DE102014205824A1

DE102014205824A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Messung des Beladungszustands von Partikeln

Info

Publication number: DE102014205824A1
Application number: DE102014205824.4A
Authority: DE
Inventors: Caroline Siegert; Sabrina Schubert; Christian Reis
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2015-10-01

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung des Beladungszustandes von Partikeln, wobei suspergierte unbeladene Partikel und suspergierte beladene Partikel, deren Beladungszustand zu bestimmen ist, mittels eines oszillierenden Magnetfeldes zum Schwingen angeregt werden, eine Phasendifferenz zwischen der Schwingung der unbeladenen Partikel und der Schwingung der beladenen Partikel bestimmt wird, und aus der Phasendifferenz auf den Beladungszustand der beladenen Partikel geschlossen wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung des Beladungszustands von Partikeln, die in einer Suspension vorliegen, wobei die unbeladenen Partikel und die beladenen Partikel, deren Beladungszustand zu bestimmen ist, mittels eines oszillierenden Magnetfelds zum Schwingen angeregt werden, eine Phasendifferenz zwischen der Schwingungen der unbeladenen Partikel und der Schwingung der beladenen Partikel bestimmt wird und aus der Phasendifferenz auf den Beladungszustand der beladenen Partikel geschlossen wird.
Magnetische Beads werden heute in zahlreichen biotechnologischen und biomedizinischen Verfahren eingesetzt. Man verwendet sie hauptsächlich zur Separation von Zellen oder Biomolekülen wie beispielsweise Proteinen oder Nukleinsäuren aus Probelösungen. Magnetische Beads sind magnetisierbare Partikel mit einer Kunststoffhülle, welche spezifisch modifiziert werden können. Durch ihre magnetischen Eigenschaften können sie in Magnetfeldern entlang eines B-Feld-Gradienten bewegt werden. Eine Separation ist daher einfach durch Verwendung eines Elektro- oder Permanentmagneten möglich. Die Oberfläche der Kunststoffhülle kann entweder unspezifisch Biomoleküle binden oder spezifisch mit speziellen Bindungspartnern ausgestattet werden. Hierbei kommen hauptsächlich Antikörper, andere Proteine oder Nukleinsäuren zum Einsatz. Diese sorgen für eine sehr spezifische Bindung eines Biomoleküls oder einer Zelle an die magnetischen Partikel. Magnetische Beads sind normalerweise in unterschiedlichen Größenbereichen von einigen Nanometern bis in den Mikrometerbereich erhältlich.
Bislang wurden magnetische Beads hauptsächlich für die reine Separation von Biomolekülen verwendet. Zur Analyse wurden sie lediglich in medizinisch bildgebenden Verfahren z. B. in der MRT eingesetzt. Seit einiger Zeit besteht verstärkt der Wunsch, die magnetischen Beads nicht nur für eine Separation von Biomolekülen zu verwenden, sondern die magnetischen Beads selbst zur Analyse einzusetzen. Aufwändige Prozessschritte wie Waschen und somit ein Reinigen der Probe, Elution des Biomoleküls vom Bead und anschließende Bestimmung der Biomoleküle oder Zellen durch beispielsweise ELISA Tests oder FACS-Analysen würden somit vermieden. Bislang gibt es nur wenige Bestrebungen mittels der magnetischen Beads direkt Biomoleküle nachzuweisen, da sie einen hohen apparativen Aufwand erfordern. Ein einfaches Verfahren mit geringem apparativem Aufwand ist daher von hohem Nutzen.
Für die Bestimmung des Beladungszustands eines magnetischen Beads verwendet man derzeit ein aufwändiges Verfahren, welches auf der sogenannten Magnetrelaxometrie basiert. Dabei werden die magnetischen Partikel durch ein äußeres Magnetfeld magnetisiert und damit in eine definierte magnetische Ausrichtung gebracht. Das Verfahren basiert auf der Verwendung superparamagnetischer Partikel, welche nach Abschalten des äußeren Magnetfeldes ihre Magnetisierung fast augenblicklich verlieren. Dafür sind zwei physikalische Phänomene verantwortlich, die Brown-Relaxation und die Neel-Relaxation. Diese Relaxationszeiten lässt sich durch kleine Magnetfeldsensoren (beispielsweise Fluxgate-Sensoren) messen. Bei Bindung eines Analyten an das magentische Bead verändert sich die Brown-Relaxation und dadurch kann der Beladungszustand analysiert werden. Dieses Verfahren ist auf die Verwendung superparamagnetischer Beads limitiert und benötigt zudem kostenintensives Equipment wie beispielsweise die Fluxgate-Sensoren und Helmholtz-Spulen zur Erzeugung sehr homogener Magnetfelder zur Magnetisierung der Beads.
Verfahren zur Bestimmung von Biomolekülen, welche an magnetische Beads gebunden haben, gibt es ebenfalls. Das Patent US 8,026,716 B2 beschreibt ein Verfahren, welches auf einer Impedanz-Analyse zur Messung der Anzahl von magnetischen Beads in einem bestimmten Bereich beruht. Wenn Biomoleküle an die magnetischen Beads gebunden sind, werden diese auf einem bestimmten Areal eines nasschemischen Teststreifens gebunden/zurückgehalten. Die dielektrischen Eigenschaften der magnetischen Beads sorgen dafür, dass sich die Impedanz eines Spulen- und Messsystems in diesem Bereich des Teststreifens ändert. Somit kann die Anzahl an vorhandenen Biomolekülen in einer auf den Teststreifen gebrachten Probe identifiziert werden.
Die Probleme des Standes der Technik werden gelöst durch das Verfahren zur Messung des Beladungszustands von Partikeln nach Anspruch 1 sowie die Vorrichtung zur Messung des Beladungszustands von Partikeln nach Anspruch 15.
Die jeweiligen abhängigen Ansprüche geben vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens an.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Messung des Beladungszustands von Partikeln angegeben. Die Partikel liegen dabei suspendiert vor, d. h. als Suspension in einem Medium, beispielsweise einer Flüssigkeit wie Wasser. Die Begriffe „suspergiert” und „suspendiert” werden in diesem Dokument synonym verwendet. Die Partikel sind so ausgestaltet, dass sie beladen werden können. Vorteilhafterweise ist dabei die Oberfläche der Partikel so beschaffen, dass Substanzen oder Objekte an diese Oberfläche binden können. In einer vorteilhaften Ausgestaltung können die Partikel eine Oberfläche aufweisen, an die Zellen und/oder Biomoleküle wie beispielsweise Proteine oder Nukleinsäuren binden können. Vorteilhafterweise können die Partikel eine Kunststoffhülle aufweisen, die besonders bevorzugt so eingerichtet ist, dass die entsprechenden Moleküle oder Zellen an dieser Kunststoffhülle binden können. Insbesondere kann vorteilhafterweise die Kunststoffhülle mit speziellen Bindungspartnern ausgestattet sein, wie beispielsweise Antikörpern, anderen Proteinen oder Nukleinsäuren, an welche die zu bindenden Substanzen sich binden können.
Die suspendierten, unbeladenen Partikel sowie die supergierten beladenen Partikel werden erfindungsgemäß mittels eines oszillierenden Magnetfeldes zum Schwingen angeregt. Im Normalfall führen dann die Partikel eine erzwungene, gedämpfte Schwingung im Grenzfall des freien Teilchens aus. Es stellt sich hierbei eine Phasenverschiebung zwischen der Schwingung des anregenden Magnetfelds einerseits und der Schwingung der Partikel andererseits ein. Der Betrag dieser Phasenverschiebung ist abhängig von der Masse der Partikel. Erfindungsgemäß wird daher eine Phasendifferenz zwischen der Schwingung der unbeladenen Partikel und der Schwingung der beladenen Partikel bestimmt. Diese Phasendifferenz entsteht dadurch, dass aufgrund der unterschiedlichen Masse der unbeladenen und der beladenen Partikel auch die Phasendifferenz zum anregenden Magnetfeld unterschiedlich ist und daher auch zwischen den Schwingungen der unbeladenen und der beladenen Partikel eine Differenz entsteht, die abhängig von der Beladung der beladenen Partikel ist. Erfindungsgemäß wird daher aus der Phasendifferenz zwischen der Schwingung der beladenen Partikel und der Schwingung der unbeladenen Partikel auf den Beladungszustand der beladenen Partikel geschlossen. Als Beladungszustand wird hierbei vorzugsweise die Differenz der Masse eines beladenen Partikels und eines unbeladenen Partikels gemessen.
Die Partikel sind vorzugsweise magnetische Partikel, magnetisierte Partikel und/oder magnetisierbare Partikel.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommenden Partikel können vorzugsweise magnetische Beads sein, wie sie in der Biotechnologie und der Biomedizin üblicherweise zum Einsatz kommen. Diese heißen zwar magnetische Beads, sind aber normalerweise eigentlich magnetisierbare Beads.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird als Phase der Schwingung der beladenen Partikel und der unbeladenen Partikel jeweils ein Zeitpunkt des Durchgangs eines der entsprechenden Partikel oder einer Gruppe der entsprechenden Partikel durch ein jeweils vorgegebenes Messvolumen bestimmt. Es wird also für die beladenen Partikel ein Messvolumen in der Suspension der beladenen Partikel vorgegeben und ein Zeitpunkt bestimmt, zu dem eines der beladenen Partikel oder eine Gruppe der beladenen Partikel durch dieses Volumen durchgeht, und es wird für die unbeladenen Partikel ein Messvolumen in der Suspension der unbeladenen Partikel bestimmt und ein Zeitpunkt des Durchgangs eines der unbeladenen Partikel oder einer Gruppe der unbeladenen Partikel durch dieses Messvolumen bestimmt. Als Phasendifferenz kann dann eine Zeitdifferenz zwischen dem Zeitpunkt des Durchgangs des beladenen Partikels oder der Gruppe der beladenen Partikel durch das Messvolumen der beladenen Partikel und dem Zeitpunkt des Durchgangs des unbeladenen Partikels oder der Gruppe der unbeladenen Partikel durch das Messvolumen der unbeladenen Partikel bestimmt werden.
Vorzugsweise ist der Gradient des Magnetfeldes so ausgestaltet, dass er immer auf das Zentrum des Magneten weist. Die Bahn kann also zwischen den Magneten immer linear sein. Jeder Punkt auf der Linie kann dann als Nullpunkt der Schwingung der Partikel herangezogen werden. Durch die vorteilhafte mechanische Fixierung des Gesamtsystems kann immer auf diesen Nullpunkt geschaut werden.
Vorzugsweise werden die beladenen Partikel einerseits und die unbeladenen Partikel andererseits in getrennten Gefäßen bereitgestellt, sodass das Volumen der unbeladenen Partikel im Gefäß der unbeladenen Partikel vorgegeben wird und das Volumen der beladenen Partikel im Gefäß der beladenen Partikel vorgegeben wird. Die jeweiligen Volumina werden vorzugsweise so angeordnet, dass sie zu jedem Zeitpunkt vom anregenden Magnetfeld in der gleichen Phase durchsetzt werden. Es ist jedoch auch möglich, dass die Volumina so angeordnet sind, dass sie in unterschiedlichen Phasen des Magnetfeldes durchsetzt werden. In diesem Falle ist es jedoch vorteilhaft, die Differenz der Phasen des anregenden Magnetfelds an den beiden Volumina in die Berechnung der Phasendifferenz zwischen der Schwingung der unbeladenen Partikel und der beladenen Partikel einfließen zu lassen. Es können hierdurch die Schwingungen der beladenen und der unbeladenen Partikel auf den gleichen Nullpunkt bezogen bzw. zurückgerechnet werden.
Es ist erfindungsgemäß auch möglich, das Verfahren mit nur einem Gefäß für die Partikel durchzuführen. In diesem Fall kann zunächst die Messung der unbeladenen Partikel durchgeführt werden. Es kann dann anschließend die Substanz, mit der die Partikel beladen werden, der Suspension der Partikel hinzugegeben werden. Nach Abschluss des Beladungsvorgangs kann dann die Messung im gleichen Aufbau erneut durchgeführt werden. Um die Phasendifferenz bestimmen zu können, kann hier für die Messung der beladenen Partikel und die Messung der unbeladenen Partikel jeweils zunächst die Phasenverschiebung zur Schwingung des anregenden Magnetfeldes bestimmt werden. Die Differenz dieser Phasenverschiebungen kann dann als Phasendifferenz zwischen der Schwingung der unbeladenen Partikel und der Schwingung der beladenen Partikel bestimmt werden.
Die Bestimmung des Durchgangs eines der entsprechenden Partikel oder einer Gruppe der entsprechenden Partikel durch das entsprechende Messvolumen ist auf verschiedene Weise möglich. In einer einfachen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Messvolumen der beladenen Partikel und das Messvolumen der unbeladenen Partikel mittels einer Strahlungsquelle, wie beispielsweise eines Lasers beleuchtet oder durchleuchtet werden und mittels einer abbildenden Optik das durch das Messvolumen durchtretende Licht oder das aus dem Messvolumen reflektierte Licht gemessen werden. Es wird hier bei Durchgang eines der entsprechenden Teilchen oder eine Gruppe der entsprechende Teilchen durch das entsprechende Messvolumen eine Verringerung der Intensität des durchtretenden Lichtes gemessen bzw. eine Vergrößerung der Intensität des reflektierten Lichtes gemessen.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können die Partikel fluoreszierende Partikel sein. In diesem Fall ist es vorteilhaft, einen Fotodetektor auf das entsprechende Messvolumen zu fokussieren und als Zeitpunkt des Durchgangs des entsprechenden Partikels oder der Gruppe der entsprechenden Partikel durch das entsprechende Messvolumen einen Zeitpunkt zu bestimmen, zu dem der Fotodetektor eine Intensitätserhöhung des detektierten Lichtes misst.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann an zumindest einige der unbeladenen und zumindest einige der beladenen Partikel jeweils ein Molekül gebunden werden, das mit einer anderen Wellenlänge, als das Partikel selbst fluoresziert. Sind hier also die Partikel selbst fluoreszierend, so sind nach Anbindung dieses zusätzlichen Moleküls die Partikel mit dem Molekül in zwei verschiedenen Wellenlängen fluoreszierend. In dieser Ausführungsform weisen also die unbeladenen Partikel die Fluoreszenz des eigentlichen Partikels auf. Die beladenen Partikel weisen hier die Fluoreszenz des ursprünglichen Partikels auf sowie die Fluoreszenz der Substanz, mit der sie beladen sind. Es kann nun als Zeitpunkt des Durchgangs des entsprechenden Partikels oder der Gruppe der entsprechenden Partikel durch das entsprechende Messvolumen ein Zeitpunkt bestimmt werden, zu dem eine Intensitätserhöhung des detektierten Lichtes in beiden Wellenlängen gleichzeitig gemessen wird. Auf diese Weise ist es möglich, Rauschen und Störungen der Messung zu verringern.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können die Moleküle auf der Oberfläche der Partikel, an welche die zu analysierenden Substanzen oder Teilchen anbinden können (im folgenden auch als Fängermoleküle bezeichnet) Biomoleküle sein, die mitgefärbt werden. Die Phasendifferenz kann dann zwischen den Partikeln mit nur Fängermolekülen und den Partikeln mit Fängermolekülen und gefangenen Biomolekülen bestimmt werden.
Vorteilhafterweise können auch leicht fluoresszierende Partikel eingesetzt werden und die Phasenverschiebung durch Detektion dieser Partikel bestimmt werden, wie auch oben dargelegt.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können auch nur die zu analysierenden Substanzen fluoreszierend sein. Es wird dann nur bei den beladenen Partikeln eine Phase detektiert. Es kann hier der Beladungszustand durch Vergleich der so beobachten Phase mit Referenzmessungen bestimmt werden, in denen die Konzentrationen und Beladungszustände bekannt sind.
Vorteilhafterweise kann der genannte Fotodetektor ein Fotomultiplier, eine Avalanche-Fotodiode, einen CCD-Sensor und/oder einen CMOS-Sensor aufweisen.
In einer Ausgestaltung der Erfindung ist es auch möglich, dass das Messvolumen in eine Spule oder ein System von Spulen mit gemeinsamer Induktivität eingebracht wird. Dabei wird das Messvolumen so in die Spule oder das System von Spulen eingebracht, dass der Durchgang der Partikel durch das Messvolumen zu einer Änderung der Induktivität der Spule oder des Systems von Spulen führt. Es kann dann als Zeitpunkt des Durchgangs der entsprechenden Partikel oder der entsprechenden Gruppe von Partikeln durch das entsprechende Messvolumen ein Zeitpunkt der Änderung der Induktivität oder ein Zeitpunkt einer Änderung der Impedanz der Spulen oder des Systems von Spulen bestimmt werden.
In dieser Ausführungsform kann die entsprechende Spule oder das System von Spulen als Teil eines Schwingkreises ausgestaltet werden und als Zeitpunkt des Durchgangs der Partikel durch das entsprechende Messvolumen kann eine Veränderung der Resonanzfrequenz des Schwingkreises bestimmt werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können wiederum die Partikel fluoreszierende Partikel sein und jeweils eine Polarisation des aus dem entsprechenden Messvolumen austretenden Lichtes gemessen werden. Es kann dann als Zeitpunkt des Durchgangs des entsprechenden Partikels oder der Gruppe der entsprechenden Partikel durch das entsprechende Messvolumen ein Zeitpunkt der Änderung der Polarisation des aus dem entsprechenden Messvolumen austretenden Lichtes bestimmt werden. Es wird in dieser Ausführungsform ausgenutzt, dass sich die Polarisation des Fluoreszenzlichtes bei Beladung der Partikel ändert. Beladene Partikel folgen dem oszillierenden Magnetfeld langsamer als nicht beladene Partikel.
In dieser Ausführungsform ist es vorteilhaft, die Partikel bei hohen Frequenzen in der Mitte des Gefäßes zu fokussieren. Das Messvolumen findet sich vorteilhafterweise in der Mitte des entsprechenden Gefäßes.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das oszillierende Magnetfeld mittels eines Systems von linear bewegten Permanentmagneten erzeugt, die so angeordnet sind, dass die unbeladenen und die beladenen Partikel durch sein Magnetfeld bewegt werden.
Es ist insbesondere möglich, zwei Permanentmagnete auf gegenüberliegenden Seiten der Messvolumina anzuordnen, sodass die Nordpol-Südpol-Richtungen beider Magnete auf einer gemeinsamen Geraden liegen, auf der auch das Messvolumen liegt. Werden nun die Permanentmagnete entlang dieser gedachten Gerade oszillierend hin und her bewegt, so wird das Partikel in eine Schwingung versetzt. Das Partikel kann auf diese Weise also zum Schwingen angeregt werden.
Es ist auch möglich zwei Permanentmagneten beiderseits der Messvolumina anzuordnen und die Magneten in einer gemeinsamen Ebene, in der auch das Messvolumen liegt, synchron um jeweils 90° zu so zu drehen, dass die Magneten mit ihrer Nord-Süd-Richtung abwechselnd auf einer Geraden liegen, die durch das Messvolumen verläuft. Auf diese Weise ist also dem Messvolumen abwechselnd der Nordpol des einen Magneten und der Südpol des anderen Magneten zugewandt.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann das oszillierende Magnetfeld mittels eines Elektromagneten erzeugt werden, der so angeordnet ist, dass die unbeladenen und die beladenen Partikel durch sein Magnetfeld bewegt werden. Vorteilhafterweise wird hierbei die Remanenz mittels einer Simulation vorab bestimmt und ein entsprechendes Signal zur Erzeugung eines Koerzitivfeldes an den Elektromagneten angelegt. Hierdurch wird die Remanenz weitgehend kompensiert.
In den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen betreffend die Erzeugung des Magnetfeldes mit einem oder mehreren Permanentmagneten oder Elektromagneten wurde von einer Anordnung ausgegangen, bei dem der oder die Magneten ein gemeinsames Magnetfeld erzeugen, dass beide Messvolumina der beladenen und der unbeladenen Partikel durchsetzt. Sofern die beladenen und die unbeladenen Partikel in unterschiedlichen Gefäßen vorliegen, ist es jedoch auch möglich beide Gefäße und damit beide Messvolumina mit jeweils eigenen Magnetfeldern zu durchsetzten, insbesondere indem für jedes Gefäß ein eigener Magnet oder ein eigenes System von Magneten vorgesehen wird. Zur Bestimmung der Phasendifferenz zwischen der Schwingung der beladenen Partikel und der unbeladenen Partikel ist es dann jedoch erforderlich, die jeweilige Phasenverschiebung relativ zum anregenden Magnetfeld zu bestimmen und aus diesen Phasenverschiebungen die Differenz der Phasen der Schwingungen der beladenen und der unbeladenen Partikel zu berechnen. Vorteilhafterweise schwingen die anregenden Magnetfelder für die beladenen und die unbeladenen Partikel hier mit der gleichen Frequenz.
Vorteilhafterweise ist die Frequenz der Oszillation des anregenden Magnetfelds größer oder gleich 0,01 Hz, vorzugsweise größer oder gleich 0,1 Hz, vorzugsweise größer oder gleich 10 Hz, besonders bevorzugt größer oder gleich 30 Hz. Außerdem ist vorzugsweise die Frequenz der Oszillation des anregenden Magnetfelds kleiner oder gleich 100 Hz, vorzugsweise kleiner oder gleich 80 Hz, vorzugsweise kleiner oder gleich 60 Hz.
Vorteilhafterweise bedeutet die Beladung des Partikels, dass zumindest ein Molekül, das vom oben beschriebenen zusätzlichen fluoreszierenden Molekül verschieden ist, und/oder zumindest eine Zelle an das Partikel gebunden ist.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann an das zumindest eine an das Partikel gebundene Molekül oder die zumindest eine an das Partikel gebundene Zelle vor Messung der Phasenverschiebung zumindest ein weiteres, nicht magnetisches Partikel gebunden werden. Die beladenen Partikel weisen in dieser Ausführungsform dann also zum Zeitpunkt der Messung zum einen das Partikel selbst, darüber hinaus das oder die zu analysierenden Moleküle oder die zu analysierende Zelle oder die zu analysierenden Zellen und zusätzlich ein weiteres Partikel auf. Hierzu kann vorzugsweise das weitere Partikel so ausgestaltet sein, dass es an das zu analysierende Molekül oder die zu analysierende Zelle binden kann. Vorteilhafterweise ist dieses weitere Partikel nicht magnetisch. Das Gesamtsystem aus magentischem Partikel, Molekül oder Zelle und unmagnetischem Partikel erfährt also durch das anregende Magnetfeld die gleiche Magnetkraft wie die unbeladenen Partikel, hat jedoch durch das zusätzliche Partikel eine wesentlich höhere Masse. Hierdurch sind die beladenen Partikel besser von den unbeladenen Partikeln zu unterscheiden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können die Zeitpunkte der Durchgänge der beladenen und der unbeladenen Partikel jeweils für eine Mehrzahl von Perioden der Schwingung gemessen werden. Es kann dann als Phasendifferenz, aus der auf den Beladungszustand geschlossen wird, ein Mittelwert der für die Mehrzahl für die Perioden jeweils bestimmten Phasendifferenzen bestimmt werden.
Vorzugsweise wird die Geometrie der das oszillierende Magnetfeld erzeugenden Magneten so ausgestaltet, dass eine optimale Bewegungsbahn der Partikel erzielt wird.
Werden Permanentmagneten eingesetzt, so können diese, beispielsweise bei Verwendung einer 5,6 mm × 5,6 mm × 10 mm großen Küvette als Probengefäß, vorteilhafterweise konisch zulaufen und eine Länge von größer oder gleich 5 mm, besonders bevorzugt größer gleich 10 mm und/oder kleiner gleich 20 mm, besonders bevorzugt kleiner gleich 15 mm und besonders bevorzugt von gleich 13 mm aufweisen. Der Durchmesser kann auf zumindest einem Teil der Länge beispielsweise größer oder gleich 10 mm und/oder kleiner oder gleich 17 mm, besonders bevorzugt gleich 14 mm betragen, beispielsweise auf einer Länge von 9 mm. Auf einem Teil der Länge von beispielsweise 4 mm kann der Permanentmagnet konisch zu einem Enddurchmesser an der Spitze von beispielsweise 2 mm zulaufen.
Auch Elektromagneten können erfindungsgemäß zum Einsatz kommen. Diese können vorzugsweise eine Länge von größer oder gleich 80 mm, besonders bevorzugt größer gleich 100 mm und/oder kleiner oder gleich 170 mm, vorzugsweise kleiner oder gleich 150 mm, besonders bevorzugt gleich 130 mm haben. Ein Kerndurchmesser des Elektromagneten kann vorzugsweise größer oder gleich 10 mm, besonders bevorzugt größer oder gleich 15 mm und/oder kleiner gleich 30 mm, kleiner gleich 25 mm und besonders bevorzugt gleich 20 mm betragen. Die Kernlänge kann beispielsweise größer oder gleich 80 mm und/oder kleiner gleich 120 mm, vorzugsweise gleich 100 mm betragen. Vorzugsweise läuft der Kern konisch auf einen Enddurchmesser an den Spitzen zu, der beispielsweise 16 mm betragen kann. Die Spule kann beispielsweise einen Durchmesser von größer oder gleich 50 mm und/oder kleiner gleich 70 mm, besonders bevorzugt von gleich 66 mm haben. Die Länge der Spule kann beispielsweise zwischen 80 und 120 mm betragen und besonders bevorzugt gleich 100 mm betragen. Eine Windungszahl der Spule kann beispielsweise bei 1100 liegen. Es kann beispielsweise eine Stromstärke von 3 Ampere mit einer Frequenz von 0,1 Hz durch die Spule geleitet werden.
Als Gefäß für die beladenen Partikel und als Gefäß für die unbeladenen Partikel kann beispielsweise jeweils eine Küvette zum Einsatz kommen. Diese hat vorzugsweise eine quadratische Grundfläche. Beispielsweise kann die Grundfläche 5,6 × 5,6 mm² betragen und die Küvette kann beispielsweise eine Höhe von 10 mm haben.
Das Gefäß, welches die Suspension der beladenen oder unbeladenen Partikel aufnimmt, kann wie beschrieben eine Küvette sein und beispielsweise ein maxmiales Füllvolumen von größer oder gleich 100 μl und/oder kleiner 1 ml haben. Vorzugsweise beträgt das maximale Füllvolumen gleich 160 μl.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand einiger Figuren beispielhaft erläutert werden. Gleiche Bezugszeichen kennzeichnen dabei gleich oder entsprechende Merkmale. Die in den Beispielen beschriebenen Merkmale können auch unabhängig vom konkreten Beispiel realisiert sein und unter verschiedenen Beispielen miteinander kombiniert werden.
Es zeigt
1 schematisch das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens,
2 schematisch eine mögliche Anregung von Partikeln,
3 eine Vorrichtung zur Messung des Beladungszustands von Partikeln entsprechend der vorliegenden Erfindung und
1 zeigt schematisch ein Beispiel, wie das erfindungsgemäße Verfahren zur Messung des Beladungszustandes von Partikeln durchgeführt werden kann. Es sind hierbei Partikel, von denen ein Partikel 4 gezeigt ist, in einem Medium suspendiert. Die Suspension befindet sich in einem Gefäß 3, beispielsweise einer Küvette 3. Um den Beladungszustand des Partikels 4 zu bestimmen, wird dieses mittels zumindest eines Magneten, im gezeigten mit zweier Magneten 1 und 2 zum Schwingen angeregt. Erfindungsgemäß liegt der in 1 gezeigte Zustand zum einen für die beladenen Partikel sowie für die unbeladenen Partikel vor. Da das Verfahren in beiden Fällen auf die gleiche Weise abläuft, ist hier nur eine Küvette 3 mit einer Art von Teilchen 4 gezeigt.
Im gezeigten Beispiel ist mit den Magneten 1 und 2 ein oszillierendes Magnetfeld erzeugbar. Hierzu können beispielsweise die Magneten 1 und 2 beweglich sein oder es können die Magneten 1 und 2 Elektromagneten sein, die mit einer Wechselspannung beaufschlagt werden.
Wird mittels der Magneten 1 und 2 im gezeigten Beispiel ein oszillierendes Magnetfeld angelegt, so folgt das Teilchen 4, das magnetisch oder magnetisierbar ist, der Bahn 5, es oszilliert also zwischen den beiden gegenüberliegenden Seitenwänden der Küvette 3 hin und her.
Im Inneren der Küvette 3 ist ein Messvolumen 6 vorgesehen, durch welches ein Durchgang des Partikels 4 detektierbar ist. Ist das Teilchen 4 fluoreszierend, so kann beispielsweise ein Lichtdetektor, wie beispielsweise ein Fotomulitplier, eine Avalanche-Fotodiode, ein CCD-Sensor und/oder ein CMOS-Sensor auf das Messvolumen 6 fokussiert werden. Die entsprechenden Sensoren sind in der Figur nicht eingezeichnet. Es ist auch möglich, mittels einer Lichtquelle wie beispielsweise eines Lasers in das Messvolumen 6 einzustrahlen und durch die Küvette durchtretendes Licht oder im Messvolumen reflektiertes Licht zu detektieren. Im Falle von durchtretendem Licht zeigt sich ein Durchgang des Teilchens in einer Verringerung der Intensität und im Falle des reflektierten Lichtes in einer Erhöhung der Intensität.
Alternativ ist es auch möglich, das Messvolumen in eine Spule oder ein System von Spulen einzubringen, deren Induktivität sich ändert, wenn das magentische Teilchen 4 sich durch das Messvolumen 6 hindurch bewegt.
Erfindungsgemäß wird mittels des geeigneten Detektors als Maß für die Phase des Teilchens ein Zeitpunkt bestimmt, zu dem das Teilchen 4 durch das Messvolumen durchtritt. Dieser Zeitpunkt wird für die beladenen, wie auch die unbeladenen Teilchen 4, bestimmt. Eine Zeitdifferenz zwischen dem Durchtreten des beladenen Teilchens durch das entsprechende Messvolumen und dem Durchtreten des unbeladenen Teilchens durch das entsprechende Messvolumen wird als Phasendifferenz bestimmt, aus der auf den Beladungszustand des beladenen Partikels geschlossen wird.
Die Messung muss nicht notwendigerweise nur mit einem einzelnen Teilchen 4 durchgeführt werden, sondern kann auch mit Gruppen von Teilchen 4 durchgeführt werden.
Sofern das Teilchen 4 sich bei seinem Durchgang durch das Messvolumen 6 eine längere Zeit in diesem Messvolumen 6 aufhält, so wird vorzugsweise eine bestimmte Phase des Durchgangs des Teilchens durch das Messvolumens als den Zeitpunkt des Durchgangs bestimmend festgelegt. Die kann beispielsweise der Eintritt des Teilchens ins Messvolumen sein, der Austritt des Teilchens aus den Messvolumen oder ein Durchgang des Teilchens durch die Mitte des Messvolumens. Entsprechende Definitionen können für Gruppen von Teilchen 4 gefunden werden.
Vernachlässigt man der Einfachheit halber alle Einflüsse auf die Partikel abgesehen von einer linearen Reibung und dem Magnetfeld, so kann der Einfluss der Masse des Partikels auf die Phasenverschiebung analytisch einfach beschrieben werden.
Zwischen der Phasenverschiebung φ_u,b der Schwingung der beladenen und unbeladenen Partikel zum anregenden Magnetfeld einerseits und der Masse m_u,b der jeweiligen Partikel andererseits besteht dann der Zusammenhang φ_u,b(ω) = arctan(–2γ_u,b/ω) wobei γ_u,b = c/(2m_u,b) ist.
Dabei bezeichnet der Index u die unbeladenen Partikel und der Index b die beladenen Partikel. Die Größe c ist hier ein Dämpfungskoeffizient, der die Dämpfung der Teilchen durch das Medium, in dem sie suspendiert sind, angibt. ω bezeichnet die Frequenz des anregenden Magnetfelds.
In der Praxis ist es jedoch vorteilhaft, das Antwortverhalten der Partikel im anregenden Magnetfeld durch eine numerische Simulation basierend auf dem Zusammenhang F_mag + F_hydr = m_parta_part zu bestimmen. Dabei ist F_mag die auf das Partikel wirkende Magnetkraft, F_hydr die Summe aller hydrodynamischen Kräfte und Reibungskräfte, m_part die Masse des Partikels und a_part die Beschleunigung des Partikels.
Vorzugsweise oszilliert das durch die Magneten 1 und 2 erzeugte Magnetfeld mit einer Frequenz ω größer oder gleich 0,01 Hz, vorzugsweise größer oder gleich 1 Hz, vorzugsweise größer oder gleich 10 Hz, vorzugsweise größer oder gleich 30 Hz und/oder kleiner oder gleich 100 Hz, vorzugsweise kleiner gleich 80 Hz, vorzugsweise kleiner oder gleich 60 Hz.
Im gezeigten Beispiel kann das Partikel 4 fluoreszieren. Es ist erfindungsgemäß auch möglich, ein weiteres Molekül an das Partikel 4 anzubinden, das mit einer anderen Frequenz fluoresziert als das Partikel 4 selbst. Wird der Durchgang des Partikels 4 durch das Messvolumen 6 durch Detektion von Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen 6 bestimmt, so kann in diesem Fall nur jenes Signal als Durchgang des Partikels 4 gewertet werden, bei dem fluoreszierendes Licht in beiden Frequenzen gleichzeitig gemessen wird.
2 zeigt schematisch einen Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. In 2 sind die das oszillierende Magnetfeld erzeugende Magneten 1 und 2 Permanentmagneten, die in gleiche Richtung ausgerichtet sind. Werden die Permanentmagneten 1 und 2 synchron in Richtung ihrer Nord-Süd-Richtung linear hin und her bewegt, so ergibt sich eine Schwingung des Partikels 4 in dieser Richtung mit einer bestimmten Amplitude. Dabei durchtritt das Partikel 4 periodisch das Messvolumen, das in 2 nicht eingezeichnet ist. Die Situation gestaltet sich so wie in 1 gezeigt.
3 zeigt einen Aufbau zur Messung des Beladungszustands von Partikeln. Insbesondere kann mit diesem Aufbau das erfindungsgemäße Verfahren durchführbar sein.
Im in 3 gezeigten Beispiel enthält die Küvette 3 eine Suspension der beladenen oder unbeladenen Partikel. Eine Küvette 3 mit der anderen Partikelsorte kann unmittelbar neben der gezeigten Küvette 3 angeordnet sein. Die im Folgenden beschriebenen Bestandteile der Vorrichtung wirken dann auf beide Küvetten in gleicher Weise.
Die Küvette 3 wird mittels Magneten 1 und 2 mit einem oszillierenden Magnetfeld beaufschlagt. Aufgrund dieses Magnetfeldes bewegen sich die suspendierten Partikel im Inneren der Küvette 3 periodisch durch das Messvolumen 6 hindurch. Im beispielhaft gezeigten Aufbau der 3 wird über ein Objektiv 7 Licht in das Messvolumen 6 eingestrahlt. Das Licht kann beispielsweise mittels einer Lichtleitfaser 8 zur Verfügung gestellt werden, die über eine Linse 9 und einen Extraktionsfilter 10 auf einen halbdurchlässigen Spiegel 11 strahlt. Der halbdurchlässige Spiegel 11 leitet das Licht in das Objektiv 7, welches das Licht in das Messvolumen 6 bündelt.
Gehen nun die zu detektierenden Teilchen oder Gruppen dieser Teilchen durch das Messvolumen 6 hindurch, so reflektieren sie das eingestrahlte Licht. Das reflektierte Licht fällt wiederum in das Objektiv 7 ein, von wo aus es auf den halbdurchlässigen Spiegel 11 trifft. Es tritt durch diesen hindurch auf einen optionalen Emissionsfilter 12 und eine Linse 13, durch welche das Licht in einen Photodetektor 14 fokussiert wird. Der Fotodetektor 14 kann beispielsweise einen Fotomultiplier, eine Avalanche-Diode, einen CCD-Sensor oder einen CMOS-Sensor aufweisen. Der Spiegel 11 kann hier ein dichroitischer Spiegel sein.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 8026716 B2 [0005]

Claims

Verfahren zur Messung des Beladungszustandes von Partikeln, wobei suspendierte unbeladene Partikel und suspendierte beladene Partikel, deren Beladungszustand zu bestimmen ist, mittels eines oszillierenden Magnetfeldes zum Schwingen angeregt werden, eine Phasendifferenz zwischen der Schwingung der unbeladenen Partikel und der Schwingung der beladenen Partikel bestimmt wird, und aus der Phasendifferenz auf den Beladungszustand der beladenen Partikel geschlossen wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei als Phase der Schwingung der beladenen und unbeladenen Partikel jeweils ein Zeitpunkt des Durchgangs eines der entsprechenden Partikel oder einer Gruppe der entsprechenden Partikel durch ein jeweils vorgegebenes Messvolumen bestimmt wird, und als Phasendifferenz eine Zeitdifferenz zwischen den Zeitpunkten der Durchgänge der beladenen und der unbeladenen Partikel durch das entsprechende Messvolumen bestimmt wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Partikel fluoreszierende Partikel sind, und wobei der Zeitpunkt des Durchgangs des oder der entsprechenden Partikel durch das entsprechende Messvolumen bestimmt wird, indem ein Photodetektor auf das entsprechende Messvolumen fokussiert wird, und als Zeitpunkt des Durchgangs des entsprechenden Partikels oder der Gruppe der entsprechenden Partikel durch das entsprechende Messvolumen ein Zeitpunkt bestimmt wird, zu dem der Photodetektor eine Intensitätserhöhung des detektierten Lichtes misst.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei an zumindest einige der unbeladenen und zumindest einige der beladenen Teilchen jeweils zumindest ein Molekül gebunden wird, das mit einer anderen Wellenlänge fluoresziert als das Partikel, und wobei als Zeitpunkt des Durchgangs des entsprechenden Partikels oder der Gruppe der entsprechenden Partikel durch das entsprechende Messvolumen ein Zeitpunkt bestimmt wird, zu dem eine Intensitätserhöhung des detektierten Lichtes beider Wellenlängen gleichzeitig gemessen wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der Photodetektor einen Photomultiplier, eine Avalanche-Photodiode, einen CCD Sensor und/oder einen CMOS Sensor aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Messvolumen in eine Spule oder ein System von Spulen mit einer gemeinsamen Induktivität eingebracht, wird und als Zeitpunkt des Durchgangs des entsprechenden Partikels oder der entsprechenden Gruppe von Partikeln durch das entsprechende Messvolumen ein Zeitpunkt einer Änderung der Induktivität oder einer Impedanz der Spule oder des Systems von Spulen bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Messvolumen mit Licht durchstrahlt wird, und als Zeitpunkt des Durchgangs des entsprechenden Partikels oder der entsprechenden Gruppe von Partikeln durch das entsprechende Messvolumen ein Zeitpunkt einer Verringerung der Intensität des durch das entsprechende Messvolumen durchtretenden Lichtes oder eine Erhöhung der Intensität des aus dem entsprechenden Messvolumen reflektierten Lichtes bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Partikel fluoreszierende Partikel sind, und wobei jeweils eine Polarisation des aus dem entsprechenden Messvolumen austretenden Lichtes gemessen wird, und als Zeitpunkt des Durchgangs des entsprechenden Partikels oder der Gruppe der entsprechenden Partikel ein Zeitpunkt der Änderung der Polarisation des aus dem entsprechenden Messvolumen austretenden Lichtes bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das oszillierende Magnetfeld mittels zumindest eines rotierenden Permanentmagneten erzeugt wird, der so angeordnet ist, dass die unbeladenen und die beladenen Partikel durch sein Magnetfeld bewegt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das oszillierende Magnetfeld mittels eines Elektromagneten erzeugt wird, der so angeordnet ist, dass die unbeladenen und die beladenen Partikel durch sein Magnetfeld bewegt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Frequenz der Oszillation des Magnetfeldes größer oder gleich 0,01 Hz, vorzugsweise größer oder gleich 1 Hz, vorzugsweise größer oder gleich 10 Hz, vorzugsweise größer oder gleich 30 Hz ist und/oder kleiner oder gleich 100 Hz, vorzugsweise kleiner oder gleich 80 Hz, vorzugsweise kleiner oder gleich 60 Hz beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die beladenen Partikel durch Anbindung zumindest eines Moleküls oder zumindest einer Zelle beladen sind.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei an das zumindest eine an das Partikel gebundene Molekül oder die zumindest eine an das Partikel gebundene Zelle vor Messung der Phasenverschiebung zumindest ein weiteres, nicht magnetisches Partikel gebunden wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, wobei die Zeitpunkte der Durchgänge für eine Mehrzahl von Perioden der Schwingung gemessen werden und die Phasendifferenz als Mittelwert der für die Mehrzahl der Perioden bestimmten Phasendifferenzen bestimmt wird.
Vorrichtung zur Messung des Beladungszustandes von Partikeln, aufweisend zumindest eine Magnetfelderzeugungseinheit, mit der ein oszillierendes Magnetfeld erzeugbar ist und zumindest einer Phasendifferenzbestimmungseinheit, mit der eine Phasendifferenz zwischen der Schwingung von unbeladenen Partikeln und von beladenen Partikeln bestimmbar ist, wobei mit der Vorrichtung ein Verfahren zur Messung des Beladungszustandes nach einem der vorhergehenden Ansprüche durchführbar ist.