doxorubicin (Adriblastin^®, DOXO-cell^®), Daunorubicin (Daunoblastin^®), Epirubicin (Farmorubicin^®), Idarubicin (Zavedos^®), Amsacrin (Amsidyl^®) oder Mitoxantron (Novantron^®); sowie mit Derivaten, Tautomeren und pharmazeutisch aktiven Salzen der oben genannten Verbindungen verabreicht werden. Auch eine Kombination der Biperiden-Verbindung mit anti-angiogenen Mitteln, z.B. mit dem monoklonalen Antikörper Bevacizumab (Avastin^®), Denosumab (Prolia^®, XGEVA^®; oder mit Tyrosinkinase-Inhibitoren, wie z.B. Sorafenib (Nexavar^®) oder Sunitinib (Sutent^®), ist möglich. Auch Kombinationen der Biperiden-Verbindung mit therapeutischen Antikörpern, wie z.B. Trastuzumab (Herceptin^®), Gemtuzumab (Mylotarg^®), Panitumumab (Vectibix^®) oder Edrecolomab (Panorex^®), sind erfindungsgemäß umfasst.
Die vorliegend vorgeschlagene Biperiden-Verbindung und entsprechende pharmazeutische Zusammensetzungen, die Biperiden-Verbindung enthalten, können darüber hinaus mit einer herkömmlichen Bestrahlungstherapie kombiniert werden. Die Bestrahlung kann dabei vor oder nach Verabreichung des erfindungsgemäßen Kombinationspräparats nach im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Die Bestrahlung kann Gammastrahlen, Röntgenstrahlen sowie die von Radioisotopen ausgesandte Strahlung umfassen. Die Bestrahlungstherapie kann des weiteren Teilchenstrahlung (Elektronen, Protonen, Neutronen) umfassen. Entsprechende Strahlungsdosen, die bei der Behandlung von Tumoren eingesetzt werden, sind dem auf dem Gebiet der Strahlentherapie tätigen Fachmann bekannt. Je nach Art des Tumors können z.B. Gesamtdosen von 20 bis 80 Gray zum Einsatz kommen.
Besonders vorteilhafte Wirkungen ergeben sich bei Kombination der Biperiden-Verbindung mit einer die MALT1-Protease hemmenden Phenothiazin-Verbindung. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass die Kombination von Biperiden mit einer solchen Phenothiazin-Verbindung eine erheblich stärkere inhibierende Wirkung auf die Proliferation von Krebszellen ausübt, als dies hätte erwartet werden können. Es ist im Stand der Technik bekannt, dass Phenothiazine wie z.B. Mepazin, Promazin und Thioridazin durch Hemmung der MALT1-Protease die Proliferation von Krebszellen hemmen können. Wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird, ist der durch Kombination von Biperiden und Phenothiazin erzielte antiproliferative Effekt deutlich stärker als durch Addition der einzelnen Wirkungen zu erwarten war. Vielmehr beruht die durch die Kombination erzielte Wirkung auf einem synergistischen Zusammenwirken der einzelnen Wirkstoffe. Wie vorliegend verwendet ist unter einer synergistischen Wirkung eine Wirkung zu verstehen, die stärker ist als durch einfache Addition der bei alleiniger Gabe der Komponenten beobachteten Effekte zu erwarten gewesen wäre. Eine synergistische Wirkung erlaubt die Verabreichung von geringeren Mengen Biperiden bzw. Phenothiazin, so dass die Verträglichkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung für den Patienten in der Regel verbessert wird. So können die einzelnen Komponenten der Kombination, d.h. die Biperiden-Verbindung und die Phenothiazin-Verbindung, unter bestimmten Umständen sogar in subtherapeutischen Dosen verabreicht werden, die bei alleiniger Gabe keine Wirkung auf den Verlauf der zu behandelnden Krebserkrankung zeigen würden.
Somit umfasst das Behandlungsverfahren in einem Aspekt der Erfindung neben der Verabreichung der Biperiden-Verbindung auch die zeitlich vorgelagerte, gleichzeitige oder zeitlich nachgelagerte Verabreichung einer die MALT1-Protease hemmenden Phenothiazin-Verbindung. Vorzugsweise handelt es sich bei der die MALT1-Protease hemmenden Phenothiazin-Verbindung um eine solche, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mepazin, Thioridazin, Promazin und pharmazeutisch geeigneten Salzen, Derivaten oder Solvaten davon. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Mepazin oder Salzen, Derivaten oder Solvaten davon in Kombination mit Biperiden.
Vorzugsweise werden die Biperiden-Verbindung und die Phenothiazin-Verbindung, wie z.B. Mepazin, in einer einheitlichen pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen. Es ist allerdings für die Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht zwingend notwendig, dass die beiden Wirkstoffe in einer einheitlichen pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen. Vielmehr können die Biperiden-Verbindung und die Phenothiazin-Verbindung auch in getrennten Formulierungen vorliegen, die gleichzeitig oder zeitlich versetzt an den zu behandelnden Patienten verabreicht werden.
Somit betrifft die Erfindung in einem weiteren Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend:

a) eine Verbindung der Formel
oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz oder Solvat davon, und
b) mindestens eine Phenothiazin-Verbindung.

Eine solche Zusammensetzung enthält neben der Biperiden-Verbindung demgemäß mindestens eine Phenothiazin-Verbindung, wie z.B. Mepazin oder ein Salz oder Solvat davon, als einheitliche Formulierung, d.h. als einheitliche pharmazeutische Zusammensetzung. Die Wirkstoffe der Kombination können beispielsweise in vitro, d.h. vor der Verabreichung an den Patienten, miteinander zu einer einheitlichen Darreichungsform kombiniert werden, solange keiner der beiden Bestandteile durch das Vermischen mit dem jeweils anderen Bestandteil der Kombination einen Verlust bezüglich seiner MALT1-hemmenden Aktivität erleidet. So lassen sich beispielsweise Biperiden und Mepazin, die in einer lyophilisierten Mischung vorliegen, durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels zu einer Infusionslösung oder einer Injektionslösung rekonstituieren, die beide Wirkstoffe umfasst. Darüber hinaus kann die pharmazeutische Zusammensetzung direkt als einheitliche Dosierungsform bereitgestellt werden, z.B. in Form einer Tablette für die orale Verabreichung.
Alternativ dazu können die Biperiden-Verbindung und die Phenothiazin-Verbindung in getrennten Formulierungen vorliegen, die zum selben Zeitpunkt oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten an den Patienten verabreicht werden. So können beispielsweise die Biperiden-Verbindung und die Biperiden-Verbindung an verschiedenen Tagen eines Behandlungszyklus verabreicht werden. Die Biperiden-Verbindung kann beispielsweise in einem sich wiederholenden, einwöchigen Behandlungszyklus täglich verabreicht werden, während die Phenothiazin-Verbindung, wie z.B. Mepazin oder ein Salz oder Solvat davon, lediglich an einem bestimmten Tag dieses Zyklus verabreicht wird. Sofern die Biperiden-Verbindung und die Phenothiazin-Verbindung zeitlich getrennt voneinander verabreicht werden sollen, ist es zweckmäßig, die Wirkstoffe in getrennten Verpackungseinheiten (z.B. in mehreren Ampullen) bereitzustellen. Dabei können die Biperiden-Verbindung und die Phenothiazin-Verbindung in gleichartigen oder unterschiedlichen Darreichungsformen vorliegen, die nachstehend genauer beschrieben werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Biperiden-Verbindung vor Verabreichung des Phenothiazins an den Patienten verabreicht. Vorzugsweise wird die Verabreichung der Biperiden-Verbindung 1–24 h vor Verabreichung der Phenothiazin-Verbindung durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verabreichung der Biperiden-Verbindung 12–16 h vor Verabreichung der Phenothiazin-Verbindung durchgeführt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Phenothiazin-Verbindung vor Verabreichung der Biperiden-Verbindung an den Patienten verabreicht. Vorzugsweise wird die Verabreichung der Phenothiazin-Verbindung 1–24 h vor Verabreichung der Biperiden-Verbindung durchgeführt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Verabreichung der Phenothiazin-Verbindung 12–16 h vor Verabreichung der Biperiden-Verbindung durchgeführt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine wie oben definierte Biperiden-Verbindung und Mepazin oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz, Derivat oder Solvat desselben. In einer alternativen Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine wie oben definierte Biperiden-Verbindung und Thioridazin oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz, Derivat oder Solvat desselben. In einer noch weiteren alternativen Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine wie oben definierte Biperiden-Verbindung und Promazin oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz, Derivat oder Solvat desselben.
Die erfindungsgemäßen, eine Biperiden-Verbindung enthaltenden Zusammensetzungen können in jeder im Stand der Technik bekannten, geeigneten Darreichungsform verabreicht werden. Derartige Verfahren sowie geeignete Hilfsstoffe und Träger werden beispielsweise in "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins; 21. Auflage (2005) beschrieben. Solche Formulierungen umfassen beispielsweise Zusammensetzungen für eine orale, rektale, nasale oder parenterale (einschließlich subkutaner, intramuskulärer, intravenöser und intradermaler) Verabreichung. Die Zusammensetzungen können dabei in Form von Granulaten, Pulvern, Tabletten, Kapseln, Sirup, Suppositorien, Injektionslösungen, Emulsionen oder Suspensionen vorliegen.
Gewöhnlich umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen neben der Biperiden-Verbindung und der Phenothiazin-Verbindung einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Träger, die mit den übrigen Inhaltsstoffen der Zusammensetzungen physiologisch kompatibel sind. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen oder Präparate können neben den eigentlichen Wirkstoffen auch weitere Hilfsstoffe, Bindemittel, Verdünnungsmittel oder ähnliche Substanzen umfassen.
Für die orale, bukkale und sublinguale Verabreichung werden in der Regel feste Formulierungen wie, z.B. Pulver, Suspensionen, Granulate, Tabletten, Pillen, Kapseln und Gelcaps verwendet. Diese können beispielsweise hergestellt werden, indem man die Wirkstoffe oder deren Salze mit mindestens einem Additiv oder mit mindestens einem Hilfsstoff vermischt. Derartige Hilfsstoffe und Träger werden beispielsweise in "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins; 21. Auflage (2005) beschrieben. Als Additive oder Hilfsstoffe können beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Casein, Albumin, Mannit, Dextran, Saccharose, Lactose, Sorbitol, Stärke, Agar, Alginate, Pectine, Kollagen, Glyceride oder Gelatine verwendet werden. Ferner können orale Dosisformen Antioxidantien (z.B. Ascorbinsäure, Tocopherol oder Cystein), Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat), Konservierungsmittel (z.B. Paraben oder Sorbinsäure), Sprengmittel, Bindemittel, Verdicker, Geschmacksverbesserer, Farbstoffe und ähnliche Substanzen umfassen.
Flüssige Formulierungen, die sich für die orale Verabreichung eignen, können beispielsweise als Emulsionen, Sirups, Suspensionen oder Lösungen vorliegen. Diese Formulierungen können unter Verwendung einer sterilen Flüssigkeit als pharmazeutischer Träger (z.B. Öl, Wasser, Alkohol oder Kombinationen derselben) in Form von flüssigen Suspensionen oder Lösungen hergestellt werden. Für die orale oder parenterale Verabreichung können pharmazeutisch geeignete Tenside, Suspensionsmittel, Öle oder Emulgatoren zugefügt werden. Für den Gebrauch in flüssigen Dosisformen geeignete Öle umfassen beispielsweise Olivenöl, Sesamöl, Erdnussöl, Rapsöl und Maisöl. Geeignete Alkohole umfassen Ethanol, Isopropylalkohol, Hexadecylalkohol, Glycerin und Propylenglykol. Suspensionen können ferner Fettsäureester, wie Ethyloleat, Isopropylmyristat, Fettsäureglyceride und acetylierte Fettsäureglyceride umfassen. Ferner werden Suspensionen häufig auch mit Substanzen wie Mineralöl oder Petrolatum versetzt.
Für die Injektion geeignete Formulierungen umfassen im Allgemeinen wässrige Suspensionen oder Ölsuspensionen, die unter Verwendung eines geeigneten Dispersionsmittels und eines Suspensionsmittels hergestellt werden können. Injizierbare Formen können in Lösungsphase oder in Form einer Suspension vorliegen, die mit einem Lösungsmittel oder Verdünnungsmittel hergestellt wird. Als pharmazeutischer Träger kommen u.a. sterilisiertes Wasser, Ringer-Lösung oder eine isotonische wässrige Kochsalzlösung in Betracht. Alternativ dazu kann man als Träger sterile Öle einsetzen, die vorzugsweise nicht flüchtig sind. Für die Injektion geeignete Dosisformen umfassen ferner Pulver, die in einem Lösungsmittel rekonstituiert werden können. Beispiele hierfür sind u.a. gefriergetrocknete oder sprühgetrocknete Pulver. Für die Injektion können diese Formulierungen gegebenenfalls mit Stabilisierungsmitteln oder Tensiden versetzt werden. Die Formulierungen können durch Injektion, wie durch Bolus-Injektion oder durch kontinuierliche Infusion verabreicht werden.
Die am besten für die jeweilige Therapie geeigneten Verabreichungsarten und die zu verabreichenden Mengen der Biperiden-Verbindung (und ggf. der Phenothiazin-Verbindung) können vom Fachmann mittels Routineverfahren ermittelt werden. Faktoren, die die jeweilige Menge der Wirkstoffe in der zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzung beeinflussen, umfassen die Art und Schwere der Krebserkrankung, das Alter, Körpergewicht, Geschlecht und den allgemeinen Gesundheitszustand des zu behandelnden Patienten, die gleichzeitige Verabreichung anderer therapeutischer Mittel sowie andere Faktoren.
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen zur humanen Verabreichung werden in der Regel 0,01 mg bis 80 mg der Biperiden-Verbindung pro kg Körpergewicht des Patienten umfassen. Vorzugsweise liegt die Menge der Biperiden-Verbindung im Bereich von 1 mg bis 20 mg pro kg Körpergewicht des Patienten und noch stärker bevorzugt im Bereich von 5 mg bis 15 mg pro kg Körpergewicht des Patienten. 10 mg der Biperiden-Verbindung pro kg Körpergewicht sind besonders bevorzugt. Sofern die pharmazeutische Zusammensetzung neben der Biperiden-Verbindung auch eine Phenothiazin-Verbindung enthält, wird die Menge der Phenothiazin-Verbindung in den pharmazeutischen Zusammensetzungen üblicherweise von 0,01 mg bis 150 mg pro kg Körpergewicht des Patienten betragen. Vorzugsweise wird die Menge der Phenothiazin-Verbindung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen oder Präparaten im Bereich von 1 mg bis 50 mg pro kg Körpergewicht des Patienten und noch stärker bevorzugt im Bereich von 5 mg bis 25 mg pro kg Körpergewicht des Patienten liegen. 15–20 mg Phenothiazin pro kg Körpergewicht sind besonders bevorzugt.
Die therapeutische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen und Präparate kann anhand von im Stand der Technik bekannten Parametern bewertet werden. Diese Parameter umfassen u.a. die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bei der Beseitigung von Tumoren, die Ansprechrate, die Zeit bis zum Fortschreiten der Erkrankung und die Überlebensrate der behandelten Patienten. Eine gegen einen Tumor gerichtete Wirkung kann sich durch eine Inhibierung des Tumorwachstums, eine Verzögerung des Tumorwachstums, eine Verkleinerung des Tumors, eine Verringerung der Anzahl der Tumorzellen, eine Verlängerung der Zeitspanne bis zum Einsetzen eines erneuten Tumorwachstums sowie eine Verzögerung im Fortschreiten der Erkrankung darstellen.
Vorzugsweise führen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Präparate zu einem vollständigen Ansprechen beim Patienten. Mit vollständigem Ansprechen ist vorliegend die Beseitigung sämtlicher klinisch nachweisbarer Erkrankungssymptome sowie die Wiederherstellung von normalen Befunden im Blutbild, bei Röntgenuntersuchungen, CT-Aufnahmen und ähnlichem gemeint. Ein solches Ansprechen dauert vorzugsweise mindestens einen Monat nach Absetzen der Behandlung an. Die antiproliferativ wirksamen Zusammensetzungen und Präparate der vorliegenden Erfindung können auch zu einem partiellen Ansprechen beim Patienten führen. Bei einem partiellen Ansprechen kommt es zu einer Verringerung der messbaren Tumorbelastung im Patienten. Dies bedeutet insbesondere, dass die Anzahl der im Patienten vorhandenen Tumorzellen abnimmt und keine neuen Läsionen zu beobachten sind. Gleichzeitig kommt es zu einer Verbesserung eines oder mehrerer durch die Krankheit verursachter Symptome (z.B. Fieber, Gewichtsverlust, Erbrechen).
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel (Ia) oder (Ib) oder eines pharmazeutisch geeigneten Salzes oder Solvats davon als MALT1-Inhibitor bei Behandlung einer Krebserkrankung. Vorzugsweise wird die Verbindung dabei, wie oben beschrieben, bei Behandlung eines Pankreaskarzinoms, Lungenkarzinoms, Bronchialkarzinoms und/oder Ösophaguskarzinoms verwendet. Die Verwendung bei der Behandlung eines Pankreaskarzinoms ist besonders bevorzugt. Die Verwendung der Verbindung der Formel (Ia) oder (Ib) oder eines pharmazeutisch geeigneten Salzes oder Solvats davon als MALT1-Inhibitor kann ferner auch die Verabreichung einer Phenothiazin-Verbindung umfassen. Vorzugsweise ist die Phenothiazin-Verbindung dabei ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mepazin, Thioridazin, Promazin und pharmazeutisch geeigneten Salzen, Derivaten oder Solvaten davon.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Kit, das die folgenden Bestandteile umfasst:

a) ein Behältnis, das eine Verbindung der Formel

oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz oder Solvat davon umfasst, und
b) mindestens ein Behältnis, das eine Phenothiazin-Verbindung umfasst.

Das Kit kann darüber hinaus auch Anweisungen für die kombinierte Verwendung der Biperiden-Verbindung und der Phenothiazin-Verbindung bei der Behandlung eines Patienten mit einer Krebserkrankung enthalten. Die Anweisungen können beispielsweise spezifische Mengen und Behandlungspläne umfassen, und sie können Informationen bezüglich der Verabreichungsdauer einschließen. Das Kit kann darüber hinaus andere Bestandteile umfassen, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beispielsweise Lösungsmittel, Hilfsstoffe, Bindemittel, Verdünnungsmittel oder ähnliche Substanzen. Ferner kann das Kit auch Injektionsspritzen, Kanülen, Katheter und andere Hilfsmittel, die für die Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen nützlich sind, umfassen.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Ergebnisse von in vitro-Assays zur Bestimmung der Proliferation von Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von Biperiden behandelt wurden.
2 zeigt die Ergebnisse von in vitro-Assays zur Bestimmung der Proliferation von Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von Mepazin behandelt wurden.
Die 3 und 4 zeigen die Ergebnisse von in vitro-Assays zur Bestimmung der Proliferation von Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von Biperiden und Mepazin behandelt wurden.
5 zeigt die Bestimmung der Apoptoserate in den Pankreaskrebs-Zelllinien L3.6pl res, L3.6pl wt, Panc-1, Panc-2, BxPC3 sowie in der Referenzzelllinie HPDE bei Behandlung der Zellen mit 29,6 μg/ml Biperiden oder 25 μM Mepazin oder einer Kombination aus 15 μM Mepazin und 3,7 μg/ml Biperiden. (*) bezeichnet einen Trend (p < 0,1), * bezeichnet eine statistische Signifikanz (p ≤ 0,05), ** bezeichnet eine hohe statistische Signifikanz (p < 0,001).
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr anhand von bevorzugten Ausführungsformen beschrieben, welche die Erfindung veranschaulichen aber in keiner Weise beschränken sollen.
BEISPIEL 1: MTT-Proliferations-Assays
Die für die Proliferations-Assays verwendeten Zelllinien wurden in verschiedenen Medien kultiviert. Die Zelllinien Panc-1, Panc-2 und BxPC3, welche sich vom humanen duktalen Pankreas-Adenokarzinom (PDAC) ableiten, wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle Medium (DMEM) (Sigma) kultiviert, das mit 1% Penicillin/Streptomycin (Life technologies/GIBCO 15140-122) und 10% fötalem Rinderserum (Life technologies/GIBCO 100500-064) supplementiert war. Die Zelllinie L3.6pl wurde in RPMI 1640 Medium (Life technologies/GIBCO 72400-21) kultiviert, das mit 1% Penicillin/Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum supplementiert war. Ein gegen Gemcitabin resistenter Subklon der Zelllinie L3.6pl, der als L3.6pl res bezeichnet wurde, wurde ebenfalls in RPMI 1640 Medium (Life technologies/GIBCO 72400-21) kultiviert, das mit 1% Penicillin/Streptomycin, 10% fötalem Rinderserum, und 2 μM Gemcitabin (GEMZAR, Lily) supplementiert war. Die humane, immortalisierte, nicht-maligne Zelllinie des duktalen Pankreas-Epithels (HPDE) wurde in Keratinozyten-SFM (Life technologies/GIBCO) kultiviert, das mit 10% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin, und 1% Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) supplementiert war.
Die Proliferationsraten der Zelllinien wurden nach Stimulation mit (i) Biperiden, (ii) Mepazin, und (iii) nach Stimulation mit beiden Wirkstoffen bestimmt. Dazu wurden in Platten mit 96 Vertiefungen jeweils 5000 Zellen pro Vertiefung ausgesät und bei 37°C und 5% CO2 über Nacht inkubiert. Am nächsten Morgen wurden zwei Stunden nach Zugabe von 100 µl Medium und 20 μl MTT-Substrat (CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega) die Nullwerte in einem ELISA-Lesegerät (FLUOstar Omega, BMG LABTECH) bei 490 nm bestimmt. Biperiden wurde in Form von Lösungen aus Biperiden-Hydrochlorid (B5311 SIGMA-Aldrich, USA) und DMSO mit steigenden Konzentrationen an Biperiden zugegeben (3,71 μg/ml, 11,1 μg/ml und 29,6 μg/ml). Mepazin wurde in Form von Lösungen von Mepazin-Hydrochlorid (MALT1 Inhibitor II, Calbiochem Merck, Millipore Billerica, USA) mit steigenden Konzentrationen an Mepazin (15 μM and 25 μM) zugegeben. Kombinationen der beiden Wirkstoffe Mepazin und Biperiden wurden in folgenden Konzentrationen zugegeben: 15 μM Mepazin + 3,71 μg/ml Biperiden; 25 μM Mepazin + 3,71 μg/ml Biperiden. Die Exstinktion wurde alle 24 Stunden während eines Zeitraums von 72 Stunden bestimmt.
Die Normalverteilung der Ergebnisse wurde durch Kolgomorov-Smirnov- und Shapiro-Wilk-Test analysiert. Nicht-parametrische Variablen wurden unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests analysiert. Wenn die Gruppe kleiner als n = 5 war, wurde der Fisher-Exakt-Test durchgeführt. Normal verteilte Variablen wurden mit dem Student-T-Test untersucht. Die Überlebensanalyse wurde durch Log-Rank-Test und Kaplan-Meier-Abschätzungen durchgeführt. Der Spearman-Rho-Test wurde verwendet, um die statistische Abhängigkeit zwischen zwei Variablen zu messen. Die Werte sind als Median und Interquartilsabstand (IQR) angegeben. Alle statistischen Tests wurden mit SPSS (Version 21, IBM) durchgeführt.
Die Ergebnisse der Untersuchung sind in den 1–4 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass Mepazin und Biperiden starke inhibierende Effekte auf die Proliferation von Pankreaskrebszellen ausüben. In der Zelllinie HPDE, die mit 11,1 µg/ml Biperiden behandelt wurde, verringerte sich die Proliferation geringfügig. HPDE zeigte jedoch keine statistisch signifikante Reaktion auf Mepazin, andere Dosen von Biperiden oder einer Kombination von Mepazin und Biperiden.
Im Gegensatz dazu zeigten alle Pankreas-Krebszelllinien massive Verringerungen der Proliferationsrate in Gegenwart von Biperiden, Mepazin oder der Kombination beider Mittel (siehe 1–4). L3.6pl res verringerte die Proliferationsraten um 71,6% in Gegenwart von 29,6 µg/ml Biperiden (p = 0,022); um 69,4% in Gegenwart von 15 μM Mepazin (p = 0,031), und die Proliferation kam bei einer Dosis von 25 μM Mepazin (p = 0,002) vollständig zum Erliegen. L3.6pl res zeigte ferner einen Trend für eine um etwa 98% verringerte Proliferationsrate bei Kombinationen aus 15 μM Mepazin und 3,71 μg/ml Biperiden (p = 0,06) und um 99,5% bei 25 μM Mepazin und 3,71 μg/ml Biperiden (p = 0,058).
L3.6pl wt zeigte eine Verringerung der Proliferationsrate um 96,4% in Gegenwart von 29,7 μg/ml Biperiden (p = 0,02), eine Verringerung um 97,9% bei 25 μM Mepazin (p = 0,004), eine Verringerung um 96,4% bei 15 mM Mepazin + 3,71 μg/ml Biperiden (p = 0,032), und ein vollständiges Erliegen der Proliferation in Gegenwart von 25 μM Mepazin + 3,71 μg/ml Biperiden (p = 0,03).
Panc-1 eine statistisch signifikante Verringerung um 97,7% in Gegenwart von 15 μM Mepazin (p = 0,005) und ein vollständiges Erliegen der Proliferation in Gegenwart von 25 μM Mepazin (p = 0,004), 15 μM Mepazin + 3,71 μg/ml Biperiden (p = 0,023), und 25 μM Mepazin + 3,71 μg/ml Biperiden (p = 0,022).
Panc-2 zeigte einen Trend für eine verringerte Proliferationsrate um 98,2% bei 29,6 μg/ml Biperiden (p = 0,077), eine statistisch signifikante Verringerung um 56,1% in Gegenwart 15 μM Mepazin (p = 0,008), eine Verringerung von 86,9% bei 25 μM Mepazin (p = 0,001), eine Verringerung von 82,2% bei 15 μM Mepazin + 3,71 μg/ml Biperiden (p = 0,031) und eine Verringerung von 89,5% in Gegenwart von 25 μM Mepazin + 3,71 μg/ml Biperiden (p = 0,006).
BxPC3 verringerte die Proliferationsraten sichtbar, wobei sich die Verringerung jedoch nicht im statistisch signifikanten Bereich bewegte.
BEISPIEL 2: Bestimmung der Apoptose
Um die Wirkung von Biperiden, Mepazin und Kombinationen der beiden Wirkstoffe auf die Apoptose in Zelllinien zu bestimmen, wurde ein "Cleaved Caspase 3"-Sandwich-ELISA durchgeführt. Die Pankreas-Krebszelllinien L3.6pl res, L3.6pl wt, Panc-1, Panc-2 sowie die Referenzzelllinie HPDE wurden mit 29,6 μg/ml Biperiden oder 25 μM Mepazin oder 15 μM Mepazin + 3,7 μg/ml Biperiden oder lediglich mit Vehikel (DMSO) behandelt. Die gespaltene Caspase-3 wurde 24, 48 und 72 h nach der Inkubation gemessen. Die Apoptose in den Zellen wurde unter Verwendung eines PathScan "Cleaved-Caspase-3"-Sandwich-ELISA (Cell Signaling, #7190C) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Jedes Experiment wurde in Doppelansätzen mindestens drei Mal durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 5 aufgeführt. In keiner der getesteten Zelllinien war die Apoptose nach Behandlung mit 25 µM Mepazin oder 15 µM Mepazin + 3,7 µg/ml Biperiden erhöht. Hingegen war bei Behandlung mit 29,6 μg/ml Biperiden in allen Zelllinien eine erhöhte Apoptose zu verzeichnen. Die Apoptoserate in der Zelllinie HPDE war bei Behandlung mit 29,6 μg/ml Biperiden im Vergleich zu Zellen, die nur mit dem Vehikel behandelt wurden, nach 48 Stunden um 132% erhöht (265,3 ± 27,8 RLU vs. 114,3 ± 40,8 RLU; p = 0,037, t-Test), und nach 72 Stunden um 283,9% (368,4 ± 33,5 RLU vs. 96,0 ± 28,9 RLU; p = 0,002, t-Test). Die Apoptoserate in der Zelllinie L3.6pl res war bei Behandlung mit 29,6 μg/ml Biperiden nach 24 Stunden um 274% erhöht (770,0 ± 72,5 RLU vs. 205,9 ± 97,8 RLU; p = 0,008, t-Test), nach 48 Stunden um 273,8 % (848,1 ± 45,7 RLU vs. 226,9 ± 91,1 RLU; p = 0,003, t-Test), und nach 72 Stunden um 204,0% (633,3 ± 55,7 RLU vs. 208,3 ± 101,1; p = 0,021, t-Test). Die Apoptoserate in der Zelllinie L3.6pl wt war bei Behandlung mit 29,6 μg/ml Biperiden nach 24 Stunden um 210,4% erhöht (443,4 ± 18,1 RLU vs. 139,7 ± 29,0 RLU; p < 0,001, t-Test), und nach 48 Stunden um 83,5% (386,2 ± 15,9 RLU vs. 210,4 ± 53,7 RLU; p = 0,028, t-Test). Die Apoptoserate in der Zelllinie Panc-1 war bei Behandlung mit 29,6 μg/ml Biperiden nach 24 Stunden um 125,3% erhöht (325,1 ± 48,3 RLU vs. 144,2 ± 48,2 RLU; p = 0,049). Die Apoptoserate in der Zelllinie Panc-2 war bei Behandlung mit 29,6 μg/ml Biperiden nach 24 Stunden um 109,1% erhöht (360,0 ± 11,0 RLU vs. 172,1 ± 49,2 RLU; p = 0,029), und nach 48 Stunden um 65,3% (306,0 ± 74,8 RLU vs. 185,2 ± 81,5 RLU; p = 0,047, t-Test). Die Apoptoserate in der Zelllinie BxPC3 war bei Behandlung mit 29,6 μg/ml Biperiden nach 24 Stunden um 369,8% erhöht (813,1 ± 37,7 RLU vs. 173,1 ± 83,7 RLU; p = 0,002, t-Test), und nach 48 Stunden um 357,5% (1046,1 ± 34,7 RLU vs. 228,7 ± 136,1 RLU; p = 0,004, t-Test), und nach 72 Stunden um 230,9% (862,8 ± 85.2 RLU vs. 260,8 ± 161,6 RLU; p = 0,032).
BEISPIEL 3: Bestimmung der MALT1-Aktivität in Tumorzellen
Die MALT1-Aktivität wurde in den Pankreas-Krebszellen Panc-1, Panc-2 und in der Referenzzelllinie HPDE sowie in PMA-stimulierten und nicht-stimulierten Jurkat-Zellen gemessen. Um zu untersuchen, ob Mepazin, Biperiden und eine Kombination beider Wirkstoffe die MALT1-Aktivität in Pankreas-Krebszellen beeinflussen, wurde ein Assay durchgeführt, wie er in Nagel et al. [4] beschrieben wurde. Zu diesem Zweck wurden die Pankreas-Krebszelllinien und die Referenzzelllinie 24 Stunden mit Biperiden (29,6 µg/ml), Mepazin (25 µM), einer Kombination beider Wirkstoffe (15 µM Mepazin + 3,71 µg/ml Biperiden) oder lediglich mit DMSO behandelt. Die Zellen wurden anschließend lysiert und wie zuvor von Gungor et al. beschrieben [5] mit Maus-anti-MALT1-Antikörper (SC-76677, Santa Cruise, CA, USA) präzipitiert. Wie in dem Protokoll beschrieben, wurde das fluorogene Substrat AC-LRSR-AMC, welches von der C-terminalen BCL10-Spaltstelle abgeleitet war, als Substrat von MALT1 verwendet. Die Spaltungsaktivität von MALT1 wurde anschließend als relative Fluoreszenzeinheiten durch ein Mikroplatten-Lesegerät bestimmt (FLUOstar, Omega, BMG Labtech).
Die Ergebnisse wurden nach 24-stündiger Inkubation mit Mepazin, Biperiden oder einer Kombination beider Wirkstoffe bestimmt. Es zeigte sich, dass die Pankreas-Krebszelllinien sowie die nicht-maligne, immortalisierte HPDE-Zelllinie eine konstitutive MALT1-Aktivität aufwiesen, wenn auch im unterschiedlichen Ausmaß. Als Referenz wurde eine nicht-stimulierte sowie eine mit PMA aktivierte Jurkat-Zelllinie untersucht. Überaschenderweise zeigten die Pankreas-Krebszellen im Vergleich zu Jurkat-Zellen eine höhere konstitutive MALT1-Aktivität.
In der Referenzzelllinie HPDE beeinflusste die Inkubation mit 25 µM Mepazin die MALT1-Aktivität nicht. Im Gegensatz dazu verringerte die Zugabe von 29,7 µg/ml Biperiden die MALT1-Aktivität 10, 30 und 60 Minuten nach Inkubation mit dem MALT1-Substrat signifikant (p = 0,002; p = 0,005; p = 0,012; T-Test).
In der Zelllinie Panc-1, die mit 25 µM Mepazin behandelt worden war, verringerte sich die MALT1-Aktivität unmittelbar nach Zugabe des MALT1-Substrats (p = 0,004; T-Test) und auch 10, 30, 60 und 90 Minuten danach signifikant (p = 0,004; p = 0,002; p = 0,001; p = 0,003; p = 0,011; T-Test). Die gleiche Wirkung wurde bei Behandlung mit einer Kombination beider Wirkstoffe beobachtet, wenn 15 µM Mepazin + 3,71 µg/ml Biperiden zu den Zellen gegeben wurden (p = 0,006; p = 0,004; p = 0,003; P = 0,004; p = 0,010; T-Test). Die Behandlung der Zellen mit 29,7 µg/ml Biperiden verringerte die MALT1-Aktivität sichtbar, jedoch war diese Wirkung statistisch nicht signifikant.
In der Zelllinie Panc-2 verringerte sich die MALT1-Aktivität bei Behandlung mit 29,7 µg/ml Biperiden unmittelbar nach Zugabe des MALT1-Substrats und auch 10 Minuten nach Zugabe des MALT1-Substrats in einem statistisch signifikanten Ausmaß (p = 0,011; p = 0,031; T-Test). 25 µM Mepazin und die Kombination der beiden Wirkstoffe, 15 µM Mepazin + 3,71 µg/ml Biperiden verringerten die MALT1-Aktivät, wobei diese Reduktion jedoch statistisch nicht signifikant war.
BEISPIEL 4: Xenograft-Maus-Model
Für das Xenograft-Modell wurden pfp-/-/rag2-/-Doppel-Knockout-Mäuse verwendet. Dieses Maus-Modell zeigt aufgrund eines inaktivierten pfp-Gens eine schwere Störung der NK-Zellfunktion. Durch Inaktivierung des rag2-Gens fehlen der Maus reife T- oder B-Lymphozyten [6–7]. Das Maus-Modell wurde vom Taconic-Institut (Quality Laboratory Animals and Services for Research, DK8680 Ry, Taconic Europe, Dänemark) durch Kreuzung des PFPN12-Maus-Modells mit dem RAGN12-Maus-Modell entwickelt. Dieses Modell wurde über 12 Generationen (N12) mit C57BL/6NTac rückgekreuzt, und die Kolonie wurde durch homozygote Paarungen beibehalten.
Das Maus-Modell wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit PDAC-Zellen der Zelllinie Panc-1 verwendet, die subkutan verabreicht wurden. 12 Tage nach der subkutanen Injektion von 10⁶ humanen Panc-1-Tumorzellen wurden die Mäuse täglich entweder mit 16 mg/kg Mepazin i.p. (n = 10), 10 mg/kg Biperiden (n = 10) i.p. oder mit einer Kombination beider Wirkstoffe, d.h. mit 16 mg/kg Mepazin und 10 mg/kg Biperiden (n = 10) i.p. behandelt. Die Kontrollgruppe (n = 10) wurde nicht behandelt.
Die tägliche Behandlung wurde unter identischen, standardisierten Bedingungen durchgeführt. Es wurde der gleiche 3-tägige Zyklus über die gesamte Zeit der Studie verwendet: Tag 1 umfasste die Injektion der Medikation und die Bestimmung des Körpergewichts durch Wiegen. Tag 2 umfasste die Injektion der Medikation und die Messung des subkutanen Tumorwachstums mit einem Kaliper. Tag 3 umfasste die Injektion der Medikation und ein Neuroscoring. Die Mäuse zeigten eine gute Verträglichkeit hinsichtlich der Biperiden-Gabe. Insgesamt erschienen die Biperiden-behandelten Mäuse sowie die Mäuse, die die Kombination aus beiden Präparaten erhielten, motorisch aktiver zu sein als die Mäuse, die Mepazin bzw. keine Medikation (Kontrolle) erhielten.
Sobald die Tumore in der Kontrollgruppe einen Durchmesser von etwa 10 mm erreichten, wurden die Mäuse der mit Biperiden, Mepazin bzw. Biperiden + Mepazin behandelten Gruppen getötet und untersucht.
Den Mäusen wurde nach der Einschläferung der subkutane Tumor entfernt. Vor dem Eingriff wurde der Körper der Maus mit Ethanol desinfiziert. Die Haut oberhalb des Tumors wurde vorsichtig eingeschnitten, und der Tumor wurde chirurgisch aus dem umliegenden Gewebe entfernt. Nach der Entfernung wurde der Tumor gewogen und gemessen.
Zur Auswertung wurden lediglich Mäuse verwendet die einen Tumor ausgebildet hatten. Die Ergebnisse zeigten, dass die Größe des subkutanen Tumors in Mäusen, die mit Mepazin und Biperiden behandelt wurden, signifikant verringert ist. Die Volumina der subkutanen Tumoren wurde nach der Entfernung mit einem Kaliper gemessen und durch die Formel Länge × Breite² berechnet, wie es in [8] beschrieben ist. Die Tumorgrößen der mit Biperiden, Mepazin bzw. Mepazin + Biperiden behandelten Gruppen waren im Vergleich mit der Kontrollgruppe sichtbar kleiner. Die durchschnittliche Tumorgröße der Kontrollgruppe betrug 729,33 mm³ ± 186,25 mm³ gegenüber 130,43 mm³ ± 63,96 mm³ in der mit Mepazin behandelten Gruppe (p = 0,002; einseitiger Fisher-Exact-Test) und 235,89 mm³ ± 124,91 mm³ in der mit Biperiden behandelten Gruppe (p = 0,027; einseitiger Fisher-Exact-Test). Bei der Behandlung mit beiden Wirkstoffen betrug die Tumorgröße 164,50 mm³ ± 45,25 mm³ gegenüber 1000,33 mm³ ± 816,86 mm³ in der Kontrollgruppe (nicht signifikant).
LITERATURSTELLEN

[1] De Vita, Hellman & Rosenberg, Cancer: Principles and Practice of Oncology, 7. Auflage 2004, Lipincott, Williams & Wilkins.
[2] Ferrone et al. (2008), J Gastrointest Surg, 12(4): 701–6.
[3] Valle et al. (2014), J Clin Oncol, 32(6): 504–12.
[4] Nagel & Krappmann (2013) Measurement of Endogenous MALT1 Activity. 3. Quelle: http://www.bio-protocol.org/e821.
[5] Gungor et al. (2011), Cancer Res, 71(14): 5009–19.
[6] Shinkai et al. (1992), Cell, 68(5): 855–67.
[7] Walsh et al (1994), Proc Natl Acad Sci USA, 91(23): 10854–8.
[8] Tomayko et al (1989), Cancer Chemother Pharmacol, 24(3): 148–54.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

"Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins; 21. Auflage (2005) [0027]
"Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins; 21. Auflage (2005) [0029]
Nagel et al. [0055]
Gungor et al. [0055]

Claims

Verbindung der Formel
oder pharmazeutisch geeignetes Salz oder Solvat davon zur Verwendung als MALT1-Inhibitor in einem Verfahren zur Behandlung einer Krebserkrankung.
Verbindung zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren die Verabreichung sowohl der Verbindung nach Formel (Ia) als auch der Verbindung nach Formel (Ib) umfasst.
Verbindung zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Krebserkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pankreaskarzinom, Lungenkarzinom, Bronchialkarzinom und/oder Ösophaguskarzinom.
Verbindung zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Krebserkrankung ein Pankreaskarzinom ist.
Verbindung zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, bei dem das Verfahren ferner die Verabreichung einer Phenothiazin-Verbindung umfasst.
Verbindung zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Phenothiazin-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mepazin, Thioridazin, Promazin und pharmazeutisch geeigneten Salzen, Derivaten oder Solvaten davon.
Verbindung zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6, bei dem die Verbindung nach Formel (Ia) und/oder Verbindung nach Formel (Ib) in einer Konzentration verabreicht wird/werden, die ausreicht, um eine Inhibierung der MALT1-Protease in den Tumorzellen zu bewirken.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: a) eine Verbindung der Formel
oder pharmazeutisch geeignetes Salz oder Solvat davon, und b) mindestens eine Phenothiazin-Verbindung.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, die ferner einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8–9, bei der die Phenothiazin-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mepazin, Thioridazin, Promazin und pharmazeutisch geeigneten Salzen, Derivaten oder Solvaten davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8–10, die sowohl eine Verbindung nach Formel (Ia) als auch eine Verbindung nach Formel (Ib) umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8–11 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer Krebserkrankung.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Krebserkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pankreaskarzinom, Lungenkarzinom, Bronchialkarzinom und/oder Ösophaguskarzinom.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Krebserkrankung ein Pankreaskarzinom ist.
Verwendung einer Verbindung der Formel
oder eines pharmazeutisch geeigneten Salzes oder Solvats davon als MALT1-Inhibitor bei der Behandlung einer Krebserkrankung.
Verwendung nach Anspruch 15, bei der die Krebserkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pankreaskarzinom, Lungenkarzinom, Bronchialkarzinom und/oder Ösophaguskarzinom.
Verwendung nach Anspruch 16, bei der die Krebserkrankung ein Pankreaskarzinom ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 15–17, bei dem die Behandlung ferner die Verabreichung einer Phenothiazin-Verbindung umfasst.
Verwendung nach Anspruch 18, bei der die Phenothiazin-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mepazin, Thioridazin, Promazin und pharmazeutisch geeigneten Salzen, Derivaten oder Solvaten davon.
Kit, umfassend a) ein Behältnis, das eine Verbindung der Formel
oder pharmazeutisch geeignetes Salz oder Solvat davon umfasst, und b) mindestens ein Behältnis, das eine Phenothiazin-Verbindung umfasst.