DE102012109742A1 - Arzneimittel zur Prophylaxe und Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung - Google Patents

Arzneimittel zur Prophylaxe und Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung.
  • Neurodegenerative Erkrankungen bilden eine Gruppe von meist langsam fortschreitenden, erblich oder sporadisch auftretenden Erkrankungen des Nervensystems. Hauptmerkmal ist der zunehmende Verlust von Nervenzellen, der zu verschiedenen neurologischen Symptomen führt, darunter häufig zu Demenz und Bewegungsstörungen. Die Erkrankungen können in unterschiedlichen Lebensaltern auftreten, verlaufen diffus oder generalisiert und rufen charakteristische histologische Schädigungsmuster hervor.
  • Morbus Alzheimer (engl. ”Alzheimer's disease”, AD) ist die häufigste Form der Neurodegeneration und die Hauptursache von Demenz. Diese multifaktorielle Störung wird klinisch durch fortschreitende kognitive Defizite und eine synaptische Dysfunktion definiert. Sie ist neuropathologisch gekennzeichnet durch extrazelluläre Ablagerungen des aggregierten Peptids β-Amyloid (Aβ), welche als senilen bzw. amyloiden Plaques bezeichnet werden, und durch intrazelluläre Ablagerungen von hyperphosphoryliertem Tau-Protein, die als Neurofibrillenbündel bezeichnet werden.
  • Obgleich von Alzheimer betroffene Patienten vielfältig medizinisch behandelt werden, bspw. mit Acetylcholinesteraseinhibitoren, steht eine zufriedenstellende pharmakologische Intervention nicht zur Verfügung.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein neues Arzneimittel bzw. einen neuen Wirkstoff zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung bereitzustellen, mit dem sowohl die klinischen als auch neuropathologischen Symptome zumindest vermindert werden können.
  • Diese Aufgabe wird durch die Verwendung von Oridonin gelöst.
  • Oridonin ist ein Diterpenoid, welches aus der Pflanze Rabdosia rubescens stammt. Oridonin hat die CAS-Nummer 2897-04-2 und die molekulare Formel C20H28O6 und weist ein Molekulargewicht von 364,42 auf.
  • Im Stand der Technik ist beschrieben, dass Oridonin verschiedene pharmakologische und physiologische Wirkungen aufweist, wie beispielsweise antibakterielle und antikarzinogene Wirkungen. Oridonin wird vorgeschlagen zur Behandlung von Tumoren, insbesondere Ösophaguskarzinome.
  • Xu et al. (2009), Multiple-modulation effects of Oridonin an the production of proinflammatory cytokines and neurotrophic factors in LPS-activated microglia, Int. Immunopharmacol. 9, S. 360 bis 365, beschreiben anti-neuroinflammatorische Wirkungen von Oridonin durch die Modulation von verschiedensten Funktionen von Mikroglia.
  • Eine Verwendung von Oridonin zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung wird im Stand der Technik weder beschrieben noch nahegelegt.
  • Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
  • Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung handelt es sich bei der neurodegenerativen Erkrankung um Morbus Alzheimer (AD).
  • Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein solches Arzneimittel bereitgestellt wird, welches gezielt zur Behandlung und/oder Prophylaxe der häufigsten Form der Neurodegeneration verwendbar ist. Die Erfinder konnten in einem anerkannten Tiermodell zur Untersuchung von Morbus Alzheimer belegen, dass Oridonin signifikante therapeutische Potenz aufweist. Die Tiere zeigten nach einer Behandlung mit Oridonin eine deutliche Besserung sämtlicher krankheitsassoziierter Symptome.
  • Nach einer bevorzugten Weiterbildung wird Oridonin zur gezielten Reduktion der β-Amyloid-Ablagerung im Gehirn verwendet.
  • Wie die Erfinder überraschenderweise zeigen konnten, vermindert Oridonin signifikant die β-Amyloid-Ablagerung im Gehirn der untersuchten Tiere. Damit erfolgt erstmals eine gezielte pharmakologische Intervention an einer krankheitsverursachenden Schlüsselstelle.
  • Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird das Oridonin in einer Fettemulsion, weiter bevorzugt in einer Lipofundin®-Fettemulsion, bereitgestellt.
  • Wie die Erfinder überraschenderweise feststellen konnten, wird die Aufnahme des Oridonins in den Organismus durch die Formulierung in einer Fettemulsion gegenüber einer wässrigen Emulsion deutlich verbessert. Als besonders geeignet haben sich sog. Nanoemulsionen herausgestellt. Ein Beispiel hierfür ist Lipofundin® 10% und/oder 20%. Lipofundin® enthält als aktive Wirkstoffe Glycerol, Phosphatidylcholin, Mittelkettige Triglyceride (MCT), und Sojabohnenöl. Fett- bzw. Nanoemulsionen mit entsprechenden oder ähnlichen Zusammensetzungen sind ebenfalls geeignet. Überraschend war die Beobachtung der Erfinder deshalb, da Lipofundin® bislang zu völlig anderen Zwecken verwendet wird, nämlich zur intravenösen Ernährung zur Zufuhr von Kalorien und Versorgung mit mittelkettigen Triglyceriden.
  • Wie die Erfinder feststellen konnten, eignet sich isoliertes bzw. gereinigtes Oridonin, um als alleiniger Wirkstoff zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer neurodegenerativen Erkrankung, vorzugsweise Morbus Alzheimer, verwendet zu werden. Nach einer Weiterbildung der Erfindung wird jedoch das Oridonin mit einem weiteren Wirkstoff zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung verwendet.
  • Durch diese Kombination können sich synergistische Effekte durch Interaktion der beiden Wirkstoffe ergeben. Als weiterer Wirkstoff kommen beispielsweise Acetylcholinesteraseinhibitoren in Frage, wie Tacrin, Rivastigmin, Galantamin oder Donepezil, oder auch NMDA-Rezeptoren-Antagonisten, wie Memantin, oder weitere gegen Alzheimer wirksame Wirkstoffe.
  • Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
  • Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist.
  • 1 zeigt die molekulare Struktur von Oridonin;
  • 2 zeigt, dass eine orale Verabreichung von Oridonin die Ablagerung von β-Amyloid (Aβ) und die Aktivierung von Mikroglia reduziert. APP/PS1-Mäuse im Alter von 5 Monaten erhielten für eine Dauer von 10 Tagen oral Oridonin oder Vehikel (CMC, als Kontrolle). Die Gehirne dieser Mäuse und einer anderen Kontrollgruppe von 5 Monate alten unbehandelten Wurfgeschwistern wurden mittels IHC analysiert. In den Balkendiagrammen sind die arithmetischen Mittel der prozentualen Anteile von IR-Bereichen und von Plaque/Zell-Anzahlen von unterschiedlich behandelten Gruppen dargestellt. Unterschiede von Plaque/Zell-Zählungen oder prozentualen Anteilen von Bereichen zwischen der Behandlung und der Kontrolle wurden durch den exakten nicht parametrischen Mann-Whitney-Test (ungepaarter T-Test) analysiert (Graph Pad Prism 5.0 Software). Für sämtliche statistischen Analysen wurden die Signifikanzspiegel auf p < 0,05 gesetzt. Weder im Cortex noch im Hippocampus von APP/PS1-Mäusen der Kontrollgruppe (die das gleiche Volumen von Vehikel erhielten) und deren alters- und geschlechtsmäßig abgeglichenen Wurfgeschwistern (ohne Behandlung, gekennzeichnet als ”5. Monat”) zeigten sich signifikante Unterschiede in der Aβ-Ablagerung (in Bezug auf die Plaque-Zählungen und den IR-Bereich) noch in der Iba-1-Expression. A: Im Cortex der Gehirne von APP/PS1-Mäusen aus der Oridonin-Gruppe wurde eine signifikant reduzierte Anzahl von Amyloid-Plaques festgestellt: B: Im Hippocampus zeigte sich jedoch keine signifikante Reduktion der Plaque-Zählungen. C und D: Die prozentualen Anteile der IR-Bereiche, die in Bezug auf Aβ-gefärbt wurden, zeigte sich sowohl im Cortex als auch im Hippocampus nach einer Behandlung mit Oridonin eine dramatische Reduktion. E und F: Nach einer Oridonin-Behandlung war Iba-1-IR im Cortex signifikant reduziert, nicht aber im Hippocampus.
  • 3 zeigt die therapeutische Wirkung von Oridonin auf die Aβ-Ablagerung und Aktivierung von Mikroglia. Repräsentative Mikroaufnahmen zeigen die Veränderungen in der Ablagerung von Aβ und der Aktivierung von Mikroglia nach einer oralen Behandlung mit Oridonin. A und B: Im Cortex der APP/PS1-Mäuse aus der Kontrollgruppe (A) können im Vergleich mit der Oridonin-Gruppe mehr Zählungen und relativ größere Aβ-Plaques beobachtet werden. C und D: Die Iba-1-Färbung zeigt mehr Zählungen und einen größeren IR-Bereich von Iba1+-Zellen im Cortex der Kontrollgruppe (C), die meisten Iba-1+-Mikroglia akkumulieren in der Umgebung von Aβ-Plaques (entsprechend der seriellen Schnitte der Aβ-Färbung, A). E und F: Im Hippocampus der Kontrollgruppe (E) können mehr und leicht größere Aβ-Ablagerungen im Vergleich zu der mit Oridonin behandelten Gruppe (F) festgestellt werden. G und H: Die Iba-1-Färbung der seriellen Schnitte (zu den Schnitten der Aβ-Färbung) zeigt, dass die meisten Iba-1+-Mikroglia um die Aβ-Plaques herum geclustert vorliegen, wobei eine Vielzahl von Iba-1+-Zellen auch über den gesamten Hippocampus verteilt gefunden werden können, und zwar sowohl in der Kontroll- als auch mit Oridonin behandelten Gruppe.
  • 4 zeigt, dass eine Injektion von Oridonin-Fettemulsion die Aβ-Ablagerung und Mikroglia-Aktivierung im Wesentlichen im Cortex reduziert. APP/PS1-Mäuse im Alter von 3 Monaten erhielten für eine Dauer von 10 Tagen täglich eine i. p.-Injektion einer Oridonin-Fettemulsion oder des Vehikels (Lipofundin®, als Kontrolle). In den Balkendiagrammen sind die arithmetischen Mittel der prozentualen Anteile des IR-Bereichs oder der Plaque-Anzahlen von verschiedenen Gruppen dargestellt. Die Unterschiede in den Plaque/Zell-Anzahlen und den prozentualen Bereichen zwischen der behandelten und der Kontrollgruppe wurden durch den exakten nichtparametrischen Mann-Whitney-Test (ungepaarter T-Test) analysiert (Graph Pad Prism 5.0 Software). Für alle statistischen Analysen wurden die Signifikanzspiegel auf p < 0,05 gesetzt. A und B: Im Cortex der APP/PS1-Mäuse war nach der Injektion der Oridonin-Emulsion die Anzahl von Amyloid-Plaques als auch der prozentuale Anteil des Bereichs der Aβ-Ablagerungen (IR) im Vergleich zu der Kontrollgruppe signifikant reduziert. C: Im Cortex war Iba-1-IR in der Oridonin behandelten Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen um nahezu die Hälfte reduziert. D: Allerdings wurde im Hippocampus nur eine leichte Abnahme von Iba-1-IR beobachtet.
  • 5 zeigt die Wirkung der Oridonin-Fettemulsion-Injektion auf die Verhaltensverschlechterung (Nestbau-Assay und soziale Interaktion). APP/PS1-Mäuse erhielten für einen Zeitraum von 10 Tagen täglich eine i. p.-Injektion einer Oridonin-Fettemulsion oder von Vehikel (Lipofundin® als Kontrolle). Zusammen mit natürlichen Mäusen wurden diese in Bezug auf ihr Nestbauverhalten und die soziale Interaktion beurteilt. Der Nestbau wurde mit Papiertuchmaterial unter Verwendung eines Drei-Punkte-Skalierungssystems in natürlichen und APP/PS1-Mäusen (A bis C) untersucht. Die soziale Interaktion wurde über einen Resident-Intruder-Test untersucht (E bis H). A: Als Basiskontrolle für den Nestbau-Assay wurde eine beeinträchtigte Nestbaufähigkeit bei den APP/PS1-Mäusen beobachtet. B: Am Tag 1, also zu Beginn der Behandlung, konnte zwischen der Oridonin- und der Kontrollgruppe kein signifikanter Unterschied beobachtet werden. C: Nach einer Behandlung von 10 Tagen, nämlich am Tag 11, wurde ein signifikanter Unterschied zwischen der mit einer Oridonin-Fettemulsion-Injektion behandelten und der Kontrollgruppe beobachtet. E und F: Als Basiskontrollen für die soziale Interaktion zeigten APP/PS1-Mäuse im Vergleich zu natürlichen Mäusen zusammen mit den eingebrachten Intruder-Mäusen weniger interaktive Verhaltensereignisse und mehr unabhängige Verhaltensereignisse. G und H: Nach der Behandlung nahmen die interaktiven Verhaltensereignisse in der Oridonin-Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen zu.
  • 6 zeigt die Aktivität von Oridonin in der Mikroglia-Zellkultur. Die Wirkungen von Oridonin auf die Mikroglia/Makrophagen-Aktivierung wurden in vitro unter Verwendung der Mikroglia-Zelllinie N9 aus der Maus analysiert. 105 Zellen wurden in Zellkulturplatten mit 12 Vertiefungen ausgesät und für 24 Stunden kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit Lipopolysaccharid (LPS; Konzentration von 1 μg/ml) stimuliert und mit oder ohne Oridonin (Arbeitskonzentration von 1 μg/ml, gelöst in Medium) für weitere 24 Stunden oder 48 Stunden inkubiert. (A): Die Überstände wurden für die Analyse der NO-Konzentrationen über den StandardGriess-Assay (Daten sind Mittelwerte aus neun Proben) gesammelt. (B): Die Balkendiagramme zeigen semi-quantifizierte Ergebnisse der Imaging Intensität relativ zu dem Haushaltsgen β-Actin. Die Gesamt-RNA aus kultivierten Zellen wurde präpariert und die mRNA-Spiegel von iNOS, IL-1β und IL-6 wurden mittels PCR gemessen. Die Ergebnisse wurden kalkuliert als Spiegel von Ziel-mRNAs relativ zu jenen von β-Actin (drei Proben von jeder Gruppe). Der exakte nichtparametrische Mann-Whitney-Test wurde durchgeführt, um Unterschiede zwischen der Kontrolle und der Oridonin-Behandlung zu vergleichen (Graph Pad Prism 5.0 für Windows). *p < 0,05, **p < 0,01 im Vergleich zur jeweiligen Gruppe mit LPS allein. C: Fotografien von Gelelektrophorese mit PCT-Produkten zeigen reduzierte mRNA-Spiegel von iNOS, IL-1β und IL-6 nach der Behandlung mit Oridonin.
  • 1. Material und Methoden
  • 1.1 Tiere
  • Männliche APP/PS1-21-Mäuse mit einem C57BL/6J-Hintergrund wurden von Prof. M. Jucker erhalten. Heterozygote männliche APP/PS1-21-Mäuse wurden mit weiblichen C57BL/6J-Wildtyp-Mäusen (Charles River Deutschland, Sulzfeld, Deutschland) gepaart. Den Nachkommen wurde aus dem Schwanz biologisches Material entnommen. Eine Genotypisierung erfolgte unter Verwendung einer PCR mit Primern, die spezifisch sind für die APP-Sequenz (vorwärts: GAATTCCGACATGACTCAGG [SEQ ID Nr. 1], rückwärts: GTTCTGCTGCATCTTGGACA [SEQ ID Nr. 2]. Sämtliche Experimente wurden im Einklang mit dem Deutschen Tierschutzgesetz aus dem Jahre 2006 durchgeführt.
  • 1.2 Materialien
  • Oridonin (> 99%) wurde von Carbosynth Ltd. bezogen. Nanostrukturierte Träger können Oridonin, das eine schlechte Wasserlöslichkeit und eine kurze biologische Halbwertszeit hat, eine bessere Bioverfügbarkeit, längere Verweildauer im Blut und eine verbesserte Einschlusseffizienz und kontrollierte Wirkstofffreisetzung verleihen. In der vorliegenden Studie wurde Oridonin mit einer Fettemulsion bzw. einem nanostrukturierten Träger, Lipofundin®, mittels Hochdrucks bei einem Konzentrationsverhältnis von 2 mg/ml (Oridonin/Lipofundin®) beladen. 30 mg Oridonin wurden zunächst grob in 60 ml Lipofundin® dispergiert. Anschließend wurde die Dispersion mittels Hochdrucks unter Verwendung eines Emulsiflex C3 (Avestin Inc., Kanada) homogenisiert. Zunächst wurden fünf Zyklen bei 750 bar und anschließend fünf Zyklen bei 1750 bar durchlaufen, was zu ungefähr 50 ml einer Formulierung von 2 mg/ml (Oridonin/Lipofundin®) führte. Die Nano-Emulsion Lipofundin® MCT 10% (zur Infusion) wurde bezogen von B. Braun Melsungen AG (Melsungen, Deutschland). Im Vergleich wurde Oridonin auch in 1% Carboxymethylcellulose (CMC, Blanose®, Hercules-Aqualon, Düsseldorf, Deutschland) bei einer Konzentration von 2 mg/ml (Oridonin/CMC-Lösung) suspendiert.
  • 1.3 Behandlung mit Oridonin
  • In dem Experiment wurden sechs Gruppen von Tieren für zwei experimentelle Behandlungen gruppiert: Orale Verabreichung von Oridonin-Suspension und Injektion mit Oridonin-Fettemulsion. Diese Gruppen werden wie folgt gelistet (I–III für die orale Behandlung und IV–VI für die Injektion): I. Gruppe: Sechs APP/PS1-21-Mäuse, 5 Monate alt, drei männliche und drei weibliche, erhielten eine orale Behandlung mit Oridonin für 10 Tage. Oridonin (20 mg/kg Körpergewicht, suspendiert in 1% CMC) wurde täglich über eine Magensonde für 10 Tage verabreicht. II. Gruppe: Sechs geschlechts- und altersabgestimmte APP/PS1-21-Mäuse, als Kontrolle, erhielten das gleiche Volumen von 1% CMC in Wasser gelöst. III. Gruppe: Sechs geschlechtsabgestimmte APP/PS1-21-Mäuse wurden zusammen mit den anderen beiden Gruppen, ohne irgendeine Behandlung, bei gleichem Alter (5 Monate alt) getötet. IV. Gruppe: Sechs APP/PS1-21-Mäuse, 3 Monate alt, drei männliche und drei weibliche, erhielten eine Behandlung mit Oridonin für 10 Tage. Oridonin (20 mg/kg Körpergewicht) wurde über Lipofundin® bei einer Konzentration von 2 mg/ml beladen und täglich intraperitoneal (i. p.) für 10 Tage injiziert. V. Gruppe: Sechs geschlechts- und altersabgestimmte APP/PS1-21-Mäuse erhielten als Kontrolle 10 Tage Injektionen mit dem gleichen Volumen von Lipofundin®. VI. Gruppe: Weitere sechs geschlechtsabgestimmte APP/PS1-21-Mäuse wurden zusammen mit den anderen Gruppen, ohne jegliche Behandlung, bei gleichem Alter (3 Monate alt) getötet.
  • 1.4 Design und Evaluierung des Nestbau-Assays
  • Ein Nestbau-Assay (Wesson und Wilson, 2011) wurde modifiziert, um die Defizite der APP/PS1-Mäuse im anschlussorientierten/Sozialverhalten und um die potenziellen Veränderungen nach der Behandlung zu bestimmen. Die Mäuse wurden individuell für zumindest 24 Stunden in transparenten Kunststoffkäfigen mit ungefähr 1 cm Einstreu aus Holzschnitzeln und codierten Identifizierungskarten gehalten, so dass der Experimentator keine Kenntnis über Geschlecht, Alter und Genotyp der Mäuse hatte. Zwei Stunden vor dem Beginn der Dunkelphase des Lichtzyklus wurden zu den Käfigen ein 20 × 20 cm großes Papiertuchstück gegeben, das in ungefähr 5 × 5 cm große Stücke zerkleinert wurde. Die Mäuse wurden in ausgeglichenen Gruppen von gemischten Genotypen getestet, um die Variabilität in den Unterbringungsbedingungen zu vermindern.
  • Am nächsten Morgen (ungefähr 16 Stunden später) wurden die Käfige bezüglich des Nestbaus inspiziert. Vor der Evaluierung wurden zur Dokumentation Fotos aufgenommen. Die Nestkonstruktion aus dem Papiertuch wurde über ein 3-Punkte-System bewertet: 1 = keine Beißspuren oder Risse auf dem Papier, 2 = moderate Beißspuren und/oder Risse auf dem Papier, aber kein stimmiges Nest (nicht in einer Ecke des Käfigs gruppiert) und 3 = der größte Teil des Papiers wurde in Stücke gerissen und in einer Ecke des Käfigs gruppiert.
  • 1.5 Soziale Interaktion: Resident-Intruder-Test
  • Der Sozialinteraktionstest wurde gemäß früheren Studien (Bolivar et al., 2007, Hibbits et al., 2009) mit geringen Veränderungen durchgeführt. Um eine Vielzahl von Aktivitäten zu erfassen, wurde der Resident-Intruder-Test auf Video aufgenommen, um alle unterschiedlichen Verhaltensweisen von natürlichen Mäusen, nicht-behandelten und mit Oridonin behandelten APP/PS1-Mäusen als Resident in der Gegenwart und Abwesenheit einer Intruder-Maus in Kombination mit der Analyse von Bewegungen zu quantifizieren, um einen Gesamtaktivitätsspiegel zu erfassen und neurologische Unterschiede offenzulegen. Individuelle Mäuse (ohne dass der Beobachter Kenntnis über die Behandlungskategorie hatte) wurden für 15 Minuten in einen transparenten Beherbergungskäfig platziert, der identisch war mit dem Käfig, in dem die Tiere gehalten wurden (325 mm × 210 mm × 185 mm), um jede als ”Resident”-Maus zu etablieren. Eine alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmte nicht-behandelte natürliche Maus wurde als ”Intruder” für weitere 15 Minuten eingesetzt. Beide 15-minütigen Abschnitte wurden auf Video aufgenommen, um die Bewertung sämtlicher identifizierbaren unterschiedlichen Verhaltensweisen zu erleichtern. Die Anzahl von unterschiedlichen Verhaltensweisen wurde für die Resident-Maus (15 Minuten allein; 15 Minuten mit Intruder) und für die Intruder-Maus (15 Minuten mit Resident) bewertet.
  • Die unabhängigen Verhaltensweisen umfassten das Beschnüffeln der Umgebung, Aufbäumen längsseits des Käfigs, unabhängiges Aufbäumen, Graben, Kreisen im Uhrzeigersinn, Kreisen entgegen des Uhrzeigersinns, gegenseitige Fellpflege, Verharren und Kratzen. Interaktive Verhaltensweisen umfassen das Beschnüffeln der anderen Maus, das Folgen, Fellpflegen und Aufbäumen gegenüber der anderen Maus, Sitzen bei und Lehnen gegen die andere Maus, das Folgen und Wegrennen der bzw. von der anderen Maus, Beißen, Boxen oder Kämpfen, Besteigen, Festhalten und Schwanzschlagen. Die Videoaufnahmen wurden analysiert und die Ereignisse wurden von drei unabhängigen Beobachtern gezählt, denen die Behandlungsbedingungen unbekannt waren.
  • 1.6 Immunhistochemie (IHC) und Evaluierung/Analyse der Aufnahmen (Quantifizierung der β-Amyloid-Ablagerung und Mikroglia- oder Astrocytenaktivierung)
  • Die mit Oridonin behandelten und Kontrollmäuse wurden nach 10-tägiger Behandlung getötet. Die Mäuse wurden mit Äther tiefenanästhesiert und intrakardial mit 4%igem Paraformaldehyd in PBS bei 4°C perfundiert. Die Gehirne wurden rasch entnommen und anschließend in 4%igem Paraformaldehyd über Nacht bei 4°C nachfixiert. Die nachfixierten Gehirne wurden in zwei Hemisphären geschnitten; die Hemisphären wurden in Paraffin eingebettet, seriell geschnitten (3 μm) und auf mit Silan beschichteten Objektträgern aufgebracht. Die Schnitte der Hemisphären wurden mit HE oder IHC gefärbt. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: β-Amyloid (1:100; Abcam, Cambridge, Vereinigtes Königreich) für die Aβ-Ablagerung, Iba-1 (1:200; Wako, Neuss, Deutschland) für aktivierte Mikroglia und GFAP (1:500; Chemicon (Millipore), Billerica, MA, USA) für Astrocyten.
  • Nach HE- und Immunfärbung wurden die Hemisphärenschnitte mittels Lichtmikroskopie (Nikon Coolscope, Nikon, Düsseldorf, Deutschland) untersucht. Die Aβ-Ablagerung, Iba-1- und GFAP-Immunfärbungen wurden an Querschnitten der Hemisphären evaluiert, speziell fokussiert auf den Neocortex und Hippocampus. Sämtliche Schnitte wurden zufallsnummeriert und unabhängig von zwei Beobachtern analysiert, die weder die Behandlung noch die Zeitpunkte kannten. Aβ-Plaques, Iba-1+- und GFAP+-Zellen im Neocortex und im Hippocampus wurden manuell gezählt, und zwar in Bezug auf einen bestimmten Durchmesser und eine deutliche Ablagerung von Plaques und zellulär bzw. nuklear in Bezug auf Zellen.
  • Um die Immunfärbedaten weiter auszuwerten, wurden in interessierenden Regionen prozentuale Bereiche spezifischer Immunreaktivität (IR) berechnet. Kurzgefasst, Aufnahmen von Hemisphärenquerschnitten wurden unter fünffacher Vergrößerung mit fixierten Parametern erstellt; der Neocortex und Hippocampus wurden manuell dargestellt und unter Verwendung der Software MetaMorph Offline 7.1 (Molecular Devices, Toronto, Kanada) weiter analysiert. Bereiche von IR wurden durch Farbschwellensegmentierung ausgewählt und alle Parameter wurden für alle Aufnahmen fixiert. Die Ergebnisse sind als arithmetische Mittel von Plaque/Zell-Anzahlen oder prozentuale Anteile von Bereichen von IR in Bezug auf interessierende Bereiche der Querschnitte und Standardabweichungen (SEM) dargestellt.
  • 1.7 In vitro-Zellkultur
  • Die immortalisierte Makrophagenzelllinie der Maus RAW 264.7 und Mikroglia-Zelllinie N9 wurden verwendet, um die Auswirkungen von Oridonin auf die inflammatorische Reaktion der Makrophagen und Mikroglia in vitro zu bestimmen. RAW 264.7-Zellen und N9 wurden bei 37°C und 5% CO2 in vollständigem RPMI 1640-Medium (Gibco, Grand Island, New York) und DMEM-Medium (Gibco, Grand Island, New York) wachsen gelassen, welche Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 U/ml) und 10% fötales Kälberserum enthielten. 105 wurden in Zellkulturschalen mit 12 Vertiefungen gegeben und für 24 Stunden kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit Lipopolysaccharid (LPS) (Arbeitskonzentration von 1 μg/ml, Stammlösung 1 mg/ml in PBS) stimuliert, und zusammen mit oder ohne Oridonin (bei einer Arbeitskonzentration von 1 μg/ml, gelöst in Medium) für weitere 24 oder 48 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Überstände für die Analyse der NO-Konzentration durch einen Standard-Griess-Assay (Sigma, München, Deutschland) gesammelt, und die Zellen wurden geerntet und gesammelt. Die gesamte RNA aus den kultivierten Zellen wurde unter Verwendung des RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) gemäß der Anweisung des Herstellers präpariert. 1 μg RNA wurde unter Verwendung des QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) in cDNA reverstranskribiert. Ein cDNA-Äquivalent zu 20 ng Gesamt-RNA wurde einer anschließenden semiquantifizierten PCR-Analyse zugeführt, in der Primer verwendet wurden, die spezifisch sind für iNOS, IL-1β und IL-6 der Maus. In Vorversuchen wurden die optimalen Zyklierungsbedingungen etabliert, die eine Amplifizierung der cDNA im linearen Bereich ermöglichen. Die PCR-Produkte wurde auf 1,5%igen Agarosegelen aufgetrennt, die 5 ul/ml GeIRedTM enthielten, fotografiert unter Verwendung des UVsolo-Systems (Whatman Biometra, Göttingen, Deutschland) und eine densitometrische Analyse wurde unter Verwendung der Software BioDocAnalyze (Whatman Biometra) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden berechnet als Spiegel von Ziel-mRNAs relativ zu jenen von β-Actin (drei Proben jeder Gruppe wurden mittels PCR analysiert).
  • Zusätzlich wurde über einen kolorimetrischen MTT-Assay die Zellviabilität der behandelten RAW- und N9-Zellen detektiert und über die Analyse der Zellkonfluenz und Morphologie unter Verwendung von Mikroaufnahmen und der Software MetaMorph bestimmt.
  • 1.8 Statistische Analyse
  • Die Unterschiede der Plaque/Zell-Zählungen, prozentualen Anteile der Bereiche oder der mRNA-Expressionsspiegel zwischen verschiedenen Gruppen oder zwischen der Behandlung und Kontrolle, wurden durch Einweg-ANOVA gefolgt von einem Dunnett's Multiple Comparison Test oder dem exakten nichtparametrischen Mann-Whitney-Test (ungepaarte T-Tests), analysiert (Graph Pad Prism 5.0 Software). Für alle statistischen Analysen wurden die Signifikanzspiegel auf p < 0,05 gesetzt.
  • 2. Ergebnisse
  • 2.1 Auswirkungen einer oralen Behandlung mit Oridonin auf neuropathologische Veränderungen
  • Amyloide Plaques sind über den gesamten Cortex von 5 Monate alten APP/PS1-transgenen Mäusen verteilt, einige von ihnen sind klein, andere sind kongophile Plaques mit dichtem Kern, und bei wiederum anderen handelt es sich um größere Plaques mit einem dichten Kern und einem großen Hof von diffusem Amyloid. Im Hippocampus wird offensichtlich eine geringe Plaque-Dichte beobachtet.
  • Die transgenen Mäuse wurden zuerst für 10 Tage über eine Sonde oral mit einer Oridonin-Suspension oder Vehikel allein behandelt. Zwischen den APP/PS1-Mäusen aus der Kontrollgruppe (nur Vehikel) und ihren alters- und geschlechtsabgestimmten Wurfgeschwistern, die keine Behandlung erhielten und in den Abbildungen mit ”5 Monate” gekennzeichnet sind, konnte kein signifikanter Unterschied bezüglich der Aβ-Ablagerung oder der Iba-1-Expression im Cortex und Hippocampus beobachtet werden. Diese orale Behandlung mit Oridonin schwächt die neuropathologischen Veränderungen im transgenen Maus-Modell im Vergleich zu alters- und geschlechtsabgestimmten Kontrollmäusen ab, die das gleiche Volumen von Vehikel erhielten. Die Anzahl der Aβ-Plaques in den Gehirnen der APP/PS1-Mäuse wurde zunächst durch zwei unabhängige Beobachter bestimmt, denen die Behandlung und Zeitpunkte nicht bekannt waren; anschließend wurden die prozentualen Anteile der Bereiche von Aβ-IR im Cortex und Hippocampus auf Mikrofotografien über die Software MetaMorph analysiert. Die Oridonin-Behandlung reduzierte die Plaque-Anzahlen relativ gering (Cortex: Kontrolle = 144,2 ± 12,4, Oridonin = 104,8 ± 8,8; p < 0,05; Hippocampus: Kontrolle = 12,0 ± 1.9, Oridonin = 8,2 ± 1,1, p > 0,05; n = 6), reduzierte jedoch dramatisch den Aβ-IR-Bereich im Cortex und Hippocampus, nämlich um die Hälfte bzw. mehr als die Hälfte (Cortex: Oridonin = 0,28 ± 0,2%, Kontrolle 0,47 ± 0,10%, p < 0,05; Hippocampus: Oridonin = 0,08 ± 0,02%, Kontrolle = 0,17 ± 0,01%, p < 0,01; n = 6) (4). In der Oridonin-Gruppe wurden Aβ-Plaques gefunden, die im Vergleich zur Kontrollgruppe eine geringere Größe und weniger Verzweigungen aufweisen. Folglich konnte eine stärkere Reduzierung in Aβ-IR als in den Plaque-Zählungen beobachtet werden (3 und 4).
  • Sowohl im Cortex als auch im Hippocampus wurden, geclustert um die amyloiden Ablagerungen herum, amöboide Iba-1-positive Mikroglia beobachtet, die charakterisiert sind durch feine gewundene Verzweigungen. Die Oridonin-Behandlung reduziert signifikant den IR-Bereich von mikroglialem Iba-1 im Cortex (Oridonin = 0,18 ± 0,02%; Kontrolle = 0,30 ± 0,05%; p < 0,05; n = 6), nicht jedoch im Hippocampus (Oridonin = 0,15 ± 0,01%; Kontrolle = 0,14 ± 0,03%; p > 0,05; n = 6) (4). Der größte Teil der Iba-1+-Zellen war weniger geclustert und zeigte nach der Oridonin-Behandlung eine Morphologie mit weniger Verzweigungen (5).
  • Viele GFAP+-Zellen (GFAP-IR) waren weit über den gesamten Hippocampus und Cortex verteilt. Sie alle zeigten die typische Morphologie von Astrocyten, einschließlich einer sternförmigen Struktur und multiple verzweigte Fortsätze. Zwischen der Oridonin-Behandlung und den Kontrollen wurden keine signifikanten Veränderungen in der GFAP+-Zellintensität beobachtet (Daten nicht gezeigt).
  • 2.2 Auswirkungen der Injektion der Oridonin-Fettemulsion auf die Aβ-Ablagerung und Mikroglia-Aktivierung
  • Die transgenen APP/PS1-Mäuse wurden darüber hinaus bei einem Alter von 3 Monaten durch Injektion i. p. mit der Oridonin-Emulsion oder dem Vehikel (Lipofundin®) für 10 Tage behandelt. In diesem relativ jungen Alter nahmen Anzahl und Größe der Aβ-Plaques im Cortex im Vergleich zu einem Alter von 5 Monaten leicht ab, wobei es ebenfalls keinen signifikanten Unterschied in der Aβ-Ablagerung zwischen der Kontrollgruppe und deren Wurfgeschwistern gab, die keine Behandlung erhielten. Im Hippocampus der Oridonin- als auch Kontrollgruppe kann eine geringe Aβ-Ablagerung beobachtet werden, was im Einklang mit dem ursprünglichen Bericht steht, dass amyloide Plaques zum ersten Mal im Cortex bei einem Alter von sechs Wochen und später im Hippocampus von transgenen APP/PS1-21-Mäusen auftauchen. Im Cortex der APP/PS1-Mäuse der Oridonin-Gruppe wurden signifikant reduzierte Zählungen von Amyloid-Plaques im Vergleich zu der Kontrollgruppe ermittelt (Kontrolle = 134,2 ± 8,8; Oridonin = 113,5 ± 5,1; p < 0,05; n = 6). Anschließend wurden die prozentualen Anteile der Bereiche von Aβ-IR im Cortex auf Mikrofotografien mittels der Software MetaMorph analysiert. Die prozentualen Anteile der Bereiche von Aβ-Ablagerungen (positive Pixel) waren im Cortex dramatisch reduziert (Kontrolle = 0,33 ± 0,02%; Oridonin = 0,23 ± 0,05%; p < 0,05; n = 6). In den Gehirnen aus der Oridonin-Emulsionsgruppe wurden mehr Plaques mit geringerer Größe beobachtet, folglich konnte eine stärkere Reduzierung im Bereich der Aβ-IR beobachtet werden als in den Plaque-Zählungen (3).
  • Anzahlen von Iba-1+-Zellen im Cortex zeigten keinen signifikanten Unterschied nach Oridonin-Behandlung, wobei jedoch eine weitere Analyse mittels Immunfärbung durch MetaMorph zeigt, dass Iba-1-IR um ebenfalls nahezu die Hälfte im Cortex der Oridonin-behandelten Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen reduziert war (Kontrolle = 0,31 ± 0,06%; Oridonin = 0,18 ± 0,04%; p < 0,05; n = 6), wobei nur eine geringe Abnahme im Hippocampus beobachtet wurde (Oridonin = 0,09 ± 0,01%; Kontrolle = 0,11 ± 0,03%; p > 0,05; n = 6). Im Cortex der Oridonin-Gruppe zeigten der größte Teil der Iba-1+-Zellen eine erhöhte Größe und weniger verzweigte Morphologie, was auf eine abgeschwächte Mikroglia-Aktivierung hinweist (3).
  • 2.3 Auswirkung der Injektion der Oridonin-Emulsion auf die Beeinträchtigung des affiliativen Verhaltens (Nestbau-Test)
  • Um den Einfluss der Injektion der Oridonin-Emulsion auf das Nestbauverhalten zu bewerten, wurde der Nestbau mit Papiertuchmaterial untersucht, indem ein 3-Punkte-Bewertungssystem in natürlichen und APP/PS1-Mäusen verwendet wurde. Bevor die Behandlung begonnen wurde, wurde die Fähigkeit zum Nestbau zwischen APP/PS1-Mäusen und natürlichen Mäusen verglichen, und für die APP/PS1-Mäuse wurde eine beeinträchtigte Nestbaufähigkeit beobachtet (APP/PS1 = 1,5 ± 0,2; natürlich = 2,9 ± 0,2; p < 0,05; n = 6). Während der experimentellen Behandlung konnte zu Beginn der Behandlung am Tag 1 kein signifikanter Unterschied zwischen der Oridonin- und Kontrollgruppe beobachtet werden (Oridonin-Gruppe = 1,8 ± 0,2; Kontrollgruppe = 1,9 ± 0,2; p > 0,5; n = 6). Allerdings konnte am Tag 11 zwischen der Oridonin- und Kontrollgruppe dieser alters- und geschlechtsabgestimmten APP/PS1-Mäusen ein signifikanter Unterschied beobachtet werden (Oridonin-Gruppe = 2,1 ± 0,1 und Kontrollgruppe = 1,4 ± 0,3; p < 0,05; n = 6). Nach der 10-tägigen Behandlung mit Oridonin konnte ziemlich unmittelbar bei den Mäusen auf den Papiertüchern ein Kau- und Weinverhalten beobachtet werden, die Papiertücher wurden in Stücke zerrissen und in einer Ecke des Käfigs gruppiert. Hierzu im Gegensatz beobachteten die APP/PS1-Mäuse aus der Kontrollgruppe und kauten wenig, zerstörten jedoch nicht wirklich die Papiertücher, im Wesentlichen auf gleiche Art und Weise, wie sie dies 10 Tage zuvor taten; die Papiertücher wurden überall im Käfig und nicht gruppiert gefunden.
  • Die orale Behandlung mit Oridonin verbesserte die beeinträchtigte Fähigkeit zum Nestbau dieser transgenen Mäuse, was jedoch nicht statistisch signifikant war (Daten nicht gezeigt).
  • 2.4 Auswirkungen der Injektion von Oridonin-Emulsion auf die soziale Interaktion – ”Resident-Intruder-Test”
  • Der Resident-Intruder-Test zur sozialen Interaktion wurde modifiziert, um offenkundige neurologische Funktionen zu evaluieren und Gesamtaktivität zu quantifizieren, sowie sämtliche distinkten Verhaltensweisen, die für jede Maus identifiziert wurden (6). Die Resident-Maus war eine natürliche mit Oridonin behandelte oder nicht behandelte APP/PS1-Maus, wohingegen die Intruder-Maus stets eine nicht behandelte natürliche Kontrolle war. Bei keiner der transgenen Mäuse, die während der Behandlung untersucht wurden, konnten offenkundige neurologische Symptome beobachtet werden. Die Daten zur sozialen Interaktion wurden analysiert, um zu bestimmen, ob für individuelle Mäuse innerhalb jeder Kohorte signifikante Unterschiede gezeigt werden können. Die interaktiven Verhaltensweisen für jede APP/PS1-Maus sind klar unterschiedlich gegenüber den Werten für die natürlichen Mäuse und die mit Oridonin behandelten transgenen Mäuse. Die Resident-APP/PS1-Mäuse zeigten eine niedrigere Frequenz von interaktiven Verhaltensweisen im Vergleich zu jenen der natürlichen Mäuse (APP/PS1 = 17,0 ± 3,1; natürlich = 33,3 ± 3,5; p < 0,01; n = 6) und in der Gegenwart der Intruder-Maus eine höhere Frequenz von unabhängigen Verhaltensweisen (APP/PS1 = 128,0 ± 13,0; natürlich = 90,7 ± 6,6; p < 0,05; n = 6). Nach der 10-tägigen Behandlung renaturierte die Oridonin-Emulsion diese Veränderung gegenüber den Kontrollen (Lipofundin®), erhöhte nämlich die Frequenz der interaktiven Verhaltensweisen (Kontrolle = 7,7 ± 0,8; Oridonin = 15,7 ± 2,2; p < 0,05; n = 6) und erniedrigte die Frequenz von unabhängigen Verhaltensweisen (Kontrolle = 121,0 ± 9,2; Oridonin = 104,5 ± 5,4; p > 0,05; n = 6) (2).
  • 2.5 Oridonin vermindert die Aktivierung von Makrophagen und Mikroglia-Zelllinien in vitro
  • Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Oridonin auf die Aktivierung von Makrophagen und Mikroglia in vitro untersucht, indem die Makrophagen-Zelllinie der Maus RAW 264.7 und die Mikroglia-Zelllinie der Maus N9 verwendet wurden. Die Aktivierung der Makrophagen wurde mit LPS (1 μg/ml) mit oder ohne Oridonin-Behandlung für 24 Stunden induziert. Nach der LPS-Induktion nahm die NO-Produktion signifikant zu und die mRNA-Expression von iNOS, IL-1β und IL-6 deutete auf eine Aktivierung hin. Oridonin reduzierte signifikant die NO-Konzentration und zeigte ein Dosis-abhängiges Muster und schwächte die mRNA-Expression von iNOS, IL-1β und IL-6 ab, was auf eine wirksame Aktivität von Oridonin gegen sowohl Makrophagen- als auch Mikroglia-Zelllinien hindeutet (7; exemplarily shown for N9 cells, similar observations were made with RAW 264.7 cells).
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Xu et al. (2009), Multiple-modulation effects of Oridonin an the production of proinflammatory cytokines and neurotrophic factors in LPS-activated microglia, Int. Immunopharmacol. 9, S. 360 bis 365 [0009]
    • Bolivar et al., 2007 [0033]
    • Hibbits et al., 2009 [0033]

Claims (10)

  1. Oridonin zur Verwendung als Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung.
  2. Oridonin zur Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der neurodegenerativen Erkrankung um Morbus Alzheimer (AD) handelt.
  3. Oridonin zur Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch eine gezielte Reduktion der β-Amyloid-Ablagerung im Gehirn.
  4. Oridonin zur Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel einen weiteren Wirkstoff zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung aufweist.
  5. Verwendung von Oridonin zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung.
  6. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der neurodegenerativen Erkrankung um Morbus Alzheimer (AD) handelt.
  7. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch eine gezielte Reduktion der β-Amyloid-Ablagerung im Gehirn.
  8. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Oridonin in einer Fettemulsion bereitgestellt wird.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Oridonin in einer Lipofundin®-Fettemulsion bereitgestellt wird.
  10. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Oridonin mit einem weiteren Wirkstoff zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung kombiniert wird.
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Hibbits et al., 2009
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Yan XU [et al.]: Multiple-modulation effects of Oridonin on the production of proinflammatory cytokines and neurotrophic factors in LPS-activated microglia. In: International Immunopharmacology, 9(3), 2009, 360-365. (Abstract) CAPLUS [online]. Accession No. 2009:226702, In: Host STN Karlsruhe. *
Yan XU [et al.]: Multiple-modulation effects of Oridonin on the production of proinflammatory cytokines and neurotrophic factors in LPS-activated microglia. In: International Immunopharmacology, 9(3), 2009, 360–365. (Abstract) CAPLUS [online]. Accession No. 2009:226702, In: Host STN Karlsruhe.

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