DE102013101456A1

DE102013101456A1 - Kulturgefäße zur Aufnahme eines Nährmediums für die Inokolum- oder Sporenproduktion im Rahmen einer in-vitro Massenproduktion von VA-Mykorrhizasporen

Info

Publication number: DE102013101456A1
Application number: DE201310101456
Authority: DE
Inventors: Antje Werwick; Angelika Spindler; Roland Watzke; Jasmin Brückner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-02-14
Filing date: 2013-02-14
Publication date: 2014-08-14
Anticipated expiration: 2033-02-15
Also published as: DE102013101456B4

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf Kulturgefäße zur Aufnahme eines Nährmediums für die Inokolum- oder Sporenproduktion im Rahmen einer in-vitro-Massenproduktion von VA-Mykorrhizasporen. Ausgehend von den Nachteilen des bekannten Standes der Technik sollen Kulturgefäße geschaffen werden, die die speziellen Anforderungen für eine in-vitro-Massenproduktion von VA-Mykorrhizasporen erfüllen, gute Wachstumsbedingungen ermöglichen sowie kostengünstig herstellbar sind. Hierzu werden als Lösung Kulturgefäße vorgeschlagen, die aus einem transparenten, leichten, biokompatiblen, sterilisierbaren Kunststoffbehälter 1 mit rechteckförmiger oder quadratischer Querschnittsfläche, einer Höhe der Seitenwände von 50 bis 500 mm und einer Füllmenge von mindestens 1,5 l bis 5 l Kulturmedium mit einer Füllhöhe in Zentimeter von 10 % bis 20 % der Menge des Kulturmediums bestehen. Die Kulturgefäße sind mit einem in den Behälter 1 einsetzbaren Rahmen 2 mit Siebgewebe 4 und einem leicht aufsetz- und abnehmbaren Deckel 3 mit einem umlaufenden überkragenden Rand 3a ausgerüstet.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Kulturgefäße zur Aufnahme eines Nährmediums für die Inokolum- oder Sporenproduktion im Rahmen einer in-vitro-Massenproduktion von VA-Mykorrhizasporen.
Aus der Literatur und der Praxis ist es bisher lediglich bekannt, Petrischalen als Kulturgefäße für die Inokolum- oder Sporenproduktion von VA-Mykorrhizasporen einzusetzen. Der Einsatz von Petrischalen für eine Massenproduktion ist ungeeignet. Z. B. werden für eine Produktion von 1 Billion VA-Mykorrhizasporen 25 Millionen Petrischalen benötigt. Für eine wirtschaftliche Massenproduktion werden Kulturgefäße benötigt, die die Anforderungen an maschinelle Reinigungs- und Sterilisationsbedingungen erfüllen. Wesentlich ist, dass unter den vorhandenen Produktionsbedingungen im Nährmedium eine hohe Anzahl an Wurzeln bzw. Sporen gebildet werden. Das eingesetzte Nährmedium geht in den Gelzustand über und muss sich nach Beendigung der Produktionsphase wieder leicht aus dem Kulturgefäß entfernen lassen.
Die Kulturgefäße sollen ein möglichst geringes Gewicht und eine hohe mechanische Belastbarkeit besitzen. Außerdem müssen diese aus einem Material bestehen, dass die Anforderungen an Biokompatibilität, optische Transparenz und Autoklavierbarkeit erfüllt. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Kulturgefäße zur Aufnahme eines Nährmediums für die Inokolum- oder Sporenproduktion zu schaffen, die die vorstehend genannten Anforderungen im Rahmen einer in-vitro-Massenproduktion von VA-Mykorrhizasporen erfüllen und insbesondere gute Wachstumsbedingungen ermöglichen sowie kostengünstig herstellbar sind.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die im Anspruch 1 angegebenen Merkmale gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 8.
Die vorgeschlagenen Kulturgefäße zur Aufnahme eines Nährmediums für die Inokolum- oder Sporenproduktion im Rahmen einer in-vitro-Massenproduktion von VA-Mykorrhizasporen bestehen aus einem transparenten, leichten, biokompatiblen, sterilisierbaren Kunststoffbehälter mit rechteckförmiger oder quadratischer Querschnittsfläche und einer Höhe von 50 bis 500 mm. Das Aufnahmevermögen für das jeweilige Kulturmedium sollte mindestens 1,5 l bis 5 l betragen, wobei die Füllhöhe in Zentimeter von 10 % bis 20 % der Menge des Kulturmediums beträgt. Zum Kulturgefäß gehören weiterhin ein in den Behälter einsetzbarer Rahmen mit Siebgewebe sowie ein leicht aufsetz- und abnehmbarer Deckel mit einem umlaufenden überkragenden Rand.
Der Behälter oder Deckel ist mit einer Meßsonde ausrüstbar, die zur Bestimmung des CO₂-Gehaltes im Gasraum über dem Nährmedium vorgesehen ist. Außerdem kann der Behälter mit Elektroden ausgerüstet werden, die zur Messung der elektrischen Impedanz im Nährmedium bestimmt sind.
Deckel bzw. Behälter besitzen hierzu entsprechende Aufnahmen zum Einsetzen der Meßsonden bzw. Elektroden.
Behälter und Deckel bestehen aus einem Kunststoffmaterial, das sich durch geringes Gewicht, Biokompatibilität, Autoklavierbarkeit, mechanische Belastbarkeit und optische Transparenz auszeichnet. Außerdem muss da Kunststoffmaterial gut verträglich für die Sporenwurzelkultur sein. Als geeignetes Material hat sich transparentes Polycarbonat Calibre erwiesen.
Der Rahmen besteht aus zwei identischen Rahmenbauteilen zwischen denen das Siebgewebe eingespannt ist. Die beiden Rahmenbauteile werden mittels aufsteckbarer Klammern zusammengehalten. Dadurch lässt sich der Rahmen für eine erforderliche Reinigung und Sterilisation mit wenigen Handgriffen in seine Einzelteile zerlegen und wieder montieren.
Die Rahmenbauteile bestehen vorzugsweise aus nichtrostendem Stahl.
Die Maschenweite des Siebgewebes, das aus Polyester besteht, sollte 0,5 bis 2 mm betragen.
Der Behälter ist so ausgeführt, dass die Eckbereiche zwischen benachbarten Seitenwänden und zwischen den Seitenwänden und dem Boden abgerundet sind.
Dadurch lässt sich das Nährmedium nach Beendigung eines Produktionszyklusses leichter entfernen und der nachfolgende Reinigungsaufwand wird geringer.
Die Erfindung soll nachfolgend an einem Beispiel näher erläutert werden. In der zugehörigen Zeichnung zeigen:
1 eine Ausführung des Kulturgefäßes als Seitenansicht,
2 den einsetzbaren Rahmen als Seitenansicht und
3 das Kulturgefäß als Draufsicht.
Die Kulturgefäße zur Anzucht von Inokulationsmaterial oder zur Bildung von VA-Mykorrhizasporen bestehen aus einem quaderförmigen Behälter 1, einem einsetzbaren Rahmen 2 und einem lose aufsetzbaren und wieder abnehmbaren Deckel 3.
Behälter 1 und Deckel 3 sind aus einem transparenten, leichten, biokompatiblen, sterilisierbaren Kunststoff, vorzugsweise Polycarbonat Calibre, hergestellt. Im Rahmen umfangreicher Versuche hat sich herausgestellt, dass dieses Material die erforderlichen Anforderungen hinsichtlich Verträglichkeit in der Sporenwurzelkultur (keine negativen Auswirkungen auf Sporenkeimung, Wurzel- und Hyphenwachstum, Bildung sekundärer Sporen) besitzt.
Der Rahmen 2 (2), der entweder auf dem festen Nähr- bzw. Kulturmedium aufliegt oder mit Füßen ausgerüstet ist, besteht aus zwei deckungsgleichen, beispielsweise 15 mm breiten Rahmenteilen 2a und 2b aus nichtrostendem Stahl. Zwischen diesen ist ein Gewebe 4 zur Fixierung der Wurzelkultur eingespannt. Die Befestigung des Gewebes 4 zwischen den Rahmenbauteilen 2a und 2b erfolgt mittels symmetrisch angeordneter Klammern 5 aus nichtrostendem Stahl. Diese Rahmenkonstruktion gewährleistet durch das Eigengewicht des Stahls einen intensiven Oberflächenkontakt der mykorrhizierten Wurzeln mit der Oberfläche des im Behälter befindlichen festen Kulturmediums.
Das Gewebe 4 besteht aus einem biokompatiblen, sterilisierbaren Polyester, das mehrfach wiederverwendbar ist. Zur optimalen Fixierung sollte die Maschenweite nicht größer als 2 mm sein. Das Gewebe dient als Verankerungs- und Wachstumshilfe. Das Wurzelwachstum erfolgt entlang des Gewebes auf der Medienoberfläche der Kultur. Das Wurzelwachstum in die Tiefe des Nährmediums wird dadurch deutlich reduziert, das Hyphenwachstum aber nicht behindert. Die Sporen werden hauptsächlich im Medium unterhalb des Rahmens gebildet.
In den beiden kurzen Seitenwänden des Behälters 1 sind in ca. 1 cm Abstand vom Boden des Behälters Elektroden 7 zur Messung der elektrischen Impedanz angeordnet, die in das Nährmedium ragen. Durch die Messung der elektrischen Impedanz im Nährmedium ist wird eine online – Prozesskontrolle der Wachstumsbedingungen ermöglicht.
Der Deckel 3 hat an den Seiten einen 2 cm überkragenden Rand 3a, um das Kontaminationsrisiko auszuschließen und das Austrocknen der Kultur zu verhindern.
Im Deckel 3 ist eine nicht näher gezeigte Anschlussstelle für eine Meßsonde vorgesehen. Mittels der Meßsonde wird der CO₂-Gehalt im Gasraum über dem Nährmedium gemessen, um bei Bedarf den CO₂-Gehalt auf den gewünschten Wert einzustellen
Bei Bedarf sind Peripherieanschlüsse durch zusätzliche Aussparrungen im Deckel nachrüstbar. Die Übergänge vom Boden zu den Seitenwänden und Eckbereiche im Innenraum des Behälters 1 sind rund gestaltet, um die Entnahme des Gels zur Sporenernte zu vereinfachen.
Der Behälter 1 eines quaderförmigen Kulturgefäßes hat z.B. folgende Abmessungen: 130 × 530 × 330 mm (Höhe × Breite × Tiefe).
Je nach Größe sind die Kulturgefäße zur Aufnahme von 1,5 l oder 5 l Kulturmedium bestimmt, bei einer Medienschichtdicke von 1,5 cm bzw. 5 cm. Die Füllhöhe in Zentimeter Kulturmedium sollte 10 % bis 20 % der Menge an Kulturmedium betragen. Die Höhe des Behälters entspricht dann in etwa dem 2- bis 3-fachen der Füllhöhe.
Diese Größe wurde in einer Vielzahl von Untersuchungen bestimmt und stellt ein Optimum zwischen Ausbeute, praktischem Handling und Produktionssicherheit dar. Die Grundfläche der Kulturgefäße kann vergrößert werden. Entscheidend ist die Medienfüllhöhe.
Der Deckel 3 ist passgenau auf den Behälter aufsetzbar.
Die Einzelteile des Kulturgefäßes, Behälter, Rahmen, Gewebe, Deckel und Klammern müssen bei einer Temperatur von 121 °C dampfsterilisierbar sein.
Die Transparenz der eingesetzten Kunststoffmaterialien ermöglicht eine visuelle Kontrolle des Wachstumsprozesses. Die inerten Oberflächeneigenschaften des Materials sichern eine biokompatible Produktion ohne nachteiliges Beeinflussen der Organismen. Das geringe Eigengewicht bei hoher Stabilität erleichtert die Handhabung, Lagerung und den Transport der Gefäße im Produktionsprozess.
Die vorstehend beschriebenen Kulturgefäße sind sowohl für die Anzucht von Inokulationsmaterial (mykorrhizierte Wurzeln) als auch für den Prozess zur Bildung von in-vitro-VA-Mykorrhizasporen geeignet.
Der einzige technische Unterschied besteht darin, dass am Rahmen des zweiten Kulturgefäßes für die Anzucht von Inokulationsmaterial Füße angeordnet sind, deren Höhe auf die Höhe des Kulturmediums abgestimmt ist.
Mit dem neuen Kulturgefäß für 5-Liter Kulturmedium konnte in Versuchen eine Produktion von 3000 bis 6000 Sporen/ml Medium statistisch sicher realisiert werden.
Für eine erfolgreiche Massenproduktion der in-vitro-VA-Mykorrhizasporen hat sich die Entwicklung entsprechender Kulturgefäße als wesentlich erwiesen. Unter Massenproduktion ist eine Jahresproduktion von mindestens ca. 1 Billion in-vitro-VA-Mykorrhizasporen zu verstehen. Hierfür werden ca. 25000 der beschriebenen Kulturgefäße benötigt.

Claims

Kulturgefäße zur Aufnahme eines Nährmediums für die Inokolum- oder Sporenproduktion im Rahmen einer in-vitro-Massenproduktion von VA-Mykorrhizasporen, dadurch gekennzeichnet, dass diese aus einem transparenten, leichten, biokompatiblen, sterilisierbaren Kunststoffbehälter (1) mit rechteckförmiger oder quadratischer Querschnittsfläche, einer Höhe der Seitenwände von 50 bis 500 mm und einer Füllmenge von mindestens 1,5 l bis 5 l Kulturmedium mit einer Füllhöhe in Zentimeter von 10 % bis 20 % der Menge des Kulturmediums, einem in den Behälter (1) einsetzbaren Rahmen (2) mit Siebgewebe (4) und einem leicht aufsetz- und abnehmbaren Deckel (3) mit einem umlaufenden überkragenden Rand (3a) bestehen.
Kulturgefäße nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kunststoffbehälter (1) und/oder Deckel (3) mit mindestens einer Meßsonde zur Bestimmung des CO₂-Gehaltes im Gasraum über dem Nährmedium ausgerüstet sind.
Kulturgefäße nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im unteren Bereich der Seitenwände Elektroden (7) zur Messung der elektrischen Impedanz im Nährmedium angeordnet sind.
Kulturgefäße nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Rahmen (2) aus zwei identischen Rahmenbauteilen (2a, 2b) besteht, zwischen denen das Siebgewebe (4) eingespannt ist und die beiden Rahmenbauteile (2a, 2b) mittels aufsteckbarer Klammern (5) zusammengehalten sind.
Kulturgefäße nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Rahmenbauteile (2a, 2b) aus nichtrostendem Stahl bestehen.
Kulturgefäße nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Siebgewebe (4) aus Polyester mit einer Maschenweite von 0,5 bis 2 mm besteht.
Kulturgefäße nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Behälter (1) und Deckel (3) aus transparentem Polycarbonat Calibre bestehen.
Kulturgefäße nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter (1) zwischen benachbarten Seitenwänden und zwischen den Seitenwänden und dem Boden abgerundete Eckbereiche besitzt.