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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren einer Probe aus einem tiefgefrorenen Substrat und Befestigen der Probe an einem Probenhalter in einem Elektronenmikroskop.
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Vitrifizierte Kryo-Proben für die Elektronenmikroskopie, d. h. solche, bei denen das in der Probe enthaltene Wasser oder andere Lösemittel unter Vermeidung von Kristallbildung eingefroren wurde, und die bei Temperaturen von weniger als –135°C gehalten werden müssen, werden derzeit mit verschiedenen Verfahren hergestellt: Flüssige Proben, z. B. wässrige Suspensionen, die Bakterien, Viren, Proteine oder andere biologische Makromoleküle enthalten, werden als sehr dünner Flüssigkeitsfilm mit einer Filmdicke von etwa 100 bis 300 nm in einem geeigneten Kryogen eingefroren. Dickere, beispielsweise Gewebeproben bis zu einer Dicke von etwa 150 μm werden zunächst unter hohem Druck, zumeist größer als 2100 bar, eingefroren und dann bei tiefen Temperaturen von weniger als –140°C mit einem Diamantmesser in Scheiben von etwa 70 bis 100 nm Querschnittsdicke geschnitten.
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Solche mechanischen Schneidverfahren strapazieren das Substrat allerdings und hinterlassen Artefakte an der Probe, insbesondere in Form von Spuren der Messerkanten an der Oberfläche der Probe oder Kompressionen der Probe in Schneidrichtung. Diese Artefakte mindern die Gate der Probe, da sie die Versuchsergebnisse negativ beeinflussen. Insbesondere dreidimensionale Strukturanalysen durch Tomographie werden deutlich erschwert oder gar unmöglich. Insofern ist es wünschenswert, die Proben unter Vermeidung von mechanischen Schneidverfahren aus dem Substrat zu schneiden.
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Hierfür bietet sich grundsätzlich das Schneider der Probe aus dem Substrat mit einem fokussierten Ionenstrahl (FIB) an. Dies wird bereits seit Jahren für materialwissenschaftliche Proben bei Raumtemperatur erfolgreich durchgeführt. Auch für das Schneiden von Kryo-Proben erscheint der Einsatz der FIB-Technologie vielversprechend, da die so extrahierten Proben nicht die oben beschriebenen Artefakte aufweisen.
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Ein Problem besteht allerdings darin, die Probe aus dem Bereich des fokussierten Ionenstrahls in den Untersuchungsbereich des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) zu transportieren, was zumeist bedeutet, dass die Probe von einem Gerät in ein anderes Gerät zu transportieren ist. Wie kann sichergestellt werden, dass die Probe während des Transports sicher gehalten wird und zugleich keine Erwärmung über die Temperatur von etwa –135°C hinaus erfährt?
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Die
US 6,188,068 B1 offenbart ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe. Die Probe wird in einer Vakuumkammer gehalten. Ein Abschnitt wird in der Vakuumkammer mittels eines fokussierten Laserstrahls freigeschnitten. Anschließend wird der freigeschnittene Teil mittels einer Mico-Manipulator-Einrichtung zu einem Probenhalter im Elektronenmikroskop transportiert.
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Die
US 2009/0146075 A1 offenbart einen Manipulator zum Positionieren einer Probe. Der Manipulator umfasst drei Nano-Aktuatoren mit jeweils einer Spitze, welche zusammen eine gemeinsame Ebene definieren, an der eine Plattform angebracht ist. Die Plattform trägt wiederum einen Probenhalter.
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Die
DE 199 21 236 A1 umfasst ein Verfahren zur Probenaufnahme an Kryosubstraten. Einzelne Proben werden mechanisch oder thermisch von einem Substrat abgetrennt und zu einem Zielsubstrat übertragen.
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In der
EP 2 009 422 A1 wird ein Verfahren beschrieben, worin eine durch FIB-Schneiden extrahierte Probe durch eine Manipulatornadel gehalten und transportiert werden kann. Durch gezielte lokale Erwärmung der an der Probe anliegenden Manipulatornadel soll die Probe eine kurzzeitige Phasenänderung erfahren. Nach anschließender Abkühlung und erneuter Phasenänderung soll die Probe an die Manipulatornadel quasi angeschweißt werden. Die Phasenänderung soll allerdings lokal begrenzt sein auf eine Stelle der Probe, an der keine Untersuchungen stattfinden werden. Es hat sich in der Praxis jedoch als unmöglich herausgestellt, an einer Probe mit einer Erstreckung von wenigen Mikrometern eine Temperaturerhöhung lokal zu begrenzen. Insofern wird weitgehend die gesamte Probe über eine Temperatur von –135°C hinaus erhitzt und damit für die Untersuchungen unbrauchbar.
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Bislang ist es also nicht möglich, die Probe bei einer Temperatur von weniger als –135°C aus dem Bereich des fokussierten Ionenstrahls in den Probenhalter innerhalb des TEMs umzusetzen. In der Praxis werden daher weiterhin die tiefgefrorenen Proben mit mechanischen Schneidvorgängen extrahiert, unter Erzeugung der unerwünschten Artefakte.
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Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bzw. für das Verfahren geeignete Vorrichtungen zum Extrahieren einer Probe aus einem tiefgefrorenen Substrat mittels eines fokussierten Ionenstrahls und Befestigen der Probe an einem Probenhalter in einem Elektronenmikroskop, insbesondere einem TEM, bereitzustellen, wobei die Probe während des gesamten Verfahrens in einer kryogenen Temperatur gehalten werden kann.
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Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1 sowie eine Anordnung nach Anspruch 6. Bevorzugte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
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Der Kern der Erfindung besteht darin, sämtliche Elemente oder Bauteile, die mit der tiefgefrorenen Probe in Kontakt geraten, stets in einer kryogenen Temperatur zu halten. Damit werden temperaturbedingte Strukturänderungen an der Probe ausgeschlossen. Unter einer kryogenen Temperatur werden insbesondere Temperaturen von weniger als –135°C, vorzugsweise –140°C angesehen.
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Die im ersten Schritt nötige erste Haltekraft zum Entnehmen der Probe aus dem Substrat und Halten der Probe an der Übergabevorrichtung kann nun mittels elektrostatischer Haltekräfte bereitgestellt werden, die auch bei sehr geringen Temperaturen wirken und keine Phasenänderung von zumindest Teilen der Probe bedingen. Zur Unterstützung wird vor der Probenentnahme mittels FIB eine mikrometergroße Kerbe in die Übergabevorrichtung geschnitten. Diese Transportkerbe selbst kann zwar auch Haltekräfte bereitstellen, die unter Umständen ausreichend sind; ihre Funktion liegt aber hauptsächlich in der Führung der Probe. Die Anlageflächen innerhalb der Kerbe bilden eine relativ große Oberfläche, an der die elektrostatischen Kräfte wirken und an denen die Haltekräfte wirken können. Der Vorteil liegt also in der Möglichkeit, ohne eine kritische Temperaturerhöhung dennoch ein Anhaften der Probe an der Übergabeeinrichtung zu bewirken. Auch die zweite Haltekraft zum Halten der Probe an dem Probenhalter kann durch elektrostatische Kräfte bereitgestellt werden.
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Dabei kann der Umstand ausgenutzt werden, dass bereits ohne ein gezieltes Anlegen elektrischer Ladung solche elektrostatischen Haltekräfte vorhanden sind. Hierbei macht man sich insbesondere zunutze, dass sich die metallisch nicht leitfähige, gefrorene Probe während der Bestrahlung mit dem Elektronenstrahl elektrostatisch auflädt. Die Übergabeeinrichtung bzw. der Probenhalter sind dagegen geerdet und können diese Ladung ableiten. Dadurch kann eine elektrostatische Fixierung der Probe in der Transportkerbe des Probenhalters bzw. der Übergabeeinrichtung erfolgen. Die Transportkerbe oder die Haltekerbe kann zudem mit elektrischer Ladung gezielt beaufschlagt werden, um das Erzeugen der elektrostatischen Haltekräfte definiert zu beeinflussen oder die elektrostatischen Haltekräfte zu vergrößern. Dafür können Mittel zum Aufbringen der elektrischen Ladung vorgesehen sein, welche elektrische Energiequellen oder zumindest Leitungen an solche elektrische Energiequellen umfassen.
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Ist nun die Probe von der Übergabeeinrichtung zunächst einmal „gegriffen” worden, so kann die Probe von der Übergabeeinrichtung an den Probenhalter, der im Vorfeld mit insbesondere ebenfalls einer Kerbe versehen wurde, übergeben werden. Dafür ist die Übergabeeinrichtung über Aktuatoren räumlich bewegbar.
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Während der Übergabe zwischen Übergabeeinrichtung und Probenhalter wird der Probenhalter eine zweite Haltekraft auf die Probe ausüben, die zunächst noch geringer ist als die erste Haltekraft. Die Probe haftet daher zunächst noch fest an der Übergabeeinrichtung an. Wenn dann allerdings die Probe in einer endgültigen Halteposition am Probenhalter angeordnet ist, wird gezielt die zweite Haltekraft derart erhöht, dass diese größer ist als die erste Haltekraft. Während des Entfernens der Übergabeeinrichtung vom Probenhalter verbleibt dann die Probe am Probenhalter. Solch ein gezieltes Ändern der zweiten Haltekraft am Probenhalter wird durch die Verwendung eines Kryo-Klebers ermöglicht. Der Kryo-Kleber weist nämlich temperaturabhängige Klebeeigenschaften auf. Für die Übergabe wird der Kryo-Kleber am Probenhalter dann auf eine Übergabetemperatur gebracht, in der der Kryo-Kleber etwas verflüssigt ist, und damit dieser lediglich geringere zweite Haltekräfte ausüben kann. Anschließend wird der Kryo-Kleber auf eine Haltetemperatur gebracht, wobei der Kryo-Kleber dann im Vergleich zur Übergabetemperatur wiederum etwas verfestigt ist. Die den Kryo-Kleber berührende Probe wird dann stärker durch den Probenhalter gehalten als durch die Übergabeeinrichtung und somit vollständig an den Probenhalter übergeben. Die Übergabetemperatur liegt dabei etwas höher als die Haltetemperatur, wobei der Kryo-Kleber während der Erwärmung dazu etwas aufgeschmolzen wird. Beide Temperaturen, nämlich die Übergabetemperatur und die Haltetemperatur liegen aber immer noch unterhalb der kryogenen Temperatur von –140°C oder zumindest –135°C, so dass die Qualität der tiefgefrorenen Probe nicht verändert wird.
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Der Kryo-Kleber kann derart geformt werden, dass er eine Haltekerbe für die Probe bereitstellt. Eine solche Haltekerbe kann durch Schneiden in die Masse aus Kryo-Kleber eingebracht werden. Das Schneiden kann wiederum durch den fokussierten lonenstrahl erfolgen. Durch die Verwendung der Haltekerbe in dem Kryo-Klebstoff kann die Festigkeit der Probe am Probenhalter verbessert werden.
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Als Kryo-Kleber eignet sich ein Gemisch aus Isopropanol und Ethanol, jeweils mit einem Anteil von ca. 1/3 bis ca. 2/3 Gew-% es können aber auch Anteile von 2-Butanol oder iso-Pentan beigemischt sein, insbesondere zu einem Anteil von maximal 10 Gew-%.
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Die Handhabung von tiefgefrorenen Proben stellt einige grundsätzliche Anforderungen an das Verfahren bzw. an die verwendeten Vorrichtungen. Beim Verfestigen von flüssigen, insbeondere wasserhaltigen Proben, kommt es normalerweise zur Bildung von kristallinem Eis. Ist die zu untersuchende Probe allerdings in eine Matrix aus kristallinem Eis eingebettet, lässt sie sich nicht mehr mit der erwarteten Genauigkeit im TEM untersuchen. Das kristalline Eis ändert durch seine Kristallstruktur die Abbildungsbedingungen dass das eigentliche Objekt nicht mehr ausreichend dargestellt werden kann.
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Daher ist es von entscheidener Bedeutung, dass alles in der Probe enthaltene Wasser amorph, also ohne Kristallbildung verfestigt wird. Dies gilt analog für Proben, deren Matirx aus einem anderen flüssigen Medium besteht. Amorphes Eis wandelt sich bei Temperaturen über –135°C spontan in kristallienes Eis um. Daher müssen alle Geräte und Vorrichtungen, die mit der Probe in Kontakt sind, auf eine Temperatur unter –135°C gekühlt werden. Als weitere Schwierigkeit wirkt die gekühlte Probe als sog. „Kryo-Falle”; Restgase, die sich im Inneren des Mikroskops befinden, kondensieren auf der Probenoberfläche und verunreinigen diese. Ohne geeignete Vorkehrungen wird die Probe im Verlauf weniger Stunden unbrauchbar. Als Gegenmaßnahme wird die Probe mit einem sog. Kryoschild geschützt. Dieser wird auf eine Temperatur unter der eigentlichen Probentemperatur abgekühlt, so dass sich Gase bevorzugt auf dem Kryoschild abscheiden. Aus den hier beschriebenen Gründen ist es auch nicht möglich, die aus der FIB-Technologie bei Raumtemperatur bekannten Verfahren zur Befestigung einer Probe mittels reaktiver Gasphasenabscheidung, einzusetzen. Die hierfür nötigen, gasförmigen Ausgangsmaterialen würden auf der gekühlten Probe kondensieren und diese unbrauchbar machen.
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Die Querschnittsdicke einer geeigneten Probe liegt zwischen 10 und 1000 nm, insbesondere zwischen 50 und 300 nm. Die Größe der Probe liegt zwischen 0,1 und 100 μm, insbesondere zwischen 10 und 50 μm.
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Die Erfindung wird anhand der Figuren näher erläutert. Hierin zeigt:
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1 eine freigelegte Probe in einem tiefgefrorenen Substrat,
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2 die Übergabe der Probe von einer Übergabeeinrichtung an einen Probenhalter in perspektivischer Darstellung,
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3 schematisch den Aufbau der Übergabeeinrichtung,
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4 eine für den Kryo-Betrieb modifizierte Manipulatornadelspitze der Übergabeeinrichtung nach 3 mit einer aufgenommenen Probe,
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5 der Probenhalter in unterschiedlichen Situationen während des Verfahrens.
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In 1 ist ein Substrat 1 gezeigt, welches bei einer Temperatur von weniger als –140°C tiefgefroren ist. Dabei kann es sich um eine Gewebeprobe handeln. Es ist zu erkennen, dass im linken Bereich ein Freiraum durch Freischneiden mittels eines fokussierten Ionenstrahls in einem FIB-Mikroskop erzeugt wurde. Das Substrat 1 wird dort durch den dünnen Ionenstrahl zu einer flachen Probenlamelle 2 geschnitten, die noch an einer Seite mit dem übrigen Substrat 1 verbunden ist. Eine Übergabeeinrichtung 4, wie sie in den 2 bis 4 gezeigt ist, kann dann die Probenlamelle 2 nun greifen und aus dem Substrat 1 herausbrechen. Die Querschnittsdicke der Probenlamellen 2 weist eine Dicke von zumindest 1–10 μm auf, damit die Probenlamelle 2 nicht aufgrund der temperaturbedingten Sprödigkeit bricht. Das Freischneiden der Probenlamelle 1 aus dem Substrat 1 entspricht im Wesentlichen dem Verfahren, wie es bereits für Proben bei Raumtemperatur angewendet wird.
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3 zeigt eine Übergabeeinrichtung 4, die für die Entnahme der freigelegten Probenlamelle 2 aus dem Substrat 1 verwendet wird. Das Aufnehmen der Probenlamelle 2 erfolgt mit der Spitze einer Manipulatornadel 14, welche an einem Aluminiumblock 13 angeschlossen ist. Der Aluminiumblock 13 ist zur thermischen Entkoppelung an einem Keramikkörper 12 angeschlossen. An den Keramikkörper 12 schließt sich eine elektrische Leitung zum Einbringen von elektrischer Ladung von einer Stromquelle an die Manipulatornadel 14 an. Die aus dem Keramikkörper 12, dem Aluminiumblock 13 und der Manipulatornadel 14 gebildete Übergabeeinrichtung 4 ist im Raum beweglich und wird mittels einer nicht dargestellten Aktuatoreinheit angetrieben. Zur Kühlung der Übergabeeinrichtung 4 ist innerhalb des Arbeitsraumes ein Kryo-Schild 10 angeordnet, welcher durch eine Kupferplatte gebildet ist. Der Kryo-Schild 10 kann an eine Kältequelle, beispielsweise einen mit flüssigem Stickstoff gefüllten Vorratsbehälter, verbunden sein. Um die Kälte von dem Kryo-Schild 10 auf die Übergabeeinrichtung 4 zu übertragen, ist der Kryo-Schild 10 mit der Übergabeeinrichtung 4 durch ein flexibles Kupferband 11 verbunden, welches die Relativbewegungen der Übergabeeinrichtung 4 gegenüber dem feststehenden Kryo-Schild 10 ausgleichen kann. Das Kupferband 11 ist mit dem Aluminiumblock 13 verschraubt, vernietet oder verschweißt.
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In 4 ist die Spitze der Manipulatornadel 14 aus 3 stark vergrößert gezeigt. Die Spitze weist eine Transportkerbe 8 auf, die U-förmig ausgebildet ist. Dabei sind zwei parallel zueinander ausgerichtete Anlageflächen 6 vorgesehen, zwischen denen die Probenlamelle 2 aufgenommen werden kann. Dafür ist der Abstand der beiden Anlagenflächen geringfügig größer als die Querschnittsdicke der Probenlamelle 2. Die Transportkerbe 8 wird dabei durch den Ionenstrahl des FIB-Mikroskops erzeugt, bevor oder nachdem die Probenlamelle 2 durch den Ionenstrahl in dem Substrat 1 freigelegt wurde. Es wird also die gleiche Ionenstrahlvorrichtung zur Erzeugung der Transportkerbe 8 wie auch für das Freilegen der Probenlamelle 2 verwendet.
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In den verschiedenen Darstellungen der 5 ist der Probenhalter 3 gezeigt. Dieser kann ebenfalls wie die Manipulatornadel aus einer Nadelspitze oder Ähnlichem gebildet sein. Zunächst wird in den unbehandelten Probenhalter 3, wie in 5a gezeigt ist, eine Kerbenausnehmung 15 eingebracht, die im Querschnitt betrachtet deutlich größer ist, als die Querschnittsdicke der Probenlamelle 2 (5b). Deutlich dicker bedeutet dabei, dass die Kerbenausnehmung 15 derart groß ist, dass diese keine ausreichende Führung für die Probenlamelle 2 bereitstellen kann. In die Kerbenausnehmung 15 wird dann eine Masse aus Kryo-Kleber 5 eingebracht (5c). Dieser Kryo-Kleber 5 besteht zu 50% aus Ethanol und zu 50% aus Isopropanol. Optional kann der Kryo-Kleber aber auch Bestandteile im einstelligen Prozentbereich von 2-Butanol und iso-Pentan aufweisen. Dieser Kryo-Kleber 5 hat die Eigenschaft, dass er sich bei einer Übergabetemperatur TÜ von etwa –140°C leicht verflüssigt und damit formbar ist bzw. eine stoffflüssige Verbindung mit einem anderen Körper eingehen kann. Bei einer Haltetemperatur TH von deutlich unter –140°C, beispielsweise TH = –150°C, wird der Kryo-Kleber 5 wieder hart und verfestigt sich damit im Vergleich zum vorherigen Zustand bei der Übergabetemperatur TÜ. Die Verflüssigung im Bereich bei TÜ = –140°C hat den Vorteil, dass während dieser Verflüssigung dennoch die Probenlamelle 2 in einer Temperatur gehalten wird, die die Probe nicht strukturell ändert oder zerstören kann. Verflüssigen bedeutet dabei lediglich, dass die Viskosität abnimmt.
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In 5d ist nun gezeigt, dass in dem Kryo-Kleber 5 eine Haltekerbe 9 eingebracht wurde. Dies kann ebenfalls durch die Ionenstrahleinrichtung vorgenommen erfolgen, durch die auch das Freilegen der Probenlamelle 2 in dem Substrat 1 erfolgt. Die Querschnittsbreite der Haltekerbe 9 ist lediglich geringfügig größer als die Querschnittsdicke der Probenlamelle 2, so dass die Probenlamelle 2 in der Haltekerbe 9 geführt werden kann. In 5e ist zu erkennen, dass die mit der Manipulatornadel 14 gehaltene Probenlamelle 2 nun in die Haltekerbe 9 eingesetzt wird. Dies erfolgt bei der Übergabetemperatur TÜ von etwa –140°C. Dadurch kann die Probenlamelle 2 leicht in die Aufnahmekerbe 9 eingelegt werden, wobei zugleich der Kryo-Kleber 5 eine gewisse Haftkraft auf die Probenlamelle 2 ausüben kann. Eine erste Haltekraft F1, die die Probenlamelle 2 an der Übergabeeinrichtung 4 hält, ist noch größer als eine zweite Haltekraft F2, die von dem Probenhalter 3 auf die Probenlamelle 2 ausgeübt wird. Anschließend wird der Kryo-Kleber 5 auf die Haltetemperatur TH von etwa –150°C abgekühlt, wodurch der Kryo-Kleber 5 sich verhärtet und die Probenlamelle 2 festhalten kann. Die zweite Haltekraft F2 ist dann größer als die erste Haltekraft F1. Die Manipulatornadel kann vom Probenhalter entfernt werden, und hinterlasst die Probenlamelle 2 dann am Probenhalter 9.
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2 zeigt die Manipulatornadel 14, den Probenhalter 9 und die Probenlamelle während der Übergabe entsprechend 5e in perspektivischer Darstellung. Nachdem die Probenlamelle an den Probenhalter übergeben wurde, können noch weitere Vorbereitungen an der Probenlamelle durchgeführt werden, insbesondere weitere Schneidvorgänge.
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In 6 sind die Temperaturverläufe von Elementen, die während des Verfahrens Anwendung finden, aufgezeigt. Zum Zeitpunkt 0 befindet sich die Anordnung auf Raumtemperatur bei etwa 20°C. Dann wird der Kryo-Schild 10 heruntergekühlt, wobei bereits nach wenigen Minuten eine Temeperatur des Kryo-Schildes 10 von weniger als –150°C und damit einer kryogen Temperatur erzielt wird, was am Temperaturverlauf A des Kryo-Schildes zu erkennen ist. Mit dem Bezugszeichen B ist der Temperaturverlauf der Manipulatornadel 14 gezeigt, die durch den Kryo-Schild 10 gekühlt wird. Nach ca. einer halben Stunde nimmt die Manipulatornadel 14 eine Temperatur von weniger als –140°C an und ist dann einsatzbereit für den Übergabeprozess der Probe. Mit dem Bezugszeichen C ist der Temperaturverlauf des Probenhalters beschrieben Auch hier ist nach ca. einer halben Stunde eine Temperatur unterhalb von –140°C erreicht.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Substrat
- 2
- Probenlamelle
- 3
- Probenhalter
- 4
- Übergabeeinrichtung
- 5
- Kryo-Klebstoff
- 6
- Anlagefläche
- 7
- elektrische Leitung
- 8
- Transportkerbe
- 9
- Haltekerbe
- 10
- Kryoschild
- 11
- Kupferband
- 12
- Keramikkörper
- 13
- Aluminiumblock
- 14
- Manipulatornadel
- 15
- Kerbenausnehmung
- 16
- Freiraum
- A
- Temperaturverlauf des Kryoschildes
- B
- Temperaturverlauf der Manipulatornadel
- C
- Temperaturverlauf des Probenhalters
