DE102014005710A1

DE102014005710A1 - Erfindung betreffend eine Messmethode zur Detektion und quantitativen Bestimmung der Zellkonzentration

Info

Publication number: DE102014005710A1
Application number: DE201410005710
Authority: DE
Inventors: Peter Czermak; Pablo Pino Grace; Zoltán Kovács; Igor Stempin
Original assignee: TECH HOCHSCHULE MITTELHESSEN; Technische Hochschule Mittelhessen
Current assignee: TECH HOCHSCHULE MITTELHESSEN; Technische Hochschule Mittelhessen
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2014-04-22
Publication date: 2014-10-23

Abstract

Die Erfindung betrifft einen in-situ Biomassesensor mit Sauerstoffkonzentrationsmessung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Messmethode zur Detektion und quantitativen Bestimmung der Zellkonzentration/Biomasse durch oximetrische Messung der Umsetzungsrate des Gelöstsauerstoffs in der flüssigen Phase, in einer räumlich definierten Messzone, welche einen zum übrigen Medium abgeschlossenen Raum bildet.
Bei biotechnologischen Prozessen sind Kenntnisse der vorhandenen Prozessbedingungen elementar notwendig, um den Mikroorganismen die bestmöglichen Bedingungen zu gewährleisten, welche sie für ein optimales Wachstum und die größtmögliche Produktausbeute benötigen. In der biotechnologischen Prozessanalytik unterscheidet man zwischen drei Analysebereichen: den physikalischen Größen, den chemischen Größen und den biologischen Größen.
Die Kenntnis der Biomassekonzentration ist essentiell zur Bestimmung der Kinetik und Stöchiometrie von mikrobiellem Wachstum, da sie ein entscheidender Parameter für die Qualität und ein ausschlaggebendes Maß für die Effizienz des Kultivierungsprozesses selbst ist. Die Gewinnung von Prozessinformation in Echtzeit (online), ohne großen apparativen Aufwand gewinnt dabei immer mehr an Bedeutung.
Stand der Technik
Die zurzeit verwendeten Messmethoden lassen sich hierbei in direkte und indirekte Messverfahren unterscheiden.
Bei direkten Methoden kann die Biomassekonzentration/Zelldichte direkt ermittelt werden. Bei den indirekten Methoden wird die Biomassekonzentration über Rückschlüsse aus Wechselbeziehungen physikalischer oder chemischer Größen, wie z. B. Substrat-, Produkt- oder Metabolitenkonzentration bestimmt.
Zu den direkten Messmethoden zählen neben gravimetrischen Bestimmungsmethoden, wie z. B. die Messung der Biotrockenmassen (BTM) und der Bestimmung der Biofeuchtmasse (Zellnassgewicht) volumetrische Messverfahren (PCV: Packed Cell Volume). Diese beiden Bestimmungen können jedoch ausschließlich ex situ und offline mit teils erheblicher Zeitverzögerung erfolgen.
Optische Messverfahren, die auf die Wechselwirkung zwischen elektromagnetischer Strahlung und Materie basieren, finden breite Anwendung. Dabei spielen je nach Messverfahren Absorptions- oder Reflektionseffekte die entscheidende Rolle. Je nach apparativem Aufwand erfolgt die Messung hierbei in-situ (online), extern (at-line) oder im Bypass.
Hierzu zählen:

– Bestimmung der optischen Dichte (in-situ oder ex-situ)
– In-situ Turbidimetrie
– In-situ Nepthelometrie
– Durchflusszytometrie

Unlösliche Medienbestandteile, Gasbläschen und Fouling an der Sensoroptik haben bei allen optischen Messverfahren einen störenden Effekt.
Zudem können veränderliche Prozessparameter, wie die Rührerdrehzahl, die Begasungsrate und der Einsatz von Antischaummitteln bei der in-situ-Messung das Messergebnis zusätzlich verfälschen. Eine Differenzierung zwischen toten und lebenden Zellen, sowie eine Bestimmung der Viabilität ist hierbei ausgeschlossen. Neben Verfahren zur Zellzahlbestimmung wie der FBMR(Focused Beam Reflectance Measurement)-Technologie z. B. der Fa. Mettler-Toledo (in-situ) oder dem Hämozytometer stellen bildgebende, optische Messverfahren wie die in-situ Mikroskopie eine weitere Methode dar, Rückschlüssen auf die Biomassenkonzentration zu gewinnen.
Hierbei kann neben Zellkonzentration und Zellgröße, die Zellviabilität und Morphologie in-situ bestimmt werden. Jedoch ist die Auswertung der aufgenommenen Bilder zur Zeit relativ arbeitsintensiv. Rückschlüsse auf die Biomassekonzentration lassen sich hierbei auch nicht bei allen Konstruktionsansätzen gewinnen.
Die direkte Bestimmung der Biomasse ist oft nicht möglich, sondern ist nur über Wechselbeziehungen und Modellannahmen durch Messung anderer Medienkomponenten zugänglich. Hierzu haben sich eine Vielzahl von Messverfahren etabliert.
Dazu zählen die Messung des Substratverbrauches, mittels chemischer Analysen, dem Brechungsindex der Viskosität oder der Nah-Infrarotspektroskopie (NIR), der Sauerstoffverbrauch durch Bestimmung des Gelöstsauerstoffs durch eine Clark-Elektrode oder über optische Sensoren: des Stickstoffverbrauchs, mittels chemischer Analyse oder mit Hilfe einer in-situ-NH₂-Elektrode oder des Verbrauchs anderer Nährstoffe wie PO₄ ^3–, Mg² ⁺, K⁺, mit Hilfe von selektiven Elektroden: der Bestimmung von Zellkomponenten mittels Fluoreszenzspektroskopie: der Abgasanalytik: der Produktbildungsrate, mittels pH-Wert Messung oder der Bestimmung des Redoxpotentials. Zudem besteht die Möglichkeit über die kalorimetrische Messungen die Biomassekonzentration zu ermitteln.
Die Korrelation zur Biomassekonzentration erfolgt bei den indirekten Methoden in der Regel über schon bekannte empirische Massenbilanzen, die jedoch nicht immer vorliegen, eine Kombination aus mehreren Methoden erlaubt erst einen Rückschluss auf das Zellwachstum und damit die Zellkonzentration.
Ein entsprechendes Beispiel stellen die sogenannten Softsensoren oder auch Software-Sensoren dar.
Aufgabe
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile im Stand der Technik zu beseitigen und eine Messmethode bereitzustellen, bei welchem selbst niedrige Konzentrationen an Biomasse detektiert werden können, ohne dabei den laufenden Prozess zu stören oder zu beeinflussen.
Lösung der Aufgabe
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, indem eine räumlich definierte Messzone, welche einen zum restlichen Medium abgeschlossenen Raum bildet, im Behälter erzeugt wird.
Dieser abgeschlossene Messraum ermöglicht die Bestimmung des gelösten Sauerstoffs über eine zuvor definierte Messzeit.
Bei Anwesenheit von Sauerstoff verbrauchenden Mikroorganismen fällt der messbare gelöste Sauerstoff bis auf ein Minimum. Diese Messmethode basiert auf der oximetrischen Bestimmung des Sauerstoffgehalts/der Sauerstoffkonzentration/Sauerstoffpartialdrucks in der flüssigen Phase.
Da aerob aktive Zellen Sauerstoff verstoffwechseln, kommt es innerhalb eines abgeschlossenen Raumes zu einem Abfall der Sauerstoffkonzentration. Die Änderung der Sauerstoffkonzentration ist proportional zur Zellzahl x. Gleichung 1:
Bei höheren zellzahlen/Biomassekonzentrationen ist der prozentuelle Abfall der Sauerstoffsättigung innerhalb einer bestimmten Zeitspanne größer ( ).
Zur Bestimmung der Zellzahl gibt es ausgehen von Gleichung 1 mehrere Rechenwege, wie zum Beispiel die Bestimmung der Steigung: Gleichung 2:
Wobei Δt die Zeit ist, welche für einen Sauerstoffabfall von 100% auf 20% benötigt wird.
Wie in zu erkennen ist, verläuft die ermittelte Steigungskurve relativ kongruent mit den beiden Kurvenverläufen der Biotrockenmasse mit der optischen Dichte.
Das Messprinzip soll in beispielhaft verdeutlicht werden. Es handelt sich um eine in-situ Variante, welche durch eine Öffnung seitlich an der Reaktorwand eingelassen ist und ins Medium eintaucht. Die in-situ-Sonde besteht aus einem starren Außenrohr und einem sich um die Längsachse beweglichen Innenrohr, in welches am unteren Ende die oximetrische Messeinheit eingebunden ist. Bei dieser Darstellung handelt es sich um einen optischen Sensor eintaucht. Eine Realisierung mit der Clark-Elektrode oder anderer Oximeter ist möglich. Das Innenrohr bildet mit dem Stempel ein zusammenhängendes Bauteil. In befindet sich das Innenrohr und der dazu gehörige Stempel in der Ausgangsstellung. In beiden Rohren ist eine Bohrung bzw. ein Durchflusskanal (Messzone) angebracht.
Das umgebende Medium kann dadurch ungehindert durch den Durchflusskanal strömen. Zur Messung fährt das Innenrohr samt Stempel nach oben (laut Skizze nach rechts) in die Messstellung.
Durch diese räumliche Verschiebung des inneren Teils des Kanals kann das Medium durch den Durchflusskanal strömen, zudem wird ein weiteres Durchströmen durch den Stempel ausgeschlossen ( ). Der innere Teil des Kanals dient nun als Messzone, welche komplett abgeschlossen von jeglichen äußeren Einflüssen ist. Mit Hilfe der oximetrischen Einheit wird der Verlauf des Sauerstoffpartialdrucks ermittelt. Nach der Messung fahren das Innenrohr und der Stempel zurück in die Ausgangsstellung. Das umgebende medium kann wieder die nun offene Messzone (Durchflusskanal) strömen. Eine weitere Möglichkeit zur Realisierung stellt die Drehung des Durchflusskanals um eine horizontale Drehung von bis zu 90° (bei aufrechtem Stand der Sonde) dar. Die Steuerung der Drehbewegung oder der eindimensionalen Bewegung kann mechanisch, elektrisch, elektromagnetisch oder pneumatisch erfolgen.
Entsprechend dem Einsatzbereich kann hierbei ein optimaler Apparaturaufbau realisiert werden.
Ausschlaggebend ist ausschließlich die oximetrische Messung in einem abgeschlossenen Raum und ein sich der Messung anschließende mathematische Umrechnung der Sauerstoffkonzentration in die Biomassekonzentration.
Diese Messmethode unterscheidet sich von den übrigen Biomassebestimmungsmethoden, da sie ohne zeitliche Verzögerung, ohne umständliche mathematische Operationen, bei geringem apparativen Aufwand die Lebendzellzahlkonzentration und Viabilität dem Anwender direkt liefern und ihm damit einen entscheidenden Prozessparameter zugänglich macht, ohne dabei einen Einfluss auf das restliche System auszuüben (keine Beeinflussung auf das umgebende Medium bzw. den Produktionsprozess).
Ausgehend von der modularen Bauweise und der Unabhängigkeit von der Wahl der oximetrischen Einheit ist damit ein breites Anwendungsspektrum realisierbar.
Vorteile dieser Messmethode sind:

– Einfacher modularer Aufbau
– Breites Feld an Einsatzmöglichkeiten
– Kein Einfluss auf das umgebende System
– Unabhängigkeit der Messmethode von der Wahl der oximetrischen Einheit
– In der Messstellung ist eine direkte Bestimmung der lebendzellzahl aus der Sauerstoffmessung möglich
– Rückschlüsse auf die Zellviabilität sind möglich
– In der Ausgangsstellung ist eine kontinuierliche Messung der Sauerstoffkonzentration im gesamten Medium möglich
– Non-destruktiv
– kontinuierliche oder diskontinuierliche Messung möglich
– einfache Automatisierung möglich

Abbildungslegenden
zeigt die Bestimmung der Biomassenkonzentration mittels BTM, OD_600nm und biO₂ mass Sonde
Verlauf der Sauerstoffsättigung bei steigender Biomassekonzentration während einem Batchfermentationsprozess von Escherichia coli aufgenommen mit der biO₂ mass Sonde mit der Fibox 3 PreSens GmbH Regensburg und dem Sensorspot PSt3.
zeigt die Bestimmung der Sauerstoffsättigung Vergleich zwischen der BTM, der OD_600nm und der ermittelten Steigung m bei einem Batchfermentationsprozess.
zeigt die schematische Darstellung der in-situ-Sonde bei offener Messzone
zeigt die schematische Darstellung der in-situ-Sonde bei geschlossener Messzone
Bezugszeichenliste

1: Reaktorwand
2: starres Außenrohr
3: bewegliches Innenrohr
4: Glasfaserkabel
5: Dichtungsring
6: Glasfenster
7: Sensorspot
8: Messzone
9: Zellkulturmedium
10: Stempel

Claims

Sensor zur Bestimmung der Biomasse dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor ein Innenrohr und ein Außenrohr mit je einer Bohrung umfasst, wobei das Innenrohr zusätzlich eine Vorrichtung zur Messung der Sauerstoffkonzentration aufweist, und das Innenrohr innerhalb des Außenrohres so angeordnet ist, dass beide Bohrungen in einer Stellung einen Durchflusskanal bilden und in einer anderen Stellung durch Bewegung des Innenrohres die Bohrungen so angeordnet sind, dass der Durchflusskanal gesperrt ist und damit eine räumlich abgeschlossene Messzone darstellen.
Sensor nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegung des Innenrohres eine Verschiebung oder Drehung umfasst.
Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zur Messung der Sauerstoffkonzentration ein optischer Sensor, eine Clark-Elektrode oder ein Oximeter ist.