DE102013014637A1 - HELMlNTHOSPORlUM TURClCUM-RESlSTENTE PFLANZE - Google Patents

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Abstract

Durch die vorliegende Erfindung wird eine verbesserte Helminthosporium turcicum-resistente Pflanze, insbesondere eine Maispflanze, welche ein Polynukleotid mit einem oder mehreren Resistenz-vermittelnden Genen beispielsweise auf einem trunkierten Chromosomfragment aus der Akzession Pepitilla umfasst, sowie eine Zelle, ein Gewebe, ein Teil, Korn und Samen davon, ein isoliertes Polynukleotid, das ein oder mehrere Resistenz-vermittelnden Genen gegen Helminthosporium turcicum umfasst, einen Vektor, eine transgene Pflanzenzelle und eine transgene Pflanze, enthaltend dieses Polynukleotid. Ferner sind von der Erfindung auch geeignete Marker und deren Verwendung zum Einbringen der Resistenz oder des Transgens in eine Pflanze sowie die Identifikation von verbesserten Maispflanzen, die ein trunkiertes Chromosomfragment aufweisen, miterfasst.

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Modifikation von Pflanzen mittels molekularbiologischer Methoden und Markertechnologie und der Gentechnik. Sie betrifft eine neue Helminthosporium turcicum-resistente Pflanze, insbesondere eine Maispflanze, welche ein Polynukleotid mit einem oder mehreren Resistenz-vermittelnden Genen auf einem modifizierten Chromosomfragment aus der Akzession Pepitilla umfasst, sowie eine Zelle, ein Gewebe, ein Teil, Korn und Samen davon, ein isoliertes Polynukleotid, das ein oder mehrere Resistenz-vermittelnden Genen gegen Helminthosporium turcicum umfasst, einen Vektor, eine transgene Pflanzenzelle und eine transgene Pflanze, enthaltend dieses Polynukleotid. Ferner sind von der Erfindung auch geeignete molekulare Marker und deren Verwendung zum Einbringen der Resistenz oder des Transgens in eine Pflanze sowie die Identifikation von verbesserten Maispflanzen, die ein modifiziertes Chromosomfragment aufweisen, miterfasst.
  • Hintergrund der Erfindung
  • In Mais (Zea mays L.) findet man eine große Zahl von pilzlichen Pathogenen die Blatterkrankungen hervorrufen. Der Pilz, der unter tropischen aber auch den gemäßigten Klimabedingungen, wie sie in großen Teilen Europas und Nordamerikas, aber auch Afrika und Indien vorherrschen, den mit Abstand größten Schaden verursachen kann, ist unter Helminthosporium turcicum oder syn. auch Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard et Suggs (Teleomorphe: Setosphaeria turcica (Luttrell) Leonard & Suggs) bekannt. H. turcicum ist der Verursacher der Blattfleckenkrankheit 'Northern Corn Leaf Blight' (NCLB), die in feuchten Jahren als Epidemie gegenüber anfälligen Maissorten hoch schädigend auftreten kann und dann beträchtlichen Ertragseinbußen von 30% und mehr über große Flächen zur Folge hat (Perkins & Pedersen, 1987; Raymundo & Hooker, 1981a; Ullstrup & Miles, 1957). Seit den 1970er Jahren wurde daher in genetischem Material nach natürlichen Resistenzen gesucht. Heute sind quantitative und qualitative Resistenzen bekannt. Während die oligo- oder polygenisch vererbte quantitative Resistenz unvollständig und rassenunspezifisch im Phänotyp erscheint und durch zusätzliche und partiell-dominante Gene beeinflusst wird, ist die qualitative Resistenz typischerweise rassenspezifisch und kann durch einzelne zumeist dominante Gene wie Ht1, Ht2, Ht3, Htm1 oder Htn1 vererbt werden (Lipps et al., 1997; Welz & Geiger, 2000). Durch Rückkreuzungen gelang in zahlreichen häufig verwendeten Inzucht-Maislinien wie W22, A619, B37 oder B73 die Introgression der Ht-Gene, wo sie eine partielle Dominanz und eine Expression in Abhängigkeit vom jeweiligen genetischen Hintergrund zeigten (Welz, 1998).
  • Trotz dieser komplexen genetischen Architektur der NCLB-Resistenz im Mais war bislang vornehmlich die Verwendung des Gens Ht1 in Mais zusammen mit einer partiellen quantitativen Resistenz ausreichend, um die Helminthosporiosis zu kontrollieren (Welz, 1998). Der Grund hierfür ist, dass die Rasse 0 von H. turcicum weltweit mit ca. 55% mit Abstand vorherrschend ist (Lipps et al., 1997; Ferguson & Carson, 2007), während andere Rassen wie 2N und 23N dagegen nur sehr selten und häufig geographisch begrenzt auftreten (Moghaddam & Pataky, 1994; Jordan et al., 1983; Lipps & Hite, 1982; Thakur et al., 1989; Welz, 1998). Diese Rasse 0 ist gegenüber einer Maispflanze mit Ht1 avirulent, sodass diese versehen mit einer geeigneten quantitative Resistenz insgesamt eine ausreichende NCLB-Resistenz aufzeigt. Zahlreiche Studien berichten jedoch von einer zunehmenden Verbreitung der weniger häufigen Rassen (Jordan et al., 1983; Welz, 1998; Pratt & Gordon, 2006). Gründe hierfür liegen in der Populationsdynamik eines Pathogens, welche durch neue Mutationen auf Avirulenzgenen und neue Kombinationen vorhandener Virulenzgene Veränderungen in der Pathogenvirulenz erlaubt. Dies kann letztendlich zum Auftauchen neuer, angepasster, teils aggressiverer pathogener Rassen führen. In Brasilien beispielsweise scheint die H. turcicum-Population schon deutlich diverser im Hinblick auf die Rassenzusammensetzung zu sein als zum Beispiel in Nordamerika. Gianasi et al. (1996) berichtet von H. turcicum Rassen, die bereits die Resistenz, welche durch das Ht1-Gen vermittelt wird, durchbrochen haben. Hinzu kommt dabei auch die Instabilität der Resistenzgene gegenüber bestimmten Umweltfaktoren wie Temperatur und Lichtintensität in einigen Klimazonen (Thakur et al., 1989). Diese Entwicklung hat zur Folge, dass global gesehen die Verwendung der bisher weniger beachteten oder neuer Ht-Resistenzgene zur Herstellung kommerzieller Maispflanzen zunehmend an Bedeutung gewinnt, um das Ziel einer breiten und dauerhaften Resistenz gegenüber H. turcicum in Mais herbeizuführen. Erste Ansätze hierzu wurden bereits von Pataky et al. im Jahr 1998 vorgestellt. Durch Verwendung einer Kombination von Ht1 und Htn1 konnte die NCLB-Resistenz in sh2-Elitekörnermais verbessert werden.
  • Ein Ursprung der monogenischen Htn1-Resistenz ist die Mexikanische Landrasse'Pepitilla' (Gevers, 1975). Die Htn1-Introgressionslinien zeigen eine Kartierung des Gens auf dem langen Arm des Chromosoms 8 ungefähr 10 cM distal von Ht2 und 0,8 cM distal vom RFLP Marker umc117 (bin 8.06) (Simcox & Bennetzen, 1993). Anders als die übrigen Ht-Resistenzgene vermittelt Htn1 eine Resistenz durch eine Verzögerung des Einsetzens der Sporulation und wirkt somit der Entwicklung von Läsionen entgegen. Im Ergebnis führt dies zu weniger und kleineren Läsionen sowie reduzierten Sporulationszonen (Raymundo et al., 1981b, Simcox & Bennetzen, 1993). Chlorotisch-nekrotische Läsionen, wie sie bei Ht1, Ht2 oder Ht3-vermittelter Resistenz auftreten, werden nicht ausgebildet (Gevers, 1975). Jedoch ist die Resistenzreaktion im heterozygoten Zustand des Htn1-Gens deutlich ineffektiver als im homozygoten Zustand (Raymundo et al., 1981b).
  • Eine verbesserte züchterische Handhabbarkeit des Htn1-Gens setzt die Entwicklung von zusätzlichen spezifischen Markern voraus, um die Genotyp-Bestimmung weiter zu vereinfachen. Durch die MAS (marker assisted-selection) Technologie wird dann ein 'Stacking' oder 'Pyramiding' von mehreren Resistenzgenen effizient möglich (Min et al., 2012). In vielen Studien zur Kartierung des Resistenzlocus und zur Identifikation der Resistenzquelle wurden die Introgressionslinien B37Htn1 oder W22Htn1 herangezogen (Raymundo et al., 1981a, b; Simsox & Bennetzen, 1993, Bar-Zur et al., 1998; Coates & White, 1998). Angaben zu Markern, die zur Selektion des Resistenzlocus für Htn1 aus der Akzession Pepitilla verwendet werden könnten, sind dabei jedoch nur begrenzt vorhanden (Simsox & Bennetzen, 1993). Die bekannten Marker für Htn1 funktional und flankierend zum Resistenzlocus aus der Akzession Pepitilla kartieren immer noch annähernd 22,2 cM auseinander, was im besten Fall das Selektieren eines großen Chromsosomfragments gestattet. Dabei besteht jedoch oft das Risiko, dass innerhalb dieses Fragments zwischen den Markern eine doppelte genetische Rekombination stattfindet, was eine falsch-positive Selektion für den Htn1-Resistenzlocus zur Folge haben könnte. Zudem steigt in einigen Fällen mit der Größe des introgressierten Chromosomenfragments auch die Wahrscheinlichkeit unerwünschte genetische Bereiche in eine Introgressionslinie zu übernehmen und über Generationen von Elitelinien mitzuführen. Solche genetischen Bereiche, insbesondere wenn sie eng gekoppelt sind mit dem Htn1-Locus, und zu deutlich-negativen Auswirkungen auf ein oder mehrere agronomische Merkmale führen, werden als Linkage Drag bezeichnet. Aus bekannten Studien, die Introgressionslinien mit Htn1 aus Pepitilla untersuchten und nutzten, sind jedoch solche negativen Effekte nicht bekannt. Auch die sehr umfangreichen Forschungsarbeiten von Welz (1998), die unter anderen auch an B37Htn1 durchgeführt wurden, postulieren, dass im Hinblick auf beispielsweise Ertrag und Reife durch die Introgression des Htn1-Locus keine signifikanten Nachteile auszumachen sind. So finden sich im Stand der Technik auch keine ernsthaften Bestrebungen das große Chromsosomfragment gezielt weiter zu verkürzen.
  • Dagegen offenbart WO 2011/163590 den Genotyp PH99N als alternative Quelle für eine NCLB-Resistenz auf Chromosom 8 bin 5, welche jedoch nicht der Akzession Pepitilla entspricht. Für erzeugte Rückkreuzungspopulation aus PH99N wurden im Wesentlichen nur Resistenzen gegenüber den H. turcicum-Rassen 0 und 1 identifiziert. Auch der Resistenz-Phänotyp wurde nicht eindeutig bestimmt. Dennoch schlussfolgern die Autoren, dass die Resistenz auf das Htn1-Gen zurückzuführen sei. Es gelang zwar für PH99N den Resistenzlocus auf ein Chromosomfragment von nur noch ~224 kb Länge zu beschränken, eine resistente Maispflanze mit dem 224 kb-Fragment und somit dem vermeintlichen Htn1, wurde jedoch nicht offenbart. Zudem ist der Genotyp PH99N der Öffentlichkeit durch Hinterlegung auch nicht zugänglich gemacht.
  • Ein alternativer Ansatz zur Nutzbarmachung des Htn1-Gens ist die Identifizierung und Klonierung des Resistenzgens und deren Verwendung in einem transgenen Ansatz.
  • Mit der Absicht der Identifikation der Resistenzgene für NCLB veröffentlichten Chung et al. 2010 eine Studie zur Feinkartierung des Resistenzlocus bin 8.06. Das untersuchte Chromosomfragment stammt jedoch nicht aus Pepitilla, sondern aus der Maishybride DK888, welche eine multiple Krankheitsresistenz aufweist. Untersuchungen zur Helmithosporium-Rassenspezifität legten zunächst nahe, dass der Resistenzlocus auf DK888, bezeichnet als qNLB8.06DK888, eng verknüpft oder funktionell verbunden ist mit dem Ht2- und dem Htn1-Gen, da Helminthosporium-Stämme 23 und 23N virulent waren (Chung et al., 2008). Ein endgültiger Nachweis für das Vorhandensein von Htn1 wurde in Mangel eines reinen N-Isolates von H. turcicum jedoch nicht durchgeführt. Zudem entsprach der Resistenz-Phänotyp mit qNLB8.06DK888 auch nicht dem zu erwartenden Phänotyp im Hinblick auf Entstehung von chlorotischen Läsionen und der Verzögerung der Läsionsbildung. Weiterführende Komplementationsstudien in Chung et al. (2010) ergaben letztendlich Hinweise, dass qNLB8.06DK888 entweder identisch, allelisch, eng verknüpft oder funktionell verbunden ist mit Ht2, aber nicht mit Htn1. Der Resistenzlocus qNLB8.06DK888 konnte einem Chromosomfragment von 0,46 Mb zugeordneten werden. Genomische Annotationen von diesem Chromosomfragment wiesen auf 12 putative offene Leserahmen hin, von denen drei jeweils ein Tandem-Proteinkinase-ähnliches Gen (GRMZM2G135202; GRMZM2G164612) oder ein Proteinphosphatase-ähnliches Gen (GRMZM2G119720) darstellen könnten und jedes gleichermaßen als vielversprechendes Kandidatengen für das Resistenzgen Ht2 favorisiert werden (Chung et al., 2010). Ein funktioneller Nachweis wird nicht beschrieben.
  • Ferner annotiert auch WO 2011/163590 A1 das vermeintliche Htn1-Gen in der Resistenzquelle PH99N als ein Tandem-Proteinkinase-ähnliches Gen (GRMZM2G451147) und offenbart deren genetische Sequenz, weist aber deren Funktionalität zum Beispiel in einer transgenen Maispflanze auch nicht nach.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wurde vor dem Hintergrund des vorstehend beschriebenen Stands der Technik gemacht, wobei es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, eine Maispflanze bereitzustellen, die eine Resistenz gegenüber dem Pathogen Helminthosporium turcicum aus dem Donor Pepitilla aufweist und hinsichtlich agronomischer Merkmale den bekannten Maispflanzen mit Resistenz aus dem Donor Pepitilla überlegen ist.
  • Die Aufgabe ist zum einen durch eine Maispflanze gelöst, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, wobei das Chromosomfragment ein Intervall des Donors (nachfolgend erstes Intervall oder Intervall 1 genannt) umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und ein Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt, und wobei das Chromosomfragment ein weiteres Intervall des Donors (nachfolgend zweites Intervall oder Intervall 2 genannt) zwischen einem Marker in einer ersten Markerregion (M1), welche durch die Marker SYN14136 und PZE-108076510 flankiert ist, und einem Marker in einer zweiten Markerregion (M2), welche durch die Marker SYN24931 und PZE-108077560 flankiert ist, nicht enthält. Diese und weiter unten beschriebene alternative Lösungen der Aufgabe können auf einem Züchtungsprogramm zur Integration des Htn1-Locus aus Pepitilla in Maislinien beruhen. Wahlweise sind jedoch auch gentechnische Ansätze anwendbar, über welche Pflanzen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können. Beispielhaft werden gentechnische Ansätze weiter unten näher ausgeführt. Zur Erzeugung der Pflanzen der vorliegenden Erfindung kann auf diverse Genotypen aus dem Stand der Technik zurückgreifen kann. Insbesondere B37HTN1, das den Resistenzlocus der Landrasse ,Pepitilla' aufweist, wurde als Ausgangslinie verwendet. Neben Pepitilla selbst und B37HTN1 (auch aus dem Stand der Technik bekannt als B37HtN) kann man zur Integration des HTN1-Locus zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Maispflanze nahezu jeden bekannten Maisgenotypen heranziehen, in dessen Genom, insbesondere auf Chromosom 8 bin 5 oder 6, eine Introgression des HTN1-Resistenzlocus aus Pepitilla inseriert wurde. Aus dem Stand der Technik sind hier zahlreiche Genotyp-Beispiele bekannt, zum Beispiel: W22Htn (z. B. Bar-Zur et al.,1998); H6314Htn (z. B. Bar-Zur et al., 1998), B73HtN (z. B. Shimoni et al., Journal of Phytopathology 131:4 (1991), 315–321), B68HtN und A632HtN (z. B. Carson, Plant Disease 79 (1995), 717–720) und A619HtN (z. B. Stanković et al, Genetika 39:2 (2007), 227–240). In einer erfindungsgemäßen Maispflanze stammt das Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla, in einer bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze stammt das Chromosomfragment aus dem Donor B37HTN1 oder einem anderen oben genannten Maisgenotyp. B37HTN1 kann über das Maize Genetics COOP Stock Center mit der Stock ID 65749 bestellt werden.
  • Das in das Genom der erfindungsgemäßen Maispflanze integrierte Chromosomfragment stammt aus dem Donor Pepitilla, welcher bekanntermaßen den Resistenzlocus HTN1 aufweist. Die Introgression dieses Resistenzlocus ist auf dem langen Arm des Chromosoms 8, bin 8.05–8.06 lokalisiert. Das integrierte Chromosomfragment umfasst das erste Intervall des Donors, welches ein Polynukleotid aufweist, das in der erfindungsgemäßen Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt. Dabei umfasst das Polynukleotid ein oder mehrere Resistenz-vermittelnde Gene des HTN1-Locus aus Pepitilla (Tabelle 1), welche unter Befallsbedingungen mit H. turcicum einen Resistenzphänotyp mit den HTN1-typischen Merkmalen bewirken. Dazu gehören beispielsweise verzögertes Einsetzen der Sporulation, verminderte Entwicklung von Läsionen, Entwicklung von kleineren Läsionen, reduzierte Sporulationszonen und/oder keine oder nur vereinzelte chlorotisch-nekrotische Läsionen. Strukturell ist das Polynukleotid dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nukleinsäuremolekül umfasst, (a) das eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 oder 15 aufweist, (b) das eine Nukleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zu einer der Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 oder 15 vorzugsweise über die gesamte Sequenzlänge, aufweist, (c) das mit dem komplementären Strang eines Nukleinsäuremoleküls nach (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, (d) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 kodiert, (e) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit einer der Aminosäuresequenzen nach (d), kodiert oder (f) das eine Teilsequenz einer Nukleinsäure nach (a) bis (e) aufweist. Eine Teilsequenz einer Nukleinsäure kann mindestens 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder mindestens 100 aufeinander folgende Nukleotide, weiter mindestens 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 oder 1000 aufeinander folgende Nukleotide umfassen.
  • Vorzugsweise liegt das Polynukleotid im homozygoten Zustand vor. Tabelle 1: Potentielle Resistenz-vermittelnde Gene des HTN1-Locus aus Pepitilla; Genname (Spalte 1); Verweis auf korrespondierende SEQ ID NOs der genomischen Exon-Sequenz (Spalte 2); Verweis auf korrespondierende SEQ ID NOs der vorhergesagten Aminosäure-/Proteinsequenz (Spalte 3); annotiertes homologes Gen aus dem 673-Referenzgenom (Spalte 4).
    Genname cDNA SEQ ID NO: Proteinsequenz SEQ ID NO: Homologes 673 Gen
    RLK1 1 2 GRMZM2G451147
    RLK4 3 4 GRMZM2G144028
    EXT1 5 6 GRMZM2G445338
    DUF1 7 8 GRMZM2G118636
    ZNF1 9 10 GRMZM2G175661
    CYT1 11 12 GRMZM2G092018
    RET1 13 14 GRMZM2G091973
    HYD 15 16 GRMZM2G144021
  • Weiterhin ist das erste Intervall im Chromosomfragment durch die Abfolge von Donor-Allelen gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 charakterisiert. Das erste Intervall zeigt mindestens das Donor-Allel, welches das Resistenz-vermittelnde Gen aus Tabelle 1 beschreibt, optional mit Donor-Allel des Markers MA0008. Bevorzugt zeigt das erste Intervall mindestens die Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 von MA0005 bis MA0016 (d. h. MA0005, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0013, MA0014, MA0015 und MA0016), besonders bevorzugt von MA0005 bis MA0017 (d. h. MA0005, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016 und MA0017), MA0005 bis MA0018 (d. h. MA0005, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017 und MA0018), MA0005 bis PZE-108095998 (d. h. MA0005, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018 und PZE-108095998), MA0005 bis PZE-108096011 (d. h. MA0005, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998 und PZE-108096011) oder MA0005 bis MA0019 (d. h. MA0005, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011 und MA0019), ganz besonders bevorzugt von MA0005 bis PZE-108096610 (d. h. MA0005, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011, MA0019 und PZE-108096610), MA0005 bis MA0020 (d. h. MA0005, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011, MA0019, PZE-108096610 und MA0020), MA0005 bis PZE-108096791 (d. h. MA0005, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011, MA0019, PZE-108096610, MA0020 und PZE-108096791) oder MA0005 bis MA0006 (d. h. MA0005, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011, MA0019, PZE-108096610, MA0020, PZE-108096791 und MA0006) auf. Dieser resistente Haplotyp erlaubt eine eindeutige Spezifizierung und Identifikation der Resistenzquelle Pepitilla. Insbesondere ist das erste Intervall zwischen den Markern MA0004 und PZE-108097482 lokalisiert. Vorzugsweise beschreibt das erste Intervall einen Abschnitt des Chromosomfragments, welcher die HTN1-typische Resistenz vermitteln kann. Als solcher ist er Träger des oben genannten Polynukleotids. Tabelle 2: Resistenter Haplotyp aus B37HTN1;
    Position in bp auf B73 AGPv02 Allele Donor B37HTN1 Marker Bezeichnung
    151831049 C MA0005
    152045106 T MA0007
    152045141 T MA0008
    152045402 T MA0009
    152045516 C MA0010
    152045912 T MA0011
    152046502 T MA0012
    152133057 G MA0013
    152133380 A MA0014
    152144310 A MA0015
    152250992 A MA0016
    152301656 A MA0017
    152304127 A MA0018
    152433358 A PZE-108095998
    152435855 A PZE-108096011
    152630794 C MA0019
    152703579 G PZE-108096610
    152753635 A MA0020
    152887338 G PZE-108096791
    152888374 A MA0006
  • Weiterhin ist jede erfindungsgemäße Maispflanze eine Ht-resistente Maispflanze. Die durch die Integration des Chromosomfragments vermittelte Ht-Resistenz kann mittels Bestimmung von Boniturnoten in Phänotypisierungsexperimenten nach Schema gemäß Tabelle 3 und Beispiel 1. A) quantifiziert werden, wobei das Resistenzlevel von 1 nach 9 hin abnimmt. Erfindungsgemäße Ht-resistente Maispflanzen zeigen eine erhöhte Resistenz gegenüber H. turcicum von mindestens 1 Boniturnote, bevorzugt von mindestens 2 Boniturnoten oder mindestens 3 Boniturnoten und besonders bevorzugt von mindestens 4 Boniturnoten. Bevorzugt zeigt eine erfindungsgemäße Maispflanze Resistenz gegenüber mindestens einer Rasse von Helmithosporium turcicum, welche nicht der bekannten Rassenspezifität entspricht wie sie aus dem Stand der Technik bekannt ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann ist eine erfindungsgemäße Maispflanze resistent gegenüber sämtlichen bekannten Rassen von Helmithosporium turcicum, d. h. die vermittelte Resistenz ist rassenunspezifisch und kann zur Ausbildung einer breiten Resistenz gegenüber Helmithosporium turcicum besonders vorteilhaft geeignet sein. Tabelle 3: Boniturnoten-Schema für Phänotypisierungsexperimente in Feldversuchen an verschiedenen Standorten mit natürlicher und künstlicher H. turcicum-Beimpfung (nach dem Deutschem Maiskomitee (DMK); AG Sortenwesen 27.02.02; (DMK J. Rath; RP Freiburg H. J. Imgraben)
    Boniturnote Phänotyp
    1 Pflanzen zeigen keine Krankheitssymptome 0%
    2 Befallsbeginn, erste kleine Flecken (kleiner als 2 cm) sichtbar. Weniger als 5% der Blattfläche ist betroffen.
    3 Einige Flecken haben sich auf einer Blattetage entwickelt. Zwischen 5–10% der Blattfläche ist betroffen.
    4 10–20% der Blattfläche ist betroffen. Deutliche Flecken auf mehreren Blattetagen.
    5 20–40% der Blattfläche ist betroffen. Flecken fangen an zusammenzufließen.
    6 40–60% der Blattfläche ist betroffen. Systematischer Befall auf den Blättern sichtbar.
    7 60–80% der Blattfläche ist betroffen. Etwa die Hälfte der Blätter ist wegen Pilzbefalls zerstört bzw. vertrocknet
    8 80–90% der Blattfläche ist betroffen. Mehr als die Hälfte der Blätter ist wegen Pilzbefalls zerstört bzw. vertrocknet
    9 90–100% der Blattfläche ist betroffen. Die Pflanzen sind nahezu vollständig vertrocknet.
  • Die Beschreibung offenbart die genetische bzw. molekulare Struktur des HTN1-Locus durch Angabe eines Haplotyps, durch Kartierung prominenter Marker sowie durch Identifizierung von Kandidaten-Genen für die Resistenzvermittlung gegenüber dem Pathogen Helminthosporium turcicum.
  • Überraschenderweise erwies sich die erfindungsgemäße Maispflanze in Geno- und Phänotypisierungsexperimenten in Feld und Gewächshaus als agronomisch überlegen.
  • Denn während andere konvertierte Linien aus einem Züchtungsprogramm zur Integration des HTN1-Locus aus Pepitilla sowie aus dem Stand der Technik bekannte konvertierte Linien wie B37HTN1 neben der vermittelten Ht-Resistenz unter Nichtbefallsbedingungen mit H. turcicum und unter vergleichbaren Umweltbedingungen (Temperatur, Nährstoffversorgung, Standort etc.) eine deutliche Verzögerung im Zeitpunkt der männlichen und/oder weiblichen Blüte im Vergleich zu der entsprechenden Linie ohne Introgression (z. B. isogene Linie oder Ausgangslinie) zeigen, entspricht bei der erfindungsgemäßen Maispflanze der Blühzeitpunkt demjenigen einer isogenen Vergleichsmaispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla nicht integriert ist. Blühzeitpunkte entsprechen einander, wenn sie um weniger als 2 Tage voneinander abweichen. Die Größenordnung der beobachteten Verzögerung ist dabei stark abhängig von der Maissorte bzw. dem Maisgenotypen, den vorherrschenden Umweltfaktoren wie beispielsweise Bodenbeschaffenheit, Feuchtigkeit, Niederschlag, Temperatur etc. und/oder von biotischem Stress wie beispielsweise Pathogenbefall mit nicht H. turcicum. Die Verzögerung betrug mindestens 2 Tage, mindestens 3 Tage, mindestens 5 Tage oder mindestens 7 Tage. Dieser festgestellte Unterschied im Blühzeitpunkt ist auf Linkage Drag als Teil der Introgression zurückzuführen, was besonders überraschend ist, da derartige Beobachtungen aus dem Stand der Technik nicht bekannt sind. Der Blühzeitpunkt ist ein wichtiges agronomisches Merkmal. Er kann unmittelbar und wesentlich das Ertragspotential einer Maispflanze beeinflussen. Ein verspäteter Blühzeitpunkt führt dabei in der Regel zu einem verminderten Ertrag. Zur Klärung der genetischen Ursache dieses Nachteils und zur Identifikation des Linkage Drags wurden beispielsweise ausgedehnte Rückkreuzungsprogramme, begleitet von Geno- und Phänotypisierungen, durchgeführt. Unterstützt wurden die Arbeiten von einer intensiven Entwicklung zielgenauer und spezifischer molekularer Marker auf dem HTN1-tragenden Chromosomfragment. Die Technologie zur Marker-gestützten Selektion (MAS) und die Durchführung von zielgerichteten Rückkreuzungsprogrammen (z. B. zum 'map based cloning') kann dem Stand der Technik entnommen werden (Gupta & Varshney, 2013). Der QTL mit der HTN1-Resistenz aus den Donor B37HTN1 bzw. Pepitilla wurde mit Hilfe der SSR Marker bnlg1067, umc1121, MA0002, MA0003, bnlg1782, umc1287, umc1960 und bnlg240 in den Filialgenerationen auf Chromosom 8 (bin 8.06) zwischen den Markern MA0002 (Tabelle 4) und umc1287 (Tabelle 5) in einem Bereich von 23,1 cM lokalisiert (siehe 1). In Maispflanzen mit dem verzögerten Blühzeitpunkt gelang es die Lage des genomischen Donor-Sequenzabschnitts, der für den identifizierten Linkage Drag des Blühzeitpunktes verantwortlich ist, eindeutig auf einem weiteren, zweiten Intervall des Donors auf dem Chromosomfragment zu bestimmen (Beispiel 3B; 3). In einer erfindungsgemäßen Maispflanze ist ein Chromosomfragment integriert, welches das zweite Intervall des Donors nicht enthält. Hier stammt das zweite Intervall beispielsweise von einem rekurrenten Elter, der nicht Träger des Linkage Drags des Blühzeitpunkts ist, oder von einem exogen eingebrachten homologen DNA-Fragment, welches nicht Täger des Linkage Drags ist, auf einem geeigneten Spendervektor für gezielte homologe Rekombination. Das zweite Intervall ist proximal gelegen und eng gekoppelt zu dem Resistenzlocus HTN1 bzw. zu dem ersten Intervall. Das zweite Intervall ist ein Intervall zwischen einem Marker in einer ersten Markerregion (M1), welche durch die Marker SYN14136 und PZE-108076510 flankiert ist, und einem Marker in einer zweiten Markerregion (M2), welche durch die Marker SYN24931 und PZE-108077560 flankiert ist. Die flankierenden Marker können der Tabelle 4 entnommen werden. Die Marker SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 und PZE-108077560 sind SNP-Marker zur Verwendung im KBioscience-KASP-System (www.lgcgenomics.com/genotyping/kasp-genotyping-reagents/kasp-overview/). Sie definieren eindeutig die Markerregionen M1 und M2, zu beiden Seiten des Sequenzabschnitts, der im Donor B37HTN1 bzw. Pepitilla den Linkage Drag des Blühzeitpunktes trägt. Als polymorphe Marker sind sie überdies auch geeignet zwischen Pepitilla-Donor-Allel und beispielsweise dem Allel des rekurrenten Elter zu unterscheiden. Alle Angaben zur Nutzung dieser Marker als KASP-Marker können der Tabelle 4 entnommen werden. Geeignete exemplarische Primer-Hybridisierungsparameter für die PCR werden in Beispiel 2 wiedergegeben. Ein Fachmann ist darüber hinaus auch in der Lage, andere geeignete Hybridisierungsparameter zu bestimmen. Ferner ist es Routinetätigkeit eines Fachmanns in Kenntnis der beschriebenen Markerregionen neben den genannten Markern andere Marker, insbesondere polymorphe Marker, in M1 und/oder in M2 zu entwickeln. Unter Verwendung der hier aufgeführten Marker SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 und PZE-108077560 oder selbst entwickelter Marker in M1 und/oder M2 fällt es dem Fachmann leicht festzustellen, ob in einer Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment mit HTN1-Resistenzlocus aus dem Donor Pepitilla integriert ist, das vorstehend beschriebene zweite Intervall des Donors enthalten ist oder nicht enthalten ist. Auch ist einem Fachmann bewusst, das beispielsweise im Laufe eines Züchtungsprozesses oder eines gentechnisch Ansatzes zur gezielten Rekombination ein chromosomales Intervall von dem Donor, das beispielsweise genomische Sequenzen umfasst, die Linkage Drag darstellen, durch genetische/homologe Rekombination von dem integrierten Chromosomfragment entfernt werden können. Dabei kann das Intervall des Pepitilla-Donors durch das korrespondierende Intervall des rekurrenten Eltergenoms oder von einem exogen eingebrachten homologen DNA-Fragment ersetzt werden. Marker im Allgemeinen und die hier offenbarten Marker im Besonderen können dabei insbesondere bei der Selektion unterstützend eingesetzt werden. Beispielhaft sei im Folgenden eine mögliche Verwendung von Markern zur Detektion eines Allels wiedergegeben: Das Detektieren eines Allels kann beispielsweise (a) das Isolieren von mindestens einem Nukleinsäuremolekül aus dem Genom einer Pflanze oder Pflanzenzelle/Maispflanze oder Maispflanzenzelle und (b) das Untersuchen des isolierten Nukleinsäuremolekül mit mindestens einem Marker umfassen, sowie optional (c) das Sequenzieren des Allels in einem und/oder mehreren Genotypen, (d) die Detektion von einem und/oder mehreren Polymorphismen und/oder (e) die Restriktion mit einer Restriktions-Endonuklease, die unterschiedlich große Fragmente an einem Markerallel erzeugen kann.
  • Eine bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment das zweite Intervall des Donors, welches flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und PZE-108077560, b) von den Markern PZE-108076510 und PZE-108077560, c) von den Markern SYN14136 und SYN24931 oder d) von den Markern PZE-108076510 und SYN24931, nicht enthält.
  • Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment weiterhin ein Intervall des Donors (nachfolgend drittes Intervall oder Intervall 3 genannt) zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in einer dritten Markerregion M3, welche durch die Marker PZE-108093423 (Tabelle 4) und PZE-108093748 (Tabelle 4) flankiert ist, nicht enthält. Die Marker PZE-108093423 und PZE-108093748 sind SNP-Marker zur Verwendung im KBioscience-KASP-System (www.lgcgenomics.com/genotyping/kasp-genotyping-reagents/kasp-overview/). Sie definieren eindeutig die Markerregion M3. Als polymorphe Marker sind sie überdies auch geeignet zwischen Donor-Allel und beispielsweise dem Allel des rekurrenten Elter zu unterscheiden. Alle Angaben zur Nutzung dieser Marker als KASP-Marker können der Tabelle 4 entnommen werden. Geeignete exemplarische Primer-Hybridisierungsparameter für die PCR werden in Beispiel 2 wiedergegeben. Ein Fachmann ist darüber hinaus auch in der Lage, andere geeignete Hybridisierungsparameter zu bestimmen. Ferner ist es Routinetätigkeit eines Fachmanns in Kenntnis der beschriebenen Markerregion neben den genannten Markern andere Marker, insbesondere polymorphe Marker, in M3 zu entwickeln. Unter Verwendung der oben genannten Marker der M2 und der hier aufgeführten Marker PZE-108093423 und PZE-108093748 oder selbst entwickelter Marker in M3 fällt es dem Fachmann leicht festzustellen, ob in einer Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment mit HTN1-ResistenzLocus aus dem Donor Pepitilla integriert ist, das vorstehend beschriebene dritte Intervall des Donors enthalten ist oder nicht enthalten ist.
  • Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment einen genetischen Abschnitt, der das zweite Intervall und das dritte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und PZE-108093423, b) von den Markern PZE-108076510 und PZE-108093423, c) von den Markern SYN14136 und PZE-108093748 oder d) von den Markern PZE-108076510 und PZE-108093748, nicht enthält.
  • In einem weiteren Aspekt konnten weitere genetische Abschnitte auf dem Chromosomfragment bestimmt werden, welche unter Nichtbefallsbedingungen mit H. turcicum einen signifikanten negativen Einfluss auf das Ertragspotential einer Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment mit HTN1-Resistenzlocus aus dem Donor Pepitilla integriert ist. So zeigen unabhängig von der oben beschriebenen Verzögerung des Blühzeitpunktes konvertierte Linien ebenso wie aus dem Stand der Technik bekannte konvertierte Linien wie B37HTN1 neben der vermittelten Ht-Resistenz einen deutlich reduzierten Ertrag, insbesondere einen deutlich reduzierten Silageertrag im Vergleich zu der entsprechenden Linie ohne Introgression (z. B. isogene Linie oder Ausgangslinie). Dies gilt selbst für Linien, in deren Genom ein genetischer Abschnitt des Donors, bestehend aus Intervall 2 (zwischen einem Marker aus M1 und M2) oder Intervall 2 und 3 (zwischen einem Marker aus M1 und M3) nicht mehr vorhanden ist. Derartige Beobachtungen waren für einen Fachmann nicht zu erwarten, da er aus dem Stand der Technik keinen Hinweis auf einen derartigen Linkage Drag in HTN1-Introgressionslinien erhält. Zur Klärung der genetischen Ursache dieses agronomischen Nachteils wurden beispielsweise ausgedehnte Rückkreuzungsprogramme, begleitet von Geno- und Phänotypisierungen durchgeführt. Unterstützt wurden die Arbeiten von einer intensiven Entwicklung zielgenauer und spezifischer molekularer Marker auf dem HTN1-tragenden Chromosomfragment. In Maispflanzen mit dem reduziertem Ertrag (Silageertrag) gelang es die Lage der genomischen Sequenzabschnitte, die für den identifizierten Linkage Drag des Silageertrags verantwortlich sind, eindeutig auf zwei weiteren Intervallen des Donors (nachfolgend viertes Intervall oder Intervall 4 und fünftes Intervall oder Intervall 5 genannt) auf dem Pepitilla-Chromosomfragment zu bestimmen (Beispiel 3C; 3). Eine erfindungsgemäße Maispflanze, welche im HTN1-Introgressionsfragment aus Pepitilla, anstatt des Linkage Drag tragenden vierten und/oder fünften Intervalls des Donors ein entsprechendes Intervall ohne Linkage Drag z. B. aus dem rekurrenten Elter aufweist, zeigt keinen reduzierten Silageertrag und somit einen Ertrag, insbesondere einen Silageertrag, welcher demjenigen einer vergleichbaren Linie ohne Introgression (z. B. isogene Linie oder Ausgangslinie) entspricht. Der Silageertrag einer erfindungsgemäßen Maispflanze ohne vierten und/oder fünften Intervall des Donors im Vergleich mit einer vergleichbare Maispflanze mit Linkage Drag des Silageertrags kann um mehr als 2%, als 3%, als 4%, als 5%, als 6%, als 7%, als 8%, als 9%, als 10%, als 15% oder als 20% höher sein. Das vierte Intervall ist proximal gelegen und eng gekoppelt zu dem Resistenzlocus HTN1 bzw. zu dem ersten Intervall. Das fünfte Intervall ist distal gelegen und eng gekoppelt zu dem Resistenzlocus HTN1 bzw. zu dem ersten Intervall.
  • Daher ist eine besonders bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment weiterhin das vierte Intervall des Donors zwischen einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in einer vierten Markerregion M4, welche durch die Marker MA0004 und MA0005 flankiert ist, nicht enthält und/oder wobei das Chromosomfragment weiterhin das fünfte Intervall des Donors zwischen einem Marker in einer fünften Markerregion M5, welche durch die Marker MA0006 und PZE-108097482 flankiert ist, und einem Marker in einer sechsten Markerregion M6, welche durch die Marker PZE-108107671 und SYN4196 flankiert ist, nicht enthält. Die flankierenden Marker können der Tabelle 4 entnommen werden. Die Marker MA0004, MA0005, MA0006, PZE-108097482, PZE-108107671 und SYN4196 sind SNP-Marker zur Verwendung im KBioscience-KASP-System (www.lgcgenomics.com/genotyping/kasp-genotyping-reagents/kasp-overview/). Sie definieren eindeutig die Markerregionen M4, M5 und M6, welche zusammen mit M3 die Sequenzabschnitte festlegen, welche im Donor B37HTN1 bzw. Pepitilla den Linkage Drag des Silageertrages tragen. Als polymorphe Marker sind sie überdies auch geeignet zwischen Donor-Allel und beispielsweise dem Allel des rekurrenten Elter zu unterscheiden. Alle Angaben zur Nutzung dieser Marker als KASP-Marker können der Tabelle 4 entnommen werden. Geeignete exemplarische Primer-Hybridisierungsparameter für die PCR werden in Beispiel 2 wiedergegeben. Ein Fachmann ist darüber hinaus auch in der Lage, andere geeignete Hybridisierungsparameter zu bestimmen. Ferner ist es Routinetätigkeit eines Fachmanns in Kenntnis der beschriebenen Markerregionen neben den genannten Markern andere Marker, insbesondere polymorphe Marker, in M4, in M5 und/oder in M6 zu entwickeln. Unter Verwendung der hier aufgeführten Marker MA0004, MA0005, MA0006, PZE-108097482, PZE-108107671 und SYN4196 oder selbst entwickelter Marker in M4, in M5 und/oder M6 zusammen mit oben beschriebenen Markern in M3 fällt es dem Fachmann leicht festzustellen, ob in einer Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment mit HTN1-Resistenzlocus aus dem Donor Pepitilla integriert ist, das vorstehend beschriebene vierte Intervall des Donors und/oder das vorstehend beschriebene fünfte Intervall enthalten ist oder nicht enthalten ist.
  • Eine weitere besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment (i) einen genetischen Abschnitt, der das zweite Intervall, das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und MA0004, b) von den Markern PZE-108076510 und MA0004, c) von den Markern SYN14136 und MA0005 oder d) von den Markern PZE-108076510 und MA0005, nicht enthält, oder (ii) einen genetischen Abschnitt, der das zweite Intervall und das dritte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und PZE-108093423, b) von den Markern PZE-108076510 und PZE-108093423, c) von den Markern SYN14136 und PZE-108093748 oder d) von den Markern PZE-108076510 und PZE-108093748, und das fünfte Intervall des Donors nicht enthält, oder (iii) einen genetischen Abschnitt, der das zweite Intervall, das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und MA0004, b) von den Markern PZE-108076510 und MA0004, c) von den Markern SYN14136 und MA0005 oder d) von den Markern PZE-108076510 und MA0005, und das fünfte Intervall des Donors nicht enthält.
  • Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist alternativ durch eine Maispflanze gelöst, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, wobei das Chromosomfragment das erste Intervall des Donors umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und das Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt, und wobei das Chromosomfragment das vierte Intervall des Donors zwischen einem Marker in der dritten Markerregion, welche durch die Marker PZE-108093423 und PZE-108093748 flankiert ist, und einem Marker in der vierten Markerregion, welche durch die Marker MA0004 und MA0005 flankiert ist, nicht enthält. Die obige Beschreibung im Hinblick beispielsweise auf Marker, auf das Polynukleotid oder auf die Phänotypisierung gilt entsprechend auch für diese und jede weitere alternative Lösung der Aufgabe sowie offenbarten Ausgestaltungen.
  • Eine bevorzugte Ausgestaltung dieser erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment das vierte Intervall des Donors, welches flankiert ist a) von den Markern PZE-108093423 und MA0004, b) von den Markern PZE-108093748 und MA0004, c) von den Markern PZE-108093423 und MA0005 oder d) von den Markern PZE-108093748 und MA0005, nicht enthält.
  • Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine vorstehend beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment weiterhin das dritte Intervall des Donors zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der dritten Markerregion M3 nicht enthält.
  • Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment einen genetischen Abschnitt, der das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN24931 und MA0004, b) von den Markern PZE-108077560 und MA0004, c) von den Markern SYN24931 und MA0005 oder d) von den Markern PZE-108077560 und MA0005, nicht enthält.
  • Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine vorstehend beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment weiterhin das fünfte Intervall des Donors zwischen einem Marker in der fünften Markerregion M5 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6 nicht enthält.
  • Eine weitere besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine vorstehend beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment einen genetischen Abschnitt, der das das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN24931 und MA0004, b) von den Markern PZE-108077560 und MA0004, c) von den Markern SYN24931 und MA0005 oder d) von den Markern PZE-108077560 und MA0005, und das fünfte Intervall nicht enthält.
  • Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist ferner alternativ durch eine Maispflanze gelöst, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, wobei das Chromosomfragment das erste Intervall des Donors umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und das Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt, und wobei das Chromosomfragment das fünfte Intervall des Donors zwischen einem Marker in der fünften Markerregion, welche durch die Marker MA0006 und PZE-108097482 flankiert ist, und einem Marker in der sechsten Markerregion, welche durch die Marker PZE-108107671 und SYN4196 flankiert ist, nicht enthält.
  • Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine vorstehend beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment weiterhin das dritte Intervall des Donors zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der dritten Markerregion M3 nicht enthält.
  • Eine weitere besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanzen ist eine der oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment flankiert ist a) von einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, b) von einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, c) von einem Marker in der vierten Markerregion M4 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, d) von einem Marker in der Markerregion M1 und einem Marker in der Markerregion M5, e) von einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der fünften Markerregion M5, f) von einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in der fünften Markerregion M5 oder g) von einem Marker in der vierten Markerregion M4 und einem Marker in der fünften Markerregion M5.
  • Eine weitere ganz besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanzen ist eine der oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment flankiert ist a) durch die Marker SYN24931 und SYN4196, b) durch die Marker PZE-108077560 und SYN4196, c) durch die Marker SYN24931 und PZE-108107671, d) durch die Marker PZE-108077560 und PZE-108107671, e) durch die Marker PZE-108093423 und SYN4196, f) durch die Marker PZE-108093748 und SYN4196, g) durch die Marker PZE-108093423 und PZE-108107671, h) durch die Marker PZE-108093748 und PZE-108107671, i) durch die Marker MA0004 und SYN4196, j) durch die Marker MA0005 und SYN4196, k) durch die Marker MA0004 und PZE-108107671, l) durch die Marker MA0005 und PZE-108107671, m) durch die Marker PZE-108076510 und MA0006, n) durch die Marker SYN14136 und MA0006, o) durch die Marker PZE-108076510 und PZE-108097482, p) durch die Marker SYN14136 und PZE-108097482, q) durch die Marker SYN24931 und PZE-108097482, r) durch die Marker PZE-108077560 und PZE-108097482, s) durch die Marker SYN24931 und MA0006, t) durch die Marker PZE-108077560 und MA0006, u) durch die Marker PZE-108093423 und PZE-108097482, v) durch die Marker PZE-108093748 und PZE-108097482, w) durch die Marker PZE-108093423 und MA0006, x) durch die Marker PZE-108093748 und MA0006, y) durch die Marker MA0004 und PZE-108097482, z) durch die Marker MA0005 und PZE-108097482, aa) durch die Marker MA0004 und MA0006 oder ab) durch die Marker MA0005 und MA0006.
  • Eine weitere besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanzen ist eine der oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment a) zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, b) zwischen einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, c) zwischen einem Marker in der vierten Markerregion M4 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, d) zwischen einem Marker in der ersten Markerregion M1 und einem Marker in der fünften Markerregion M5 e) zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der fünften Markerregion M5, f) zwischen einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in der fünften Markerregion M5 oder g) zwischen einem Marker in der vierten Markerregion M4 und einem Marker in der fünften Markerregion M5, lokalisiert ist. Tabelle 4: KASP-Marker Primer-Sequenzen und die Zuordnung zum 637HTN1-Donor Allele stammend aus der Landrasse Pepitilla (Allel X und Allel Y: beschreiben die biallelischen Werte der SNPs)
    SNP-Marker Markerposition AGPv02 [bp] Primer Allele X(5'-3') [SEQ ID NO] Primer Allele Y(5'-3') [SEQ ID NO] Gemeinsamer Primer (5'-3') [SEQ ID NO] 637HTN1 Donor Allele (SNP) Markerregion
    SYN14136 131681497 17 18 19 A M1
    PZE-108076510 131905855 20 21 22 G M1
    SYN24931 132877982 23 24 25 A M2
    PZE-108077560 133189880 26 27 28 A M2
    PZE-108093423 150279048 29 30 31 A M3
    PZE-108093748 150562764 32 33 34 G M3
    PZE-108107671 161543406 35 36 37 C M6
    SYN4196 161766769 38 39 40 C M6
    MA0004 151688652 41 42 43 A M4
    MA0005 151831049 44 45 46 C M4
    MA0006 152888310 47 48 49 A M5
    PZE-108097482 153139646 50 51 52 A M5
    MA0002 147720853 53 54 55 A
    MA0003 151346184 56 57 58 C
    MA0007 152045106 59 60 61 T
    MA0008 152045141 62 63 64 T
    MA0009 152045402 65 66 67 T
    MA0010 152045516 68 69 70 C
    MA0011 152045912 71 72 73 T
    MA0012 152046502 74 75 76 A
    MA0013 152133057 77 78 79 G
    MA0014 152133380 80 81 82 T
    MA0015 152144310 83 84 85 A
    MA0016 152250992 86 87 88 A
    MA0017 152301656 89 90 91 A
    MA0018 152304127 92 93 94 A
    MA0019 152630794 95 96 97 C
    MA0020 152753635 98 99 100 A
    PZE-108095998 152433358 101 102 103 T
    PZE-108096011 152435855 104 105 106 A
    PZE-108096610 152703579 107 108 109 C
    PZE-108096791 152887338 110 111 112 G
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auch auf einen Samen oder ein Korn, ein Gewebe, ein Organ, einen Teil und eine Zelle der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Maispflanzen. Dabei ist der Same oder das Korn ein Same oder ein Korn, in deren Genom das Chromosomfragment der oben beschriebenen Ausgestaltungen der Erfindung integriert ist.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer H. turcicum resistenten Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, umfassend den Nachweis von mindestens zwei Allelen im Genom der Pflanze, wobei mindestens ein Allel in einem genomischen Abschnitt lokalisiert ist, welcher durch einen Marker in der ersten Markerregion M1, der zweiten Markerregion M2, der dritten Markerregion M3 oder der vierten Markerregion M4 und durch das oben beschriebene Polynukleotid, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber H. turcicum vermittelt, flankiert ist, und wobei mindestens ein Allel in einem genomischen Abschnitt lokalisiert ist, welcher durch das Polynukleotid und durch einen Marker in der sechsten Markerregion M6 oder der fünften Markerregion M5 flankiert ist. Die Markerregionen sowie beispielhafte Marker in diesen Markerregionen sind oben beschrieben. Vorzugsweise ist die identifizierte Maispflanze eine erfindungsgemäße Maispflanze. Die Erfindung betrifft weiterhin auch eine Maispflanze, welche mit dem genannten Verfahren zur Identifizierung identifiziert wurde.
  • In einem weiteren Aspekt erfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags einer H. turcicum resistenten Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, wobei das Verfahren einen Schritt umfasst, welcher die Entfernung des zweiten Intervalls des Donors, vierten Intervalls des Donors oder fünften Intervalls des Donors bewirkt und wobei das Chromosomfragment das oben beschriebene erste Intervall des Donors umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und ein Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt. Beispielsweise kann die Entfernung durch genetische Rekombination während eines Kreuzungsprozesses zwischen zwei Maispflanzen erreicht werden, wobei eine Maispflanze eine Maispflanze den HTN1-Resistenzlocus aus Pepitilla trägt. Neben der Verwendung von konventionellen Züchtungstechniken zur Erzeugung einer genetischen Rekombination, die als Ergebnis das Ersetzen von mindestens einem der oben identifizierten Donor-Intervalle mit Linkage Drag durch genomische Sequenzen des rekurrenten Elter, welche bevorzugt frei sind von unerwünschten Genen, hat, stellt die moderne Biotechnologie dem Fachmann diverse weitere Werkzeuge zur Verfügung, welche ein präzises Genom-Engineering ermöglichen. Zu den bekannten Werkzeugen zählen beispielsweise (Meganukleasen (Silva et al., 2011), Homing-Endonukleasen (Chevalier 2002), Zinkfinger-Nukleasen, TALE-Nukleasen ( WO 2010/079430 ; WO 2011/072246 ) oder CRISPR (Gaj et al., 2013). Hierbei handelt es sich um artifiziell Nuklease-Fusionsproteine, die in der Lage sind gezielt doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle wie pflanzliche DNA zu schneiden und damit Doppelstrangbrüche an gewünschten Positionen im Genom zu erzeugen. Unter Nutzbarmachung der zelleigenen Mechanismen zur Reparatur von induzierten Doppelstrangbrüchen kann dann eine homologe Rekombination oder ein ,nonhomologous end-joining' bewirkt werden, welche zur Entfernung der Linkage Drag-tragenden Intervalle des Donors führen kann. Geeignete Zielsequenzen im Genom für die Erkennungsdomänen vorstehender Nukleasen können beispielsweise den Sequenzinformationen zu den SNP-Markern (Tabelle 4) oder in deren Intervallen entnommen werden. Ein Fachmann ist jedoch auch in der Lage, andere Sequenzen, bevorzugt innerhalb oder zwischen den oben beschriebenen sechs Markerregionen, zu identifizieren, welche als Zielsequenzen für die Erkennungsdomäne der Nukleasen geeignet sind.
  • Im Folgenden sollen hierzu zwei gentechnische Ansätze näher erläutert werden, mit deren Hilfe die Eliminierung von Linkage Drag-tragenden Nukleotidsequenzen aus einem pflanzlichen Genom unterstützt wird oder unmittelbar erreicht wird. Folgende Verfahren, sowie auch die konventionellen Züchtungsverfahren, können zur Herstellung der erfindungsgemäßen Maispflanzen herangezogen werden.
  • Wie bereits ausgeführt sind vorstehende molekulare Werkzeuge in der Lage an definierten Orten im Genom einer Pflanze DNA-Doppelstrangbrüche zu induzieren. Als besonders vorteilhaft zeigt sich hierbei die Verwendung von TALE-Nukleasen (TALENs) oder Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs). Die TALE- oder ZF-Erkennungsdomäne erlaubt es an beliebiger Stelle im Genom spezifisch zu binden. In Kenntnis der Sequenz am Zielbereich kann man die TALE- oder ZF Erkennungsdomäne maßgeschneidert designen, so dass sie ausschließlich an gewünschter Stelle im Genom bindet. Ist die Erkennungssequenz beispielsweise mit eine unspezifischen Endonukease wie Fokl fusioniert, kann man an definierter Stelle im Genom einen Doppelstrangbruch (DSB) induzieren, was ein gezieltes Genom-Engineering ermöglicht (Tzfira et al., 2012; Li et al., 2011; Puchta and Hohn 2010). Dem Fachmann ist der Umgang mit Fokl-Endonukleasen sowie die Erstellung von geeigneten TALENs und ZFNs aus dem Stand der Technik bekannt.
  • Ein induzierter Doppelstrangbruch kann beispielsweise eine homologe Rekombination zwischen einem endogenen Ziel-Genlocus (z. B. eine der vorstehenden Markerregionen) und einem exogen eingebrachten homologen DNA-Fragment, welches beispielsweise nicht Täger von Linkage Drag ist (z. B. auf einem geeigneten Spendervektor), stimulieren. Dieses sogenannte ,gene replacement' oder ,genome editing' kann in vitro durchgeführt werden und bedarf keines Schrittes der Kreuzung zwischen zwei Pflanzen. Hierfür müssen die zu modifizierenden Pflanzen zum einen mit Nukleinsäuren, kodierend für die designten TALENs oder ZFNs, und zum anderen mit dem exogenen DNA-Fragment transient transformiert werden. Das DNA-Fragment kann hierbei aus einer Pflanze derselben Spezies stammen und entspricht beispielsweise dem chromosomalen Abschnitt, welcher ersetzt werden soll, nur ohne Linkage Drag. Nach Abschluss der induzierten homologen Rekombination können Zellen mit modifizierten Genom zu Pflanzen regeneriert werden und dahingehend selektiert werden, ob der Linkage Drag erfolgreich entfernt wurde und die zuvor transient transformierten DNA-Elemente im Zuge der regenerativen Zellteilung wieder verloren gegangen sind. Hierzu können auch oben beschriebene Marker eingesetzt werden. Methoden zur Transformation und Regeneration sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden auch weiter unten nochmals erläutert.
  • Weiterhin können vorstehende TALENs und ZFNs auch im Prozess der Meiose transgen eingesetzt werden, wo sie an vorbestimmten Stellen im Genom Doppelstrangbrüche induzieren und somit die Wahrscheinlichkeit für eine Rekombination an diesen Stellen im Schritt des ,Crossing over' erhöhen. Dadurch kann die Elimierung von Linkage Drag deutlich begünstigt werden. Einem Fachmann ist bekannt, wie er nach Abschluss der Meiose aus den haploiden Zellen Linkage-Drag-freie und TALENs bzw. ZFNs-freie Pflanzen erzeugt. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Maispflanze, welches die folgenden Schritte umfasst: (A) Bereitstellen einer ersten Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, wobei das Chromosomfragment ein erstes Intervall des Donors umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und ein Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt, und wobei das Chromosomfragment ein zweites Intervall des Donors und/oder das vierte Intervall des Donors und/oder das fünfte Intervall des Donors enthält, (B) Bereitstellen einer zweiten Maispflanze, (C) Kreuzen der Maispflanze aus (A) mir der Maispflanze aus (B) und (D) Selektieren einer erfindungsgemäßen Maispflanze, vorzugsweise unter Verwendung von mindestens einem oben beschriebenen Marker. Alternativ betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Maispflanze, welches die folgenden Schritte umfasst: (A) Transientes Transformieren einer Maispflanzenzelle mit einer ersten Nukleotidsequenz, welche für ein erstes Protein mit Endonuklease-Aktivität (z. B. ein TALE- oder ZF-Endonuklease-Fusionsprotein) kodiert, das in der Lage ist zwischen Markerregion M2 und M4 eine Doppelstrangbruch der DNA im Genom der Maispflanzenzelle zu induzieren, und mit einer zweiten Nukleotidsequenz, welche für ein zweites Protein mit Endonuklease-Aktivität (z. B. ein TALE- oder ZF-Endonuklease- Fusionsprotein) kodiert, das in der Lage ist zwischen Markerregion M5 und M6 eine Doppelstrangbruch der DNA im Genom der Maispflanzenzelle zu induzieren, (B) Transientes Einbringen eines Spendervektors in die erste Maispflanzenzelle, welcher ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla trägt, wobei das Chromosomfragment ein erstes Intervall des Donors umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und ein Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt, und wobei das Chromosomfragment weiterhin die chromosomalen Abschnitte des Donors Pepitilla zwischen den Stellen der Doppelstrangbrüche aus (A) aufweist, sodass zwischen dem Genom der ersten Maispflanzenzelle und dem Chromsomfragment des Spendervektors eine homologe Rekombination stattfindet, (C) Regenation einer Maispflanze aus der Maispflanzenzelle, (D) Identifikation einer erfindungsgemäßen Maispflanze, vorzugsweise unter Verwendung von mindestens einem oben beschriebenen Marker. Besonders bevorzugt sind transient eingebrachte erste und zweite Nunkleinsäuresequenzen und Spedervektor wieder verloren gegangen. Dem Fachmann ist bekannt wir er dieses erreicht und nachweisen kann.
  • In einem weiteren Aspekt sind von der vorliegenden Erfindung die oben beschriebenen Marker als Oligonukleotide, insbesondere Primer-Oligonukleotide erfasst. Vorzugsweise sind die Oligonukleotide isolierte Oligonukleotide. Ein Oligonukleotid umfasst ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus einer der SEQ ID NOs: 41–49 oder 53–100. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Oligonukleotids, welches ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus einer der SEQ ID NOs: 17–228, umfasst, zur Identifizierung einer H. turcicum resistenten Maispflanze. Vorzugsweise stammt die Resistenz aus dem Donor Pepitilla und ist HTN1.
  • Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist weiterhin alternativ durch eine transgene Pflanze, insbesondere eine transgene Maispflanze, gelöst, welche eine unten beschriebene transgene Pflanzenzelle umfasst. Ferner betrifft die Erfindung auch einen Teil dieser erfindungsgemäßen Pflanze, wobei ein Teil eine Zelle, ein Gewebe, ein Organ oder ein Zusammenschluss von mehreren Zellen, Geweben oder Organen sein kann. Ein Zusammenschluss von mehreren Organen ist z. B. eine Blüte oder ein Samen. In einer besonderen Ausgestaltung betrifft die Erfindung einen Samen von der transgenen Pflanze, wobei der Samen das weiter unten beschriebene erfindungsgemäße Polynukleotid als Transgen umfasst. Bevorzugt zeigt eine transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung, insbesondere eine Pflanze der Spezies Zea mays, gegenüber H. turcicum eine höhere Resistenz als eine korrespondierende nicht-transformierte Pflanze (Pflanze ohne das Transgen). Eine erfindungsgemäße transgene Ht-resistente Pflanze zeigen eine erhöhte Resistenz gegenüber H. turcicum von mindestens 1 Boniturnote, bevorzugt von mindestens 2 Boniturnoten oder mindestens 3 Boniturnoten und besonders bevorzugt von mindestens 4 Boniturnoten (siehe Boniturschema in Tabelle 3). Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereit, welches einen Schritt des Einbringens des erfindungsgemäßen Polynukleotids oder des weiter unten beschriebenen Vektors der vorliegenden Erfindung in eine pflanzliche Zelle und optional einen Schritt der Selektion einer transgenen Pflanzenzelle umfasst. Weiterhin ist ein solches Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze durch einen anschließenden Schritt gekennzeichnet, der die Regenerierung der transgenen Pflanze aus der im ersten Schritt erzeugten transgenen Pflanzenzelle einschließt. Methoden zur Regeneration sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt.
  • In einem zusätzlichen Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung das Polynukleotid, welches ein oder mehrere Resistenz-vermittelnde Gene des HTN1-Locus aus Pepitilla (Tabelle 1), welche unter Befallsbedingungen mit H. turcicum einen Resistenzphänotyp mit den HTN1-typischen Merkmalen bewirken. Strukturell ist das Polynukleotid dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nukleinsäuremolekül umfasst, (a) das eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 und 15 aufweist, (b) das eine Nukleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zu einer der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 und 15 vorzugsweise über die gesamte Sequenzlänge, aufweist, (c) das mit dem komplementären Strang eines Nukleinsäuremoleküls nach (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, (d) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 kodiert, oder (e) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit einer der Aminosäuresequenzen nach (d), kodiert. Vorzugsweise kann das Polynukleotid isoliert und/oder gereinigt von seiner natürlichen genetischen Umgebung sein oder liegt in im Wesentlichen reiner oder homogener Form vor. Bevorzugt ist das Polynukelotid DNA, und besonders bevorzugt cDNA, d. h. das Polynukleotid umfasst die cDNA vom einem oder mehreren Resistenz-vermittelnde Genen (Tabelle 1). Es kann aber auch als RNA vorliegen. Dem Fachmann ist bekannt, wie er aus der hier offenbarten Sequenzinformation die cDNA-Sequenz ableiten kann. Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kodiert ein mindestens ein Polypeptid, das in der Lage ist, eine Resistenz gegenüber einem Helminthosporium turcicum in einer Pflanze, in welcher das Polypeptid exprimiert wird, zu vermitteln. Bevorzugt vermittelt das Polypeptid, welches durch das erfindungsgemäße Polynukleotid oder Teilen davon kodiert wird, insbesondere in einer Pflanze der Gattung Zea oder in einer Pflanze der Spezies Zea mays eine Resistenz gegenüber dem Pathogen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin auch ein Polypeptid, welches in der Lage ist eine Resistenz gegenüber H. turcicum in einer Pflanze, in welcher das Polypeptid exprimiert wird, zu vermitteln und welches durch das erfindungsgemäße Polynukleotid oder einem Teil davon kodiert wird. Besonders bevorzugt weist das Polypeptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16. Bei dem Polypeptid kann es sich um ein isoliertes Polypeptid handeln.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, welcher das erfindungsgemäße Polynukleotid umfasst. Bei dem Vektor kann es sich um ein Plasmid, ein Cosmid, eine Phage oder einen Expressionsvektor, einen Transformationsvektor, Shuttle-Vektor oder Klonierungsvektor handelt, er kann doppel- oder einzelsträngig, linear oder zirkulär sein oder kann einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt entweder durch Integration in dessen Genom oder extrachromosomal transformieren. Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Polynukleotid in einem Expressionsvektor mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen, welche die Transkription und optional die Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle erlauben, operativ verknüpft. Beispielsweise steht das Polynukleotid unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors oder eines Terminators. Geeignete Promotoren können Promotoren sein, welche konstitutiv induziert werden (Bsp.: 35S-Promoter aus dem „Cauliflower mosaic virus” (Odell et al. 1985), besonders geeignet sind solche Promotoren, welche pathogen-induzierbar sind (Bsp.: PR1-Promotor aus Petersilie (Rushton et al., 1996). Besonders geeignete Pathogen-induzierbare Promotoren sind synthetische bzw. chimäre Promotoren, welche in der Natur nicht vorkommen, aus mehreren Elementen zusammengesetzt sind und einen Minimalpromotor beinhalten sowie stromaufwärts des Minimalpromotors mindestens ein cis-regulatorisches Element aufweisen, welches als Bindungsstelle für spezielle Transkriptionsfaktoren dient. Chimäre Promotoren werden den gewünschten Anforderungen nach konzipiert und werden durch unterschiedliche Faktoren induziert oder reprimiert. Beispiele für solche Promotoren finden sich in WO 2000/29592 und WO 2007/147395 . Ein geeigneter Terminator ist beispielsweise der nos-Terminator (Depicker et al., 1982).
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen Vektoren, stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren bereit, das die Einbringung eines beschriebenen Vektors in eine Wirtszelle umfasst. Der Vektor kann beispielsweise durch Konjugation, Mobilisation, biolistische Transformation, Agrobakterium-vermittelte Transformation, Transfektion, Transduktion, Vakuuminfiltration oder Elektroporation eingebracht werden. Solche Verfahren ebenso wie Verfahren zur Präparation von beschriebenen Vektoren sind dem Fachmann geläufig (Sambrook et al. 2001).
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, welche das erfindungsgemäße Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst. Eine Wirtszelle im Sinne der Erfindung kann eine prokaryotische (z. B. bakteriell) oder eukaryotische Zelle (z. B. eine pflanzliche Zelle oder eine Hefezelle) sein. Vorzugsweise ist die Wirtszelle ein Agrobakterium wie Agrobakterium tumefaciens oder Agrobakterium rhizogenes oder eine Pflanzenzelle, welche das erfindungsgemäße Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfassen. Dem Fachmann sind sowohl zahlreiche Methoden wie Konjugation oder Elektroporation bekannt, mit denen er das erfindungsgemäße Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung in ein Agrobakterium einbringen kann, als auch Methoden wie diverse Transformationsverfahren (biolistische Transformation, Agrobakterium-vermittelte Transformation), mit denen er das erfindungsgemäße Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle einbringen kann (Sambrook et al. 2001).
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine transgene Pflanzenzelle, welche das erfindungsgemäße Polynukleotid als Transgen oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst. Eine solche transgene Pflanzenzelle ist beispielsweise eine Pflanzenzelle, welche mit dem erfindungsgemäßen Polynukleotid oder mit dem Vektor der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise stabil, transformiert ist. In einer bevorzugten Ausgestaltung der transgenen Pflanzenzelle ist, das Polynukleotid mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen, welche die Transkription und optional die Expression in der Pflanzenzelle erlauben, operativ verknüpft. Das Gesamtkonstrukt aus dem erfindungsgemäßen Polynukleotid und der/den regulatorischen Sequenzen stellt dann das Transgen dar. Solche regulatorische Sequenzen sind beispielsweise ein Promoter oder ein Terminator. Dem Fachmann sind zahlreiche in Pflanzen anwendbare, funktionelle Promotoren und Terminatoren bekannt. Bevorzugt zeigt eine transgene Pflanzenzelle der vorliegenden Erfindung, insbesondere eine Zelle einer Pflanze der Spezies Zea mays gegenüber H. turcicum eine höhere Resistenz als eine korrespondierende nicht-transformierte Pflanzenzelle (die Pflanzenzelle ohne das Transgen). Erfindungsgemäße transgene Ht-resistente Pflanzenzelle zeigen eine erhöhte Resistenz gegenüber H. turcicum von mindestens 1 Boniturnote, bevorzugt von mindestens 2 Boniturnoten oder mindestens 3 Boniturnoten und besonder bevorzugt von mindestens 4 Boniturnoten (siehe Boniturschema in Tabelle 3). Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle der vorliegenden Erfindung, welches einen Schritt des Einbringens des erfindungsgemäßen Polynukleotids oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in eine pflanzliche Zelle umfasst. Beispielsweise kann das Einbringen durch Transformieren stattfinden, vorzugsweise durch stabiles Transformieren. Die geeigneten Techniken zur Einbringung wie biolistische Transformation, Agrobakterium-vermittelte Transformation oder Elektroporation sind dem Fachmann bekannt (Sambrook et al. 2001).
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Vermittlung oder Erhöhung einer Resistenz gegenüber H. turcicum in einer Pflanze, bevorzugt einer Pflanze der Spezies Zea mays, welche einen Schritt des Transformierens einer Pflanzenzelle mit dem erfindungsgemäßen Polynukleotid oder dem Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst. Bevorzugt führt dieses Verfahren zu erhöhter Resistenz gegenüber H. turcicum von mindestens 1 Boniturnote, bevorzugt von mindestens 2 Boniturnoten oder mindestens 3 Boniturnoten und besonder bevorzugt von mindestens 4 Boniturnoten (siehe Boniturschema in Tabelle 3).
  • Einige der in dieser Anmeldung verwendeten Begriffe werden nachfolgend zunächst näher erläutert:
    Der Begriff ”Allel” betrifft eine von zwei oder mehr Nukleotidsequenzen an einem bestimmten Locus im Genom. Ein erstes Allel findet sich auf einem Chromosom, ein zweites auf einem zweiten Chromosom an derselben Position. Unterscheiden sich die beiden Allele liegen diese heterozygot vor, sind es dieselben Allele liegen sie homozygot vor. Verschiedene Allele eines Gens (Genallele) unterscheiden sich in mindestens einem SNP. Je nach Kontext der Beschreibung meint ein Allel auch nur ein einzelnes SNP, das beispielsweise eine Unterscheidung zwischen Donor von HTN1 (Pepitilla) und rekurrentem Elter erlaubt.
  • Der Ausdruck ”Chromosomfragment” ist ein spezifischer chromosomaler DNA-Abschnitt eines bestimmten Chromosoms, der mindestens ein Gen umfasst. Ein integriertes Chromosomfragment stammt aus einer Donor-Quelle. Im Sinne der Erfindung kann die sequenzielle Abfolge der Gene innerhalb eines integrierten Chromosomfragments derjenigen Abfolge entsprechen, wie sie im ursprünglichen Chromosomfragment der Donor-Quelle vorliegt. Somit kann das integrierte Chromosomfragment über die gesamte Länge unverändert zum entsprechenden Chromosomfragment in der Donor-Quelle vorliegen. Ein Chromosomfragment oder ein Teil davon kann einen spezifischen ”Haplotyp” darstellen, wobei das Chromosomfragment dann bestimmte SNPs aufweist, durch die der Haplotyp auch eindeutig spezifiziert ist und identifiziert werden kann.
  • Die Begriffe ”distal” und ”proximal” bezeichnen die Position einer chromosomalen Intervalls bzw. eines genetischen Abschnitts in Relation zu einem bestimmten Bezugsort (beispielsweise einem bestimmten Polynukleotid, einem anderen chromosomalen Intervall oder einem Gen) auf einem Gesamtchromosom, wobei distal bedeutet, dass das Intervall oder der Abschnitt auf der dem Chromosom-Centromer abgewandten Seite des Bezugsortes lokalisiert ist, und proximal bedeutet, dass das Intervall oder der Abschnitt auf der dem Chromosom-Centromer zugewandten Seite des Bezugsortes lokalisiert ist.
  • ”Eng gekoppelt” oder „eng verknüpft” meint zwei Loci, zwei intervalle, zwei genetische Abschnitte oder zwei Marker (Markerloci), welche weniger als 15 cM, weniger als 12 cM, welche weniger als 10 cM, welche weniger als 8 cM, welche weniger als 7 cM, welche weniger als 6 cM, welche weniger als 5 cM, welche weniger als 4 cM, welche weniger als 3 cM, welche weniger als 2 cM, welche weniger als 1 cM, welche weniger als 0,5 cM, welche weniger als 0,2 cM, welche weniger als 0,1 cM, festgelegt durch die IBM2 neighbors 4 genetic map öffentlich zugänglich auf der Maize GDB website, voneinander entfernt sind.
  • Der Begriff ”Ertrag” im Sinne der vorliegenden Erfindung betrifft die Produktivität pro Flächeneinheit eines bestimmten Pflanzenproduktes mit kommerziellem Wert. Beispielsweise wird der Ertrag von Mais gewöhnlich gemessen in metrischen Tonnen Samen oder Korn pro Hektar (ha) und Saison oder in metrischen Tonnen Trockenbiomasse pro Hektar (ha) und Saison. Sofern nicht ausdrücklich anders angegeben oder spezifiziert, kann der Ertrag die absolute Frisch- oder Trockenmasse, die relative Frisch- oder Trockenmasse, den Silageertrag (auch Silomaisertrag oder Total Dry Matter Yield genannt) oder den Körnerertrag betreffen. Der Ertrag wird durch genetische und umweltbedingte Faktoren beeinflusst und setzt sich prinzipiell aus zahlreichen agronomischen Eigenschaften zusammen, die auf genetischen Elementen beruhende Merkmale einer Pflanze darstellen und im Verlauf der Saison zum letztendlichen Ertrag beitragen. Zu diesen individuellen agronomischen Eigenschaften gehören beispielsweise Saataufgang, vegetative Vitalität, Stresstoleranz, Krankheitsresistenz oder -toleranz, Herbizidresistenz, Verzweigungsneigung, Blühzeitpunkt, Samenansatz, Samendichte, Standfestigkeit und Lagerneigung, Druschfähigkeit (gleichmäßige Abreife), etc.
  • Unter „Hybridisieren” oder „Hybridisierung” wird ein Vorgang verstanden, bei dem sich ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül an einen weitestgehend komplementären Nukleinsäurestrang anlagert, d. h. mit diesem Basenpaarungen eingeht. Standardverfahren zur Hybridisierung sind beispielsweise in Sambrook et al. 2001 beschrieben. Vorzugsweise wird darunter verstanden, dass mindestens 60%, weiter bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Basen des Nukleinsäuremoleküls eine Basenpaarung mit dem weitestgehend komplementären Nukleinsäurestrang eingehen. Die Möglichkeit einer solchen Anlagerung hängt von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ab. Der Begriff „Stringenz” bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen. Hohe Stringenz ist dann gegeben, wenn eine Basenpaarung erschwert ist, niedrige Stringenz, wenn eine Basenpaarung erleichtert ist. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen hängt beispielsweise von der Salzkonzentration bzw. Ionenstärke und der Temperatur ab. Generell kann die Stringenz durch eine Erhöhung der Temperatur und/oder eine Erniedrigung des Salzgehaltes erhöht werden. Unter „stringenten Hybridisierungsbedingungen” sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung überwiegend nur zwischen homologen Nukleinsäuremolekülen stattfindet. Der Begriff „Hybridisierungsbedingungen” bezieht sich dabei nicht nur auf die bei der eigentlichen Anlagerung der Nukleinsäuren herrschenden Bedingungen, sondern auch auf die bei den anschließenden Waschschritten herrschenden Bedingungen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Bedingungen, unter denen überwiegend nur solche Nukleinsäuremoleküle hybridisieren, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Sequenzidentität aufweisen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 × SSC bei 65°C und anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 × SSC bei 65°C für insgesamt etwa 1 Stunde. Der hier verwendete Begriff ”stringente Hybridisierungsbedingungen” kann auch bedeuten: Hybridisieren bei 68°C in 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,2, 7% SDS, 1 mM EDTA und 1% BSA für 16 Stunden und anschließendes zweimaliges Waschen mit 2 × SSC und 0,1% SDS bei 68°C. Bevorzugt findet eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen statt.
  • Der Begriff „Intervall” oder „chromosomales Intervall” meint einen durchgängigen linearen Abschnitt auf einer genomischen DNA, welcher in einem einzelnen Chromosom in planta oder auf einem Chromosomfragment vorliegt und welcher gewöhnlicherweise durch die Angabe von zwei Markern, welche die Endpunkte des Intervalls zur distalen und proximalen Seite hin darstellen, definiert ist. Dabei können die Marker, die das Intervall endständig definieren selbst auch Teil des Intervalls sein. Weiterhin können zwei unterschiedliche Intervalle auch überlappen. In der Beschreibung wird ein Intervall durch die Angabe „zwischen Marker A und Marker B” spezifiziert. Ein endständiger Marker eines Intervalls kann auch in einer definierten Markerregion zu einer Seite des Intervalls lokalisiert sein. Eine Markerregion wird dann durch die Angabe von zwei flankierenden Markern definiert und stellt einen chromosomalen Abschnitt dar, auf dem neben den flankierenden Markern noch weitere Marker liegen können. Flankierende Marker bestimmen die Endpunkte einer Markerregion und sind selbst noch Teil der Markerregion. Sind beide endständigen Marker eines Intervalls Marker in unterschiedlichen Markerregionen zu beiden Seiten eines Intervalls, wird in der Beschreibung ein Intervall durch die Angabe „zwischen einem Marker in einer Markerregion X, welche durch die Marker C und D flankiert ist, und einem Marker in einer Markerregion Y, welche durch die Marker E und F flankiert ist” spezifiziert. Eine Markerregion kann sich über bis zu 500.000 Baasenpaare (bp) erstrecken, kann bevorzugt zwischen 100.000 und 400.000 bp groß sein oder kann besonders bevorzugt zwischen 140.000 und 315.000 bp groß sein.
  • Unter ”Introgression” versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Übertragung von mindestens einem gewünschten Genallel auf einem genetischen Locus von einem genetischen Hintergrund in einen anderen. Beispielsweise kann eine Introgression eines gewünschten Genallels an einen spezifischen Locus auf einen Nachkommen durch sexuelle Kreuzung zwischen zwei Eltern derselben Spezies übertragen werden. Alternativ kann zum Beispiel die Übertragung eines Genallels auch durch Rekombination zwischen zwei Donorgenomen in einem fusionierten Protoplasten auftreten, wobei mindestens ein Donor-Protoplast das gewünschte Genallel in seinem Genom trägt. In jedem Fall können die Nachkommen, die dann das gewünschte Genallel umfassen, anschließend wiederholt mit einer Linie, die einen vorzüglichen genetischen Hintergrund aufweist, rückgekreuzt und auf das gewünschte Genallel selektiert werden. Das Ergebnis ist eine Fixierung des gewünschten Genallels in einem ausgewählten genetischen Hintergrund.
  • Unter einem „isolierten Nukleinsäuremolekül” oder „isolierten Polynukleotid” wird ein aus seiner natürlichen bzw. ursprünglichen Umgebung herausgelöstes Nukleinsäuremolekül oder Polynukleotid verstanden. Der Begriff umfasst auch ein synthetisch hergestelltes Nukleinsäuremolekül. Unter einem „isolierten Polypeptid” wird ein aus seiner natürlichen bzw. ursprünglichen Umgebung herausgelöstes Polypeptid verstanden. Der Begriff umfasst auch ein synthetisch hergestelltes Polypeptid.
  • Unter einer ”Pathogeninfektion” ist der früheste Zeitpunkt zu verstehen, zu dem ein Pathogen mit einem pflanzlichen Wirtsgewebe interagiert. Beispielsweise gehören bei Pilzen wie Ascomyceten oder bei Oomyceten das Auswachsen von Hyphen oder die Bildung von spezifischen Infektionsstrukturen wie Penetrationshyphen und Appressorien. Im Detail kann die Infektion durch Helminthosporium turcicum bereits mittels diverser Färbetechniken (z. B. Trypan-Blau) untersucht (Chung et al., BMC Plant Biology 10 (2010), 103; Walsh et al. (2008), Posterpräsentation P192, 50th Maize Genetics Conference in Washington D.C.).
  • Ein ”Locus” ist eine Position auf einem Chromosom, wo sich ein oder mehrere Gene befinden, welche ein agronomisches Merkmal verursachen oder beeinflussen. Insbesondere meint Locus hier den HTN1-Resistenzlocus, welcher Resistenz gegenüber den Pathogen Helminthosporium turcicum bzw. mindestens gegenüber eine Rasse von Helminthosporium turcicum vermittelt.
  • Eine Maispflanze ist eine Pflanze der Spezies Zea mays sowie deren Subspezies wie beispielsweise Zea mays ssp. mays, Zea mays ssp. mexicana oder Zea mays ssp. parviglumis verstanden.
  • Ein ”Marker” ist eine Nukleotidsequenz, die als Bezugs- oder Orientierungspunkt verwendet wird. Ein Marker zum Erkennen eines Rekombinationsereignisses sollte geeignet sein, Unterschiede oder Polymorphismen innerhalb einer pflanzlichen Population zu überwachen. Für Marker finden sich diese Unterschiede auf DNA-Ebene und sind beispielsweise Polynukleotidsequenzunterschiede wie zum Beispiel SSRs (simple sequence repeats), RFLPs (restriction fragment length polymorphisms), FLPs (fragment length polymorphisms) oder SNPs (single nucleotide polymorphisms). Die Marker können von genomischen oder exprimierten Nukleinsäuren wie beispielsweise gespleißter RNA, cDNA oder ESTs abgeleitet sein und können sich auch auf Nukleinsäuren beziehen, die als Sonden oder Primer-Paare eingesetzt werden und als solche geeignet sind, ein Sequenzfragment unter Verwendung PCR-basierter Verfahren zu amplifizieren. Marker, welche genetische Polymorphismen zwischen Teilen einer Population betreffen, können mittels etablierter Verfahren aus dem Stand der Technik nachgewiesen werden (An Introduction to Genetic Analysis. 7th Edition, Griffiths, Miller, Suzuki et al., 2000). Dazu gehören z. B.: DNA-Sequenzierung, PCR-basierte, sequenzspezifische Amplifikation, Nachweis von RFLPs, Nachweis von Polynukleotidpolymorphismen mittels Allel-spezifischer Hybridisierung (ASH), Detektion von SSRs, SNPs oder RFLPs. Darüber hinaus sind auch Verfahren zur Detektion von ESTs (expressed sequence tags) und RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) bekannt. Je nach Kontext kann der Begriff Marker in der Beschreibung auch eine spezifische Chromosomposition in dem Genom einer Spezies, wo ein spezifischer Marker (z. B. SNP) gefunden werden kann, meinen. Ein solche Marker-Position kann genutzt werden, um die Anwesenheit eines gekoppelten Locus zu verfolgen, z. B. ein gekoppelter Locus, der zur Expression eines bestimmten phänotypischen Merkmals beiträgt (z. B. HTN1 oder Linkage Drag). Beispielsweise kann der Marker-Locus auch genutzt werden, um die Segregation von Allelen an einem Locus (QTL oder Einzelgen), die genetisch oder physikalisch eng gekoppelt sind mit dem Marker-Position, zu beobachten.
  • ”Operativ verknüpft” meint verbunden in einem gemeinsamen Nukleinsäuremolekül, in einer Weise, dass die verbundenen Elemente derart zueinander positioniert und orientiert sind, dass eine Transkription des Nukleinsäuremolekül stattfinden kann. Eine DNA, welche operativ mit einem Promotor verknüpft ist, steht unter der transkriptionellen Kontrolle dieses Promotors.
  • Pflanzliche ”Organe” meinen beispielsweise Blätter, Sprossachse, Stamm, Wurzeln, vegetative Knospen, Meristeme, Embryos, Antheren, Ovula oder Früchte. Pflanzliche ”Teile” meinen einen Zusammenschluss mehrerer Organe, z. B. eine Blüte oder ein Samen, oder einen Teil eines Organs, z. B. einen Querschnitt aus der Sprossachse. Pflanzliche ”Gewebe” sind zum Beispiel Kallusgewebe, Speichergewebe, meristematische Gewebe, Blattgewebe, Sprossgewebe, Wurzelgewebe, Pflanzentumorgewebe oder reproduktives Gewebe. Unter pflanzlichen ”Zellen” sind beispielsweise isolierte Zellen mit einer Zellwand oder Aggregate davon oder Protoplasten zu verstehen.
  • Eine ”Pflanze” im Sinne der Erfindung kann, sofern nicht anders angegeben von jeder Spezies aus den dikotyledonen, monokotyledonen und gymnospermen Pflanzen sein. Vorzugsweise sind Pflanzen monokotyl und sind in Agrikultur oder Hortikultur oder zur Erzeugung von Bioenergie (Bioethanol, Biogas etc.) interessant. Hierzu zählen beispielhaft Gossypium sp., Zea mays, Brachypodium distachyon, Triticum sp., Hordeum vulgare, Oryza sativa, Sorghum sp., Musa sp., Saccharum officinarum, Secale cereale, Avena sp., Rasen- und Futtergras. Eine erfindungsgemäße Pflanze ist vorzugsweise eine Pflanze der Gattung Zea, insbesondere der Spezies Zea mays, oder Sorghum.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff ”regulatorische Sequenz” eine Nukleotidsequenz, welche die Spezifität und/oder die Expressionsstärke beeinflusst, zum Beispiel indem die regulatorische Sequenz eine bestimmte Gewebespezifität vermittelt. Eine solche regulatorische Sequenz kann stromaufwärts des Transkriptionsinitiationspunkts eines Minimalpromotors, aber auch stromabwärts davon wie beispielsweise in einer transkribierten aber nicht translatierten Leader-Sequenz oder innerhalb eines Introns lokalisiert sein.
  • Der Ausdruck ”Resistenz” oder ”resistent” gegenüber einem Pathogen ist als die Widerstandsfähigkeit einer Pflanze oder pflanzlichen Zelle gegenüber die schädlichen Einflüsse des Pathogens zu verstehen und erstreckt sich von einer Verzögerung in der Krankheitsentwicklung bis hin zu einer kompletten Unterdrückung der Krankheitsentwicklung. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist eine Pflanze/Pflanzenzelle resistent oder besitzt eine Pflanze/Pflanzenzelle eine Resistenz gegenüber dem Pathogen Helminthosporium turcicum (H. turcicum oder Ht), d. h. somit gegenüber der Blattkrankheit Northern Corn Leaf Blight (NCLB). Die Resistenz wird vermittelt durch ein oder mehrere Proteine, die durch ein Gen oder durch Gene (resistenzvermittelnden Gene) aus der Akzession Pepitilla kodiert werden. Die Resistenz kann vollständig oder partiell sein und kann Pathogenrassen-spezifisch oder nicht-Pathogenrassen-spezifisch ausgeprägt sein. Im Fall einer Pathogenrassen-spezifischen Resistenz können zu den virulenten Rassen von Helminthosporium turcicum beispielsweise N, 1N, 2N, 23N oder 123N, zu den avirulenten Rassen beispielsweise 0, 1, 2, 3, 12, 23 oder 123 gehören. Eine vermittelte Resistenz kann eine neu-erworbene Resistenz sein oder die Erhöhung einer bereits existierenden partiellen Resistenz.
  • Eine ”Transgene Pflanze” bezieht sich auf einen Pflanze, in dessen Genom mindestens ein Polynukleotid, vorzugsweise ein heterologes Polynukleotid, integriert ist. Bevorzugt ist das Polynukleotid stabil integriert, was bedeutet, dass das integrierte Polynukleotid in der Pflanze stabil erhalten bleibt, exprimiert wird und auch stabil an die Nachkommen vererbt werden kann. Das stabile Einbringen eines Polynukleotids in das Genom einer Pflanze schließt auch die Integration in das Genom einer Pflanze der vorhergehenden Parentalgeneration mit ein, wobei das Polynukleotid stabil weitervererbt werden kann. Der Begriff ”heterolog” bedeutet, dass das eingebrachte Polynukleotid beispielsweise von einer Zelle oder einem Organismus mit einem anderen genetischen Hintergrund derselben Spezies oder einer anderen Spezies stammt, oder homolog ist zu der prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle, dann aber in einer unterschiedlichen genetischen Umgebung lokalisiert ist und sich so von einem eventuell natürlicherweise vorhandenen korrespondierenden Polynukleotid unterscheidet. Ein heterologes Polynukleotid kann zusätzlich zu einem entsprechenden endogenen Gen vorhanden sein.
  • Ausgestaltungen und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die angehängten Figuren und Sequenzen beschrieben:
  • 1: Errechneter QTL-Bereich von 23,1 cM auf Chromosom 8 mittels 8 Markern in 528 F2-Individuen der Kreuzung RP1 × RP1HTN1. Der schwarze Balken (HtN) zeigt das confidence-Intervall an. Positions-Angaben der Marker in cM.
  • 2: Silageertrag-Versuch über 5 Standorten in Deutschland und in zwei Wiederholungen mit dem rekurrenten Elter RP3 und der A-Version des Donorfragments aus B37HTN1 (RP3HTNA) und der K-Version des Donorfragments aus B37HTN1 (RP3HTNK). Balken geben signifikante Unterschiede gemäß t-Test mit p = 0,05 wieder.
  • 3: Beschreibung der Markerregionen M1 bis M6, welche die chromosomalen Intervalle (Int.1 bis Int.5) definieren, die in den Introgressionslinien das Resistenz-vermittelnde Polynukleotid aufweisen und im vom Donor-stammenden Chromosomfragment den Linkage Drag tragen. Chromosomale Abschnitte des Donor ,Pepitilla' sind gepunktet, solche des rekurrenten Elter (ohne Linkage Drag) sind diagonal gestreift dargestellt. Intervall 1 (Int.1) umfasst den Resistenzlocus HTN1, Intervall 2 (Int.2) umfasst Sequenzbereiche, welche im Donor für den Linkage Drag des Blühzeitpunkts verantwortlich sind, Intervalle 4 und 5 (Int.4 und Int.5) umfassen Sequenzbereiche, welche im Donor für den Linkage Drag des Silageertrages verantwortlich sind.
  • 4: BAC-contig auf seiner RP4HTN1 BAC-Bank mit entsprechendem Sequenz scaffold und Gen-Annotationen. Kandidatengene sind als karierte Kästchen wiedergegeben. Schwarze Pfeile stellen weitere annotierte Gene dar, welche keine Kandidatengene der HTN-Resistenz sind.
  • 1. Phänotypisierungexperimente
    • A) Durchführung von Feld-Versuchen zur Bestimmung der HT-Resistenz unter natürlicher und künstlicher Beimpfung/Infektion und des Blühzeitpunkts: An einem Standort wurden pro zu untersuchenden Mais-Genotyp jeweils mindestens 20 Individuen in einer Reihe ausgepflanzt. Die Inokulation erfolgte natürlich oder künstlich. Die natürliche Beimpfung/Infektion erfolgt durch natürlich auftretende Sporen von H. turcicum. Die künstliche Beimpfung/Infektion erfolgte mittels infiziertem und gemahlenem Blattmaterial, welches auf die zu untersuchenden Pflanzen gegeben wurde. Letztere Art der Inokulation ermöglichte die Simulation eines vergleichbaren H. turcicum-Befalls in unterschiedlichen Versuchsjahren und an unterschiedlichen Standorten unabhängig von den jeweils vorherrschenden natürlichen Befallsbedingungen. Als Kontroll-Genotypen wurden entsprechend der untersuchten Kreuzungspopulation ein anfälliger Elter und ein Elter mit HtN1-Introgression aus dem Donor B37HTN1 kultiviert. Die Bonitur des Merkmals HT-Resistenz fand zu mindestens drei Zeitpunkten während der Vegetationsperiode statt. Das einheitlich verwendete Boniturschema ist in Tabelle 3 wiedergegeben. Der Donor B37HTN1 als Quelle der HT-Resistenz wurde in verschiedene genetische Hintergründe aus Elite-Linien mit unterschiedlichen stark ausgeprägten Anfälligkeit gegenüber H. turcicum eingekreuzt und nahisogene Linien entwickelt, welche sich von den anfälligen Ausgangslinien im Wesentlichen nur durch die Introgression aus B37HTN1 unterscheiden. In Phänotypisierungsexperimenten wurden nach künstlicher Inokulation wie oben beschrieben solche Linien selektiert, welche durch Einbringen der Resistenz-vermittelnden Introgression aus B37HTN1 eine Verbesserung der HT-Resistenz um mindestens 2 bis 3 Boniturnoten, bevorzugt von 3 bis 4 Boniturnoten aufzeigten. Beispielhaft wird die vorliegende Erfindung im Weiteren an den beiden selektierten rekurrenten Eltern RP1 und RP3 näher beschrieben. Die Ergebnisse der genannten Phänotypisierungsexperimente sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Der rekurrente Elter RP1 ohne Introgression zeigte durchschnittliche Boniturnoten von 7 bis 9, die sich durch die Introgression aus B37HTN1 um 3 bis 4 Noten verbessert wurden. Der rekurrente Elter RP3 zeigte Boniturnoten zwischen 4 und 6 ohne Introgression und eine Verbesserung um 2 bis 3 Boniturnoten durch die Introgression. Der rekurrente Elter RP4 zeigte eine Boniturnoten von 6 ohne Introgression und eine Verbesserung um 2–3 Boniturnoten durch die Introgression.
  • Tabelle 5: Phänotypisierungsdaten zur HT-Resistenz aus Genotypen RP1, RP3, und RP4 mit und ohne Resistenz-vermittelnder Introgression aus B37HTN1 (Boniturnoten wurden gemäß Schema aus Tabelle 3 bestimmt).
    Genotyp Durchschnittliche Boniturnoten (n = 20) ohne Introgression aus B37HTN1 Verbesserung der HT-Resistenz mit Introgression aus B37HTN1
    RP1 7 bis 9 3 bis 4
    RP3 4 bis 6 2 bis 3
    RP4 6 2 bis 3
    • Neben der HT-Resistenz wurde zudem für jeden Genotyp der Zeitpunkt der weiblichen und männlichen Blüte in Tagen nach Aussaat erfasst. Der Zeitpunkt der weiblichen Blüte ist durch das Auftreten von Narbenfäden, der männlichen Blüte durch das Auftreten der Rispe festgelegt. Die Ergebnisse sind unter Beispiel 3. B) näher ausgeführt.
    • B) Durchführung von Feld-Versuchen zur Bestimmung des Korn- und Silage-Ertrags: Neben vorstehenden Daten zu HT-Resistenz und Blühzeitpunkt wurden Ertragsdaten für RP3, enthaltend unterschiedlich lange Resistenz-vermittelnde Introgressionsfragmente aus B37HTN1 bzw. Pepitilla, und für eine vergleichende Elite-Linie ermittelt. Die Linien RP3, RP3HTNA und RP3HTNK wurden mit einem Tester (Flintmais, interpool Einfachkreuzung) des komplementären Genpools (Flintmais) bestäubt, um Saatgut für Testhybriden zu erzeugen. Diese Testhybriden wurden jeweils zweifach in einem Feldversuch an fünf für den Maisanbau repräsentativen Standorten in Deutschland angebaut. Die Testhybriden sind an diese Anbauregion in Bezug auf die Reife gut angepasst. Der Feldversuch wurde in zwei Wiederholungen in 4-reihigen Parzellen mit 6 m Länge und 0,75 m Reihenabstand durchgeführt. Die Bestandsdichte betrug 9 Pflanzen je m2 in der ersten und 11 Pflanzen je m2 in der zweiten Wiederholung. Zum Zeitpunkt der Silomaisreife wurden nur die beiden mittleren Reihen jeder Parzelle geerntet, um Konkurrenzeffekte zu minimieren. Am Erntegut wurde das Gewicht je Parzelle und der Wassergehalt bestimmt, um den Silomaisertrag (auch Silageertrag oder Total Dry Matter Yield) und den Trockensubstanzgehalt (Total Dry Matter Content) zu berechnen.
    • C) Durchführung von Gewächshaus-Versuchen zur Bestimmung der HT-Resistenz: Es wurden 20 Individuen pro Genotyp in Töpfen angezogen. Als Kontrollen dienten je nach Kreuzung Genotypen eines anfälligen Elters und eines nah-isogenen Elters (NIL) mit Resistenz-vermittelnder Introgression aus B37HTN1. 14 Tagen nach Aussaat erfolgte eine künstliche Infektion (siehe oben). Nach weiteren 2 bis 3 Wochen entwickelten sich erste Krankheitssymptome. Ab dem Zeitpunkt des Auftretens erster Symptome wurden alle zwei Tage die Bonituren des Merkmals HT-Resistenz sowie die Anzahl der Pflanzen mit Symptomen erfasst. Daraus wurde dann der AUDPC (area under disease progress curve) bestimmt. Die Befallshäufigkeit (in %/Zeit × Zeitraum) wurde für die Einteilung der untersuchten Pflanzen verwendet, wobei AUDPC von 0–100 resistent, 101–450 heterozygot, und > 450 anfällig entspricht.
  • 2. Markerentwicklung für die HTN1-Target-Region
  • Neben den Boniturversuchen wurde die Target-Region um den HTN1-Resistenzlocus auf Chromosom 8 (bin 8.06) in zahlreichen Genotypen mittels neuer und/oder optimierter molekularer Marker genauer untersucht und feinkartiert. Hierzu eingesetzte molekulare Marker wurden auf Grund von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) oder bereits öffentlich verfügbaren simple sequence repeat Marker (SSR) entwickelt: Die DNA aus den Genotypen zur Anwendung der Marker wurde entweder mittels der Methode NucleoSpin 96 Plant II nach Herstellerangaben (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Deutschland) oder mittels der Methode Klear Gene DNA Extraction 384 (LGC Genomics GmbH, Deutschland) isoliert.
  • Die Primersequenzen der SSR-Marker waren bereits aus der öffentlichen Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists bekannt; die Primersequenzen der Marker bnlg1782, umc1960, bnlg240, umc1121, bnlg1067 und umc1287, welche zur Untersuchung der Targetregion verwendet wurden, zusammen mit den vorgenommenen Modifikationen sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 6: Primer Sequenzen der SSR Marker (NED: 2'-chloro-5'-fluoro-7',8'-fused phenyl-1.4-dichloro-6-carboxyfluorescein; FAM: 6-carboxyfluorescein; M13: Kernsequenz der Phage M13)
    Marker Forward Primer Sequenz (5'-3') [SEQ ID NO] Modifikation Reverse Primer Sequenz (5'-3') [SEQ ID NO] Modifikation Zusätzlicher Primer + Modifikation
    bnIg1782 113 NED 114 keine
    umc1960 115 NED 116 keine
    bnlg240 117 FAM 118 keine
    umc1121 119 FAM 120 keine
    bnlg1067 121 FAM 122 keine
    umc1287 123 keine 124 keine M13 + FAM
  • Der PCR-Reaktions-Mix von bnlg1782, umc1960, bnlg240, umc1121 und bnlg1067 umfasste 10 μl und bestand aus einer Einfach-Konzentration des 4 × PufferB (Solis BioDyne, Estland), 0,5 pmol des forward Primers, 0,5 pmol des reversen Primers, 10–30 ng DNA, 0,25 Units HotFirepol TAQ-Polymerase (Solis BioDyne, Estland). Der Reaktionsmix von umc1287 umfasste 10 μl und bestand aus einer Einfach-Konzentration des 4 × PufferB (Solis BioDyne, Estland), 0,5 pmol des forward Primers, 2,5 pmol des reversen Primers, 0,3 pmol des zusätzlichen Primers M13, 10–30 ng DNA, 0,25 Units HotFirepol TAQ-Polymerase (Solis BioDyne, Estland).
  • Die PCR-Reaktion wurde mit einer anfänglichen Denaturierungszeit von 900 Sekunden bei 94°C, einem Amplifikations-Zyklus von 25–40 Zyklen mit 15 Sekunden 94°C, 30 Sekunden 50–55°C und 120 Sekunden bei 72°C, und einem abschließenden Schritt für 300 Sekunden bei 72°C durchgeführt. Im Anschluss erfolgte eine 2 h Inkubation der PCR-Reaktion bei 65°C. Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte auf einem ABI3730xl (Life TechnologiesTM, USA) nach den Angaben des Herstellers für die Auftrennung von Fragmenten von 50–400 bp.
  • Die SNP Marker wurden entweder (a) aus öffentlich verfügbaren Ressourcen, (b) aus einer vergleichenden Amplicon-Sequenzierung oder (c) aus einem Sequenz-Vergleich von BAC-Sequenzen aus RP4HTN1 (siehe Abschnitt Molekulare Analyse) und B73 Referenz-Genom AGPv02 (www.maizesequence.org) entwickelt und verwendet.
    • (a) Aus der öffentlich verfügbare SNP Ressource des Mais Community 50K-Illumina-Chip (Ganal et al., 2011) wurden SNPs in KASP-Marker (LGC Genomics GmbH, Deutschland) umgewandelt. Dazu wurden neue Primer entwickelt, die im KASP-Marker-Assay die Amplifikation der entscheidenden Allele gewährleisteten (siehe Tabelle 4). Der gesamte Arbeitsablauf wurde mit der KrakenTM Software (LGC Genomics GmbH, Deutschland) durchgeführt. Für einen KASP-Marker-Assay wurden 5–20 ng DNA, 0,02 μl eines Oligo-Assay-Mixes (12 μM Primer Allele 1 (forward); 12 μM Primer Allele 2 (forward); 30 μM reverse Primer) und 1,5 μl eines 1xKASPar Reagent Kits für 1536-Platten verwendet. Ein Standard-PCR-Setup bestand aus 94°C für 15 min, 10 Zyklen mit 94°C für 20 Sekunden, 61–55°C touch down für 1 Minute, 26 Zyklen mit 94°C für 20 Sekunden und 55°C für 1 Minute. Die Auswertung der Allele pro Genotyp wurde mittels der KrakenTM Software (LGC Genomics GmbH, Deutschland) durchgeführt.
    • (b) Die vergleichende Amplicon-Sequenzierung wurde mittels Sanger-Sequenzierung durchgeführt. Die Genotypen in der vergleichenden Sequenzierung umfassten jeweils den Donor B37HTN1, sowie B37, RP1, RP1HTN1, RP3, RP3HTN1 (Versionen A, B, K), RP4, RP4HTN1. Die DNA wurde aus vermahlenen Körnern mittels der CTAB-Methode (Maniatis et al., 1982) isoliert. Die Primersequenzen für die Amplicon-Sequenzierung sind in Tabelle 4 aufgelistet. Ein Standard-PCR-Protokoll für die Amplifikation der entsprechenden Bereiche bestand aus einer Denaturierung bei 94°C für 5 Minuten, 35 Zyklen mit jeweils 94°C für 1 Minute, 60°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten und einem abschließendem Schritt bei 72°C für 10 Minuten. Die PCR-Produkte wurden mit der Sanger-Methode (Sanger & Coulson, 1975) sequenziert. Die Sequenzauswertung erfolgte mit der DNAStar Lasergene Software (DNASTAR Inc., USA). Die detektierten Polymorphismen wurden wie unter (a) beschrieben in KASP-Marker umgewandelt.
    • (c) Die BAC-Sequenz-Contigs wurden mittels Blast-Algorithmus (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) gegen das 673 Referenz-Genom AGPv02 projiziert um Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) zu detektieren. Die Polymorphismen wurden mit der Lasergene Software (DNASTAR Inc., USA) detektiert und sind zusammen mit den flankierenden Sequenzen in Tabelle 4 aufgeführt. Zu den flankierenden Sequenzen eines SNPs wurden Primer entwickelt und die identifizierten SNPs wie unter (a) beschrieben in KASP-Marker umgewandelt.
  • 3. Lokalisierung des HTN1-Resistenzlocus auf Chromosom 8 durch Verwendung der SSR-Marker
  • A) Lokalisierung des HTN1-Resistenzlocus:
  • Der HTN1-Resistenzlocus aus den Donoren B37HTN1 wurde wie unter Beispiel 1.A) beschrieben in Elite-Linien eingekreuzt und mit Hilfe der SSR und SNP Marker aus Beispiel 2. auf Chromosom 8 (bin 8.06) lokalisiert (siehe 1). NILs der Kreuzungen RP1 × RP1HTN1 und RP3 × RP3HTN1 wurden an zwei Standorten über mehrere Jahre mit zwei Wiederholungen unter natürlichen Infektionsbedingungen gemäß Boniturschema nach Tabelle 3 phänotypisiert. Die NILs zeigten im Mittel eine um 4 Boniturnoten verbesserte Resistenzantwort im Vergleich zur Originallinie. Die Entwicklung der lokalen Läsionen auf den Blättern war um etwa 2 Wochen im Vergleich zum anfälligen Genotyp verschoben. Eine QTL-Kartierung wurde mit 528 F2 Individuen (Kreuzung RP1 × RP1 HTN1) unter Verwendung von den 8 Markern (aus 1 QTL Kartierung – Marker sind Tabellen 4 und 6 aufgeführt) durchgeführt. Der QTL-Bereich, welcher den HTN1-Resistenzlocus umfasst, wurde auf Chromosom 8 zwischen den Markern MA0002 und umc1287 in einem Bereich von 23,1 cM lokalisiert.
  • B) Einkreuzen des B37HTN1 Donor Fragmentes in eine Elite-Maislinien und Identifikation und Eliminierung des Linkage Drags für verspäteten Blühzeitpunkt:
  • Der Donor B37HTN1 wurde mit KWS.elite, einer Elite-Maislinie der KWS SAAT AG (Deutschland) gekreuzt und über fünf Generationen fortgesetzt mit KWS.elite rückgekreuzt. In jeder Rückkreuzungsgeneration wurden molekulare Marker genutzt um Pflanzen zu selektieren, die heterozygot für die HTN-Zielregion waren. Anschließend wurde eine selektierte Pflanze der fünften Rückkreuzungsgeneration fortgesetzt geselbstet und mit molekularen Markern wurden homozygote Pflanzen für die HTN-Zielregion identifiziert.
  • Diese Linien wurden in Feldversuchen an mehreren Standorten getestet. Dabei wurden für die Genotypen B37HTN1, KWS.elite und KWS.elite.B37HTN1 wie unter Beispiel 1. beschrieben die phänotypischen Daten der HT-Resistenz und der Blühzeitpunkte erfasst. Die Genotypen mit HTN1-Introgression zeigten die erwartete HT-Resistenz mit Boniturnoten von 1 bis 3, während die Ausgangs-Linie KWS.elite Boniturnoten von 5–7 erhielt. Unerwarteterweise wies die KWS.elite.B37HTN1 zudem im Vergleich zu KWS.elite einen um mindestens 2 Tage verschobenen Zeitpunkt sowohl der weiblichen als auch der männlichen Blüte auf. Diese verschobenen Blühzeitpunkte stellen ein auf Linkage Drag beruhendes negatives agronomisches Merkmal für Mais dar, welches in dieser Form nach Introgression der HT-Resistenz aus B37HTN1 noch nicht beschreiben wurde. Marker-Analysen ermöglichten die Lokalisierung des Linkage Drags, welcher für den verzögerten Blühzeitpunkt verantwortlich ist, in einem Bereich zwischen zwei Markerregionen auf der Introgression aus B37HTN1, zwischen M1 und M2. Dafür wurden die Genotypen B37HTN1, KWS.elite und KWS.elite.B37HTN1 beispielsweise mit den KASP-Markern SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 und PZE-108077560 analysiert (siehe 3 und Tabelle 4). SYN14136 und PZE-108076510 wurden zur spezifischen Detektion der Markerregion M1, SYN24931 und PZE-108077560 zur spezifischen Detektion des Region M2 herangezogen. Danach liegt die Markerregion M1 5' vom Locus des Linkage Drags und die Markerregion M2 3' dazu. Die Marker-Analyse zeigte, dass B37HTN1 und KWS.elite.B37HTN1, beide mit einer um zwei Tage späteren Blüte, gemeinsame Allele für die Regionen M1 und M2 sowie dem Intervall zwischen diesen Regionen zeigten, während KWS.elite mit einem normalen Blühzeitpunkt andere Allele für die Regionen M1 und M2 und dem Intervall dazwischen aufwiesen.
  • Der Donor B37HTN1 wurde mit RP3 gekreuzt und über drei Generationen fortgesetzt mit RP3 rückgekreuzt. In jeder Rückkreuzungsgeneration wurden molekulare Marker genutzt. Zunächst wurden Pflanzen, die heterozygot für die HTN1-Zielregion waren selektiert und anschließend wurden diese Pflanzen mit gleichmäßig über das Genom verteilten Markern untersucht, um gegen das Donorgenom zu selektieren. Anschließend wurde eine selektierte Pflanze der dritten Rückkreuzungsgeneration fortgesetzt geselbstet und mit molekularen Markern wurden homozygote Pflanzen für die HTN1-Zielregion identifiziert.
  • Weiterhin wurde der Donor B37HTN1 auch mit den rekurrenten Elter RP3 und RP4 gekreuzt und eine Linie RP3HTNA und RP4HTNA über mehrere Schritte der Rückkreuzung erzeugt. Die Phänotypisierung auf HT-Resistenz zeigte eine Verbesserung der Boniturnoten von 5 bis 7 für die Ausgangslinie RP3 auf 1 bis 3 für RP3HTNA und eine Verbesserung der Boniturnoten von 6 für die Ausgangslinie RP4 auf 2 bis 3 für RP4HTNA. Die Phänotypisierung auf Blühzeitpunkte zeigte vergleichbare Blühzeitpunkte für RP3 und RP3HTNA und RP4 und RP4HTNA.
  • Durch Verwendung der KASP-Marker SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 und PZE-108077560 konnte nachgewiesen werden, dass RP3 und RP3HTNA gemeinsame Allele für die Regionen M1 und M2 tragen. Diese entsprachen nicht dem Donor B37HTN1. Im Ergebnis liegt somit der Blühzeitpunkt-verzögernde chromosomale Abschnitt der Introgression aus B37HTN1 auf einem chromosomalen Intervall zwischen den Markerregionen M1 und M2. Mit der Linie RP3HTNA war es somit gelungen diesen Linkage Drag zu entfernen. Die verwendeten KASP-Marker SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 und PZE-108077560 stellten sich als wirksames Werkzeuge zur „assistierten Selektion” dar.
  • Die Phänotypisierung der RP3 und RP3HTNA umfasste zudem auch die Erfassung des Korn- und des Silageertrags. Während der Kornertrag in den Genotypen nicht signifikant unterschiedlich war, zeigte das Merkmal Silageertrag bei RP3HTNA eine eindeutige statistisch belegbare Reduktion um mindestens 14 Dezitonnen pro Hektar (dt/ha) gegenüber RP3, oder eine Reduktion um mehr als 5%.
  • Mit Hilfe der entwickelten KASP-Marker SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 und PZE-108077560 konnten aus der Kreuzung von B37HTN1 und dem rekurrenten Elter RP1 eine Linie RP1HTN1 selektiert werden, die keinen Blühzeitverzögernden Linkage Drag mehr aufwies, aber ebenfalls eine Silageertragsreduktion, wie sie für RP3HTNA beobachtet wurde, zeigte. Zur verfeinerten molekularen Charakterisierung wurde RP1HTN1 weiterentwickelt und eine F2-Population mit 724 Individuen aus der Kreuzung RP1 × RP1HTN1 erstellt. Anschließend wurde die F3-Generation geselbstet und selektierte F4-Pflanzen wurden geno- und phänotypisiert. Die Genotypisierung wurde mittels Marker der Tabelle 6 im detektierten QTL-Bereich von 23,1 cM durchgeführt. Die Phänotypisierung wurde an mehreren Standorten in zwei Wiederholungen durchgeführt (siehe Beispiel 1.). Es wurden rekombinante Pflanzen für den QTL-Bereich selektiert und mit den phänotypischen Daten korreliert. Die Selektion umfasste Pflanzen, die unterschiedliche Bereiche der Targetregion abdeckten, sowie heterozygote Pflanzen, mit dem Ziel neue rekombinante Pflanzen zu erhalten. Es wurden in jedem Jahr zwei Rückkreuzungen mit RP1 und selektierten Einzelpflanzen durchgeführt und somit neue Rekombinante erstellt. Neue Rekombinante wurden im Feld- und Gewächshausversuchen phänotypisiert (siehe unter 1.) und für die Entwicklung neuer molekularer Marker gemäß 2. genotypisiert.
  • Die Anwendung dieser neuen Marker auf den Genotyp RP3HTNA ermöglichte die Identifizierung einer Markerregion M3, welche im 5'-Bereich die Introgression begrenzt und mit den flankierenden Markern PZE-108093423 und PZE-108093748 beschrieben werden kann. Dabei sollte PZE-108093423 das Allele des rekurrenten Elter RP3 und PZE-108093748 das Allele des Donors B37HTN1 aufweisen. Im 3' Bereich wird die Introgression von RP3HTNA von den Markern PZE-108107671 und SYN4196 in einer weiteren Markerregion M6 beschrieben (siehe 3). Dabei trägt PZE-108107671 das Allele des Donors B37HTN1 und SYN4196 das Allele des rekurrenten Elter RP3. Die Introgression aus RP3HTNA (nachfolgend A-Version genannt) entspricht zwischen den Markerregionen M3 und M6 dem Donor B37HTN1, aber außerhalb dieses Bereichs dem rekurrenten Elter, oder einer anderen Linie, die nicht die Allele im Bereich zwischen M1 und M2 des Donors B37HTN1 trägt. Diese A-Version wurde in verschiedene andere genetische Hintergründe eingebracht und erneut Ertragsprüfungen, Resistenz-Phänotypisierungen und Blühzeitpunkt-Bestimmung unterzogen. Die Ergebnisse waren vergleichbar mit denjenigen beschrieben für RP3HTNA. So war der Blühzeitpunkt im Vergleich zur entsprechenden Linie ohne Introgression nicht verschoben und die Linie zeigte eine verbesserte Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum, im Vergleich mit der Ausgangslinie, allerdings weiterhin die Reduktion des Silageertrags.
  • C) Identifikation und Eliminierung des Linkage Drags für reduzierten Silageertrag:
  • Als Donor wurde die Linie RP3HTNA verwendet. Diese wurde mit RP3 gekreuzt und über sechs Generationen fortgesetzt geselbstet. In jeder Selbstungsgeneration wurden molekulare Marker im Zielbereich genutzt, um das Donorfragment zu verkleinern. Da alle Regionen des Genoms außerhalb der Zielregion bereits in der Linie RP3HTNA auf RP3 Genom selektiert worden waren, wurde mit Markern nur noch der Bereich um die HTN-Zielregion untersucht. Dabei wurden homozygote Pflanzen für eine verkleinerte HTN-Zielregion identifiziert. Parallel dazu fand eine intensive Markerentwicklung im Target-Bereich statt. Neben vielen anderen gelang es eine Linie RP3HTNK zu identifizieren, die das B37HTN1-Donor-Fragment von einer Markerregion M4, flankiert durch die Marker MA0004 und MA0005, wobei MA0004 das Allele des rekurrenten Elter RP3 und MA0005 das Allele des Donors B37HTN1 in RP3HTNK beschreibt, bis zu einer Markerregion M5, flankiert durch die Marker MA0006 und PZE-108097482, wobei MA0006 das Allele des Donors B37HTN1 und PZE-108097482 das Allele des rekurrenten Elter RP3 beschreibt, trägt. Die Introgression aus RP3HTNK (nachfolgend K-Version genannt) bewirkt in RP3HTNK eine verbesserte HTN1-Resistenz um 3 bis 4 Boniturnoten im Vergleich zu RP3, einen gleichen Blühzeitpunkt wie ihre Ausgangslinie RP3 (keine Verzögerung in der Blüte) und keine signifikante Ertragsreduktion des Silage-Ertrags (siehe 2) mehr. Mit Hilfe der beschriebenen Marker konnten auch aus der Ausgangslinie RP1 durch Kreuzung Linkage Drag-freie Linien erstellt werden, welche die K-Version der Introgression aufwiesen.
  • D) Resistenz-vermittelnder Haplotyp aus B37HTN1 bzw. aus Pepitilla
  • Die K-Version besitzt einen Haplotyp aus B37HTN1 bzw. Pepitilla, der die in Tabelle 4 beschriebenen Donor-Allele an den physischen Positionen bezogen auf B73 AGPv02 in bp trägt. Exemplarisch sei die Haplotypbeschreibung hier an Marker MA0008 beschrieben: Verwendet man den Marker MA0008 und bestimmt die Allele für B37HTN1, RP3, RP3HTNA, RP3HTNK so wird das Allele „T” für B37HTN1, RP3HTNA, RP3HTNK bestimmt und das Allele „C” für RP3. Dieser Marker unterscheidet für diesen Locus ebenfalls die mutmaßliche HTN1-Resistenzquelle PH99N ( WO 2011/163590 ), die an dieser Position ebenfalls ein Allel „C” enthält, von der für hier verwendeten Resistenzquelle.
  • 4. Molekulare Analyse der fein-kartierten Region
  • Weiterhin wurde das durch Introgression inserierte und trunkierte Chromosomfragment molekular untersucht. Der Resistenzlocus Htn1 aus der Akzession Pepitilla wurde so auf eine distinkte Zielregion, ein chromosomales Intervall von 700 kb, reduziert und in dem Genotyp RP4HTN1 sequenziert. Wie im Folgenden näher ausgeführt wurden BAC Klone aus RP4HTN1 isoliert, sequenziert und zu einem Sequenz Scaffold assembliert. Der Sequenz scaffold wurde annotiert und den annotierten Genen aus diesem Intervall wurden EST/cDNA-Sequenzinformationen gegenübergestellt. Aus einer Vielzahl von annotierten Genen wurden dann durch differentielle Expressionsstudien die Kandidaten-Gene identifiziert (siehe Tabelle 1).
  • A) BAC Bank- und Pool-Erstellung, BAC Bank Sichtung, BAC Sequenzierung
  • Eine BAC Bank wurde aus dem Genotyp RP4HTN1 erstellt. Es erfolgte die Erstellung der BAC Bank und der 3D-Matrix-Pools aus Blattmaterial sowie die Sichtung der 3D-Matrix-Pools. Die Primer für die Sichtung der 3D-Matrix-Pools wurden auf Grund der B73 AGPv01 Sequenz von 149957158 bp bis 152977351 bp auf Chromosom 8 (www.maizesequence.org) und dem Programm Primer 3 (http://simgene.com/Primer3; Rozen & Skaletsky, 2000). Die Parameter für die Primerauswahl waren ein durchschnittlicher GC-Gehalt von 50%, Primerlänge von 20–25 bp, Schmelztemperatur zwischen 70–90°C und Amplicon Länge zwischen 70–80 bp. Mit den Primerpaaren in Tabelle 7 wurden die 3D-Pools mittels RT-PCR gesichtet. Die Werte der beiden Parameter Schmelz-Temperatur und CP-Wert sind für die BAC-Klone angegeben. Es konnten 26 BAC Klone für den ausgewählten Bereich identifiziert werden. Alle BAC Klone wurden aus der BAC Bank isoliert und als E.coli-Kultur zur DNA Isolation und Sequenzierung genutzt. Die Sequenzierung wurde mit einem Standard GS-FLX Titanium Laufs (454 Life Sciences, USA) durchgeführt. Die erhaltene Sequenzinformation der BAC Klone 144N24, 119F13, 219G11, 86N21, 16B06, 84L18, 128D02, 25M23, 96H10, 19J24, 136A01, 75H06, 135F07 ist in Tabelle 8 zusammengestellt. Tabelle 7: Primerpaare zur Detektion von BAC-Klonen aus der RP4HTN-BAC-Bank
    BAC Klon ID Primerpaar 1 Sequenz Primerpaar 1 (5'-3') Schmelz-Temp °C (50% des Amplicons ist einzelsträngig) im Genotyp RP4HTN1 RP4HTN1 CP-Value (Cyclus, wenn die exponentielle Phase der PCR beginnt) Amplicon Größe (bp)
    Primerpaar 2
    58A14 579ZMPM0_2F; 579ZMPM0_2R 125; 126 77,4 28,5 74
    579ZMPM0_4F; 579ZMPM0_4R 127; 128 80,96 26,52 77
    144N24 579ZMPM0_5F; 579ZMPM0_5R 129; 130 79,09 27,09 76
    579ZMPM0_17F; 579ZMPM0_17R 131; 132 83,06 25,53 78
    219G11 579ZMPM0_16F; 579ZMPM0_16R 133; 134 84,7 25,96 78
    579ZMPM0_25F; 579ZMPM0_25R 135; 136 78,95 26,09 80
    119F13 579ZMPM0_22F; 579ZMPM0_22R 137; 138 80,89 25,98 73
    579ZMPM0_34F; 579ZMPM0_34R 139; 140 80,1 24,43 76
    86N21 579ZMPM0_35F; 579ZMPM0_35R 141; 142 80,9 25,27 70
    579ZMPM0_38F; 579ZMPM0_38R 143; 144 83,86 26,01 71
    16B6 579ZMPM0_37F; 579ZMPM0_37R 145; 146 79,22 25,71 80
    579ZMPM0_41F; 579ZMPM0_41R 147; 148 75,93 26,6 74
    84L18 579ZMPM0_41F; 579ZMPM0_41R 149; 150 75,93 26,6 74
    579ZMPM0_46F; 579ZMPM0_46R 151; 152 80,54 25,68 78
    128D2 579ZMPM0_180F; 579ZMPM0_180R2 153, 154 84,41 25,99 77
    579ZMPM0_48F; 579ZMPM0_48R 155 156 83,96 25,33 77
    25M23 579ZMPM0_48F; 579ZMPM0_48R 157; 158 83,96 25,33 77
    579ZMPM0_56F; 579ZMPM0_56R 159; 160 77 29,12 79
    19J24 579ZMPM0_51F; 579ZMPM0_51R 161; 162 87,76 27,75 77
    579ZMPM0_199F; 579ZMPM0_199R 163; 164 82,49 26,56 79
    96H10 579ZMPM0_63F; 579ZMPM0_63R 165; 166 85,78 26,08 63
    579ZMPM0_208F; 579ZMPM0_208R 167; 168 79,87 26,84 79
    136A1 579ZMPM0_206F; 579ZMPM0_206R 169; 170 89,81 32,09 70
    579ZMPM0_86F; 579ZMPM0_86R 171; 172 81,81 30,07 71
    135F7 579ZMPM0_79F; 579ZMPM0_79R 173; 174 75,82 25,43 72
    579ZMPM0_278F; 579ZMPM0_278R 175; 176 78,13 22,69 78
    75H6 579ZMPM0_209F; 579ZMPM0_209R 177; 178 75,41 24,93 77
    579ZMPM0_86F; 579ZMPM0_86R 179; 180 81,81 30,07 71
    117O2 579ZMPM0_87F; 579ZMPM0_87R 181; 182 81,89 27,7 76
    579ZMPM0_91F; 579ZMPM0_91R 183; 184 80,13 26,93 75
    173H23 579ZMPM0_216F; 579ZMPM0_216R 185; 186 82,3 25,76 80
    579ZMPM0_95F; 579ZMPM0_95R 187; 188 79 5 24,97 73
    118N19 579ZMPM0_99F; 579ZMPM0_99R 189; 190 76,84 24,69 80
    579ZMPM0_244F; 579ZMPM0_244R 191; 192 80,07 25,38 80
    42L23 579ZMPM0_241F; 579ZMPM0_241R 193; 194 81,16 25,79 79
    579ZMPM0_109F; 579ZMPM0_109R 195; 196 77,89 25,28 74
    112N13 579ZMPM0_109F; 579ZMPM0_109R 197; 198 77,89 25,28 74
    579ZMPM0_247F; 579ZMPM0_247R 199; 200 80,76 24,82 71
    97K23 579ZMPM0_112F; 579ZMPM0_112R 201; 202 79,22 25,2 77
    579ZMPM0_125F; 579ZMPM0_125R 203; 204 83,44 28,17 74
    18J17 579ZMPM0_253F; 579ZMPM0_253R 205; 206 77,5 32,34 71
    579ZMPM0_125F; 579ZMPM0_125R 207; 208 83,44 28,17 74
    5M22 579ZMPM0_128F; 579ZMPM0_128R 209; 210 77,99 24,05 77
    579ZMPM0_136F; 579ZMPM0_136R 211; 212 78,65 26,46 78
    146I6 579ZMPM0_131F; 579ZMPM0_131R 213; 214 76,58 26,54 78
    579ZMPM0_137F; 579ZMPM0_137R 215; 216 83,7 25,42 73
    147O15 579ZMPM0_138F; 579ZMPM0_138R 217; 218 79,38 24,8 79
    579ZMPM0_147F; 579ZMPM0_147R 219; 220 79,63 26,77 80
    88K17 579ZMPM0_145F; 579ZMPM0_145R 221; 222 8151 27,61 76
    579ZMPM0_262F; 579ZMPM0_262R 223; 224 75,7 25,82 80
    180G22 579ZMPM0_161F; 579ZMPM0_161R 225; 226 80,21 25,16 73
    579ZMPM0_265F; 579ZMPM0_265R 227; 228 79,3 24,7 79
    Tabelle 8: Sequenzgehalt der 13 analysierten BAC-Klone
    BAC #Reads # Reads ohne E.coli Menge Sequenz in bp Menge Sequenz in bp ohne E.coli
    144N24 10967 10849 3646226 3591222
    119F13 17987 17847 6033910 5957456
    219G11 32904 32484 10553629 10381924
    86N21 39606 39106 12991596 12750077
    16B06 36198 35849 12523123 12357036
    84L18 50537 34162 15991645 10776458
    128D02 15998 15847 5138442 5064677
    25M23 22551 22416 7864493 7786402
    96H10 7723 7614 2569604 2525488
    19J24 21953 21775 7327364 7234315
    136A01 31998 31724 10298869 10158900
    75H06 24345 24121 8021727 7920125
    135F07 29702 29484 9721708 9604010
  • B) BAC Sequenz Assembly, -Annotation und Kandidaten-Gen-Selektion:
  • Erstellung eines Sequenz Scaffolds: Die BAC Klone 144N24, 119F13, 219G11, 86N21, 16B06, 84L18, 128D02, 25M23, 19J24, 96H10, 136A01, 75H06, 137F07 wurden mittels der 454-Technik sequenziert (Margulies et al., 2005).
  • Das automatische Assembly der Roh-Sequenzen der BAC Klone wurde mit der Software „Newbler” (454 runAssembly Software, Software Release 2.3) durchgeführt.
  • Die so erzeugten Sequenz-Contigs pro BAC wurden in manueller Analyse korrekt angeordnet, wobei folgende Techniken angewandt wurden:
    • 1. Sequenzen von überlappenden BACs konnten grob in überlappende und nicht überlappende Bereiche eingeteilt werden.
    • 2. Sequenz-Contigs von verschiedenen überlappenden BACs wurden in den überlappenden Bereichen verglichen. Etwa 20% der Sequenz-Contigs konnten so angeordnet werden und Lücken zwischen ihnen geschlossen werden (z. B. wenn ein Contig des einen BACs zwei Contigs des anderen BACs abdeckt oder verbindet).
    • 3. Alle Sequenz-Contigs wurden manuell annotiert. Hier wurden zunächst nur Repetitive Elemente (Transposons und Retrotransposons, kurz ”TEs”) annotiert. Da Sequenzlücken vor allem in TEs auftreten, kann die TE Annotation helfen, Sequenz-Contigs korrekt anzuordnen. Das heißt, wenn das eine Ende eines TEs auf einem Sequenz-Contig liegt und das andere Ende auf einem anderen, können die zwei Contigs entsprechend angeordnet werden. In solchen Fällen wurde jeweils eine Sequenz von 100 Ns eingefügt, um die Lücke zwischen den Sequenz-Contigs zu füllen. Auch die Information von TEs, die verschachtelt sind (d. h. TEs, welche sich in andere TEs inseriert hatten) wurde verwendet, um Sequenz-Contigs anzuordnen.
    • 4. In manchen Bereichen konnten weder Informationen von überlappenden BACs noch TE-Annotationen verwendet werden (dies war v. a. der Fall in Bereichen, die nur von einem BAC abgedeckt wurden). Dort wurden die Sequenz-Contigs willkürlich angeordnet und die Lücken zwischen ihnen mit Sequenzen von 200 Ns gefüllt.
    • 5. Viele der TEs im Maisgenom sind ”Long Terminal Repeat” (LTR) Retrotransposons, die von langen (1–2 kb) LTR-Sequenzen flankiert werden. Diese LTRs können bis 100% identisch sein. In einigen Fällen wurden daher Roh-Sequenzen der beiden LTRs in eine Konsensus-Sequenz assembliert (d. h. eine Kopie der LTR is nicht im Assembly vorhanden. In diesen Fällen wurden die Sequenz-Lücken mit der Anzahl N's gefüllt die der Länge des zweiten LTR entsprechen würde.
    • 6. Gene wurden manuell annotiert. Hierzu wurden die kodierenden Sequenzen (CDS) des publizierten B73 Maisgenoms als Referenz benutzt (http://www.maizegdb.org/gene_model.php). Die CDS wurden via DotPlot (http://www.dotplot.org/) mit der RP4HTN-Sequenz aliniert und so die Positionen von Exons und Introns bestimmt. Kandidatengene wurden einerseits durch die Beschreibung Ihrer Funktion (falls öffentlich bekannt) bestimmt. Andererseits wurden die CDS der resistenten RP4HTN mit der den anfälligen B73 AGPv02 verglichen. Falls Unterschiede vorhanden waren, wurde das jeweilige Gen in die Liste der Kandidaten aufgenommen. Die fertige Sequenz hat eine Länge von 1'328'253 bp. Die Liste der Kandidaten-Gene ist in Tabelle 1 wiedergegeben.
  • 5. Molekulare Analyse der Kandidaten-Gene:
  • Expressionanalyse: Die Expression der verschiedenen Kandidatengene wurde auf 21 Tage alten (nach Aussaat), nicht infizierten Pflanzen (Infektionstag = 0 dpi) als auch auf 36 Tage alten mit H. turcicum infizierten und nicht infizierten (15 Tage nach der Infektion = 15 dpi inf/ni) Pflanzen getestet.
  • RNA vom zweiten Blatt wurde aus den getesteten Maispflanzen extrahiert, in cDNA revers transkribiert und die Expression mittels qPCR gemessen. Jeweils das zweite Blatt wurde geerntet, eingefroren und die RNA mit dem SV Total RNA Isolation System Kit (Z3100; Promega, Dübendorf, Schweiz), gleich wie beschrieben (Brunner et al., 2011; Risk et al., 2012) extrahiert, quantifiziert und auf die Qualität und Reinheit hin geprüft. 1 μg RNA wurde mit dem iScript RT Supermix (170–8841; Bio-Rad, Cressier, Schweiz) in einem Reaktionsvolumen von 20 μl gemäss Herstellerangaben revers transkribiert. Um eine mögliche Kontamination durch genomische DNA auszuschliessen (RT minus), wurde parallel von jeder Probe eine Reaktion ohne die Zugabe der reversen Transkriptase mit inkubiert.
  • Quantitative Real Time PCR (RT-qPCR) wurde in technischen Triplikaten oder Duplikaten in einem Reaktionsvolumen von 10 μl und Zugabe von 4 μl 1:10 verdünnter (10 mM Tris HCL pH8, 0,1 mM EDTA) cDNA 5 ul SsoFast EvaGreen® Supermix (172–5201; Bio-Rad, Schweiz) und einer Primerkonzentration von 400 nM auf dem C1000 Touch Cycler (Bio-Rad, Schweiz) durchgeführt. Für die Amplifikation wurde folgendes Programm verwendet: 95°C für 30 Sekunden, gefolgt von 40 Zyklen 95°C für 3 Sekunden, dann 60–63°C (gem Tabelle 2) für 5 Sekunden. Zur Analyse der Schmelzkurve (ausschliessen von Primer Dimeren) wurde das PCR Produkt in 0,5°C Schritten von 65°C auf 95°C aufgeheizt.
  • Amplifikationskurven und Schmelzkurven wurden in Programm CFX Manager V 3.0 (Bio-Rad, Schweiz) überprüft und die Cq-Werte (quantification cycle) in das Programm qbasePLUS V 2.3 (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgien) zur Bestimmung der Relativen Expression exportiert.
  • Primer für die Kandidatengene wurden mithilfe von Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) bestimmt, um unspezifische Amplifikation auf bereits bekannten Transkripten möglichst auszuschliessen. Zur Evaluation geeigneter Amplikons wurden die PCR Produkte mittels Agarose Gel Elektrophorese aufgetrennt und auf eine einzelne Bande und ihre Grösse hin überprüft. Weiter wurden Amplikons gem.
  • Tabelle 1 von RP1HtN als auch NILHtN sequenziert. Zur Normalisierung der Expressionsdaten wurden 1–3 Referenzgene (LUG, MEP, FPGS) verwendet (Manoli et al., 2012).
  • Alle Kandidaten-Gene sind im anfälligen Genotyp RP1 und im resistenten Genotyp RP1HTN exprimiert. Eine differentielle Expression zwischen RP1 und RP1HTN konnte für RLK1 gezeigt werden. RLK1 ist in den anfälligen Pflanzen bis zu 4 mal stärker exprimiert als in den resistenten Pflanzen. Tabelle 9: Primerpaare für die Kandidaten-Gene mit ihrer Amplicon-Länge in bp und der geeigneten Annealing Temperatur.
    Gen Name Primer Name SEQ ID NO: Primer Sequenzen (F = Forward Sequenz; R = Reverse Sequenz) Länge (in bp) in RP1 Länge (in bp) in RP1HTN annealing Temperatur
    ZNF1 GH034 229 F: TGGTTGGTGTCGAAGCTGAG 130 130 60 °C
    GH033 230 R: ATTTATCCCGGCCTTTGCAT
    HYD GH039 231 F: GATCTACAGGGAAGCCCACTGA 74 74 60°C
    GH040 232 R: TTTTTCCTTGAGGCAGTTATA TGCT
    RLK4 GH220 233 F: TTGTGCAGCGGAGGGAA 91 85 63°C
    GH221 234 R: CCAGGGCACCAGCAAGAAT
    EXT1 GH168 235 F: CGACTACAAGACGCGTACC 103 103 60°C
    GH170 236 R: GGTGTCGATGGTGAGGTTC
    RLK1 GH138 237 F: TATTGTTGGTGCTGTTGCCG 121 121 60°C
    GH139 238 R: GGACTCAATCCTTGTCCCTG
    RET1 GH055 239 F: CGCTCGTTTGCCAGATAGCC 165 165 60°C
    GH056 240 R: CACGGTGTGTGCCAGTTTGT
  • Tilling-Population Sichtung und Detektion von Mutanten: Für die Kandidaten-Gene (Tabelle 1) kann eine Tilling-Population von 10000 Pflanzen gesichtet werden, die die Introgression aus Pepitilla auf Chromosom 8 im Bereich von 151688552–153139596 bp im Vergleich zur B73-Referenz AGPv02 (www.maizesequence.org) trägt (RP3HTN1) und eine Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum aufweist. Die Mutationen können entweder stille Nukleotid-Austausche, Aminosäure-Austausche oder Stop-Codons sein und dienen zum Nachweis der Funktion des Kandidaten-Gens.
  • Transformation: Kandidaten-Gene können beispielsweise in den anfälligen Genotyp A188 durch Agrobacterium tumefanciens-vermittelte Transformation eingebracht werden. Dieser Genotyp zeichnet sich durch AUDPC-Werten von 702 im GWH-Test (n = 18 Pflanzen) aus, so dass eine Transformation mit dem Resistenz-Gen eine deutliche Resistenzantwort ergibt.
  • 6. Bestimmung der Rassenspezifität; Nachweis, dass HTN1 auch rassenunspezifisch Resistenz vermittelt
  • Das Screening der Genotypen mit HtN Gen erfolgt an vielen Standorten in allen Befallsregionen Europas. Bisher wurde diese Resistenz noch nicht gebrochen, sodass wir davon ausgehen, dass sie bisher rassenunspezifisch wirkt, solange, bis eine Rasse N gefunden wird. Vorherrschend in Europa ist die Rasse 1, wobei auch in einzelnen Regionen schon die Rassen 2 oder 3 oder eine Kombination dieser nachgewiesen werden konnte (Hanekamp et al., 2013).
  • Referenzen
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (14)

  1. Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, wobei das Chromosomfragment ein Intervall des Donors umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und ein Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt, und wobei das Chromosomfragment a) ein Intervall des Donors zwischen einem Marker in einer ersten Markerregion, welche durch die Marker SYN14136 und PZE-108076510 flankiert ist, und einem Marker in einer zweiten Markerregion, welche durch die Marker SYN24931 und PZE-108077560 flankiert ist, und/oder b) ein Intervall des Donors zwischen einem Marker in einer dritten Markerregion, welche durch die Marker PZE-108093423 und PZE-108093748 flankiert ist, und einem Marker in der vierten Markerregion, welche durch die Marker MA0004 und MA0005 flankiert ist, und/oder c) ein Intervall des Donors zwischen einem Marker in der fünften Markerregion, welche durch die Marker MA0006 und PZE-108097482 flankiert ist, und einem Marker in der sechsten Markerregion, welche durch die Marker PZE-108107671 und SYN4196 flankiert ist, nicht enthält.
  2. Maispflanze nach Anspruch 1, wobei das Chromosomfragment weiterhin ein Intervall des Donors zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion und einem Marker in der dritten Markerregion nicht enthält.
  3. Maispflanze nach Anspruch 1, wobei der Blühzeitpunkt der Maispflanze und/oder der Silageertrag der Maispflanze demjenigen einer Vergleichsmaispflanze, in deren Genom das Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla nicht integriert ist, entspricht.
  4. Maispflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polynukleotid ein Nukleinsäuremolekül umfasst, (a) das eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 oder 15 aufweist, (b) das eine Nukleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 80% zu einer der Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, oder 15 vorzugsweise über die gesamte Sequenzlänge, aufweist, (c) das mit dem komplementären Strang eines Nukleinsäuremoleküls nach (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, (d) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 kodiert, (e) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% identisch ist mit einer der Aminosäuresequenzen nach (d), kodiert, oder (f) das eine Teilsequenz einer Nukleinsäure nach (a) bis (e) aufweist.
  5. Zelle, Gewebe oder Teil der Maispflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
  6. Korn oder Samen von der Maispflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
  7. Verfahren zur Identifizierung einer Helminthosporium turcicum resistenten Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, umfassend den Nachweis von mindestens zwei Allelen im Genom der Pflanze, wobei mindestens ein Allel in einem genomischen Abschnitt lokalisiert ist, welcher durch einen Marker in der ersten Markerregion, der zweiten Markerregion, der dritten Markerregion oder der vierten Markerregion und durch das Polynukleotid, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt, flankiert ist, und wobei mindestens ein Allel in einem genomischen Abschnitt lokalisiert ist, welcher durch das Polynukleotid und durch einen Marker in der sechsten Markerregion oder der fünften Markerregion flankiert ist.
  8. Isoliertes Oligonukleotid, das ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus einer der SEQ ID NOs: 41–49, 53–100 oder 229–240, umfasst.
  9. Verwendung eines Oligonukleotids, das ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus einer der SEQ ID NOs: 17–240, umfasst, zur Identifizierung einer Helminthosporium turcicum-resistenten Maispflanze.
  10. Isoliertes Polynukleotid, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst, (a) das eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 oder 15 aufweist, (b) eine Nukleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 80% zu einer der Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 oder 15 vorzugsweise über die gesamte Sequenzlänge, aufweist, (c) das mit dem komplementären Strang eines Nukleinsäuremoleküls nach (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, (d) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 kodiert, oder (e) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% identisch ist mit einer der Aminosäuresequenzen nach (d), kodiert.
  11. Vektor oder mobiles genetisches Element, umfassend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 10.
  12. Transgene Pflanzenzelle, umfassend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 10 als Transgen oder einen Vektor nach Anspruch 11.
  13. Transgene Pflanze, umfassend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 12.
  14. Korn oder Samen von der Pflanze nach Anspruch 13, wobei das Korn oder der Samen ein Polynukleotid gemäß Anspruch 10 als Transgen umfasst.
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