DE102014220186A1 - Hefestämme und Verfahren zur Produktion von Omega-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren - Google Patents

Hefestämme und Verfahren zur Produktion von Omega-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft verschiedene neue Hefestämme der Art Yarrowia lipolytica sowie zugehörige Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren mithilfe dieser Stämme, wodurch vorteilhaft die Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren erhöht ist.

Description

  • Die Erfindung betrifft verschiedene Hefestämme der Art Yarrowia lipolytica sowie zugehörige Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren mithilfe dieser Stämme.
  • Bei Dicarbonsäuren handelt es sich um Carbonsäuren mit zwei Carboxy-Gruppen (allgemeine Struktur: HOOC-(CH2)n-COOH), die vielfältige Anwendungen in der chemischen Industrie, z.B. zur Herstellung von Duftstoffen, Klebstoffen, Nylon und anderen Polyamiden, Harzen, Korrosionsinhibitoren oder Schmierstoffen, finden. Insbesondere die biotechnologische Produktion langkettiger Dicarbonsäuren ist von besonderem Interesse, da bei der chemischen Synthese der selbigen eine Reihe an unerwünschten Nebenprodukten gebildet wird.
  • ω-Hydroxyfettsäuren enthalten am Cω-Atom (C-Atom mit der weitest möglichen Entfernung zur Carboxygruppe) eine Hydroxylgruppe (allgemeine Struktur: HOOC-(CH2)n-CH2OH). ω-Hydroxyfettsäuren sind ebenfalls von großer Bedeutung in der chemischen Industrie, da sie u.a. in Schmiermitteln, Klebstoffen, Kosmetika und Krebstherapeutika Anwendung finden. Weiterhin könnten ω-Hydroxyfettsäuren in Zukunft eine große Bedeutung erlangen, da sie als Monomere zur Synthese von Biokunststoffen genutzt werden können.
  • Zur Gewinnung von ω-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren aus n-Alkanen und Fettsäuren soll im Rahmen dieser Erfindung die nicht-konventionelle Hefe Yarrowia (Y.) lipolytica genutzt werden. Die Hefe Y. lipolytica wurde als Wirtsorganismus für die Biokonversion ausgewählt, weil sie in der Lage ist eine Vielzahl an Substraten als Kohlenstoffquelle zu nutzen. Hierzu zählen neben Glucose, Glycerol, Proteinen, Alkoholen und Acetat auch eine Vielzahl an hydrophoben Substraten wie Pflanzenöle, Fette, Fettsäuren und n-Alkane (Barth G & Gaillardin C (1997) FEMS Microbiol Rev 19: 219–237.). Die hydrophoben Substrate werden durch die Hefen emulgiert und mithilfe spezialisierter Membrantransporter in das Zellinnere aufgenommen (Fickers P, Benetti PH, Waché Y, Marty A, Mauersberger S, Smit MS & Nicaud JM (2005) FEMS Yeast Res 5: 527–543.). In die Zelle aufgenommene n-Alkane werden im Rahmen der primären (monoterminalen) Alkanoxidation schrittweise zur Fettsäure mit gleicher Kettenlänge umgesetzt (1). Die Fettsäuren werden anschließend im Rahmen der β-Oxidation zu Acetyl-CoA abgebaut, das in den Tricarbonsäure- und den Glyoxylatzyklus einfließt. Parallel zur β-Oxidation von Fettsäuren in den Peroxisomen findet die ω-Oxidation im Endoplasmatischen Retikulum statt (vgl. 1). Diese diterminale Oxidation von Fettsäuren findet natürlicher Weise jedoch in einem weitaus geringeren Umfang als die β-Oxidation statt.
  • Verschiedene Hefen, wie z.B. Candida (C.) tropicalis und Y. lipolytica sind in der Lage, langkettige Alkane oder Fettsäuren zu α,ω-Dicarbonsäuren umzusetzen. Damit die hydrophoben Substrate überhaupt zur jeweiligen Dicarbonsäure umgesetzt werden können, muss deren Verstoffwechselung im Rahmen der β-Oxidation unterbunden werden. Dies kann z.B. durch die Deletion der für die Acyl-CoA-Oxidase kodierenden POX-Gene geschehen. Ist die β-Oxidation ausgeschaltet, führt dies zu einer gesteigerten ω-Oxidation der Fettsäuren (Smit et al. (2005) Biotechnol. Lett. 27: 859–864.).
  • Die mikrobielle Produktion langkettiger Dicarbonsäuren wurde bereits mithilfe der Hefe C. tropicalis durchgeführt:
    • – Picataggio S, Rohrer T, Deanda K, Lanning D, Reynolds R, Mielenz J & Eirich LD (1992) Biotechnology (N Y) 10: 894–898.
  • Die Produktion der Dicarbonsäuren wurde hierbei vor allem durch die Deletion der Gene POX4 und POX5 erreicht. Es bestehen eine Reihe von Patenten, die entsprechende C. tropicalis-Produktionsstämme sowie zugehörige Produktionsverfahren schützen (z.B. US4339536A , EP296506A2 und WO200017380A1 ).
  • In einer Patentschrift von 2013 wird beschrieben, wie Hefen allgemein (in an sich bekannter Weise) zur Produktion erhöhter Mengen an Dicarbonsäuren veranlasst werden können. In den Ausführungsbeispielen wird hier jedoch im Speziellen nur auf C. tropicalis eingegangen ( WO201306730A2 , WO201306733A2 ).
  • Ebenso wurde die mikrobielle Produktion langkettiger ω-Hydroxyfettsäuren bereits mithilfe der Hefe C. tropicalis durchgeführt:
    • – Lu W, Ness JE, Xie W, Zhang X, Minshull J & Gross RA (2010) J Am Chem Soc 132: 15451–15455.
  • Hierfür wurden zusätzlich zu den Genen POX4 und POX5 sechs Cytochrom P450-, vier Alkohol-Oxidase- und sechs Alkohol-Dehydrogenase-Gene deletiert. Auch diese Stämme und Produktionsverfahren sind bereits patentrechtlich geschützt ( WO2011008232A2 ).
  • Des Weiteren wurde bereits beschrieben, wie Y. lipolytica zur Bildung von Dicarbonsäuren veranlasst werden kann:
    • – Smit MS, Mokgoro MM, Setati E & Nicaud JM (2005) Biotechnol Lett 27: 859-864.
  • Hierbei wurden alle derzeit bekannten Acyl-CoA-Oxidase-Gene (POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6) sowie das Acyl-CoA-Diacylglycerol-Acyltransferase-Gen (DGA1) und das Lecithin-Cholesterol-Acyltransferase-Gen (LRO1) deletiert. Weiterhin wurde das NADPH-Cytochrom P450-Reduktase-Gen (CPR1) überexprimiert ( WO200664131A8 ).
  • Neben der biotechnologischen Produktion von ω-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren mithilfe von gentechnisch veränderten Hefen unter Ausnutzung der intrazellulären ω-Oxidation von Fettsäuren gibt es auch weitere biotechnologische Verfahren, die auf anderen enzymatischen Umsetzungen beruhen. Ein Beispiel hierfür stellt die Verwendung der Baeyer-Villiger-Monooxygenase, die die Umwandlung eines Ketons zum Ester katalysiert, dar ( WO2013151393A1 ).
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuartiger Hefestämme der Art Y. lipolytica die zur mikrobiellen Produktion von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren, in größeren Mengen als bisher bekannt, geeignet sind sowie eines Verfahren zur Kultivierung ebendieser Stämme.
  • Die Aufgabe wird durch einen Hefestamm gemäß Anspruch 1 sowie durch Verfahren gemäß den Ansprüchen 8 und 11 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
  • Gemäß eines ersten Aspekts der Erfindung wird zur mikrobiellen Produktion von ω-Hydroxyfettsäuren aus hydrophoben Substraten ein Hefestamm der Art Y. lipolytica bereitgestellt, der eine Verringerung der Aktivitäten der Acyl-CoA-Oxidasen (namentlich POX1: YALI0E32835g, POX2: YALI0F10857g, POX3: YALI0D24750g, POX4: YALI0E27654g, POX5: YALI0C23859g, POX6: YALI0E06567g) aufweist, wobei in diesem Hefestamm zusätzlich die Aktivitäten relevanter (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen (=(Fettsäure-)Alkohol-Dehydrogenasen, namentlich ausgewählt aus FADH: YALI0F09603g, ADH1: YALI0D25630g, ADH2: YALI0E17787g, ADH3: YALI0A16379g, ADH4: YALI0E15818g, ADH5: YALI0D02167g, ADH6: YALI0A15147g und/oder ADH7: YALI0E07766g) reduziert sind und die Aktivitäten relevanter (Fett-)Alkohol-Oxidasen (=(Fettsäure-)Alkohol-Oxidasen, namentlich FAO1: YALI0B14014g) reduziert sind, was zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren, vorzugsweise lineare ω-Hydroxyfettsäuren gemäß der allgemeinen Struktur: HOOC-(CH2)n-CH2OH, HOOC-(CnH2n-2)-CH2OH, COOC-(CnH2n-4)-CH2OH oder HOOC-(CnH2n-6)-CH2OH, mit n im Bereich von 6 bis 18, vorzugsweise im Bereich von 8 bis 16, aus einem hydrophoben Substrat, insbesondere einem entsprechenden n-Alkan oder einer Fettsäure (und anderen hydrophoben Substraten) führt.
  • Besonders bevorzugt ist die ω-Hydroxyfettsäure eine lineare ω-Hydroxyfettsäure gemäß der allgemeinen Struktur: HOOC-(CH2)n-CH2OH mit n im Bereich von 8 bis 16.
  • Die Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren bzw. Dicarbonsäuren ist im Sinne der vorliegenden Erfindung gesteigert, wenn diese gegenüber Hefezellen ohne die entsprechende gentechnische Veränderung um mindestens 10 Mol.-%, besonders bevorzugt mindestens 20 Mol.-% erhöht ist.
  • Der Erfindung liegt die jüngst gewonnene Erkenntnis zugrunde, dass das Gen, welches für die Fett-Alkohol-Oxidase FAO1: YALI0B14014g in dem Hefestamm der Art Y. lipolytica kodiert, identifiziert werden konnte.
  • Die Erfinder haben zudem nun überraschend gefunden, dass die Deletion des für das Enzym Fao1p kodierenden Gens die weitere ω-Oxidation der ω-Hydroxyfettsäuren zum Fettsäurealdehyd, bzw. zur Dicarbonsäure im Rahmen der ω-Oxidation von Fettsäuren vermindert.
  • Besonders vorteilhaft unterbindet oder verringert die Verringerung der Aktivität der Produkte von FADH, ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7 und/oder FAO1 die weitere Oxidation der ω-Hydroxyfettsäuren zum Fettsäurealdehyd, bzw. zur Dicarbonsäure im Rahmen der ω-Oxidation von Fettsäuren.
  • Das Fett-Alkohol-Oxidase-Gen wurde in Y. lipolytica bisher noch nicht beschrieben. Dessen Nutzung im Rahmen von biotechnologischen Anwendungsfeldern stellt ebenfalls einen Teil dieser Erfindung dar.
  • Unter einer Verringerung der Aktivität eines Proteins ist vorzugsweise zu verstehen, dass die Aktivität des Proteins pro Zelle verringert wird. Besonders bevorzugt ist darunter das Fehlen der Aktivität des Proteins in der Hefezelle zu verstehen. Die Verringerung der Aktivität von Proteinen kann durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren erlangt werden, wie bspw.:
    • (i) durch die Inhibierung oder Verminderung der Expression der dafür kodierenden Gene
    • (ii) durch partielle oder komplette Deletion der dafür kodierenden Gene
    • (iii) durch Expression von nicht-funktionalen Genen
    • (iv) durch Inhibierung oder Verminderung der Aktivität der exprimierten Gene.
  • Die Inhibierung oder Verminderung der Expression eines für ein Protein kodierenden Gens kann beispielsweise durch Inhibierung oder Verminderung der Transkription des kodierenden Gens oder der Translation der gebildeten mRNA erfolgen. Die Deletion der kodierenden Gene kann beispielsweise durch einen Ausbau der Gene mittels Deletionskassetten durchgeführt werden. Die Expression eines dysfunktionalen oder aktivitätsreduzierten Genproduktes kann beispielsweise durch Insertion, Substitution oder Punktmutation in dem für das Protein kodierenden Gen bewerkstelligt werden.
  • Bei der Aktivitätsverringerung wird die Deletion eines kodierenden Gens bevorzugt.
  • Vorzugsweise weist der erfindungsgemäße Hefestamm zur Produktion von ω-Hydroxyfettsäuren somit eine Deletion der Gene für die Acyl-CoA-Oxidasen (POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6) sowie für die (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen (FADH, ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7) und/oder für die (Fett)Alkohol-Oxidasen (FAO1) auf. Weiterhin ist die Bildung der Fettkörperchen verringert, vorzugsweise durch die Verringerung der Aktivität der Genprodukte von PAH1 und/oder SCT1.
  • Die Deletion der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 unterbindet die β-Oxidation und verhindert somit den Abbau von Fettsäuren (zu Acetyl-CoA, bzw. Propionyl-CoA).
  • Bevorzugt sind in dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren zusätzlich die Aktivitäten einzelner oder aller Cytochrom P450-Genprodukte, insbesondere von ALK1: YALI0E25982g, ALK2: YALI0F01320g, ALK3: YALI0A20130g, ALK4: YALI0B13816g, ALK5: YALI0B13838g, ALK6: YALI0B01848g, ALK7: YALI0A15488g, ALK8: YALI0C12122g, ALK9: YALI0B06248g, ALK10: YALI0B20702g, ALK11: YALI0C10054g und/oder ALK12: YALI0A20130g erhöht. Vorteilhaft führt die Erhöhung einzelner oder aller Cytochrom P450-Genprodukte zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren.
  • Es kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass in dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren zusätzlich die Aktivität der NADPH-Cytochrom P450-Reduktase (CPR1: YALI0D04422g) erhöht ist, was zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Bevorzugt ist in dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren zusätzlich die Aktivität der Phosphatidsäure-Dephosphohydrolase (PAH1: YALI0D27016p) verringert. Vorteilhaft führt dies zu einer Reduzierung der Größe der Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren.
  • Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist in dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren zusätzlich die Aktivität der Glycerol-3-phosphat-Acyltransferase (SCT1: YALI0C00209g) verringert, was vorteilhaft zu einer Reduzierung der Größe der Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren (und anderen hydrophoben Substraten) führt.
  • Es kann ferner auch vorgesehen sein, dass in dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren zusätzlich die Aktivität der Phospholipid-Diacylglycerol-Acyltransferase (LRO1: YALI0E16797g) verringert ist, was zu einer Reduzierung der Größe der Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist in dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren zusätzlich die Aktivität der Diacylglycerol-Acyltransferase (DGA1: YALI0E32769g) verringert, was zu einer Reduzierung der Größe der Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist in dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren zusätzlich die Aktivität der Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase (GUT2: YALI0B13970g) erhöht ist, was zu einer Reduzierung der Größe der Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Besonders vorteilhaft wurde nun gefunden, dass die zusätzlich Erhöhung der Aktivitäten relevanter Triacylglycerol-Lipasen (TGL3/TGL4: YALI0F10010g, YALI0D16379g, YALI0D17534g) in dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren, zu einer Reduzierung der Größe der Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Besonders vorteilhaft hat sich die die Verringerung der Aktivität des Citrat- und Oxalacetat-Transporters (YHM2: YALI0B10736g) und/oder die Verringerung der Aktivität des Citrat-Transport-Proteins (CTP1: YALI0F26323g) in dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren herausgestellt, da dadurch eine geringere Mengen an organischen Säuren produziert und/oder ins Kulturmedium sekretiert wird.
  • Optional kann vorgesehen sein, dass in dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren zusätzlich der Transport von ω-Hydroxyfettsäuren aus der Hefezelle bzw. aus dem Endoplasmatisches Retikulum ins Cytoplasma, z.B. durch die erhöhte Aktivität spezifischer Membrantransporter, gesteigert ist, was zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Bevorzugt ist in dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren zusätzlich der Transport der hydrophoben Substrate in die Hefezelle bzw. die jeweiligen Organellen (Peroxisomen, Endoplasmatisches Retikulum), z.B. durch die erhöhte Aktivität spezifischer Membrantransporter, gesteigert ist, was zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren der allgemeinen Struktur: HOOC-(CH2)n-OH, HOOC-(CnH2n-2)-CH2OH, COOC-(CnH2n-4)-CH2OH oder HOOC-(CnH2n-6)-CH2OH, mit n im Bereich von 6 bis 18, aus einem hydrophoben Substrat.
  • Die Erfindung umfasst auch einen Hefestamm der Art Y. lipolytica zur mikrobiellen Produktion von Dicarbonsäuren aus n-Alkanen und Fettsäuren (und anderen hydrophoben Substraten) der eine Verringerung der Aktivitäten der Acyl-CoA-Oxidasen (namentlich POX1: YALI0E32835g, POX2: YALI0F10857g, POX3: YALI0D24750g, POX4: YALI0E27654g, POX5: YALI0C23859g, POX6: YALI0E06567g) aufweist und dadurch gekennzeichnet ist, dass in diesem Hefestamm zusätzlich die Aktivitäten relevanter (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen (namentlich ausgewählt aus FADH: YALI0F09603g, ADH1: YALI0D25630g, ADH2: YALI0E17787g, ADH3: YALI0A16379g, ADH4: YALI0E15818g, ADH5: YALI0D02167g, ADH6: YALI0A15147g und/oder ADH7: YALI0E07766g) und die Aktivitäten relevanter (Fett)Alkohol-Oxidasen (namentlich FAO1: YALI0B14014g) erhöht sind, was zu einer gesteigerten Bildung von Dicarbonsäuren, vorzugsweise gemäß der allgemeinen Struktur: HOOC-(CH2)n-COOH, HOOC-(CnH2n-2)-COOH, COOC-(CnH2n-4)-COOH oder HOOC-(CnH2n-6)-COOH, mit n im Bereich von 6 bis 18, vorzugsweise im Bereich von 8 bis 16, aus n-Alkanen und Fettsäuren (und anderen hydrophoben Substraten) führt.
  • Der erfindungsgemäße Hefestamm zur Produktion von Dicarbonsäuren weist vorzugsweise eine Deletion der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 auf. Außerdem weist er eine erhöhte Aktivität der Produkte von FADH, ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7 und/oder FAO1 auf. Weiterhin ist die Bildung der Fettkörperchen verringert, vorzugsweise durch die Verringerung der Aktivität der Genprodukte von PAH1 und/oder SCT1.
  • Besonders vorteilhaft verstärkt die Aktivitätssteigerung der Genprodukte von FADH, ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7 und/oder FAO1 die weitere Oxidation der ω-Hydroxyfettsäuren zum Fettsäurealdehyd, bzw. zur Dicarbonsäure im Rahmen der ω-Oxidation von Fettsäuren, so dass die gewünschte Dicarbonsäuren verstärkt gebildet wird.
  • Unter einer erhöhten Aktivität eines Proteins ist vorzugsweise zu verstehen, dass die Aktivität pro Zelle erhöht ist, was durch die Steigerung der Proteinmenge oder durch die Steigerung der proteineigenen Aktivität erzielt werden kann. Die Steigerung der Proteinmenge ist dadurch gekennzeichnet, dass mehr Protein gebildet wird, als bei einem unveränderten Stamm unter gleichen Bedingungen. Die Steigerung der proteineigenen Aktivität ist dadurch gekennzeichnet, dass die gleiche Menge an Protein in einem veränderten Stamm eine höhere Aktivität aufweist als in einem unveränderten Stamm.
  • Eine erhöhte Aktivität der Proteine kann auf verschiedene Weise erzeugt werden:
    • (i) durch Einbringen des relevanten Gens in mehrfacher, vorzugsweise 8 bis 12facher, Kopie in das Genom des Organismus (Gen-Dosis-Effekt)
    • (ii) durch Austausch des natürlichen Promotors des relevanten Gens durch einen stärkeren als den natürlichen Promotor, vorzugsweise einen Promotor, der mindestens 50% der Aktivität des Promotors des Translationselongationsfaktor 1 alpha-Gens (TEF1: YALI0C09141g) besitzt, höchstvorzugsweise einen Promotor, der mindestens die Aktivität des TEF1-Promotors besitzt. Dabei können Promotoren gewählt werden, die entweder während der gesamten Kultivierung oder nur in einer gewünschten Wachstumsphase aktiv sind (Gen-Regulations-Effekt).
  • Bei der Aktivitätserhöhung wird das zusätzliche Einbringen des relevanten Gens unter Kontrolle eines starken Promotors besonders bevorzugt, vorzugsweise der TEF1-Promotor aus Yarrowia lipolytica.
  • Erfindungsgemäß sind die Hefestämme der Art Y. lipolytica zur Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren bzw. von Dicarbonsäuren nicht zum Abbau von Fettsäuren im Rahmen der β-Oxidation befähigt. Dies kann beispielsweise durch folgende Maßnahmen gewährleistet werden:
    • (i) Verringerung der Aktivität der Acyl-CoA-Oxidasen (POX1: YALI0E32835g, POX2: YALI0F10857g, POX3: YALI0D24750g, POX4: YALI0E27654g, POX5: YALI0C23859g, POX6: YALI0E06567g)
    • (ii) Verhinderung der Peroxisomenbiogenese, z.B. durch Verringerung der Aktivität der Peroxine (z.B. PEX10: YALI0C01023g)
  • Für die Produktion von ω-Hydroxyfettsäuren muss zusätzlich zur Verhinderung der β-Oxidation die Oxidation der ω-Hydroxyfettsäuren zum Fettsäure-Aldehyd, bzw. zur Dicarbonsäure im Rahmen der ω-Oxidation verhindert oder verringert werden. Dies kann folgendermaßen gewährleistet werden:
    • (i) Verringerung der Aktivität relevanter (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen (FADH: YALI0F09603g, ADH1: YALI0D25630g, ADH2: YALI0E17787g, ADH3: YALI0A16379g, ADH4: YALI0E15818g, ADH5: YALI0D02167g, ADH6: YALI0A15147g, ADH7: YALI0E07766g)
    • (ii) Verringerung der Aktivität relevanter (Fett-)Alkohol-Oxidasen (FAO1: YALI0B14014g)
  • Bevorzugt wird die Produktausbeute ferner durch die direkte Beeinflussung relevanter Stoffwechselwege erhöht, insbesondere sind diese:
    • (i) die Erhöhung der Aktivität der Cytochrom P450-Genprodukte (ALK1: YALI0E25982g, ALK2: YALI0F01320g, ALK3: YALI0A20130g, ALK4: YALI0B13816g, ALK5: YALI0B13838g, ALK6: YALI0B01848g, ALK7: YALI0A15488g, ALK8: YALI0C12122g, ALK9: YALI0B06248g, ALK10: YALI0B20702g, ALK11: YALI0C10054g, ALK12: YALI0A20130g)
    • (ii) die Erhöhung der Aktivität der NADPH-Cytochrom P450-Reduktase (CPR1: YALI0D04422g)
  • Nur für die Produktion von Dicarbonsäuren:
    • (iii) die Erhöhung der Aktivität relevanter (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen (FADH: YALI0F09603g, ADH1: YALI0D25630g, ADH2: YALI0E17787g, ADH3: YALI0A16379g, ADH4: YALI0E15818g, ADH5: YALI0D02167g, ADH6: YALI0A15147g, ADH7: YALI0E07766g)
    • (iv) die Erhöhung der Aktivität relevanter (Fett-)Alkohol-Oxidasen (FAO1: YALI0B14014g)
    • (v) die Erhöhung der Aktivität relevanter (Fett-)Aldehyd-Dehydrogenasen (FALDH1: YALI0A17875g, FALDH2: YALI0E15400g, FALDH3: YALI0B01298g, FALDH4: YALI0F23793g)
  • Im Rahmen unserer Untersuchungen wurde festgestellt, dass die Zellen im Verlauf der Kultivierung sehr große Fettkörperchen (Lipid bodies) bilden. Es ist davon auszugehen, dass die Fettsäuren (oder intrazellulär vorliegende Derivate dieser) mit Glycerol verestert und intrazellulär in den Fettkörperchen gespeichert werden. Dies verringert die letztendlich erzielte Produktausbeute.
  • Vorzugsweise führen gentechnische Veränderungen zu einer Ausbildung kleinerer Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Produktausbeute, insbesondere sind diese:
    • (i) die Verringerung der Aktivität der Phosphatidsäure-Dephosphohydrolase (PAH1: YALI0D27016p)
    • (ii) die Verringerung der Aktivität der Phospholipid-Diacylglycerol-Acyltransferase (LRO1: YALI0E16797g)
    • (iii) die Verringerung der Aktivität der Diacylglycerol-Acyltransferase (DGA1: YALI0E32769g)
    • (iv) die Verringerung der Aktivität der Glycerol-3-phosphat-Acyltransferase (SCT1: YALI0C00209g)
    • (v) die Erhöhung der Aktivität der Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase (GUT2: YALI0B13970g)
    • (vi) die Erhöhung der Aktivität der Triacylglycerol-Lipasen (TGL3/TGL4: YALI0F10010g, YALI0D16379g, YALI0D17534g)
  • Insbesondere die Verringerung der Aktivität der Phosphatidsäure-Dephosphohydrolase, der Diacylglycerol-Acyltransferase und/oder der Glycerol-3-phosphat-Acyltransferase führen zu einer gesteigerten Produktausbeute, d.h. Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren bzw. Dicarbonsäuren.
  • Weiterhin werden der Transport der Substrate in die Zelle bzw. die jeweiligen Organellen (Peroxisomen, Endoplasmatisches Retikulum) sowie der Transport der Produkte (ω-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren) aus der Zelle bzw. aus den jeweiligen Organellen gesteigert. Dies kann beispielsweise durch die Erhöhung der Aktivität spezifischer Transporter gewährleistet werden.
  • Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung führt die Kombination mehrerer vorgenannter gentechnischer Veränderungen zu einer gesteigerten Produktausbeute, einem gesteigerten Ertrag und/oder einer gesteigerten Raum-Zeit-Ausbeute.
  • Als Ausgangsstamm für die Konstruktion eines erfindungsgemäßen Stammes kann ein Wildtypisolat der Hefe Y. lipolytica verwendet werden, vorzugsweise der Stamm H222. Der Stamm H222 wurde am 29.04.2013 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 27185 gemäß Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt.
  • Zur Verwendung eines Stammes für die weitere gentechnische Bearbeitung ist ein Selektionsmarker notwendig. Dieser Selektionsmarker kann z.B. in Form der Uracilauxotrophie in an sich bekannter Weise in den Stamm eingebracht werden. Alternativ kann auf bereits bekannte uracilauxotrophe Stämme zurückgegriffen, vorzugsweise auf den Stamm H222-S4 (Mauersberger S, Wang HJ, Gaillardin C, Barth G & Nicaud JM (2001) J Bacteriol 183: 5102–5109.).
  • Eingebracht werden zusätzliche Gene oder Konstrukte, die vorhandene Gene ersetzen, vorzugsweise mittels üblicher Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Um eine effiziente Transkription der eingebrachten Gene zu gewährleisten, ist es bevorzugt, für den Organismus funktionierende Promotoren mit dem offenen Leserahmen der Gene zu verknüpfen. Hierbei können sowohl konstitutive Promotoren als auch von den Kultivierungsbedingungen abhängige Promotoren genutzt werden.
  • Bevorzugt sind die eingebrachten Gene, die für die genannten Enzyme kodieren, funktionell unter die Kontrolle eines konstitutiven Promotors gestellt, wobei die Promotoren identisch oder untereinander unterschiedlich sein können.
  • Vorzugsweise werden konstitutive Promotoren genutzt. Besonders bevorzugt wird der Promotor des Translationselongationsfaktors 1 alpha (pTEF1) verwendet.
  • Alternativ bevorzugt werden die eingebrachten Gene unter die Kontrolle eines, von den Kultivierungsbedingungen abhängigen Promotors gestellt. Vorzugsweise aktivieren Aktivatoren bzw. Induktoren den von den Kultivierungsbedingungen abhängigen Promotor (im Sinne der Anmeldung auch Operator genannt), indem sie direkt mit einem regulierbaren Promotor interagieren bzw. in dem sie an ein Repressorprotein binden, das sich daraufhin vom Promotor löst. Durch das Kontaktieren des erfindungsgemäßen Hefestamms mit einem Aktivator und/oder Induktor werden die o.g. Enzyme in dem erfindungsgemäßen Hefestamm synthetisiert und stehen somit für die biokatalytische Umsetzung eines hydrophoben Substrates, insbesondere eines entsprechenden n-Alkans oder einer Fettsäure, zur Verfügung.
  • In einer Ausgestaltung der Erfindung unterscheiden sich die von den Kultivierungsbedingungen abhängigen Promotoren voneinander, sodass die Promotoren Primärsignal-spezifisch aktivierbar sind. Vorteilhaft kann somit die Anwesenheit unterschiedlicher Aktivatoren und/oder Induktoren in dem Hefestamm zur Expression ausgewählter Gene führen, wodurch der Stress für eine rekombinante Hefezelle minimiert wird.
  • Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen für Promotoren (bspw. pTEF1, pPOX2, pPOT1, pXPR1, pICL1), die für ein erfindungsgemäßes Verfahren eingesetzt werden können, sind dem Fachmann bestens bekannt oder können bekannten Datenbanken entnommen werden. Vorteilhaft können für ein erfindungsgemäßes Verfahren neben künstlich in Organismen eingebrachte Promotoren ebenfalls natürliche Promotoren eingesetzt werden.
  • Ebenso ist es bevorzugt, den offenen Leserahmen der Gene mit einem Terminator zu versehen. Vorzugsweise wird der Terminator des Gens der Isocitratlyase (ICL1t) verwendet.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren, vorzugsweise gemäß der allgemeinen Struktur: HOOC-(CH2)n-CH2OH, HOOC-(CnH2n-2)-CH2OH, COOC-(CnH2n-4)-CH2OH oder HOOC-(CnH2n-6)-CH2OH, mit n im Bereich von 6 bis 18, vorzugsweise im Bereich von 8 bis 16, aus einem hydrophoben Substrat, das die folgenden Schritte umfasst:
    • a) Bereitstellung von Hefezellen mindestens eines Hefestamms der Art Y. lipolytica, der (i) eine Verringerung der Aktivitäten der Acyl-CoA-Oxidasen, (ii) eine reduzierte Aktivität relevanter (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen und (iii) eine reduzierte Aktivität relevanter (Fett-)Alkohol-Oxidasen aufweist, in einem geeigneten Kultivierungsmedium,
    • b) Kontaktieren der Hefezellen mit dem hydrophoben Substrat, wobei das hydrophobe Substrat mit mindestens einem der Enzyme der Hefezellen, ausgewählt aus der Gruppe, (i) Cytochrom P450-Genprodukte, (ii) NADPH-Cytochrom P450-Reduktase und (iii) (Fett-)Aldehyd-Dehydrogenasen zu dem Reaktionsprodukt ω-Hydroxyfettsäure umgesetzt wird
    • c) Isolierung der ω-Hydroxyfettsäure.
  • Besonders bevorzugt ist die ω-Hydroxyfettsäure eine lineare ω-Hydroxyfettsäure gemäß der allgemeinen Struktur: HOOC-(CH2)n-CH2OH mit n im Bereich von 8 bis 16.
  • Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur biokatalytischen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren kann vorgesehen sein, dass die Umsetzung zu dem Reaktionsprodukt ω-Hydroxyfettsäure zusätzlich mit in den verwendeten Hefezellen verbleibenden (Fett-)Alkohol-Oxidasen, (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen erfolgt.
  • Bevorzugt sind die Hefezellen mindestens eines Hefestamms in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren der Art Y. lipolytica ausgewählt aus dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren.
  • Überraschend hat sich gezeigt, dass nach der biokatalytischen Umsetzung des hydrophoben Substrates zu dem gewünschten Reaktionsprodukt ω-Hydroxyfettsäuren diese in den erfindungsgemäßen Hefezellen eines Hefestamms der Art Y. lipolytica nicht weiter verstoffwechselt (d.h. im Stoffwechsel des Ganzzellkatalysators abgebaut) werden und sich in der wässrigen Komponente anreichern. Vorteilhaft reichert sich die ω-Hydroxyfettsäure in Folge des Ausschleusens aus den Hefezellen in dem Kultivierungsmedium an.
  • Bevorzugt erfolgt das Kontaktieren des Hefestamms mit einem hydrophoben Substrat durch direkte Zugabe zur flüssigen Komponente in Form als Flüssigkeit und/oder Feststoff. Bei direkter Zugabe zum Hefestamm kann zudem eine organische Phase als Substratreservoir Anwendung finden, wodurch die Prozesslaufzeit optimiert werden kann.
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter einem hydrophoben Substrat ein an sich wasserunlöslicher Stoff verstanden, aufweisend ein gegebenenfalls verzweigtes und/oder ungesättigtes Kohlenwasserstoffgrundgerüst mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt ist das hydrophobe Substrat ausgewählt aus der Gruppe der n-Alkane der allgemeinen Struktur: H3C-(CH2)n-CH3 (bspw. Dodekan, Pentadekan, Hexadekan) oder Alkene der allgemeinen Struktur H3C-(CnH2n-2)-CH3, H3C-(CnH2n-4)-CH3 oder H3C-(CnH2n-6)-CH3, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 6 bis 18 ist, der gegebenenfalls verzweigten gesättigten Fettsäuren der allgemeinen Struktur: HOOC-(CH2)n-CH3, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 6 bis 18 ist (bspw. Dodekansäure, Hexadekansäure, Pentadekansäure, Phytansäure), der ungesättigten Fettsäuren der allgemeinen Struktur: HOOC-(CnH2n-2)-CH3, COOC-(CnH2n-4)-CH3 oder HOOC-(CnH2n-6)-CH3, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 6 bis 18 ist (bspw. Ölsäure, Linolsäure, Arachidonsäure), und Fettsäurealkylester der allgemeinen Struktur: ROOC-(CH2)n-CH3, mit n im Bereich von 6 bis 18 und wobei R ein gegebenenfalls verzweigter C1-4-Alkylrest ist.
  • Insbesondere bevorzugt aber nicht ausschließlich dienen vorgenannte n-Alkane, Alkene oder gesättigte bzw. ungesättigte Fettsäuren mit einer Kettenlänge (Anzahl der Kohlenstoffatome der längsten Kette) von acht bis achtzehn Kohlenstoffatomen, d.h. n im Bereich von 6 bis 16 als hydrophobes Substrat für die Biokonversion.
  • Nach einer alternativ bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung dienen für die Biokonversion vorzugsweise aber nicht ausschließlich n-Alkane und Fettsäuren mit einer Kettenlänge von acht bis achtzehn Kohlenstoffatomen, d.h. n im Bereich von 6 bis 16, als hydrophobes Substrat.
  • Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt die Konzentration des hydrophoben Substrats zu Beginn der Herstellung 1 bis 50 Gramm pro Liter Kulturmedium (g l–1), besonders bevorzugt sind 5 bis 40 g l–1.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Dicarbonsäuren, vorzugsweise gemäß der allgemeinen Struktur: HOOC-(CH2)n-COOH, HOOC-(CnH2n-2)-COOH, COOC-(CnH2n-4)-COOH oder HOOC-(CnH2n-6)-COOH, mit n im Bereich von 6 bis 18 vorzugsweise im Bereich von 8 bis 16, aus einem hydrophoben Substrat, insbesondere ausgewählt aus n-Alkanen und Fettsäuren, das die folgenden Schritte umfasst:
    • a) Bereitstellung von Hefezellen mindestens eines Hefestamms der Art Y. lipolytica, der (i) eine Verringerung der Aktivitäten der Acyl-CoA-Oxidasen, (ii) eine erhöhte Aktivität relevanter (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen und (iii) eine erhöhte Aktivität relevanter (Fett-)Alkohol-Oxidasen aufweist, in einem geeigneten Kultivierungsmedium,
    • b) Kontaktieren der Hefezellen mit dem hydrophoben Substrat, wobei das hydrophobe Substrat mit mindestens einem der Enzyme der Hefezellen, ausgewählt aus der Gruppe, (i) der Cytochrom P450-Genprodukte, (ii) der NADPH-Cytochrom P450-Reduktase, (iii) der (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen nach a), (iv) der (Fett-)Alkohol-Oxidasen nach a) und (v) (Fett-)Aldehyd-Dehydrogenase, zu dem Reaktionsprodukt Dicarbonsäure umgesetzt wird,
    • c) Isolierung der Dicarbonsäure.
  • Besonders bevorzugt ist die Dicarbonsäure eine lineare Dicarbonsäure gemäß der allgemeinen Struktur: HOOC-(CH2)n-CH2OH mit n im Bereich von 8 bis 16.
  • Bevorzugt sind in den Hefezellen für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren zusätzlich die Aktivitäten einzelner oder aller Cytochrom P450-Genprodukte, insbesondere von ALK1: YALI0E25982g, ALK2: YALI0F01320g, ALK3: YALI0A20130g, ALK4: YALI0B13816g, ALK5: YALI0B13838g, ALK6: YALI0B01848g, ALK7: YALI0A15488g, ALK8: YALI0C12122g, ALK9: YALI0B06248g, ALK10: YALI0B20702g, ALK11: YALI0C10054g und/oder ALK12: YALI0A20130g erhöht. Vorteilhaft führt die Erhöhung einzelner oder aller Cytochrom P450-Genprodukte zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren.
  • Es kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass in den Hefezellen für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren zusätzlich die Aktivität der NADPH-Cytochrom P450-Reduktase (CPR1: YALI0D04422g) erhöht ist, was zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren, führt.
  • Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Dicarbonsäuren sind in den Hefezellen zusätzlich die Aktivitäten relevanter (Fetts-)Alkohol-Dehydrogenasen (namentlich FADH: YALI0F09603g, ADH1: YALI0D25630g, ADH2: YALI0E17787g, ADH3: YALI0A16379g, ADH4: YALI0E15818g, ADH5: YALI0D02167g, ADH6: YALI0A15147g, ADH7: YALI0E07766g) erhöht, was vorteilhaft zu einer gesteigerten Bildung von Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Bevorzugt sind in den Hefezellen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Dicarbonsäuren zusätzlich die Aktivitäten relevanter (Fett-)Alkohol-Oxidasen (FAO1: YALI0B14014g) erhöht, was zu einer gesteigerten Bildung von Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt
  • Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Dicarbonsäuren, sind in den Hefezellen zusätzlich die Aktivitäten relevanter (Fett-)Aldehyd-Dehydrogenasen (FALDH1: YALI0A17875g, FALDH2: YALI0E15400g, FALDH3: YALI0B01298g, FALDH4: YALI0F23793g) erhöht, was zu einer gesteigerten Bildung von Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Bevorzugt liegen die Ausbeuten von ω-Hydroxyfettsäuren bzw. Dicarbonsäuren in dem erfindungsgemäßen Verfahren für den Zeitraum von einem Tag (d.h. 24 h) im Bereich von 1 bis 20 g l–1, besonders bevorzugt im Bereich von 4 bis 15 g l–1.
  • Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren in einem Bioreaktor (Fermenter), in dem ein erfindungsgemäßer Hefestamm unter geeigneten Wachstumsbedingungen in einem geeigneten Kultivierungsmedium fermentiert wird.
  • Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus in an sich bekannter Art und Weise in einem Bioreakor (Fermenter) kultiviert wird.
  • Bevorzugt erfolgt die Isolierung des Reaktionsproduktes ω-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren durch Extraktion der wässrigen Komponente mit einem organischen Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe der Phthalsäureester, besonders bevorzugt Ethylacetat, 1,2-Cyclo-hexandicarbonsäurediisononylester und Mesamoll®, und/oder der aliphatischen verzweigten und/oder linearen Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit 5 bis 16 Kohlenstoffatomen, wie z.B. n-Pentan, Cyclopentan, n-Hexan, Cyclohexan, n-Heptan, n-Octan, Cyclooctan, n-Dekan, n-Dodekan oder n-Hexadekan. Bevorzugt dienen die genannten organischen Lösungsmittel in einem einphasigen, wässrigen System zur Extraktion nach dem Umsatz des hydrophoben Substrates. Alternativ dienen die genannten organischen Lösungsmittel in einem zweiphasigen System in Form einer zweiten Phase neben dem Kultivierungsmedium als Reservoir für das hydrophobe Substrat und/oder zur Abtrennung des Reaktionsprodukts.
  • Die Isolierung der Dicarbonsäuren und/oder ω-Hydroxyfettsäuren durch Extraktion der wässrigen Komponente mit einem organischen Lösungsmittel erfolgt vorzugsweise nach der Abtrennung der Hefezellen in Form von Biomasse von dem Kultivierungsmedium, wobei die Abtrennung der Hefezellen in Form von Biomasse von dem Kultivierungsmedium bevorzugt durch Zentrifugation oder Filtration erfolgt.
  • Bevorzugt erfolgt die Extraktion von den Reaktionsprodukten ω-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren mit einem organischen Lösungsmittel bei einem pH-Wert zwischen 0 und 8, besonders bevorzugt zwischen 1 und 7, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und 6.
  • Gegebenenfalls erfolgt zur Reinigung der Dicarbonsäuren und/oder ω-Hydroxyfettsäuren im Anschluss an die Extraktion eine Destillation, wobei bevorzugt das organische Lösungsmittel abgetrennt wird. Bevorzugt erfolgt die Abtrennung des organischen Lösungsmittels durch Verdampfung bei einem Druck zwischen 0,1 und 1000 mbar, besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 750 mbar, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und 400 mbar.
  • Bevorzugt ist in einem Hefestamm für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren bzw. Dicarbonsäuren zusätzlich die Aktivität der Phosphatidsäure-Dephosphohydrolase (PAH1: YALI0D27016p) verringert. Vorteilhaft führt dies zu einer Reduzierung der Größe der Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren.
  • Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren bzw. Dicarbonsäuren ist in dem eingesetzten Hefestamm zusätzlich die Aktivität der Glycerol-3-phosphat-Acyltransferase (SCT1: YALI0C00209g) verringert, was vorteilhaft zu einer Reduzierung der Größe der Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren (und anderen hydrophoben Substraten) führt.
  • Es kann ferner auch vorgesehen sein, dass in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Dicarbonsäuren bzw. ω-Hydroxyfettsäuren in den Hefezellen des eingesetzten Hefestamms zusätzlich die Aktivität der Phospholipid-Diacylglycerol-Acyltransferase (LRO1: YALI0E16797g) verringert ist, was zu einer Reduzierung der Größe der Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist in dem erfindungsgemäßen Hefestamm zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren bzw. Dicarbonsäuren zusätzlich die Aktivität der Diacylglycerol-Acyltransferase (DGA1: YALI0E32769g) verringert, was zu einer Reduzierung der Größe der Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren bzw. Dicarbonsäuren ist in den Hefezellen des entsprechend eingesetzten Hefestamms zusätzlich die Aktivität der Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase (GUT2: YALI0B13970g) erhöht, was zu einer Reduzierung der Größe der Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Besonders vorteilhaft wurde nun gefunden, dass die zusätzlich Erhöhung der Aktivitäten relevanter Triacylglycerol-Lipasen (TGL3/TGL4: YALI0F10010g, YALI0D16379g, YALI0D17534g) in den verwendeten Hefezellen zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren bzw. Dicarbonsäuren, zu einer Reduzierung der Größe der Fettkörperchen und somit zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Bevorzugt ist in den Hefezellen des für das erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren bzw. Dicarbonsäuren verwendeten Hefestamms zusätzlich der Transport der hydrophoben Substrate in die Hefezelle bzw. die jeweiligen Organellen (Peroxisomen, Endoplasmatisches Retikulum), z.B. durch die erhöhte Aktivität spezifischer Membrantransporter, gesteigert ist, was zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren führt.
  • Optional kann vorgesehen sein, dass in den Hefezellen zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren bzw. Dicarbonsäuren zusätzlich der Transport von ω-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren aus der Hefezelle bzw. aus dem Endoplasmatisches Retikulum ins Cytoplasma, z.B. durch die erhöhte Aktivität spezifischer Membrantransporter, gesteigert ist, was zu einer gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren oder Dicarbonsäuren aus dem entsprechenden hydrophoben Substrat, insbesondere n-Alkanen und Fettsäuren und Anreicherung in dem Kulturmedium führt.
  • Besonders vorteilhaft hat sich die die Verringerung der Aktivität des Citrat- und Oxalacetat-Transporters (YHM2: YALI0B10736g) und/oder die Verringerung der Aktivität des Citrat-Transport-Proteins (CTP1: YALI0F26323g) in den Hefezellen für das erfindungsgemäße Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren bzw. Dicarbonsäuren herausgestellt, da dadurch eine geringere Mengen an organischen Säuren produziert und/oder ins Kulturmedium sekretiert wird.
  • Bevorzugt ist das Kultivierungsmedium ein Minimalmedium. Unter einem Minimalmedium wird im Sinne der vorliegenden Erfindung ein wässriges Kulturmedium verstanden, welches alle zum Wachstum der Hefezellen benötigten Substrate (bspw. C-Quelle, Mineralsalze, Spurenelemente, Vitamine) in gelöster Form enthält, welches aber zugleich keine komplexen Inhaltsstoffe bzw. komplexen Biomolekülen (bspw. Hefeextrakt, Pepton, Trypton usw.) aufweist. Dem Fachmann ist aus dem Stand der Technik eine Vielzahl von Minimalmedien zur Kultivierung von Hefezellen bekannt.
  • Neben dem angebotenen hydrophoben Substrat für die Biokonversion ist während der Kultivierung eine weitere Kohlenstoffquelle (C-Quelle; Substrat für die Energiegewinnung), auf deren Grundlage die Zelle Energie gewinnen kann, bereitzustellen.
  • Vorzugsweise sind dem Kultivierungsmedium daher als C-Quelle Mono- bzw. Disaccharide, bspw. Glukose, D-Fructose, Xylose, Maltose, Saccharose und/oder mehrwertige Alkohole, wie bspw. Glycerol, Rohglycerol und Mannit zugesetzt, besonders bevorzugt ist die zugesetzte Kohlenstoffquelle Glucose.
  • Insbesondere dient als Stickstoffquelle (N-Quelle) für die Kultivierung von Hefestämmen in dem erfindungsgemäßen Verfahren Ammonium/Ammoniak oder Aminosäuren wie Glutamin/Glutamat.
  • Bei der Kultivierung eines erfindungsgemäßen Stammes sind Kultivierungsbedingungen, unter denen die Fettkörperchen vergleichsweise gering und die Umsatzrate der angebotenen Substrate vergleichsweise groß ausgeprägt sind, zu bevorzugen. Eine Limitierung des Wachstums der Zellen verhindert, dass zu große Mengen des eingesetzten Substrates in den Zellen gespeichert werden, was die Produktausbeute verringert, und dass eine Sauerstofflimitierung eintritt, die die Produktivität vermindert.
  • Eine mögliche Form der Limitierung ist die Stickstofflimitierung. Diese Limitierung führt in der Hefe Y. lipolytica zu einem Wachstumsstopp nach Aufbrauchen der Stickstoffquelle und zur Bildung von Citronensäure und Iso-Citronensäure. Vorzugsweise sollte der Stickstoffgehalt im Medium während der Produktionsphase, also nach dem Kontaktieren der Hefezellen mit dem hydrophoben Substrat, kleiner als 2 g l–1, vorzugsweise kleiner als 1 g l–1, hoch vorzugswiese kleiner 0,5 g l–1, höchst vorzugsweise 0 g l–1 sein. Die Produktionsphase ist dadurch gekennzeichnet, dass sie sich einer Phase starken Wachstums (Wachstumsphase) anschließt und nur noch (im Vergleich zur Wachstumsrate) geringes Wachstum, jedoch erhöhte Produktbildung aufweist.
  • Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung im Fermenter unter kontrollierten Prozessparametern, wobei besonders bevorzugt der pH-Wert im Kultivierungsmedium (während einer bestimmten Wachstumsphase) konstant gehalten wird. Insbesondere bevorzugt erfolgt die Fermentation unter Limitationsbedingungen.
  • Der pH-Wert im Kultivierungsmedium sollte, nach dem Kontaktieren, also während der Wachstumsphase dem physiologisch bevorzugten von 5,5 entsprechen und während der Produktionsphase, also nach dem Kontaktieren der Hefezellen mit dem hydrophoben Substrat, vorzugsweise 5,5–9,0, besonders bevorzugt 7,0–9,0 und insbesondere bevorzugt 8,0 betragen.
  • Bevorzugt erfolgt die Kultivierung der Hefezellen unter physiologischen Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 0 und 60°C, bevorzugt zwischen 10 und 50°C, besonders bevorzugt zwischen 20 und 40°C, wobei der pH-Wert des Kultivierungsmediums zwischen 2,0 und 9,0, bevorzugt zwischen 5,5 und 9,0, besonders bevorzugt zwischen 7,0 und 9,0, insbesondere bevorzugt um die 8,0 liegt.
  • Vorzugsweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren die genannten Limitationsbedingungen miteinander kombiniert.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur biokatalytischen Herstellung von Dicarbonsäuren oder ω-Hydroxyfettsäuren enthaltend:
    • a) mindestens einen Typ an Hefezellen, bevorzugt ein Typ erfindungsgemäß modifizierter Hefezellen des Hefestamms der Art Y. lipolytica in einer wässrigen Komponente und/oder
    • b) mindestens einen Typ kryokonservierter Hefezellen, bevorzugt eines Typs erfindungsgemäß modifizierter Hefezellen des Hefestamms der Art Y. lipolytica.
  • Die Biomasse in Form von Hefezellen für das erfindungsgemäße Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von Dicarbonsäuren oder ω-Hydroxyfettsäuren kann durch eine dem Fachmann bekannte Weise der Vorkultivierung der entsprechend einzusetzenden Hefezellen (Anzucht auf Vollmedium und/oder Minimalmedium) erhalten werden, beispielsweise durch Kultivierung in Vollmedium, wie YPD-Medium (DSM-Medium No. 393), vorzugsweise jedoch durch Kultivierung in einem Medium, das die Erzeugung hoher Zelldichten, beispielsweise durch Kultivierung in Minimalmedium (bspw. 5 % (w/v) Glucose, 20 g l–1 CaCO3, 1 g l–1 KH2PO4, 0,16 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 3 g l–1 (NH4)2SO4, 0,7 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 0,5 g l–1 NaCl, 0,4 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 0,5 mg l–1 H3BO3, 0,04 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,1 mg l–1 KI, 0,4 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,2 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,4 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 6 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,3 mg l–1 Thiaminhydrochlorid) insbesondere größer als 1 × 109 Zellen pro ml, zulässt. Die Anzucht dieser Vorkultur der Hefezellen des erfindungsgemäßen Kits erfolgt vorzugsweise in laborüblichen Schüttelkolben, zur Erzeugung größerer Mengen an Biomasse ist aber auch die Anzucht unter kontrollierten Bedingungen im Fermenter möglich.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft auch die Verwendung erfindungsgemäß modifizierter Hefezellen des Hefestamms der Art Y. lipolytica, ein erfindungsgemäßes Verfahren oder eines erfindungsgemäßes Kits.
  • Bevorzugte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Kombinationen der Ansprüche oder einzelner Merkmale davon.
  • Nachfolgend soll die Erfindung anhand einiger Ausführungsbeispiele und zugehöriger Figuren eingehender erläutert werden. Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
  • Dabei zeigt:
  • 1: die Stoffwechselwege zum Abbau hydrophober Substrate durch Y. lipolytica.
  • 2: die Akkumulation von Dicarbonsäuren und ω-Hydroxyfettsäuren in Y. lipolytica H222ΔP, H222ΔPΔA und H222ΔPΔF unter Verwendung verschiedener hydrophober Substrate.
  • 3: die Biokonversion vom Pentadekansäure zu ω-Hydroxypentadekansäure durch Y. lipolytica H222ΔPΔF.
  • 4: die Ausbildung von Fettkörperchen bei Y. lipolytica H222ΔPΔF, H222ΔPΔFΔD, H222ΔPΔFΔH und H222ΔPΔFΔS.
  • 5: die Akkumulation von Dodekandisäure und ω-Hydroxydodekansäure bei der Kultivierung verschiedener Stämme der Hefe Y. lipolytica unter Verwendung von Dodekan als Substrat.
  • 6: die (Fett-)Alkohol-Dehydrogenase und -Oxidase-Enzymaktivität bei der Kultivierung verschiedener Stämme der Hefe Y. lipolytica unter Verwendung von Dodekan als Substrat.
  • 7: die Biokonversion vom Dodekan zu ω-Hydroxydodekansäure und Dodekandisäure durch Y. lipolytica H222ΔPΔF.
  • Erläuterungen zu den genetischen Veränderungen:
    • ∆P
      Deletion der Acyl-CoA-Oxidase-Gene (POX1-6)
      ∆F
      Deletion des (Fett-)Alkohol-Oxidase-Gens (FAO1)
      ∆A
      Deletion der (Fett-)Alkohol-Dehydrogenase-Gene (FADH, ADH1-7)
      ∆D
      Deletion des Diacylglycerol-Acyltransferase-Gens (DGA1)
      ∆H
      Deletion des Phosphatidsäure-Dephosphohydrolase-Gens (PAH1)
      ∆S
      Deletion der Glycerol-3-phosphat-Acyltransferase-Gens (SCT1)
      oC
      Überexpression des NADPH-Cytochrom P450-Reduktase-Gens CPR1
      oF
      Überexpression der (Fett-)Alkohol-OxidaseGens FAO1
  • Erläuterungen zum Sequenzprotokoll
    • SEQ ID NO. 1: DNA-Sequenz des Plasmids pJET1.2/blunt (Fermentas).
    • SEQ ID NO. 2: DNA-Sequenz des Plasmids pUCBM21 (Boehringer Ingelheim).
    • SEQ ID NO. 3: DNA-Sequenz des artifiziellen Plasmids pUC-Lys2-DK2.
    • SEQ ID NO. 5: DNA-Sequenz des artifiziellen Plasmids pINTB_HMG1.
  • Die 1 zeigt, dass n-Alkane in die Zelle aufgenommen und dann im Rahmen der primären Alkanoxidation zur korrespondierenden Fettsäure mit gleicher Kettenlänge umgewandelt werden. Die Fettsäuren werden dann im Rahmen der β-Oxidation zu Acetyl-CoA (bzw. Propionyl-CoA) abgebaut. Die diterminale Oxidation von Fettsäuren (ω-Oxidation) kann parallel stattfinden. Die Namen der gebildeten chemischen Substanzen sind ebenso angegeben wie die Bezeichnungen der beteiligten Enzyme und der korrespondierenden Gene. ALK1: YALI0E25982g, ALK2: YALI0F01320g, ALK3: YALI0A20130g, ALK4: YALI0B13816g, ALK5: YALI0B13838g, ALK6: YALI0B01848g, ALK7: YALI0A15488g, ALK8: YALI0C12122g, ALK9: YALI0B06248g, ALK10: YALI0B20702g, ALK11: YALI0C10054g, ALK12: YALI0A20130g, CPR1: YALI0D04422g, FADH: YALI0F09603g, ADH1: YALI0D25630g, ADH2: YALI0E17787g, ADH3: YALI0A16379g, ADH4: YALI0E15818g, ADH5: YALI0D02167g, ADH6: YALI0A15147g, ADH7: YALI0E07766g, ADH8: YALI0C12595g, FAO1: YALI0B14014g, FALDH1: YALI0A17875g, FALDH2: YALI0E15400g, FALDH3: YALI0B01298g, FALDH4: YALI0F23793g, FAA1: YALI0D17864g, POX1: YALI0E32835g, POX2: YALI0F10857g, POX3: YALI0D24750g, POX4: YALI0E27654g, POX5: YALI0C23859g, POX6: YALI0E06567g, MFE2: YALI0E15378g, POT1: YALI0E18568g.
  • In 2 wurden Y. lipolytica H222ΔP, H222ΔPΔA und H222ΔPΔF in Minimalmedium mit Glycerol und verschiedenen n-Alkanen und Fettsäuren (DD: Dodekan; DDS: Dodekansäure; PD: Pentadekan; PDS: Pentadekansäure; HD: Hexadekan; HDS: Hexadekansäure) im Schüttelkolben kultiviert (3 % (v/v) Glycerol + 0,5 % (v/v) Glycerol nach 48 h, 1 % (v/v) n-Alkan oder 1 % (v/v) Fettsäure, 20 g l–1 CaCO3, 17,3 g l–1 KH2PO4, 1,35 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 3 g l–1 (NH4)2SO4, 0,7 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 0,5 g l–1 NaCl, 0,4 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 0,5 mg l–1 H3BO3, 0,04 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,1 mg l–1 KI, 0,4 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,2 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,4 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 6 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,3 mg l–1 Thiaminhydrochlorid). Die Mengen der gebildeten Dicarbonsäuren und ω-Hydroxyfettsäuren (DDDS: Dodekandisäure; ω-HDDS: ω-Hydroxydodekansäure; PDDS: Pentadekandisäure; ω-HPDS: ω-Hydroxypentadekansäure; HDDS: Hexadekandisäure; ω-HHDS: ω-Hydroxyhexadekansäure) wurden nach 96 h Kultivierung mittels Gaschromatographie bestimmt.
  • Bei 3 wurde Y. lipolytica H222ΔPΔF in Minimalmedium mit Glucose und Pentadekansäure (PDS) als Kohlenstoffquellen im Schüttelkolben kultiviert (3 % (v/v) Glucose, 1 % (w/v) PDS, 17,3 g l–1 KH2PO4, 1,35 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 3 g l–1 (NH4)2SO4, 0,7 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 0,5 g l–1 NaCl, 0,4 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 0,5 mg l–1 H3BO3, 0,04 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,1 mg l–1 KI, 0,4 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,2 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,4 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 6 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,3 mg l–1 Thiaminhydrochlorid). Die Glucosekonzentration wurde durch regelmäßiges Nachfüttern (Pfeile) zwischen 2 und 3 % (w/v) gehalten. Nach 5 Tagen wurde 1 % (w/v) Pentadekansäure nachgefüttert. Die gebildeten Pentadekansäurederivate, ω-Hydroxypentadekansäure (ω HPDS) und Pentadekandisäure (PDDS), wurden mittels Gaschromatographie quantifiziert. Die Zellen wurden gegen Ende der Kultivierung mikroskopiert, wobei die Fettkörperchen mit Nilrot angefärbt wurden.
  • 4 zeigt die Kultivierung von Y. lipolytica H222ΔPΔF, H222ΔPΔFΔD, H222ΔPΔFΔH und H222ΔPΔFΔS in Minimalmedium mit Glucose und Pentadekansäure (PDS) als Kohlenstoffquellen (3% (v/v) Glucose, 1 % (w/v) PDS, 17,3 g l–1 KH2PO4, 1,35 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 3 g l–1 (NH4)2SO4, 0,7 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 0,5 g l–1 NaCl, 0,4 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 0,5 mg l–1 H3BO3, 0,04 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,1 mg l–1 KI, 0,4 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,2 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,4 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 6 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,3 mg l–1 Thiaminhydrochlorid). Die Glucosekonzentration wurde durch regelmäßiges Nachfüttern zwischen 2 und 3% (w/v) gehalten. Nach 3 Tagen wurde 1% (w/v) Pentadekansäure nachgefüttert. Die Zellen wurden nach 5 Tagen mikroskopiert, wobei die Fettkörperchen mit Nilrot angefärbt wurden (oben: lichtmikroskopische Aufnahme; unten: fluoreszenzmikroskopische Aufnahme).
  • In 5 wurden Y. lipolytica H222ΔP, H222ΔPΔA, H222ΔPΔF, H222ΔPΔAΔF, H222ΔPoF, H222ΔPoC, H222ΔPΔD, H222ΔPΔH, H222ΔPΔS, H222ΔPΔAΔFoC, H222ΔPΔAΔFΔD, H222ΔPΔAΔFΔH und H222ΔPΔAΔFΔS im Fermenter kultiviert. Als Kultivierungmedium diente hierbei Minimalmedium mit Glucose (5 % (w/v) Glucose, 1 g l–1 KH2PO4, 0,16 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 3 g l–1 (NH4)2SO4, 0,7 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 0,5 g l–1 NaCl, 0,4 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 0,5 mg l–1 H3BO3, 0,04 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,1 mg l–1 KI, 0,4 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,2 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,4 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 6 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,3 mg l–1 Thiaminhydrochlorid). Die Kultivierung erfolgte im Fermenter bei 28 °C. Die Sauerstoffsättigung wurde auf 55 % eingestellt. Die Zellen wurden mit einer OD600 von 1 inokuliert und für 24 h bei pH 5,5 (automatisierte Titration von HCl und NaOH) inkubiert. Dann wurden 15 g l–1 DD zugegeben und der pH wurde auf 8,0 eingestellt. Alle 24 h wurde Glucose zugegeben, um eine Endkonzentration von 5 % (w/v) einzustellen. Die Mengen der gebildeten Dodekandisäure (DDDS) und ω-Hydroxydodekansäure (ω-HDDS) wurden nach 2 d, 3 d und 4 d Kultivierung mittels Gaschromatographie bestimmt.
  • 6 zeigt die Enzymaktivitäten der (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen und -Oxidase in Zelllysaten der Stämme Yarrowia lipolytica H222ΔP, H222ΔPΔA, H222ΔPΔF, H222ΔPΔAΔF und H222ΔPoF. Die Zellen wurden wie in Beispiel 8 beschrieben kultiviert und nach drei Tagen geerntet und aufgeschlossen.
  • Bei 7 wurde Y. lipolytica H222ΔPΔF in Minimalmedium mit Glucose und Dodekan (DD) als Kohlenstoffquellen im Fermenter kultiviert (5 % (w/v) Glucose, 2 g l–1 KH2PO4, 0,32 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 6 g l–1 (NH4)2SO4, 1,4 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 1 g l–1 NaCl, 0,8 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 1 mg l–1 H3BO3, 0,08 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,2 mg l–1 KI, 0,8 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,4 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,8 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 12 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,6 mg l–1 Thiaminhydrochlorid). Die Glucosekonzentration wurde alle 24 h durch regelmäßiges Nachfüttern (Pfeile) auf 5–10 % (w/v) eingestellt. Nach 2 d wurde der pH auf 8,0 eingestellt und es wurden nach 2 d und 3 d 15 g l–1 Dodekan zugegeben. Alle 24 h wurde Glucose zugegeben, um eine Endkonzentration von 5–10 % (w/v) einzustellen.
  • Beispiel 1: Verhinderung des Abbaus von Fettsäuren durch Blockierung der β-Oxidation
  • Für die Konstruktion der Deletionskassetten für die POX-Gene wurde der jeweilige Promotor- und Terminator-Bereich durch PCR amplifiziert, wobei die Primer pXXX_fw/pXXX_rv und XXXt_fw/XXXt_rv genutzt wurden (XXX steht für das zu deletierende Gen). Als Template diente hierbei genomische DNA von Y. lipolytica H222. Durch Verwendung von Überhang-Primern wurde am Ende des Promotor- sowie am Anfang des Terminator-Bereichs eine I-SceI-Restriktionsschnittstelle eingefügt. Promotor- und Terminator-Fragment wurden durch Overlap-PCR mit dem Primern pXXX_fw und XXXt_rv miteinander fusioniert. Das Overlap-Fragment wurde anschließend in den Vektor pJET1.2/blunt (Fermentas; SEQ ID NO 1) ligiert. Das resultierende Plasmid wurde mit I-SceI geschnitten und die loxP-URA3-loxP-Kassette, die aus dem pJMP113-Plasmid (Fickers P, Le Dall MT, Gaillardin C, Thonart P & Nicaud JM (2003) New disruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeast Yarrowia lipolytica. J Microbiol Methods 55: 727–737.) unter Verwendung des Restiktionsenzyms I-SceI gewonnen wurde, wurde eingefügt.
  • Die jeweilige Deletionskassette wurde durch PCR oder Restriktion gewonnen und in Y. lipolytica H222-S4, der aus Y. lipolytica H222 hergestellt werden kann (Mauersberger, S., H. J. Wang, et al. (2001), J Bacteriol 183(17): 5102–5109), nach Barth und Gaillardin (Barth G & Gaillardin C (1996) Yarrowia lipolytica. Springer- Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.) transformiert.
  • Vor einer erneuten Transformation wurde der Marker mithilfe des Cre-lox-Rekombinationssystems zurückgewonnen (Fickers P, Le Dall MT, Gaillardin C, Thonart P & Nicaud JM (2003) New disruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeast Yarrowia lipolytica. J Microbiol Methods 55: 727–737.).
  • Die erfolgreiche Deletion eines Gens wurde durch PCR bestätigt, wobei die Primer pXXX_fw und XXXt_rv sowie pXXX_fw und XXXt_rv2 genutzt wurden. XXXt_rv2 bindet im Bereich des zu deletierenden Gens, jedoch außerhalb der Deletionskassette. Der Stamm, der die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 trug, wurde H222ΔP genannt und bildet die Grundlage für die Konstruktion von Stämmen, die zur biotechnologischen Produktion ω-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren genutzt werden können. Tabelle 1: zur Gewinnung und zum Nachweis der POX-Deletionskassetten
    Figure DE102014220186A1_0002
  • Beispiel 2: Verhinderung der Oxidation der ω-Hydroxyfettsäuren zum Fettsäure-Aldehyd, bzw. zur Dicarbonsäure im Rahmen der ω-Oxidation
  • Für die Konstruktion der Deletionskassetten für die (Fett-)Alkohol-Dehydrogenaseund -Oxidase-Gene wurde der jeweilige Promotor- und Terminator-Bereich durch PCR amplifiziert, wobei die Primer pXXX_fw/pXXX_rv und XXXt_fw/XXXt_rv genutzt wurden (XXX steht für das zu deletierende Gen). Als Template diente hierbei genomische DNA von Y. lipolytica H222.
  • Für die Konstruktion der Deletionskassetten für die Gene ADH1-ADH6 und FAO1 wurde durch Verwendung von Überhang-Primern am Ende des Promotor- sowie am Anfang des Terminator-Bereichs eine BamHI-Restriktionsschnittstelle eingefügt. Zusätzlich wurde am Anfang des Promotor-Bereichs eine HindIII-Restriktionsschnittstelle und am Ende des Terminator-Bereichs eine NdeI-Restriktionsschnittstelle (ADH1: NotI, FAO1: EcoRI) angefügt. Die Fragmente wurden in den Vektor pJET1.2/blunt (Fermentas; SEQ ID NO 1) oder pUCBM21 (Boehringer Ingelheim; SEQ ID NO 2) ligiert. Die so erhaltenen Plasmide wurden mit BamHI linearisiert und der URA-Blaster (TcR-URA3-TcR-Kassette), der aus dem Plasmid pUC-Lys2-DK2(SEQ ID NO 3) durch Restriktion mit BamHI und BglII gewonnen wurde, wurde eingefügt.
  • Für die Konstruktion des ADH7-Deletionsvektors wurde das vollständige Gen (inklusive des Promotor- und Terminator-Bereichs) mittels PCR amplifiziert, wobei die Primer pADH7_fw und ADH7t_rv verwendet wurden. Das erhaltene Fragment wurde in den Vektor pJET1.2/blunt (Fermentas; SEQ ID NO 1) ligiert, der offene Leserahmen des ADH7-Gens wurde durch Restriktion mit SanDI und NsiI entfernt und der URA-Blaster, der aus dem Plasmid pUC-Lys2-DK2 durch Restriktion mit SanDI und NsiI gewonnen wurde, wurde eingefügt.
  • Die jeweilige Deletionskassette wurde durch PCR oder Restriktion gewonnen und in Y. lipolytica H222-S4, der aus Y. lipolytica H222 hergestellt werden kann (Mauersberger, S., H. J. Wang, et al. (2001), J Bacteriol 183(17): 5102–5109), nach Barth und Gaillardin (Barth G & Gaillardin C (1996) Yarrowia lipolytica. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.) transformiert.
  • Vor einer erneuten Transformation wurde der Marker per FOA-Selektion (Boeke JD, LaCroute F & Fink GR (1984) Mol Gen Genet 197: 345–346.) zurückgewonnen. Die erfolgreiche Deletion eines Gens wurde durch PCR bestätigt, wobei die Primer pXXX_fw und XXXt_rv sowie pXXX_fw und XXXt_rv2 genutzt wurden. XXXt_rv2 bindet im Bereich des zu deletierenden Gens, jedoch außerhalb der Deletionskassette. Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch FADH, AHD1, AHD2, AHD3, AHD4, AHD5, AHD6 und AHD7 trug, wurde H222ΔPΔA genannt.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch FAO1 trug, wurde H222ΔPΔF genannt. Tabelle 2: zur Gewinnung und zum Nachweis der (F)ADH- und FAO-Deletionskassetten
    Figure DE102014220186A1_0003
    Figure DE102014220186A1_0004
  • Beispiel 3: Vergleichende Kultivierung verschiedener Produktionsstämme im Schüttelkolben
  • Um zu überprüfen, ob die erzeugten Ausgangsstämme Yarrowia lipolytica H222ΔP, H222ΔPΔA und H222ΔPΔF zur Produktion größerer Mengen an ω-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren befähigt sind, wurden diese in Minimalmedium mit Glycerol und verschiedenen n-Alkanen (Dodekan, Pentadekan, Hexadekan) und Fettsäuren (Dodekansäure, Pentadekansäure, Hexadekansäure) kultiviert (3 % (v/v) Glycerol + 0,5 % (v/v) Glycerol nach 48 h, 1 % (v/v) n-Alkan oder 1 % (v/v) Fettsäure, 20 g l–1 CaCO3, 17,3 g l–1 KH2PO4, 1,35 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 3 g l–1 (NH4)2SO4, 0,7 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 0,5 g l–1 NaCl, 0,4 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 0,5 mg l–1 H3BO3, 0,04 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,1 mg l–1 KI, 0,4 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,2 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,4 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 6 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,3 mg l–1 Thiaminhydrochlorid). Die Mengen der gebildeten ω-Hydroxyfettsäuren (ω-Hydroxydodekansäure, ω-Hydroxypentadekansäure, ω-Hydroxyhexadekansäure) und Dicarbonsäuren (Dodekandisäure, Pentadekandisäure, Hexadekandisäure) wurden nach 96 h Kultivierung mittels Gaschromatographie bestimmt (2).
  • Y. lipolytica H222ΔP bildete hierbei relativ große Mengen an Dicarbonsäuren und kann somit als Ausgangsstamm zur Konstruktion eines entsprechenden Produktionsstamms für Dicarbonsäuren genutzt werden.
  • Sowohl Y. lipolytica H222ΔPΔA als auch H222ΔPΔF bildeten gesteigerte Mengen an ω-Hydroxyfettsäuren und können somit als Ausgangsstämme zur Konstruktion entsprechender Produktionsstämme für ω-Hydroxyfettsäuren genutzt werden. Y. lipolytica H222ΔPΔF ist hierbei gegenüber H222ΔPΔA zu bevorzugen.
  • Sowohl n-Alkane als auch Fettsäuren können von allen Stämmen zur ω-Hydroxyfettsäure, bzw. Dicarbonsäure mit gleicher Kettenlänge umgesetzt werden.
  • Beispiel 4: Nutzung verschiedener Kultivierungsbedingungen und –medien
  • Verschiedene Stämme (z.B. Yarrowia lipolytica H222ΔP und H222ΔPΔF) wurden in unterschiedlichen Medien unter verschiedenen Bedingungen kultiviert, wobei sich herausstellte, dass die verwendeten Medien und Bedingungen unterschiedlich gut geeignet sind.
  • Die Hefen wurden vergleichend in Minimalmedium mit Glucose (3 % (w/v) Glucose, 1 % (w/v) Pentadekansäure, 17,3 g l–1 KH2PO4, 1,35 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 3 g l–1 (NH4)2SO4, 0,7 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 0,5 g l–1 NaCl, 0,4 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 0,5 mg l–1 H3BO3, 0,04 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,1 mg l–1 KI, 0,4 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,2 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,4 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 6 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,3 mg l–1 Thiamin-Hydrochlorid) und Glycerol (3 % (v/v) Glycerol, 1 % (w/v) Pentadekansäure, 17,3 g l–1 KH2PO4, 1,35 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 3 g l–1 (NH4)2SO4, 0,7 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 0,5 g l–1 NaCl, 0,4 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 0,5 mg l–1 H3BO3, 0,04 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,1 mg l–1 KI, 0,4 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,2 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,4 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 6 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,3 mg l–1 Thiamin-Hydrochlorid) als Kohlenstoffquelle kultiviert, wobei nach 48 h 1 % (w/v) Glucose, bzw. 1 % (v/v) Glycerol nachgefüttert wurden. Nach 96 h bildeten alle untersuchten Stämme (z.B. Y. lipolytica H222ΔP, H222ΔPΔA und H222ΔPΔF) bei Wachstum in Minimalmedium mit Glucose größere Mengen an ω-Hydroxypentadekansäure, bzw. Pentadekandisäure als bei Wachstum in Minimalmedium mit Glycerol.
  • Die Hefen wurden weiterhin in Vollmedium mit Glucose und Pentadekansäure kultiviert (1 % (w/v) Hefeextrakt, 2 % (w/v) Pepton, 2 % (w/v) Glucose und 1 % (w/v) Pentadekansäure in 1 % Tween 80), wobei 1 % (w/v) Glucose nachgefüttert wurden, wenn diese aufgebraucht war. Nach 4 Tagen wurden 1 % (w/v) Pentadekansäure in 1 % Tween 80 nachgefüttert. Unter diesen Bedingungen wurde nahezu keine ω-Hydroxypentadekansäure, bzw. Pentadekandisäure gebildet (je < 0,1 g l–1).
  • Die Hefen wurden in Minimalmedium mit Glucose und Pentadekansäure kultiviert (3 % (v/v) Glucose, 1 % (w/v) Pentadekansäure in 1 % Tween 80, 17,3 g l–1 KH2PO4, 1,35 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 3 g l–1 (NH4)2SO4, 0,7 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 0,5 g l–1 NaCl, 0,4 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 0,5 mg l–1 H3BO3, 0,04 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,1 mg l–1 KI, 0,4 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,2 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,4 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 6 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,3 mg l–1 Thiamin-Hydrochlorid), wobei 1 % (w/v) Glucose nachgefüttert wurden, wenn diese aufgebraucht war. Nach 4 Tagen wurden 1 % (w/v) Pentadekansäure in 1 % Tween 80 nachgefüttert. Unter diesen Kultivierungsbedingungen bildete der Stamm Y. lipolytica H222ΔPΔF nach 10 Tagen rund 0,7 g l–1 ω-Hydroxypentadekansäure und 2,4 g l–1 Pentadekandisäure.
  • Die Hefen wurden in Minimalmedium mit Glucose und Pentadekansäure kultiviert (3 % (v/v) Glucose, 1 % (w/v) Pentadekansäure in 1 % Tween 80, 17,3 g l–1 KH2PO4, 1,35 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 3 g l–1 (NH4)2SO4, 0,7 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 0,5 g l–1 NaCl, 0,4 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 0,5 mg l–1 H3BO3, 0,04 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,1 mg l–1 KI, 0,4 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,2 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,4 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 6 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,3 mg l–1 Thiamin-Hydrochlorid), wobei die Glucose so nachgefüttert wurde, dass deren Konzentration im Medium zwischen 1 und 3 % (w/v) lag. Nach 5 Tagen wurden 1 % (w/v) Pentadekansäure in 1 % Tween 80 nachgefüttert. Unter diesen Kultivierungsbedingungen bildete der Stamm Y. lipolytica H222ΔPΔF nach 7 Tagen rund 3,9 g l–1 ω-Hydroxypentadekansäure und 1,3 g l–1 Pentadekandisäure.
  • Zusammenfassend ist festzustellen, dass Minimalmedium für die Kultivierung besser geeignet ist als Vollmedium. Weiterhin ist Glucose als Kohlenstoffquelle für die Energiebereitstellung besser geeignet als Glycerol. Die Glucose sollte im Verlauf der Kultivierung derart nachgefüttert werden, dass die Glucose nicht aufgebraucht wird (d. h. dass deren Konzentration nicht auf 0 g l–1 absinkt).
  • Beispiel 5: Reduktion der Bildung vom Fettkörperchen
  • sFür die Konstruktion der Deletionskassetten für die Gene DGA1, PAH1 und SCT1 wurde der jeweilige Promotor- und Terminator-Bereich durch PCR amplifiziert, wobei die Primer pXXX_fw/pXXX_rv und XXXt_fw/XXXt_rv genutzt wurden (XXX steht für das zu deletierende Gen). Als Template diente hierbei genomische DNA von Y. lipolytica H222.
  • Für die Konstruktion der Deletionskassetten für die Gene DGA1, PAH1 und SCT1 wurde durch Verwendung von Überhang-Primern am Ende des Promotor- sowie am Anfang des Terminator-Bereichs eine BamHI-Restriktionsschnittstelle eingefügt. Zusätzlich wurde am Anfang des Promotor-Bereichs eine HindIII-Restriktionsschnittstelle und am Ende des Terminator-Bereichs eine EcoRI-Restriktionsschnittstelle angefügt. Die Fragmente wurden in den Vektor pUCBM21 (Boehringer Ingelheim; SEQ ID NO 2) ligiert. Die so erhaltenen Plasmide wurden mit BamHI linearisiert und der URA-Blaster (TcR-URA3-TcR-Kassette), der aus dem Plasmid pUC-Lys2-DK2(SEQ ID NO 3) durch Restriktion mit BamHI und BglII gewonnen wurde, wurde eingefügt. Die jeweilige Deletionskassette wurde durch PCR oder Restriktion gewonnen und in Y. lipolytica H222-S4, der aus Y. lipolytica H222 hergestellt werden kann (Mauersberger, S., H. J. Wang, et al. (2001), J Bacteriol 183(17): 5102–5109), nach Barth und Gaillardin (Barth G & Gaillardin C (1996) Yarrowia lipolytica. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.) transformiert.
  • Vor einer erneuten Transformation wurde der Marker per FOA-Selektion (Boeke JD, LaCroute F & Fink GR (1984) Mol Gen Genet 197: 345–346.) zurückgewonnen.
  • Die erfolgreiche Deletion eines Gens wurde durch PCR bestätigt, wobei die Primer pXXX_fw und XXXt_rv sowie pXXX_fw und XXXt_rv2 genutzt wurden. XXXt_rv2 bindet im Bereich des zu deletierenden Gens, jedoch außerhalb der Deletionskassette.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch DGA1 trug, wurde H222ΔPΔD genannt.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch PAH1 trug, wurde H222ΔPΔH genannt.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch SCT1 trug, wurde H222ΔPΔS genannt.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch FAO1 und DGA1 trug, wurde H222ΔPΔFΔD genannt.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch FAO1 und PAH1 trug, wurde H222ΔPΔFΔH genannt.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch FAO1 und SCT1 trug, wurde H222ΔPΔFΔS genannt.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch FADH, ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, FAO1 und DGA1 trug, wurde H222ΔPΔAΔFΔD genannt.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch FADH, ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, FAO1 und PAH1 trug, wurde H222ΔPΔAΔFΔH genannt.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch FADH, ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, FAO1 und SCT1 trug, wurde H222ΔPΔAΔFΔS genannt. Tabelle 3: Primer zur Gewinnung und zum Nachweis der DGA1-, PAH1-und SCT1-Deletionskassetten
    Figure DE102014220186A1_0005
  • Die Stämme Y. lipolytica H222ΔPΔFΔD, H222ΔPΔFΔH und H222ΔPΔFΔS sowie deren Ausgangsstamm Y. lipolytica H222ΔPΔF wurden in Minimalmedium mit Glucose und Pentadekansäure kultiviert (3 % (v/v) Glucose, 1 % (w/v) Pentadekansäure, 17,3 g l–1 KH2PO4, 1,35 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 3 g l–1 (NH4)2SO4, 0,7 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 0,5 g l–1 NaCl, 0,4 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 0,5 mg l–1 H3BO3, 0,04 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,1 mg l–1 KI, 0,4 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,2 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,4 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 6 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,3 mg l–1 Thiamin-Hydrochlorid). Alle 24 h wurde die Glucose-Konzentration auf 3 % (w/v) eingestellt und nach 3 Tagen wurde 1 % (w/v) Pentadekansäure nachgefüttert. Die Mengen an ω-Hydroxypentadekansäure und Pentadekandisäure wurden nach 8 Tagen Kultivierung mittels Gaschromatographie bestimmt. Die Zellen wurden mikroskopisch untersucht, wobei die Fettkörperchen mit Nilrot angefärbt wurden und somit fluoreszenzmikroskopisch detektierbar sind (4).
  • Hierbei ist zu erkennen, dass die Größe der Fettkörperchen durch die Deletionen von PAH1 und SCT1 unter den genannten Kultivierungsbedingungen deutlich reduziert war. Dies konnte, wie bereits gezeigt, nicht für die bereits beschriebene Deletion von DGA1 (Thevenieau F (2006) Institut National Agronomique Paris-Grignon, PhD thesis.; Athenstaedt K (2011) Biochim Biophys Acta 1811: 587–596.)festgestellt werden.
  • Die Verfügbarkeit von Stämmen mit verkleinerten Fettkörperchen bildet die Grundlage für die Entwicklung von Stämmen für die effiziente Produktion von ω-Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren, da die Veresterung der angebotenen Substrate mit Glycerol und deren Einlagerung in den Fettkörperchen die Umsatzrate verringert.
  • Beispiel 6: Erhöhte Expression von FAO1 in Yarrowia lipolytica H222ΔP
  • Für die Konstruktion eines Vektors zu Überexpression von FAO1 wurde ein Teil des konstitutiven Promotors des Translationselongationsfaktor 1 alpha-Gens (TEF1: YALI0C09141g) mittels PCR gewonnen, wobei die Primer pTef_SpeI_fw3 und pTef_FAOo_ol_rv genutzt wurden. Als Template diente hierbei das Plasmid pINTB_HMG1 (SEQ ID NO 5).
  • Weiterhin wurde das FAO1-Gen(YALI0B14014g) mittels PCR unter Verwendung der Primer pTef_FAOo_ol_fw und FAO1o_SphI_rv amplifiziert (Template: genomische DNA von Y. lipolytica H222).
  • Durch die Primer pTef_FAOo_ol_rv und pTef_FAOo_ol_fw wurde ein Überhangbereich angefügt, mit dessen Hilfe beide PCR-Fragmente mittels Overlap-PCR unter Verwendung der Primer pTef_SpeI_fw3 und FAO1o_SphI_rv verbunden wurden. Das Overlap-Fragment wurde anschließend in den Vektor pJET1.2/blunt (Fermentas; SEQ ID NO 1) ligiert, aus diesem unter Verwendung der Restriktionsenzyme SpeI und SphI herausgeschnitten und letztendlich in das mit SpeI und SphI geschnittene Rückgrat des Plasmids pINTB_HMG1 (SEQ ID NO 5) ligiert, wobei des Plasmid pINTB-FAO1 entstand.
  • Weiterhin wurde eine Integrationplattform mittels PCR unter Verwendung der Primer INT_AscI_fw_KpnI und INT_AscI_rv_KpnI gewonnen, mit KpnI geschnitten und in das durch Restriktionsverdau mit KpnI gewonnene Rückgrat des Vektors pINTB-FAO1 ligiert, wobei das Plasmid pINTC-FAO1 entstand.
  • Das Plasmid pINTC-FAO1 wurde letztendlich mit AscI linearisiert und in den gewünschten Y. lipolytica-Empfängerstamm transformiert.
  • Die erfolgreiche Integration des FAO1-Gens wurde durch PCR bestätigt, wobei die Primer INT_AscI_fw_out und INT_AscI_rv_out genutzt wurden, die in der genomischen DNA außerhalb des integrierten Konstruktes binden.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch die zusätzliche Kopie von FAO1 unter Kontrolle des TEF1-Promotors trug, wurde H222ΔPoF genannt und diente als Ausgangsstamm zu Konstruktion weiterer Stämme für die Produktion von Dicarbonsäuren. Tabelle 4: Primer für die Überexpression von FAO1
    Figure DE102014220186A1_0006
  • Beispiel 7: Erhöhte Expression von CPR1 in Yarrowia lipolytica H222ΔP und H222ΔPΔAΔF
  • Für die Konstruktion eines Vektors zu Überexpression von FAO1 wurde ein Teil des konstitutiven Promotors des Translationselongationsfaktor 1 alpha-Gens (TEF1: YALI0C09141g) mittels PCR gewonnen, wobei die Primer pTef_SpeI_fw3 und pTEF_CPR1_ol_rv genutzt wurden. Als Template diente hierbei das Plasmid pINTB_HMG1 (SEQ ID NO 5).
  • Weiterhin wurde das CPR1-Gen(YALI0D04422g) mittels PCR unter Verwendung der Primer pTEF_CPR1_ol_fw und CPR1_SphI_rv amplifiziert (Template: genomische DNA von Y. lipolytica H222).
  • Durch die Primer pTEF_CPR1_ol_rv und pTEF_CPR1_ol_fw wurde ein Überhangbereich angefügt, mit dessen Hilfe beide PCR-Fragmente mittels Overlap-PCR unter Verwendung der Primer pTef_SpeI_fw3 und CPR1_SphI_rv verbunden wurden. Das Overlap-Fragment wurde anschließend in den Vektor pJET1.2/blunt (Fermentas; SEQ ID NO 1) ligiert, aus diesem unter Verwendung der Restriktionsenzyme SpeI und SphI herausgeschnitten und letztendlich in das mit SpeI und SphI geschnittene Rückgrat des Plasmids pINTB_HMG1 (SEQ ID NO 5) ligiert, wobei das Plasmid pINTB-CPR1 entstand.
  • Das resultierende Plasmid wurde letztendlich mit NotI linearisiert und in die gewünschten Y. lipolytica-Empfängerstämme transformiert.
  • Die erfolgreiche Integration des CPR1-Gens wurde durch PCR bestätigt, wobei die Primer INTB_out_fw und INTB_out_rv genutzt wurden, die in der genomischen DNA außerhalb des integrierten Konstruktes binden.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 als auch die zusätzliche Kopie von CPR1 unter Kontrolle des TEF1-Promotors trug, wurde H222ΔPoC genannt und diente als Ausgangsstamm zu Konstruktion weiterer Stämme für die Produktion von Dicarbonsäuren.
  • Der Stamm, der sowohl die Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5, POX6, FADH, ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, FAO1 als auch die zusätzliche Kopie von CPR1 unter Kontrolle des TEF1-Promotors trug, wurde H222ΔPΔAΔFoC genannt. Tabelle 5: Primer für die Überexpression von CPR1
    Figure DE102014220186A1_0007
  • Beispiel 8: Vergleichende Kultivierung verschiedener Produktionsstämme im Fermenter
  • Um zu überprüfen, inwieweit sich verschiedene gentechnische Modifikationen auf die Produktion von ω-Hydroxyfettsäuren und/oder Dicarbonsäuren auswirken, wurden die Stämme Yarrowia lipolytica H222ΔP, H222ΔPΔA, H222ΔPΔF, H222ΔPΔAΔF, H222ΔPoF, H222ΔPoC, H222ΔPΔD, H222ΔPΔH, H222ΔPΔS, H222ΔPΔAΔFoC, H222ΔPΔAΔFΔD, H222ΔPΔAΔFΔH und H222ΔPΔAΔFΔS, deren Konstruktion in den Beispielen 1,2,5,6 und 7 beschrieben wurde, im Fermenter kultiviert. Als Kultivierungmedium diente hierbei Minimalmedium mit Glucose (5 % (w/v) Glucose, 1 g l–1 KH2PO4, 0,16 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 3 g l–1 (NH4)2SO4, 0,7 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 0,5 g l–1 NaCl, 0,4 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 0,5 mg l–1 H3BO3, 0,04 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,1 mg l–1 KI, 0,4 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,2 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,4 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 6 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,3 mg l–1 Thiaminhydrochlorid). Die Kultivierung erfolgte im Fermenter bei 28 °C. Die Sauerstoffsättigung wurde auf 55 % eingestellt. Die Zellen wurden mit einer OD600 von 1 inokuliert und für 24 h bei pH 5,5 (automatisierte Titration von HCl und NaOH) inkubiert. Dann wurden 15 g l–1 DD zugegeben und der pH wurde auf 8,0 eingestellt. Alle 24 h wurde Glucose zugegeben, um eine Endkonzentration von 5 % (w/v) einzustellen.
  • Y. lipolytica H222ΔP bildete hierbei relativ große Mengen an Dicarbonsäuren und kann somit als Ausgangsstamm zur Konstruktion eines entsprechenden Produktionsstamms für Dicarbonsäuren genutzt werden (5A).
  • Y. lipolytica H222ΔPΔA als auch H222ΔPΔF bildeten gesteigerte Mengen an ω-Hydroxyfettsäuren und können somit als Ausgangsstämme zur Konstruktion entsprechender Produktionsstämme für ω-Hydroxyfettsäuren genutzt werden. Y. lipolytica H222ΔPΔF ist hierbei gegenüber H222ΔPΔA zu bevorzugen(5A).
  • Y. lipolytica H222ΔPΔAΔF bildete nur geringe Mengen Dicarbonsäuren und ist somit der bevorzugte Ausgangsstamm zur Konstruktion von Produktionsstämmen für ω-Hydroxyfettsäuren (5A).
  • Die Überexpressionen von FAO1 und CPR1 in dem Stamm Y. lipolytica H222ΔP (resultierende Stämme: Y. lipolytica H222ΔPoF und H222ΔPoC) führte jeweils zu einer gesteigerten Produktion von Dicarbonsäuren (5B).
  • Die Deletion von DGA1 in dem Stamm Y. lipolytica H222ΔP (resultierender Stamm: Y. lipolytica H222ΔPΔD) führte zu einer gesteigerten Produktion von Dicarbonsäuren, wohingegen die Deletionen von PAH1 und SCT1 (resultierende Stämme: Y. lipolytica H222ΔPΔH und H222ΔPΔS) die Produktion von Dicarbonsäuren nicht signifikant steigerte (5B).
  • Die Überexpression von CPR1 in dem Stamm Y. lipolytica H222ΔPΔAΔF (resultierender Stamm: Y. lipolytica H222ΔPΔAΔFoC) führte zu einer gesteigerten Produktion von Dicarbonsäuren, nicht jedoch von ω-Hydroxyfettsäuren (5C).
  • Die Deletionen von DGA1, PAH1 und SCT1 in dem Stamm Y. lipolytica H222ΔPΔAΔF (resultierende Stämme: Y. lipolytica H222ΔPΔAΔFΔD, H222ΔPΔAΔFΔH und H222ΔPΔAΔFΔS) führte nicht zu einer gesteigerten Produktion von ω-Hydroxyfettsäuren (5B).
  • Beispiel 9: Enzymtest zur Bestimmung der (Fett-)Alkohol-Dehydrogenase und -Oxidase-Aktivität
  • Die Enzymaktivitäten der (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen und -Oxidase wurden in Zelllysaten der Stämme Yarrowia lipolytica H222ΔP, H222ΔPΔA, H222ΔPΔF, H222ΔPΔAΔF und H222ΔPoF bestimmt. Die Zellen wurden wie in Beispiel 8 beschrieben kultiviert und nach drei Tagen geerntet und aufgeschlossen.
  • Die (Fett-)Alkohol-Dehydrogenase- und -Oxidase-Enzymaktivitäten wurden wie bei Matatiele (2005) beschrieben durchgeführt (Matatiele PR (2005) PhD thesis, University of the Free State, Republic of South Africa).
  • Das (Fett-)Alkohol-Dehydrogenase-Assay (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 1,3 mM Dodekan-1-ol in DMSO, 2 mM NAD+, 2 mM NAP+, 1,5 % (v/v) Zellextrakt) wurde mit einem wurde mit einem aufzeichnenden Spektrophotometer bei 30 °C und λ = 340 nm eingemessen und die Enzymaktivität wurde mithilfe des bestimmten Extinktions-Anstiegs berechnet (εNAD(P)H = 6,3 mM–1 cm–1).
  • Das (Fett-)Alkohol-Oxidase-Assay (50 mM Glycin-NaOH pH 9,0, 0,35 mM Dodekan-1-ol in DMSO, 0,013 % (w/v) Peroxidase (150 U/mg), 0,044 % (w/v) ABTS, 6 mM Natriumazid, 1–5 % (v/v) Zellextrakt) wurde mit einem wurde mit einem aufzeichnenden Spektrophotometer bei λ = 405 nm eingemessen und die Enzymaktivität wurde mithilfe des bestimmten Extinktions-Anstiegs berechnet (εABTSox = 18,4 mM–1 cm–1). Überraschenderweise wurde zwischen den Stämmen keinen deutlicher Unterschied der (Fett-)Alkohol-Dehydrogenase festgestellt (6A). Dies könnte mit verbleibender Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität begründet werden. Weiterhin ist es möglich, dass die gemessene Umsetzung Dodekan-1-ol auch durch Cytochrom P450 katalysiert und letztendlich die Aktivität von Aldehyd-Dehydrogenasen bestimmt wird.
  • Wie erwartet war die (Fett-)Alkohol-Oxidase-Aktivität nur in den Stämmen Y. lipolytica H222ΔP und H222ΔPΔA nachweisbar und nicht in den FAO1-Deletionsstämmen Y. lipolytica H222ΔPΔF und H222ΔPΔAΔF (6B). Die gemessene (Fett-)Alkohol-Oxidase-Aktivität war durch die Überexpression von FAO1 (Stamm: Y. lipolytica H222ΔPoF) mehr als zehnfach erhöht.
  • Beispiel 9: Kultivierung Y. lipolytica H222ΔPΔF im Fermenter
  • Um zu überprüfen, ob die Produktionsstämme in der Lage sind, auch größere Mengen an Dicarbonsäuren und/oder ω-Hydroxyfettsäuren zu produzieren und im Kulturmadium anzuhäufen, wurde der Stamm Y. lipolytica H222ΔPΔF für 7 d im Fermenter kultiviert. Als Kultivierungmedium diente hierbei Minimalmedium mit Glucose und einer erhöhten Menge an Mineralsalzen, Spurenelementen und Vitaminen (5 % (w/v) Glucose, 2 g l–1 KH2PO4, 0,32 g l–1 K2HPO4 × 3 H2O, 6 g l–1 (NH4)2SO4, 1,4 g l–1 MgSO4 × 7 H2O, 1 g l–1 NaCl, 0,8 g l–1 Ca(NO3)2 × 4 H2O, 1 mg l–1 H3BO3, 0,08 mg l–1 CuSO4 × 5 H2O, 0,2 mg l–1 KI, 0,8 mg l–1 MnSO4 × 4 H2O, 0,4 mg l–1 Na2MoO4 × 2 H2O, 0,8 mg l–1 ZnSO4 × 7 H2O, 12 mg l–1 FeCl3 × 6 H2O, 0,6 mg l–1 Thiaminhydrochlorid). Die Kultivierung erfolgte im Fermenter bei 28 °C. Die Sauerstoffsättigung wurde auf 55 % eingestellt. Die Zellen wurden mit einer OD600 von 1 inokuliert und für 2 d bei pH 5,5 (automatisierte Titration von HCl und NaOH) inkubiert. Nach 2 d wurde der pH auf 8,0 eingestellt und es wurden nach 2 d und 3 d 15 g l–1 Dodekan zugegeben. Alle 24 h wurde Glucose zugegeben, um eine Endkonzentration von 5–10 % (w/v) einzustellen.
  • Nach 6 d Kultiviernung (d.h. nach 4 d in der Produktionsphase) bildete Y. lipolytica H222ΔPΔF 29,5 g l–1 ω-Hydroxydodekansäure und 3,5 g l–1 Dodekandisäure (7).
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Claims (22)

  1. Ein Hefestamm der Art Y. lipolytica, aufweisend eine Verringerung der Aktivitäten der Acyl-CoA-Oxidasen, der dadurch gekennzeichnet ist, dass in diesem zusätzlich a) die Aktivitäten relevanter (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen und/oder b) die Aktivitäten relevanter (Fett-)Alkohol-Oxidasen reduziert sind, wodurch eine gesteigerten Bildung von ω-Hydroxyfettsäuren gemäß der allgemeinen Struktur: HOOC-(CH2)n-OH, HOOC-(CnH2n-2)-CH2OH, COOC-(CnH2n-4)-CH2OH oder HOOC-(CnH2n-6)-CH2OH, mit n im Bereich von 6 bis 16, aus einem hydrophoben Substrat erfolgt.
  2. Hefestamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Aktivitäten einzelner oder aller Cytochrom P450-Genprodukte erhöht sind.
  3. Hefestamm nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Aktivität der NADPH-Cytochrom P450-Reduktase erhöht ist.
  4. Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Aktivität der Phosphatidsäure-Dephosphohydrolase verringert ist.
  5. Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Aktivität der Glycerol-3-phosphat-Acyltransferase verringert ist.
  6. Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Hefestamm eine Deletion der Gene für die Acyl-CoA-Oxidasen, die (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen und/oder die (Fett-)Alkohol-Oxidasen aufweist.
  7. Verwendung eines Hefestamms nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur mikrobiellen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren gemäß der allgemeinen Struktur: HOOC-(CH2)n-OH, HOOC-(CnH2n-2)-CH2OH, COOC-(CnH2n-4)-CH2OH oder HOOC-(CnH2n-6)-CH2OH, mit n im Bereich von 6 bis 18, aus einem hydrophoben Substrat.
  8. Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren aus einem hydrophoben Substrat, das die folgenden Schritte umfasst: d) Bereitstellung von Hefezellen mindestens eines Hefestamms der Art Y. lipolytica, der (iv) eine Verringerung der Aktivitäten der Acyl-CoA-Oxidasen, (v) eine reduzierte Aktivität relevanter (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen und (vi) eine reduzierte Aktivität relevanter (Fett-)Alkohol-Oxidasen aufweist, in einem geeigneten Kultivierungsmedium, e) Kontaktieren der Hefezellen mit dem hydrophoben Substrat, wobei das hydrophobe Substrat mit mindestens einem der Enzyme der Hefezellen, ausgewählt aus der Gruppe, (iv) Cytochrom P450-Genprodukte, (v) NADPH-Cytochrom P450-Reduktase, (vi) (Fett-)Aldehyd-Dehydrogenasen zu dem Reaktionsprodukt ω-Hydroxyfettsäure umgesetzt wird, f) Isolierung der ω-Hydroxyfettsäure.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung zu dem Reaktionsprodukt ω-Hydroxyfettsäure zusätzlich mit verbleibenden (Fett-)Alkohol-Oxidasen, (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen erfolgt.
  10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefezellen mindestens eines Hefestamms der Art Y. lipolytica ausgewählt sind aus einem Hefestamm nach den Ansprüchen 1 bis 6.
  11. Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von Dicarbonsäuren aus einem hydrophoben Substrat, das die folgenden Schritte umfasst: d) Bereitstellung von Hefezellen mindestens eines Hefestamms der Art Y. lipolytica, der (iv) eine Verringerung der Aktivitäten der Acyl-CoA-Oxidasen, (v) eine erhöhte Aktivität relevanter (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen und (vi) eine erhöhte Aktivität relevanter (Fett-)Alkohol-Oxidasen aufweist, in einem geeigneten Kultivierungsmedium, e) Kontaktieren der Hefezellen mit dem hydrophoben Substrat, wobei das hydrophobe Substrat mit mindestens einem der Enzyme der Hefezellen, ausgewählt aus der Gruppe, (vi) der Cytochrom P450-Genprodukte, (vii) der NADPH-Cytochrom P450-Reduktase, (viii) der (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen nach a), (ix) der (Fett-)Alkohol-Oxidasen nach a) und (x) (Fett-)Aldehyd-Dehydrogenasen zu dem Reaktionsprodukt Dicarbonsäure umgesetzt wird, f) Isolierung der Dicarbonsäure.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass in den Hefezellen zusätzlich die Aktivitäten einzelner oder aller Cytochrom P450-Genprodukte erhöht sind.
  13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass in den Hefezellen zusätzlich die Aktivität der NADPH-Cytochrom P450-Reduktase erhöht ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass in den Hefezellen zusätzlich die Aktivitäten relevanter (Fett-)Alkohol-Dehydrogenasen erhöht sind.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass in den Hefezellen zusätzlich die Aktivitäten relevanter (Fett-)Alkohol-Oxidasen erhöht sind.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass in den Hefezellen zusätzlich die Aktivitäten relevanter (Fett-)Aldehyd-Dehydrogenasen erhöht sind.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10 oder 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe der n-Alkane der allgemeinen Struktur: H3C-(CH2)n-CH3, der Alkene der allgemeinen Struktur H3C-(CnH2n-2)-CH3, H3C-(CnH2n-4)-CH3 oder H3C-(CnH2n-6)-CH3, Fettsäuren der allgemeinen Struktur: HOOC-(CH2)n-CH3, HOOC-(CnH2n-2)-CH3, COOC-(CnH2n-4)-CH3 oder HOOC-(CnH2n-6)-CH3, und Fettsäurealkylester der allgemeinen Struktur: ROOC-(CH2)n-CH3, mit n im Bereich von 6 bis 18.
  18. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche 8 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zu dem hydrophoben Substrat Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet wird.
  19. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche 8 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Glucose-Konzentration im Verlauf der Kultivierung nicht auf 0 g l–1 absinkt.
  20. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche 8 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Stickstoffgehalt im Kulturmedium nach dem Kontaktieren kleiner als 2 g l–1 ist.
  21. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche 8 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert nach dem Kontaktieren größer als 5,5 ist.
  22. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche 8 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Substrat ein n-Alkane, ein Alken oder eine Fettsäure mit n im Bereich 8 bis 18 ist.
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