DE102011110945A1 - Biotechnologisches Syntheseverfahren von organischen Verbindungen mit alkIL-Genprodukt - Google Patents

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen unter Zuhilfenahme mindestens eines alklL-Genproduktes.

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Gegenstand der Erfindung ist ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen unter Zuhilfenahme mindestens eines alklL-Genproduktes.
  • Stand der Technik
  • Fettsäuren und deren Derivate werden heute ausschließlich aus pflanzlichen und tierischen Ölen bzw. Fetten gewonnen. Dies hat eine Vielzahl von Nachteilen:
    Insbesondere tierische Fette treffen in Folge der BSE-Krise als Rohstoffe kaum noch auf Kundenakzeptanz. Pflanzliche Öle, die kurz- und mittelkettige Fettsäuren enthalten, sind entweder schwer verfügbar oder werden in tropischen Regionen produziert. Hier ist in vielen Fällen die Nachhaltigkeit der Produktion in Frage gestellt, da gegebenenfalls Regenwald gerodet wird, um die Anbauflächen bereit zu stellen. Außerdem besitzen pflanzliche und tierische Öle bzw. Fette für den jeweiligen Rohstoff spezifische, aber festgelegte Fettsäurespektren. Daher findet hier eine Koppelproduktion statt, die für eine bestimmte Fettsäurespezies preisbestimmend sein kann. Zu guter letzt sind viele der pflanzlichen Öle gleichzeitig auch Nahrungsmittel, so dass unter bestimmten Umständen eine Konkurrenz zwischen stofflicher Verwertung und einer Verwertung als Nahrungsmittel auftreten kann.
  • Aus diesem Grund wird nach alternativen Quellen und Produktionswegen für Fettsäuren gesucht, wodurch zur Zeit viel Forschungsaufwand zur Herstellung von Fettsäuren in beispielsweise Algen, aber auch insbesondere in rekombinanten Mikroorgasmen wie beispielweise Hefen und Bakterien investiert wird.
  • Obwohl sich eine Reihe von Technologien für die Herstellung von auf Fettsäuren basierenden Treibstoffen und Chemikalien aus nachwachsenden Rohstoffen, insbesondere Kohlenhydraten, in der Entwicklung befinden, sind die erreichten Ausbeuten für eine sinnvolle kommerzielle Nutzung zu gering.
  • Aufgabe der Erfindung war es, eine biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen mit einer höheren Produktivität bereitzustellen.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Überraschenderweise wurde gefunden, dass die im Folgenden beschriebene Co-Expression eines alkL-Genproduktes in dem produzierenden Mikroorganismus die der Erfindung gestellte Aufgabe zu lösen vermag.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Mikroorganismen, die organische Substanzen synthetisieren und verstärkt alkL exprimieren. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der vorgenannten Mikroorganismen zur Herstellung von organischen Substanzen sowie ein Verfahren zur Herstellung von organischen Substanzen unter Einsatz der Mikroorganismen.
  • Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass die Produktinhibition im Herstellungsverfahren stark reduziert werden kann. Ein weiterer Vorteil ist es, dass die Raum-Zeit-Ausbeute und Kohlenstoffausbeute des Verfahrens erhöht ist, verglichen zu Mikroorganismen die kein oder weniger alkL exprimieren. Noch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die Produktkonzentration im Kulturüberstand erhöht wird, so dass eine effiziente Aufarbeitung erleichtert wird.
  • Alle angegebenen Prozent (%) sind, wenn nicht anders angegeben, Massenprozent.
  • Die Erfindung umfasst Methoden für die Generierung von rekombinanten mikrobiellen Zellen, die in der Lage sind, organische Substanzen, wie Carbonsäuren und Carbonsäurederivate wie zum Beispiel Carbonsäureester, Alkane, Alkan-1-ole, Alkan-1-ale, Alkan-1-amine sowie 1-Alkene, aus nicht verwandten Kohlenstoffquellen herzustellen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst somit einen Mikroorganismus, der eine erste gentechnische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp mehr organische Substanz aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermag, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus eine zweite gentechnische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp mehr alkL-Genprodukt bildet.
  • Unter dem Begriff „eine erste gentechnische Modifikation” wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung mindestens eine gentechnische Veränderung des Mikroorganismus verstanden, bei dem ein oder mehrere Gene in ihrer Expression verglichen zum Wildtypstamm verändert, d. h. erhöht oder reduziert, wurden. Unter dem Begriff „einfache Kohlenstoffquelle” werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Kohlenstoffquellen verstanden, bei denen im Kohlenstoffgerüst mindestens eine C-C-Bindung aufgebrochen und/oder mindestens ein Kohlenstoffatom der einfachen Kohlenstoffquelle mit mindestens einem Kohlenstoffatom eines anderen Moleküls mindestens eine neue Bindung ausbilden muss, um zu dem Kohlenstoffgerüst der „mehr gebildeten organischen Substanz” zu gelangen. Unter dem Begriff „alkL-Genprodukt” werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Proteine verstanden, die mindestens eine der nachfolgenden beiden Bedingungen erfüllen:
    • 1.) Das Protein wird als ein Mitglied der Superfamilie der OmpW-Proteine (Proteinfamilie 3922 in der „Conserved Domain Database” (CDD) des „National Center for Biotechnology Information” (NCBI)) identifiziert, wobei diese Zuordnung durch ein Alignment der Aminosäuresequenz des Proteins mit den in der CDD des NCBI vorhandenen Datenbankeinträgen, die bis zum 22.03.2010 hinterlegt wurden, unter Nutzung der Standardsuchparameter, einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 0,01 und unter Verwendung des Algorithmus „blastp 2.2.23+”, erfolgt,
    • 2.) bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST wird die Präsenz der konservierten Domäne „OmpW, Outer membrane protein W” (COG3047) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt (englisch „domain hit”).
  • Bevorzugte organische Substanzen der vorliegenden Erfindung stellen solche dar, die über mehr als ein, insbesondere 3 bis 36, bevorzugt 6 bis 24, insbesondere 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweisen. Die organischen Substanzen können linear, verzweigt, gesättigt oder ungesättigt und gegebenenfalls mit anderen Gruppen substituiert sein.
  • Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die organische Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend, bevorzugt bestehend aus,
    Carbonsäuren, insbesondere mit 3 bis 34, bevorzugt mit 6 bis 22, besonders bevorzugt mit 6 bis 18, Kohlenstoffatomen,
    Carbonsäureester, insbesondere mit 3 bis 34, bevorzugt mit 6 bis 22, besonders bevorzugt mit 6 bis 18, Kohlenstoffatomen im Carbonsäureanteil, bei denen die Alkoholkomponente sich ableitet von Methanol, Ethanol oder anderen primären Alkoholen mit 3-18 Kohlenstoffatomen, insbesondere von Methanol und Ethanol,
    Alkane mit 3 bis 34, bevorzugt mit 6 bis 22, besonders bevorzugt mit 6 bis 18, Kohlenstoffatomen,
    Alkene mit 3 bis 34, bevorzugt mit 6 bis 22, besonders bevorzugt mit 6 bis 18, Kohlenstoffatomen,
    einwertige Alkohole mit 3 bis 34, bevorzugt mit 6 bis 22, besonders bevorzugt mit 6 bis 18, Kohlenstoffatomen,
    Aldehyde mit 3 bis 34, bevorzugt mit 6 bis 22, besonders bevorzugt mit 6 bis 18, Kohlenstoffatomen,
    einwertige Amine mit 3 bis 34, bevorzugt mit 6 bis 22, besonders bevorzugt mit 6 bis 18, Kohlenstoffatomen,
    sowie substituierte Verbindungen der vorgenannten Gruppenmitglieder, die insbesondere als weitere Substituenten einen oder mehrer Hydroxy-, Amin-, Keto-, Carboxyl-, Methyl-, Ethyl-, Cyclopropyl- oder Epoxy-Funktionen tragen, wobei unsubstituierte bevorzugt sind. Besonders bevorzugt sind die organischen Substanzen Fettsäuren, Fettsäureester, Alkan-1-ale, Alkan-1-ole und Alkan-1-amine, Alkane und Alkene, insbesondere 1-Alkene, wobei die Ester bei den vorgenannten Verbindungen bevorzugt solche sind, bei denen die Alkoholkomponente sich ableitet von Methanol, Ethanol oder anderen primären Alkoholen mit 3-18 Kohlenstoffatomen, insbesondere von Methanol und Ethanol. Besonders bevorzugt sind die organischen Substanzen ausgewählt aus Fettsäuren und Fettsäureester, bei denen die Fettsäurekomponenten ausgewählt ist aus der Gruppe Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Capronsäure, Önanthsäure, Caprylsäure, Pelargonsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Pentadecansäure, Palmitinsäure, Margarinsäure, Stearinsäure, Nonadecansäure, Arachinsäure, Behensäure, Lignocerinsäure, Cerotinsäure, Montansäure, Melissinsäure, Undecylensäure, Myristoleinsäure, Palmitoleinsäure, Petroselinsäure, Ölsäure, Elaidinsäure, Vaccensäure, Gadoleinsäure, Icosensäure, Cetoleinsäure, Erucasäure, Nervonsäure, Pelargonsäure, Linolsäure, α-Linolensäure, γ-Linolensäure, Calendulasäure, Punicinsäure, α-Elaeostearinsäure, β-Elaeostearinsäure, Arachidonsäure, Timnodonsäure, Clupanodonsäure, Cervonsäure, Vernolsäure, Ricinolsäure
    sowie
    deren Derivate in Form von korrespondierenden Alkan-1-alen, Alken-1-olen, Alkan-1-aminen bzw. im Fall von ungesättigten Fettsäuren, wie etwa Palmitoleinsäure, Ölsäure, Linolsäure, α-Linolensäure, γ-Linolensäure auch Alken-1-alen, Alken-1-olen, Alken-1-aminen, durch enzymatische Reduktion und Decarbonylierung von vorgenannten Fettsäuren hergestellte Alkane und Alkene sowie durch enzymatische Decarboxylierung von vorgenannten Fettsäuren hergestellte Alkene, insbesondere 1-Alkene, ggf. mit weiteren, nicht-terminalen Doppelbindungen. Unter dem Begriff „korrespondierende Alkan/Alken-1-Verbindungen” ist in diesem Zusammenhang zu verstehen, dass die Carboxylgruppe der betrachteten Fettsäure durch ein -COH, ein -CH2OH oder ein -CH2NH2 ersetzt ist. Werden im Folgenden Enzymaktivitäten im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beschrieben, die Reaktionen katalysieren, an denen direkt oder indirekt Alkansäuren, Alken-1-ale, Alkan-1-ole oder Alkan-1-amine beteiligt sind, so ist davon auszugehen, dass Alkansäuren, Alkan-1-ale, Alkan-1-ole oder Alkan-1-amine. die zusätzlich eine oder mehrere, nicht terminale, Doppelbindungen besitzen, in der Regel bei der angegebenen Enzymaktivität miterfasst sind.
  • Als Kohlenstoffquelle können Kohlehydrate wie z. B. Glukose, Saccharose, Arabinose, Xylose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose und Hemlcellulose, aber auch Glycerin oder einfachste organische Moleküle wie CO2, CO oder Synthesegas eingesetzt werden.
  • Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass aufgrund der guten genetischen Zugänglichkeit Mikroorganismen eingesetzt werden; ausgewählt aus der Gruppe der Bakterien, besonders aus der Gruppe enthaltend, bevorzugt bestehend aus, Magnetococcus, Mariprofundus, Acetobacter, Acidiphilium, Afipia, Ahrensia, Asticcacaulis, Aurantimonas, Azorhizobium, Azospirillum, Bartonella, tribocorum, Beijerinckia, Bradyrhizobium, Brevundimonas, subvibrioides, Brucella, Caulobacter, Chelativorans, Citreicella, Citromicrobium, Dinoroseobacter, Erythrobacter, Fulvimarina, Gluconacetobacter, Granulibacter, Hirschia, Hoeflea, Hyphomicrobium, Hyphomonas, Ketogulonicigenium, Labrenzia, Loktanella, Magnetospirillum, Maricaulis, Maritimibacter, Mesorhizobium, Methylobacterium, Methylocystis, Methylosinus, Nitrobacter, Novosphingobium, Oceanibulbus, Oceanicaulis, Oceanicola, Ochrobactrum, Octadecabacter, Oligotropha, Paracoccus, Parvibaculum, Parvularcula, Pelagibaca, Phaeobacter, Phenylobacterium, Polymorphum, Pseudovibrio, Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Roseibium, Roseobacter, Roseomonas, Roseovarius, Ruegeria, Sagittula, Silicibacter, Sphingobium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Starkeya, Sulfitobacter, Thalassiobium, Xanthobacter, Zymomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia, Orientia, Rickettsia, Wolbachia, Bordetella, Burkholderia, Cupriavidus, taiwanensis, Lautropia, Limnobacter, Polynucleobacter, Ralstonia, Chromobacterium, Eikenella, corrodens, Basfia, Kingella, Laribacter, Lutiella, Neisseria, Simonsiella, Achromobacter, Acidovorax, Alicycliphlius, Aromatoleum, Azoarcus, Comamonas, Dechloromonas, Delftia, Gallionella, Herbaspirillum, Herminiimonas, Hylemonella, Janthinobacterium, Leptothrix, Methylibium, Methylobacillus, Methylophilales, Methyloversatilis, Methylovorus, Nitrosomonas, Nitrosospira, Oxalobacter, Parasutterella, Polaromonas, Polaromonas, Pusillimonas, Rhodoferax, Rubrivivax, Sideroxydans, Sutterella, wadsworthensis, Taylorella, Thauera, Thiobacillus, Thiomonas, Variovorax, Verminephrobacter, Anaeromyxobacter, Bdellovibrio, bacteriovorus, Bilophila, Desulfarculus, Desulfatibacillum, Desulfobacca, Desulfobacterium, Desulfobulbus, Desulfococcus, Desulfohalobium, Desulfitobacterium, Desulfomicrobium, Desulfonatronospira, Desulfotalea, Desulfovibrio, Desulfuromonas, Geobacter, Haliangium, Hippea, Lawsonia, Myxococcus, Pelobacter, Plesiocystis, Sorangium, Stigmatella, Syntrophobacter, Syntrophus, Arcobacter, Caminibacter, Campylobacter, Helicobacter, Nitratifractor, Nitratiruptor, Sulfuricurvum, Sulfurimonas, Sulfurospirillum, Sulfurovum, Wolinella, Buchnera, Blochmannia, Hamiltonella, Regiella, Riesia, Citrobacter, Cronobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Pectobacterium, Proteus, Providencia, Rahnella, Salmonella, Serratia, Shigella, Sodalis, Wigglesworthia, Glossina, Xenorhabdus, Yersinia, Acidithiobacillus, Acinetobacter, Aeromonas, Alcanivorax, Alkalilimnicola, Allochromatium, Alteromonadales, Alteromonas, Baumannia, Beggiatoa, Bermanella, Carsonella, Ruthia, Vesicomyosocius, Cardiobacterium, Chromohalobacter, Colwellia, Congregibacter, Coxiella, Dichelobacter, Endoriftia, Enhydrobacter, Ferrimonas, Francisella, Glaciecola, Hahella, Halomonas, Halorhodospira, Halothiobacillus, Idiomarina, Kangiella, Legionella, Marinobacter, Marinomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylomicrobium, Methylophaga, Moraxella, Moritella, Neptuniibacter, Nitrococcus, Pseudoalteromonas, Psychrobacter, Psychromonas, Reinekea, Rickettsiella, Saccharophagus, Shewanella, Succinatimonas, Teredinibacter, Thioalkalimicrobium, Thioalkalivibrio, Thiomicrospira, Tolumonas, Vibrionales, Actinobacillus, Aggregatibacter, Gallibacterium, Haemophilus, Histophilus, Mannheimia, Pasteurella, Azotobacter, Cellvibrio, Pseudomonas, Aliivibrio, Grimontia, Photobacterium, Photobacterium, Vibrio, Pseudoxanthomonas, Stenotrophomonas, Xanthomonas, Xylella, Borrelia, Brachyspira, Leptospira, Spirochaeta, Treponema, Hodgkinia, Puniceispirillum, Liberibacter, Pelagibacter, Odyssella, Accumulibacter, insbesondere
    E. coli, Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp., Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Cyanobakterien, Klebsiella sp., Klebsiella oxytoca, Salmonella sp., Rhizobium sp. und Rhizobium meliloti, wobei E. coli besonders bevorzugt ist.
  • Bevorzugte in den erfindungsgemäßen Mikroorganismen enthaltene alkL-Genprodukte sind dadurch gekennzeichnet, dass die Produktion des alkL-Genproduktes im nativen Wirt durch Dicyclopropylketon induziert wird; in diesem Zusammenhang ist weiterhin bevorzugt, dass die Expression des alkL-Gens als Teil einer Gruppe von Genen, beispielsweise in einem Regulon wie etwa einem Operon, stattfindet. In den erfindungsgemäßen Mikroorganismen enthaltene alkL-Genprodukte werden bevorzugt kodiert von alkL-Genen aus Organismen ausgewählt aus der Gruppe der gram-negativen Bakterien, insbesondere der Gruppe enthaltend, bevorzugt bestehend aus Pseudomonas sp., Azotobacter sp., Desulfitobacterium sp., Burkholderia sp., bevorzugt Burkholderia cepacia, Xanthomonas sp., Rhodobacter sp., Ralstonia sp., Delftia sp. und Rickettsia sp., Oceanicaulis sp., Caulobacter sp., Marinobacter sp. und Rhodopseudomonas sp., bevorzugt Pseudomonas putida, Oceanicaulis alexandrii, Marinobacten aquaeolei, insbesondere Pseudomonas putida GPo1 und P1, Oceanicaulis alexandrii HTCC2633, Caulobacter sp. K31 und Marinobacter aquaeolei VT8. In diesem Zusammenhang sind ganz besonders bevorzugte alkL-Genprodukte kodiert durch die alkL-Gene aus Pseudomonas putida GPo1 und P1, welche wiedergegeben werden durch SEQ ID NR. 1 und SEQ ID NR. 29, sowie Proteine mit Polypeptidsequenz SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 30, SEQ ID NR. 31, SEQ ID NR. 32 oder SEQ ID NR. 33 oder mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 30, SEQ ID NR. 31, SEQ ID NR. 32 oder SEQ ID NR. 33 durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der jeweiligen Bezugssequenz SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 30, SEQ ID NR. 31, SEQ ID NR. 32 oder SEQ ID NR. 33 besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, und zwar in einem System, wie es in den Ausführungsbeispielen beschrieben wird, bei dem Glucose zu Palmitoleinsäure in einer E. coli-Zelle umgesetzt wird. Eine Methode der Wahl zur Bestimmung der Syntheserate ist den Ausführungsbeispielen zu entnehmen. Für die Definition der Units gilt hier die in der Enzymkinetik übliche Definition: 1 Unit Biokatalysator setzt 1 μmol Substrat in einer Minute zum Produkt um.
    1 U = 1 μmol/min
  • Änderungen von Aminosäureresten einer gegebenen Polypeptidsequenz, die zu keinen wesentlichen Änderungen der Eigenschaften und Funktion des gegebenen Polypeptides führen, sind dem Fachmann bekannt. So können beispielsweise manche Aminosäuren oft problemlos gegeneinander ausgetauscht werden; Beispiele für solche geeigneten Aminosäuresubstitutionen sind: Ala gegen Ser; Arg gegen Lys; Asn gegen Gln oder His; Asp gegen Glu; Cys gegen Ser; Gln gegen Asn; Glu gegen Asp; Gly gegen Pro; His gegen Asn oder Gln; Ile gegen Leu oder Val; Leu gegen Met oder Val; Lys gegen Arg oder Gln oder Glu; Met gegen Leu oder Ile; Phe gegen Met oder Leu oder Tyr; Ser gegen Thr; Thr gegen Ser; Trp gegen Tyr; Tyr gegen Trp oder Phe; Val gegen Ile oder Leu. Ebenso ist bekannt, dass Änderungen besonders am N- oder C-Terminus eines Polypeptides in Form von beispielsweise Aminosäureinsertionen oder -deletionen oft keinen wesentlichen Einfluss auf die Funktion des Polypeptides ausüben.
  • Erste gentechnische Modifikation zur Synthese von Carbonsäuren, Carbonsäure-Estern und anderen Carbonsäurederivaten aus einer einfachen Kohlenstoffquelle
  • Erfindungsgemäß weisen die Mikroorganismen eine erste gentechnische Modifikation auf, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr orgaqnische Substanz, insbesondere Carbonsäuren und Carbonsäurederivate aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Es ist in diesem Zusammenhang erfindungsgemäß bevorzugt, dass es sich bei der ersten gentechnischen Modifikation um eine verglichen zu der enzymatischen Aktivität des Wildtypes des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme handelt, ausgewählt aus der Gruppe
    Ei Acyl-ACP(Acyl Carrier Protein)-Thioesterase, bevorzugt der EC 3.1.2.14 oder EC 3.1.2.22, welche die Hydrolyse eines Acyl-Acyl Carrier Protein-Thioesters katalysiert,
    Eii Acyl-CoA(Coenzym A)-Thioesterase, bevorzugt der EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20 oder EC 3.1.2.22, welche die Hydrolyse eines Acyl-Coenzym A-Thioesters katalysiert,
    Eiib Acyl-CoA(Coenzym A):ACP(Acyl Carrier Protein)-Transacylase, welche bevorzugt eine Reaktion katalysiert, in der ein CoA-Thioester in einen ACP-Thioester umgewandelt wird,
    Eiii Polyketidsynthase, welche eine Reaktion katalysiert, die an der Synthese von Carbonsäuren und Carbonsäure-Estern mitwirkt, und
    Eiv Hexansäuresynthase, eine spezialisierte Fettsäuresynthase des FAS-I-Typs, welche die Synthese von Hexansäure aus 2 Molekülen Malonyl-Coenzym A und einem Molekül Acetyl-Coenzym A katalysiert.
  • Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivität des Enzyms Ei bis Eiv als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann sowie auch für eine erhöhte alkL-Genprodukt Bildung.
  • Der Begriff „gesteigerte Aktivität eines Enzyms”, wie er vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise als gesteigerte intrazelluläre Aktivität zu verstehen; diese Aussage gilt auch für eine erhöhte alkL-Genprodukt Bildung. Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet, die Kodonnutzung des Gens verändert, auf verschiedene Art und Weise die Halbwertszeit der mRNA oder des Enzyms erhöht, die Regulation der Expression des Gens modifiziert oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Mikroorganismen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder eine Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Promotor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einen extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt. Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999 , die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet. Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1- und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1- oder 2-dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712–23 (2001) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989) und anschließende optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32–39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630–2647) analysiert werden. Diese Methode bietet sich auch immer dann an, wenn mögliche Produkte der durch die zu bestimmende Enzymaktivität katalysierten Reaktion im Mikroorganismus schnell verstoffwechselt werden können oder aber die Aktivität im Wildtyp selber zu gering ist, um die zu bestimmende Enzymaktivität anhand der Produktbildung ausreichend bestimmen zu können. Mit den oben beschriebenen Methoden ist ebenfalls festzustellen, ob ein betrachteter Mikroorganismus verglichen zu seinem Wildtyp mehr alkL-Genprodukt bildet.
  • Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung angeführten Accession-Nummern entsprechen den ProteinBank Datenbank-Einträgen des NCBI mit Datum vom 26.07.2011; in der Regel wird vorliegend die Versionsnummer des Eintrages durch „.Ziffer” wie beispielsweise „.1”, kenntlich gemacht.
  • Bestimmte Enzyme Ei
  • Die durch Ei katalysierte Reaktion unterscheidet sich von der durch Eii katalysierten lediglich dadurch, dass anstelle eines Acyl-Acyl Carrier Protein-Thioesters ein Acyl-Coenzym A-Thioester hydrolysiert wird. Es ist offenbar, dass viele der genannten Enzyme Ei sich aufgrund signifikanter Nebenaktivität ebenfalls als Eii einsetzen lassen werden, wie auch umgekehrt.
  • In erfindungsgemäß bevorzugten Zellen stellt das Enzym Ei eines dar, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
    Figure 00110001
    Figure 00120001
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms Ei generell insbesondere die Hydrolyse von Dodecanoyl-ACP–Thioester verstanden wird.
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung erste gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit der zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden. Die WO2010063031 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0007] bis [0008], [0092] bis [0100], [0135] bis [0136], [0181) bis [0186] und [0204] bis [0213] sowie den Ausführungsbeispielen 4 bis 8 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0012] bis [0013], [0155], [0160] bis [0163], [0185] bis [0190] und [0197] bis [0199], , den Ausführungsbeispielen 4 bis 8 sowie Tabelle 3. Die WO2010063032 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0007] bis [0008], [0092] bis [0100], [0135] bis [0136], [0181] bis [0186] und [0204] bis [0213], den Ausführungsbeispielen 4 bis 8 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0012] bis [0013], [0155], [0160] bis [0163], [0185] bis [0190] und [0197] bis [0199], , den Ausführungsbeispielen 4 bis 8 sowie Tabelle 3. Die WO2011003034 A2 beschreibt insbesondere auf Seite 3, zweiter Abschnitt, bis Seite 7, erster Abschnitt, Seite 20, zweiter Abschnitt, bis Seite 22, zweiter Abschnitt, und auf Seite 156 bis Seite 166, fünfter Abschnitt, sowie in den Ansprüchen 1 bis 100 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Adipinsäure, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere auf Seite 35, dritter Abschnitt, und Seite 36, erster Abschnitt. Die WO2011008565 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0018] bis [0024] sowie [0086] bis [0102] und den Ausführungsbeispielen 2, 4, 7, 9 und 10 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren, Alkan-1-ale, Alkan-1-ole, Alkane und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0009] bis [0018] und [0073] bis [0082], bis und , Tabelle 4, den Ausführungsbeispielen 1 bis 10 sowie den Ansprüchen 1 bis 5 und 11 bis 13. Die WO2009076559 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0013] bis [0051] und [0064] bis [00111] sowie den Ansprüchen 1 bis 10 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren, Alkan-1-ole, Alkane oder Alkene, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen in insbesondere Tabelle 1, den Abschnitten [0021], [0024] bis [0030] und [0064] bis [00111] sowie . Die WO2010017245 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0011] bis [0015] und [00114] bis [00134], dem Ausführungsbeispiel 3 sowie den Ansprüchen 1 bis 2 und 9 bis 11 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen in insbesondere Tabellen 1, 2 und 3, den Abschnitten [0080] bis [00112] sowie den Ansprüchen 3 bis 8. Die WO2010127318 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 1 bis 9 und 11 bis 16, den Ausführungsbeispielen 1, 2 und 4, den bis sowie den Ansprüchen 23 bis 43, 62 bis 79 und 101 bis 120 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Biodiesel-Äquivalente und andere Fettsäurederivate, vor allem Fettsäureethylester, Fettsäure-Ester, Wachsester, Alkan-1-ole und Alkan-1-ale, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen auf insbesondere Seiten 17, 19 bis 23. Die WO2008100251 A1 beschreibt insbesondere auf den Seiten 4 bis 7 und 45 bis 46, den bis sowie den Ansprüchen 9 bis 13 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester und Alkan-1-ole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen auf insbesondere Seiten 4 bis 5 und 45 bis 46. Die WO2007136762 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 2 bis 4 und 17 bis 18, der Tabelle 7, den bis , den Ausführungsbeispielen 2 bis 8 sowie den Ansprüchen 13 und 35 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester, Kohlenwasserstoffe und Alkan-1-ole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere auf den Seiten 17 bis 18, in den Tabellen 1, 7, 8 und 10 sowie der . Die WO2008113041 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 35 bis 41 und 64 bis 67, der , den Ausführungsbeispielen 6 und 10 sowie den Ansprüchen 7 und 36 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester, Kohlenwasserstoffe, aliphatische Ketone und Alkan-1-ole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in und den Ausführungsbeispielen 6 und 10. Die WO2010126891 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0034] bis [0091], [0195] bis [0222] und [0245] bis [0250], den bis und den Ausführungsbeispielen 1 bis 5 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester und Alkan-1-ole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0245] bis [0250], der Tabelle 1 und den Ausführungsbeispielen 1 bis 5. Die WO2010118410 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0022] bis [0043], [0158] bis [0197], den bis , den Ausführungsbeispielen 3 und 5 bis 8 sowie den Ansprüchen 1 bis 53 und 82 bis 100 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester und Wachsester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0158] bis [0197], der Tabelle 1, den und und den Ausführungsbeispielen 3 sowie 5 bis 8. Die WO2010118409 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0134] bis [0154], den bis sowie und dem Ausführungsbeispiel 3 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester und Wachsester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0134] bis [0154], den und und dem Ausführungsbeispiel 3. Die WO2010075483 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0061] bis [0090], und [0287] bis [0367], den , und , den Ausführungsbeispielen 1 bis 38 sowie den Ansprüchen 18 bis 26 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren, Fettsäuremethylester, Fettsäureethylester, Alkan-1-ole, Fettalkyl-Acetate, Alkan-1-ale, Fettamine, Fettamide, Fettsulfate, Fettether, Ketone, Alkane, interne und terminale Olefine, Dicarbonsäuren, α,ω-Dicarbonsäuren und α,ω-Diole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0012] bis [0060], den Tabellen 7, 17, 26 und 27, den , bis und bis , den Ausführungsbeispielen 1 bis 38 sowie den Ansprüchen 1 bis 17. Die WO2010062480 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0022] bis [0174] und [0296] bis [0330], den Ausführungsbeispielen 3 und 5 bis 8 sowie den Ansprüchen 17 und 24 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Alkan-1-ole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0022] bis [0174], der Tabelle 1, sowie den Ausführungsbeispielen 3 und 5 bis 8. Die WO2010042664 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0022] bis [0143] und [0241] bis [0275], dem Ausführungsbeispiel 2 sowie den Ansprüchen 3 und 9 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Alkan-1-ale, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in der Tabelle 1, der und dem Ausführungsbeispiel 2. Die WO2011008535 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0024] bis [0032], und [0138] bis [0158] sowie der erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Carbonsäuren, Hydroxy-Carbonsäuren und deren Lactone aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen.
  • Die WO2010022090 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0022] bis [0143] und [0238] bis [0275], den bis , dem Ausführungsbeispiel 2 sowie den Ansprüchen 5, 15, 16 und 36 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester und Wachsester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in der Tabelle 1, der und dem Ausführungsbeispiel 2. Die WO2009140695 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0214] bis [0248] und den Ausführungsbeispielen 22 bis 24 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Kohlenwasserstoffe, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in Tabelle 1, der und den Ausführungsbeispielen 22 bis 24. Die WO2010021711 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0009] bis [0020] und [0257] bis [0317], den bis und , den Ausführungsbeispielen 2 bis 24 sowie den Ansprüchen 4, 5 und 30 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester und Wachsester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen, insbesondere in Tabelle 3, der und den Ausführungsbeispielen 2 bis 24. Die WO2009085278 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0188] bis [0192] und erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Olefine, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in der Tabelle 1 und der . Die WO2011019858 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0023], [0064] bis [0074] und [0091] bis [0099], den Ausführungsbeispielen 1 bis 13, der und dem Anspruch 8 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Alkan-1-ole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0085] bis [0090], den Ausführungsbeispielen 1 bis 13 und Tabelle 1. Die WO2009009391 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0010] bis [0019] und [0191] bis [0299], den bis , den Ausführungsbeispielen 2, 4 bis 6, 9 bis 14, 17 und 19 sowie den Ansprüchen 16, 39, 44 und 55 bis 59 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester und Alkan-1-ole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0010] bis [0019] und [0191] bis [0299], der sowie den Ausführungsbeispielen 2, 4 bis 6, 9 bis 14, 17 und 19. Die WO2008151149 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0009], [0015] bis [0033], [0053], [0071], [0174] bis [0191], [0274] und [0396], den Ansprüchen 53 bis 114, 188 bis 206 und 344 bis 355 sowie den Tabellen 1 bis 3 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen in insbesondere Tabelle 5. Die WO2008147781 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0147] bis [0156], den Ausführungsbeispielen 1 bis 3, 8, 9 und 14 sowie den Ansprüchen 65 bis 71 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Kohlenwasserstoffe, Olefine und aliphatische Ketone, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in den Ausführungsbeispielen 1 bis 3, 8, 9 und 14. Die WO2008119082 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 3 bis 5, 8 bis 10 und 40 bis 77, in den und , den Ausführungsbeispielen 2 bis 5 und 8 bis 18 sowie den Ansprüchen 3 bis 39 und 152 bis 153 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester, Triglyceride, Biodiesel, Gasolin, Flugzeugtreibstoff und Alkan-1-ole aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in der Tabelle 1, der , den Ausführungsbeispielen 2 bis 5 und 8 bis 18 sowie den Ansprüchen 124 bis 134 und 138 bis 141. Die WO2010135624 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0067] bis [0083], und [0095] bis [0098] erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Alkan-1-ole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0067] bis [0083] und [0095] bis [0098]. Zheng Z, Gong Q, Liu T, Deng Y, Chen JC und Chen GQ. (Thioesterase II of Escherichia coli plays an important role in 3-hydroxydecanoic acid production. Appl Environ Microbiol. 2004. 70(7): 3807–13) beschreiben insbesondere auf den Seiten 3808 bis 3810 und 3012 sowie Tabelle 1, 3 und 4 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester und Alkan-1-ole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen auf insbesondere den Seiten 3807 und in der Tabelle 2. Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G, Hu Z, Schirmer A, McClure A, Del Cardayre SB und Keasling JD (Microbial production of fatty-acid derived fuels and chemicals from plant biomass Nature. 2010. 463(7280): 559–62) beschreiben insbesondere in S. 559, dritter Absatz, bis S. 559, erster Absatz, erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen, insbesondere in der Supplementären Tabelle 1. Lennen RM, Braden DJ, West RA, Dumesic JA und Pfleger BF (A process for microbial hydrocarbon synthesis: Overproduction of fatty acids in Escherichia coli and catalytic conversion to alkanes. Biotechnol Bioeng. 2010. 106(2): 193–202) beschreiben insbesondere in S. 193, erster Absatz, S. 194, erster und zweiter Absatz, S. 195, zweiter Absatz bis S. 197, zweiter Absatz, S. 198, zweiter Absatz bis S. 199, dritter Absatz, erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen, insbesondere auf S. 193, erster Absatz, S. 194, erster und zweiter Absatz, S. 196, zweiter Absatz, und im Supplementären Material. Liu T, Vora H und Khosla C. (Quantitative analysis and engineering of fatty acid biosynthesis in E. coli Metab Eng. 2010 Jul; 12(4): 378–86.) beschreiben insbesondere in den Abschnitten 2.2, nd 3.1 sowie in Tabelle 1 und 2 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen, insbesondere in Tabelle 1. Yuan L, Voelker TA und Hawkins DJ. (Modification of the substrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by protein engineering. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Nov 7; 92(23): 10639–43) beschreiben insbesondere auf S. 10641, vierter Absatz, sowie in und Tabelle 1 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen, insbesondere auf S. 10639 erster Absatz, S. 10640, zweiter, dritter und letzter Absatz, S. 10641, zweiter und dritter Absatz, sowie in und Tabelle 1 und 2. Lu X, Vora H und Khosla C. (Overproduction of free fatty acids in E. coli: implications for biodiesel production. Metab Eng. 2008. 10(6): 333–9.) beschreiben insbesondere in S. 334, zweiter Absatz, den Abschnitten 2.2, 2.3 und 3 (erster bis vierter Absatz) sowie in Tabelle 1 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen, insbesondere in Abschnitt 2.2. Liu X, Sheng J und Curtiss IIII R. (Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 2011. 108(17): 6899–904) beschreiben insbesondere auf S. 6899, vierter und letzter Absatz, S. 6900, erster bis vorletzter Absatz, und in Tabelle S1 der „Supporting Information” erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ei und deren Sequenzen, insbesondere auf S. 6899, sechster und letzter Absatz.
  • Bestimmte Enzyme Eii
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung erste gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit der zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden.
  • Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G, Hu Z, Schirmer A, McClure A, Del Cardayre SB und Keasling JD (Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass. Nature. 2010. 463(7280): 559–62) beschreiben insbesondere in S. 559, dritter Absatz, bis S. 559, erster Absatz, erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eii und deren Sequenzen, insbesondere in der Supplementären Tabelle 1.
  • Lennen RM, Braden DJ, West RA, Dumesic JA und Pfleger BF (A process for microbial hydrocarbon synthesis: averproduction of fatty acids in Escherichia coli and catalytic conversion to alkanes. Biotechnol Bioeng. 2010. 106(2): 193–202) beschreiben insbesondere in S. 193, erster Absatz, S. 194, erster und zweiter Absatz, S. 195, zweiter Absatz bis S. 197, zweiter Absatz, S. 198, zweiter Absatz bis S. 199, dritter Absatz, erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eii und deren Sequenzen, insbesondere auf S. 193, erster Absatz, S. 194, erster und zweiter Absatz, S. 196, zweiter Absatz, und im Supplementären Material. Liu T, Vora H und Khosla C. (Quantitative analysis and engineering of fatty acid biosynthesis in E. coli. Metab Eng. 2010 Jul; 12(4): 378–86.) beschreiben insbesondere in den Abschnitten 2.2, und 3.1 sowie in Tabelle 1 und 2 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eii und deren Sequenzen, insbesondere in Tabelle 1. Yuan L, Voelker TA und Hawkins DJ. (Modification of the substrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by protein engineering. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Nov 7; 92(23): 10639–43) beschreiben insbesondere auf S. 10641, vierter Absatz, sowie in und Tabelle 1 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eii und deren Sequenzen, insbesondere auf S. 10639 erster Absatz, S. 10640, zweiter, dritter und letzter Absatz, S. 10641, zweiter und dritter Absatz, sowie in und Tabelle 1 und 2. Lu X, Vora H und Khosla C. (Overproduction of free fatty acids in E. coli: implications for biodiesel production. Metab Eng. 2008. 10(6): 333–9.) beschreiben insbesondere in S. 334, zweiter Absatz, den Abschnitten 2.2, 2.3 und 3 (erster bis vierter Absatz) sowie in Tabelle 1 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eii und deren Sequenzen, insbesondere in Abschnitt 2.2. Liu X, Sheng J und Curtiss IIII R. (Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 2011. 108(17): 6899–904) beschreiben insbesondere auf S. 6899, vierter und letzter Absatz, S. 6900, erster bis vorletzter Absatz, und in Tabelle S1 der „Supporting Information” erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eii und deren Sequenzen, insbesondere auf S. 6899, sechster und letzter Absatz.
  • Bestimmte Enzyme Eiii
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung erste gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit der zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden. Die WO2009121066 A1 beschreibt insbesondere in den Ansprüchen 8 bis 14 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Dicarbonsäuren, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eiii und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [00026] bis [0054], den Ausführungsbeispielen 1 bis 6, den bis und den Ansprüchen 1 bis 7. Die WO2009134899 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0079] bis [0082], dem Ausführungsbeispiel 1 und dem Anspruch 20 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Carbonsäuren, Hydroxy-Carbonsäuren und deren Lactone, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eiii und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0009] bis [0010] und [0044] bis [0078], dem Ausführungsbeispiel 1, den sowie 5 bis 8 und den Ansprüchen 15 bis 17 und 19.
  • Bestimmte Enzyme Eiv
  • In erfindungsgemäß bevorzugten Zellen stellt das Enzym Eiv eines dar, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
    Figure 00250001
    Figure 00260001
    Figure 00270001
    Figure 00280001
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms Eiv generell insbesondere die Umsetzung zu Hexansäure aus 2 Molekülen Malonyl-Coenzym A und einem Molekül Acetyl-Coenzym A verstanden wird.
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung erste gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit der zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden. Die WO2011003034 A2 beschreibt insbesondere in S. 2 bis 3, S. 5 dritter Abschnitt, in den Ausführungsbeispielen 1 bis 4, 7 bis 9 und 12 bis 14 sowie den Ansprüchen 1 bis 100 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Hexansäure aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eiv und deren Sequenzen auf insbesondere S. 5 und im Ausführungsbeispiel 3. Hitchman TS, Schmidt EW, Trail F, Rarick MD, Linz JE und Townsend CA. (Hexanoate synthase, a specialized type I fatty acid synthase in aflatoxin B1 biosynthesis. Bioorg Chem. 2001. 29(5): 293–307) beschreiben insbesondere auf S. 296, vorletzter Absatz, bis S. 298, zweiter Absatz, erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Hexansäure, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eiv und deren Sequenzen in insbesondere S. 299, vierter Absatz, bis S. 302, erster Absatz.
  • Es kann im Zusammenhang mit der ersten gentechnischen Modifikation förderlich sein, anstelle des Enzyms Ei eine Kombination der Aktivitätserhöhung verglichen zu der des Wildtyps eines Enzyms Eii gepaart mit der eines Enzyms Eiib einzusetzen, welches eine Reaktion katalysiert, in der ein CaA-Thioester in einen ACP-Thioester umgewandelt wird. Entsprechende Enzyme Eiib sind als Acyl-CoA (Coenzym A):ACP (Acyl Carrier Protein)-Transacylasen bekannt. Bevorzugte Enzyme Eiib sind ausgewählt aus
    Figure 00290001
    Figure 00300001
    Figure 00310001
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms Eiib generell insbesondere die Umsetzung von Dodecanayl-CoA-Thioester zu Dodecanoyl-ACP-Thioester verstanden wird.
  • Dritte gentechnische Modifikation für die Herstellung von Carbonsäure-Estern aus einer einfachen Kohlenstoffquelle
  • Insbesondere für die Herstellung von Carbonsäure-Estern ist es vorteilhaft, wenn der Mikroorganismus zusätzlich eine dritte gentechnische Modifikation aufweist, die eine verglichen mit der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme Eiib, Ev, Evi oder Evii umfasst. Es ist in diesem Zusammenhang erfindungsgemäß bevorzugt, dass es sich bei dieser gentechnischen Modifikation um eine verglichen zu der enzymatischen Aktivität des Wildtypes des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme handelt, ausgewählt aus der Gruppe
    Eiib Acyl-CoA (Coenzym A):ACP (Acyl Carrier Protein)-Transacylase, welche einen ACP-Thioester in einen CoA-Thioester bzw. einen CoA-Thioester in einen ACP-Thioester umwandelt,
    Ev Wachsester-Synthase oder Alkohol-O-Acyltransferase, bevorzugt der EC 2.3.1.75 oder EC 2.3.1.84, welche die Synthese eines Esters aus einem Acyl-Coenzym A-Thioester oder einem ACP-Thioester und einem Alkohol katalysiert,
    Evi Acyl-CoA(Coenzym A)-Synthetase, bevorzugt der EC 6.2.1.3, welche die Synthese eines Acyl-Coenzym A-Thioesters katalysiert, und
    Evii Acyl-Thioesterase, bevorzugt der EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.4, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20 oder EC 3.1.2.22, welche die Umsetzung eines Acyl-Thioesters mit einem Alkohol zu einem Carbonsäure-Ester katalysiert.
  • In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die dritte gentechnische Modifikation Kombinationen der gesteigerte Aktivitäten der Enzyme ausgewählt aus
    Ev, Evii, EvEvi, EviEvii, EviEviiEiib
    umfasst.
  • Bevorzugte Enzyme Eiib in Zusammenhang mit der dritten gentechnischen Modifikation entsprechen den oben als bevorzugt herausgestellten Enzymen Eiib in Zusammenhang mit der ersten gentechnischen Modifikation.
  • Bestimmte Enzyme Ev
  • In erfindungsgemäß bevorzugten Zellen stellt das Enzym Ev eines dar, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
    Figure 00320001
    Figure 00330001
    Figure 00340001
    Figure 00350001
    Figure 00360001
    Figure 00370001
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms Ev generell insbesondere die Umwandlung von Dodecanoyl-CoA-Thioester und/oder Dodecanoyl-ACP-Thioester mit Methanol zu Dodecanoyl-Methylester verstanden wird.
  • Handelt es sich bei dem Enzym Ev um eine Alkohol-O-Acyltransferase der EC 2.11.84, so ist es bevorzugt, dass diese ausgewählt sind aus:
    Figure 00380001
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms Ev generell insbesondere die Umwandlung von Dodecanoyl-CoA-Thioester mit Methanol zu Dodecanoyl-Methylester verstanden wird.
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung dritte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden. Die WO2007136762 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 2 bis 4 und 21 bis 24, den bis , den Ausführungsbeispielen 1, 2 und 5 bis 7 sowie den Ansprüchen 1, 2, 5, 6, 9 bis 27 und 33 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine dritte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester, Kohlenwasserstoffe und Alkan-1-ole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ev und deren Sequenzen insbesondere auf den Seiten 21 bis 24, in der Tabelle 10 und der .
  • Bestimmte Enzyme Evi
  • In erfindungsgemäß bevorzugten Zellen stellt das Enzym Evi eines dar, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus YP_001724804.1 (kodiert durch SEQ ID NR: 18)
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber der vorgenannten Bezugssequenz durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms Evi generell insbesondere die Synthese von Dodecanoyl-CoA-Thioester verstanden wird.
  • Bestimmte Enzyme Evii
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung dritte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden. Die WO2010075483 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0061] bis [0090] und [0287] bis [0367], den , und , den Ausführungsbeispielen 1 bis 38 sowie den Ansprüchen 18 bis 26 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine dritte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren, Fettsäuremethylester, Fettsäureethylester, Fettalkohole, Fettalkyl-Acetate, Fettaldehyde, Fettamine, Fettamide, Fettsulfate, Fettether, Ketone, Alkane, interne und terminale Olefine, Dicarbonsäuren, α,ω-Dicarbonsäuren und α,ω-Diole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Evii und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0012] bis [0060], den Tabellen 7, 17, 26 und 27, den , bis und bis , den Ausführungsbeispielen 1 bis 38 sowie den Ansprüchen 1 bis 17.
  • Vierte gentechnische Modifikation für die Herstellung von Alken-1-olen, Alkan-1-alen, Alkan-1-aminen, Alkanen, Olefinen, Alken-1-alen, Alken-1-olen und Alken-1-aminen aus einer einfachen Kohlenstoffquelle
  • Für den Fall, dass die Herstellung von Alkan-1-olen, Alkan-1-alen, Alkan-1-aminen und Olefinen gewünscht ist, kann es vorteilhaft sein, die entsprechenden Carbonsäuren bzw. -Ester, entsprechend enzymatisch zu reduzieren, zu aminieren, zu decarboxylieren oder zu decarbonylieren. Dazu weisen erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen eine vierte gentechnische Modifikation auf, die eine verglichen mit der enzymatischen Aktivität des Wildtypes des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der umfasst, ausgewählt aus der Gruppe
    Eiib Acyl-CoA (Coenzym A):ACP(Acyl Carrier Protein)-Transacylase, welche einen ACP-Thioester in einen CoA-Thioester bzw. einen CoA-Thioester in einen ACP-Thioester umwandelt,
    Evi Acyl-CoA(Coenzym A)-Synthetase, bevorzugt der EC 6.2.1.3, welche die Synthese eines Acyl-Coenzym A-Thioesters katalysiert,
    Eviii Acyl-CoA(Coenzym A)-Reduktase, bevorzugt der EC 1.2.1.42 oder EC 1.2.1.50, welche bevorzugt die Reduktion eines Acyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden Alkan-1-al oder Alkan-1-ol katalysiert,
    Eix Fettsäurereduktase (auch Fettaldehyd-Dehydrogenase oder Arylaldehyd-Oxidoreduktase), bevorzugt der EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.20 oder EC 1.2.1.48, welche bevorzugt die Reduktion einer Alkansäure zum entsprechenden Alkan-1-al katalysiert,
    Ex Acyl-ACP(Acyl Carrier Protein)-Reduktase, bevorzugt der EC 1.2.1.80, welche die Reduktion eines Acyl-ACP-Thioesters zum entsprechenden Alkan-1-al oder Alkan-1-ol katalysiert,
    Exi Cytochrom P450 Fettsäuredecarboxylase, welche die Umsetzung einer Alkansäure mit n Kohlenstoffatomen zu einem entsprechenden terminalen Olefin mit n – 1 Kohlenstoffatomen, insbesondere von Dodecansäure zu Undec-10-en-Säure katalysiert,
    Exii Alkan-1-al-Decarbonylase, welche die Umsetzung eines Alkan-1-als (n Kohlenstoffatome) zu einem entsprechenden Alkan (n – 1 Kohlenstoffatome) katalysiert, und
    Exiii Alkan-1-al-Transaminase, welche die Umsetzung eines Alkan-1-als zu einem entsprechenden Alkan-1-amin katalysiert.
  • In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die vierte gentechnische Modifikation Kombinationen an gesteigerten Aktivitäten der Enzyme ausgewählt aus
    Eix, Ex, Exi, EviEviii, EviExEiib, EviiiExii, EviiiExiii, EixExii, EixExiii, ExExii, ExExiii, EivEviiiExii, EviEviiiExiii, ExExiiEviEiib sowie ExExiiiEviEiib
    umfasst.
  • Bevorzugte Enzyme Eiib in Zusammenhang mit der vierten gentechnischen Modifikation entsprechen den oben als bevorzugt herausgestellten Enzymen Eiib in Zusammenhang mit der ersten und dritten gentechnischen Modifikation.
  • Bevorzugte Enzyme Evi in Zusammenhang mit der vierten gentechnischen Modifikation entsprechen den oben als bevorzugt herausgestellten Enzymen Evi in Zusammenhang mit der dritten gentechnischen Modifikation.
  • Bestimmte Enzyme Eviii
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung vierte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden. Die WO2011008565 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0021], [0103] bis [0106], [0108] und [0129] erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren, Fettaldehyde, Fettalkohole, Alkane und Fettsäure-Ester aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0104] bis [0106] sowie [0108] und [0129] und dem Ausführungsbeispiel 11. Die WO2008151149 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0009], [0015] bis [0037], [0053], [0071], [0171], [0174] bis [0191], [0274] und [0396], den Ansprüchen 53 bis 114, 188 bis 206 und 344 bis 355 sowie den Tabellen 1 bis 3 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0255] bis [0261] und [0269] sowie Tabellen 6 und 7. Die WO2007136762 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 2 bis 4 und 19 bis 20, den bis , den Ausführungsbeispielen 2 bis 7 sowie den Ansprüchen 4, 8 bis 27 und 33 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester, Kohlenwasserstoffe und Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen insbesondere auf den Seiten 19 bis 20, in der Tabelle 10 und der . Die WO2011019858 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0015] bis [0020], [0064] bis [0074], [0085] bis [0086] und [0092] bis [0099], den Ausführungsbeispielen 1 bis 13, der und den Ansprüchen 1 bis 14 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0004] bis [0007] und [0075] bis [0080] sowie den Ausführungsbeispielen 1 bis 13. Die WO2009140695 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0031] bis [0040], [0051] und [0214] bis [0233], den Ausführungsbeispielen 22 bis 24, der Tabelle 1, der , den Ausführungsbeispielen 5 bis 24 und 28 bis 30 sowie den Ansprüchen 29 bis 30 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Kohlenwasserstoffe, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0023] bis [0030], [0056], [0066] bis [0069] und [0193] bis [02081 der Tabelle 1, der , den Ausführungsbeispielen 5 bis 24 und 28 bis 30 sowie den Ansprüchen 69 bis 74. Die WO2011008535 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0023] bis [0024], und [0133] bis [0158], der , den Ansprüchen 39 und 45 bis 47 sowie den Ausführungsbeispielen 1 bis 5 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Carbonsäuren, Hydroxy-Carbonsäuren und deren Lactone aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0017] bis [0022], [0084] bis [0132], den bis , den Ansprüchen 31 bis 37 und 40 bis 44 sowie den Ausführungsbeispielen 1 bis 5. Die WO2010063031 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0007], [0092] bis [0100], [0181] bis [0183] und [0199] bis [0213] erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0191] bis [0194] sowie Tabellen 4 und 5. Die WO2010063032 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0007], [0092] bis [0100], [0181] bis [0183] und [0199] bis [0213] erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0191] bis [0194] sowie Tabellen 4 und 5.
  • Bestimmte Enzyme Eix
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung vierte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden. Die WO2011019858 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0004] bis [0008], [0064] bis [0074], [0085] bis [0086], [0095] bis [0099], den Ausführungsbeispielen 1 bis 13, der und dem Anspruch 7 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eix und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0008] bis [0009], [0074] und [0081] bis [0082] sowie den Ausführungsbeispielen 1 bis 13. Die WO2010135624 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0005], [0067] bis [0085] und [0092] bis [0102], den Ansprüchen 13 bis 17 und den Ausführungsbeispielen 1 bis 4 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Carbonsäuren, Hydroxy-Carbonsäuren und deren Lactone aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eix und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0005] bis [0006] und [0086] bis [0090], den bis , dem Anspruch 28 und den Ausführungsbeispielen 1 bis 4. Die WO2010062480 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0022] bis [0174] und [0292] bis [0316], den Ausführungsbeispielen 1 und 3 bis 8, der sowie den Ansprüchen 17 und 24 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eix und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0019] bis [0032] und [0263] bis [0286], der Tabelle 1, den bis sowie den Ausführungsbeispielen 1 und 3 bis 8. Die WO201042664 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0236] bis [0261], dem Ausführungsbeispiel 2, der und sowie dem Anspruch 25 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0211] bis [0233], den bis und den Ausführungsbeispielen 1 bis 2.
  • Bestimmte Enzyme Ex
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung vierte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden. Die WO2007136762 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 2 bis 4 und 19 bis 20, den bis , den Ausführungsbeispielen 2 bis 7 sowie den Ansprüchen 4, 8 bis 27 und 33 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester, Kohlenwasserstoffe und Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ex und deren Sequenzen insbesondere auf den Seiten 19 bis 20, in der Tabelle 10 und der . Die WO2011019858 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0015] bis [0020], [0064] bis [0074], [0085] bis [0086] und [0092] bis [0099], den Ausführungsbeispielen 1 bis 13, der und den Ansprüchen 1 bis 14 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ex und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0004] bis [0007] und [0075] bis [0080] sowie den Ausführungsbeispielen 1 bis 13. Die WO2009140695 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0031] bis [0040], [0051] und [0214] bis [0233], den Ausführungsbeispielen 22 bis 24, der Tabelle 1, der , den Ausführungsbeispielen 5 bis 24 und 28 bis 30 sowie dem Anspruch 29 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Kohlenwasserstoffe, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ex und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0023] bis [0030], [0056], [0066] bis [0069] und [0193] bis [0208], der Tabelle 1, der , den Ausführungsbeispielen 5 bis 24 und 28 bis 30 sowie den Ansprüchen 69 bis 74.
  • Die WO2011008535 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0023] bis [0024], und [0133] bis [0158], der , den Ansprüchen 39 und 45 bis 47 und dem Ausführungsbeispielen 1 bis 5 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Carbonsäuren, Hydroxy-Carbonsäuren und deren Lactone aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ex und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0017] bis [0022], [0084] bis [0132], den bis , den Ansprüchen 31 bis 37 und 40 bis 44 und den Ausführungsbeispielen 1 bis 5.
  • Bestimmte Enzyme Exi
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung vierte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden. Die WO2009085278 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0033] bis [0048], [0056] bis [0063] und [0188] bis [0202], der , der Tabelle 8, den Ausführungsbeispielen 5 bis 18 sowie den Ansprüchen 28 bis 51 und 188 bis 195 erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Olefine, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ex; und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0021] bis [0032], [0051] bis [0055], [0081] bis [0084] und [0160] bis [0183], der Tabelle 8, den Ausführungsbeispielen 5 bis 18, den Ansprüchen 1 bis 25 und den , und .
  • Bestimmte Enzyme Exii
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung vierte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden. Die WO2009140695 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0031] bis [0040], [0051] und [0214] bis [0233], den Ausführungsbeispielen 22 bis 24, der Tabelle 1, der , den Ausführungsbeispielen 5 bis 24 und 28 bis 30 sowie den Ansprüchen 29 bis 30 erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Kohlenwasserstoffe, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Exii und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0023] bis [0030], [0056], [0066] bis [0069] und [0193] bis [0208], der Tabelle 1, der , den Ausführungsbeispielen 5 bis 24 und 28 bis 30 sowie den Ansprüchen 69 bis 74. Die WO2008151149 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0009], [0015] bis [0037], [0053], [0071], [0171], [0174] bis [0191], [0274] und [0396], den Ansprüchen 53 bis 114, 188 bis 206 und 344 bis 355 sowie den Tabellen 1 bis 3 erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Exii und deren Sequenzen in insbesondere Tabelle 8.
  • Bestimmte Enzyme Exiii
  • Erfindungsgemäß bevorzugt handelt es sich bei dem Enzym Exiii um eine ω-Transaminase der EC 2.6.1.-. Bevorzugte Enzyme Exiii sind ausgewählt aus der Gruppe:
    Figure 00480001
    Figure 00490001
    Figure 00500001
    und besonders bevorzugt NP_901695.1, YP_353455.1,
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms Exiii generell insbesondere die Umsetzung von ω-Oxo-Laurinsäure und/oder ω-Oxo-Laurinsäuremethylester zu ω-Amino-Laurinsäure und/oder ω-Amino-Laurinsäuremethylester verstanden wird.
  • Exiv, Hilfsenzym zu Exiii
  • Es kann in bei einer erhöhten Aktivität des Enzyms Exiii förderlich sein, anstelle des Enzyms Exii alleine die Kombination eines Enzyms Exiii gepaart mit einem Enzym Exiv einzusetzen, welches die Umsetzung einer α-Keto-Carbonsäure zu einer Aminosäure katalysiert, bevorzugt ist das Enzym Exiv eine Aminosäuredehydrogenase, wie beispielsweise Serin-Dehydrogenasen, Aspartat-Dehydrogenasen, Phenylalanin-Dehydrogenasen und Glutamat-Dehydrogenasen, besonders bevorzugt eine Alanindehydrogenase der EC 1.4.1.1. Solche bevorzugten Alanindehydrogenasen sind ausgewählt aus
    Figure 00510001
    Figure 00520001
    Figure 00530001
    Figure 00540001
    Figure 00550001
    Figure 00560001
    Figure 00570001
    Figure 00580001
    Figure 00590001
    Figure 00600001
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, und zwar in einem System, bei dem Pyruvat zu Alanin umgesetzt wird.
  • Fünfte gentechnische Modifikation zur Unterdrückung des Abbaus von Carbonsäuren- und Carbonsäurederivaten
  • Erfindungsgemäß sind darüber hinaus Mikroorganismen bevorzugt, die eine fünfte gentechnische Modifikation aufweisen, die eine verglichen mit der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus verminderten Aktivität mindestens eines der Enzyme, ausgewählt aus der Gruppe
    Ea Acyl-CoA-Synthetase, bevorzugt der EC 6.2.1.3, welche die Synthese eines Acyl-Coenzym A-Thioesters katalysiert,
    Eb Acyl-CoA-Dehydrogenase, bevorzugt der EC 1.3.99.-, EC 1.3.99.3, oder EC 1.3.99.13, welche die Oxidation eines Acyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden Enoyl-Coenzym A-Thioester katalysiert,
    Ec Acyl-CoA-Oxidase, bevorzugt der EC 1.3.3.6, welche die Oxidation eines Acyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden Enoyl-Coenzym A-Thioester katalysiert,
    Ed Enoyl-CoA-Hydratase, bevorzugt der EC 4.2.1.17 oder EC 4.2.1.74, welche die Hydratisierung eines Enoyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Thioester katalysiert,
    Ee 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase, bevorzugt der EC 1.1.1.35 oder EC 1.1.1.211, welche die Oxidation eines 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden 3-Oxoacyl-Coenzym A-Thioester katalysiert und
    Ef Acetyl-CoA-Acyltransferase, bevorzugt der EC 2.3.1.16, welche den Transfer eines Acetylrestes von einem 3-Oxoacyl-Coenzym A-Thioester auf Coenzym A überträgt und somit ein um zwei Kohlenstoffatome verkürzten Acyl-Coenzym A-Thioester erzeugt,
    umfasst.
  • Dies hat den technischen Effekt, dass der Abfluss der durch die erste gentechnische Modifikation, aber auch der durch die zweite, dritte und vierte gentechnische Modifikation vermehrt gebildeten Carbonsäuren und Carbonsäurederivaten unterbunden wird.
  • Unter der Formulierung „im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität” wird vorzugsweise eine um mindestens 50% verminderte, besonders bevorzugt um mindestens 90%, darüber hinaus bevorzugt um mindestens 99.9%, darüber hinaus noch mehr bevorzugt um mindestens 99,99% und am meisten bevorzugt um mindestens 99,999% verminderte Aktivität bezogen auf die Wildtyp-Aktivität verstanden. Die Formulierung „verminderte Aktivität” beinhaltet auch keine detektierbare Aktivität („Aktivität von null”). Die Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte Mutation oder durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms erfolgen. Weitere Verfahren zur Verminderung von enzymatischen Aktivitäten in Mikroorganismen sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere molekularbiologische Techniken bieten sich hier an.
  • Anleitung zur Modifikation und Verminderung von Proteinexpressionen und damit einhergehender Enzymaktivitätsverringerung speziell für Candida, insbesondere zum Unterbrechen spezieller Gene findet der Fachmann in der WO91/006660 und WO03/100013 . Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind dadurch gekennzeichnet, dass die Verminderung der enzymatischen Aktivität erreicht wird durch Modifikation eines Genes umfassend eine Nukleinsäuresequenzen kodierend für die vorgenannten Enzyme, wobei die Modifikation ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend, bevorzugt bestehend aus, Insertion von Fremd-DNA in das Gen, Deletion mindestens von Teilen des Gens, Punktmutationen in der Gensequenz, RNA-Interferenz (siRNA), antisense-RNA oder Modifikation (Insertion, Deletion oder Punktmutationen) von regulatorischen Sequenzen, welche das Gen flankieren. Unter Fremd-DNA ist in diesem Zusammenhang jegliche DNA-Sequenz zu verstehe, die dem Gen (und nicht dem Organismus) „fremd” ist. In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass das Gen durch Insertion eines Selektionsmarkergens unterbrochen wird, somit die Fremd-DNA ein Selektionsmarkergen ist, wobei bevorzugt die Insertion durch homologe Rekombination in den Genlocus erfolgte. In diesem Zusammenhang kann es vorteilhaft sein, wenn das Selektionsmarkergen durch weitere Funktionalitäten erweitert wird, die wiederum eine anschließende Entfernung aus dem Gen ermöglichen. Dies kann beispielsweise durch dem Organismus fremde Rekombinationssysteme, wie etwa ein Cre/loxP-System oder FRT(Flippase Recognition Target)-System oder das dem Organismus eigene homologe Rekombinationssystem erreicht werden. Die Verminderung der Aktivität des erfindungsgemäßen Mikroorganismus im Vergleich zu ihrem Wildtyp wird bestimmt nach oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Aktivität unter Einsatz von möglichst gleichen Zellzahlen/-konzentrationen, wobei die Zellen unter gleichen Bedingungen wie beispielsweise Medium, Begasung, Agitation angezogen wurden.
  • Bestimmte Enzyme Ea
  • In erfindungsgemäß bevorzugten Zellen stellt das Enzym Ea eines dar, welches die Sequenz umfasst NP_416319.1 (SEQ ID NR: 18)
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms Ea generell insbesondere die Synthese von Dodecanoyl-CoA-Thioester verstanden wird.
  • Bestimmte Enzyme Eb
  • Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in den erfindungsgemäßen Zellen das Enzym Eb eines darstellt, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
    Figure 00630001
    Figure 00640001
    Figure 00650001
    Figure 00660001
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms Eb generell insbesondere die Oxidation von Dodecanoyl-CoA-Thioester zu 2-Dodecenoyl-CoA-Thioester verstanden wird.
  • Bestimmte Enzyme Ec
  • Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in den erfindungsgemäßen Zellen das Enzym Ec eines darstellt, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
    Figure 00670001
    Figure 00680001
    Figure 00690001
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms Ec generell insbesondere die Oxidation von Dodecanoyl-CoA-Thioester zu 2-Dodecenoyl-CoA-Thioester verstanden wird.
  • Bestimmte Enzyme Ed und Ee
  • Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in den erfindungsgemäßen Zellen das Enzym Ed oder Ee eines darstellt, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
    Figure 00690002
    Figure 00700001
    Figure 00710001
    Figure 00720001
    Figure 00730001
    Figure 00740001
    Figure 00750001
    Figure 00760001
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms Ed und Ee generell insbesondere die Umsetzung von 2-Dodecenoyl-CoA-Thioester zu 3-Oxo-Dodecanoyl-CoA-Thioester verstanden wird.
  • Bestimmte Enzyme Ef
  • Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in den erfindungsgemäßen Zellen das Enzym Ef eines darstellt, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
    Figure 00760002
    Figure 00770001
    Figure 00780001
    Figure 00790001
    Figure 00800001
    Figure 00810001
    Figure 00820001
    Figure 00830001
    Figure 00840001
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhag und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms Ef generell insbesondere die Reaktion von 3-Oxo-Dodecanoyl-CoA-Thioester und CoA zu Decanoyl-CoA-Thioester und Acetyl-CoA verstanden wird.
  • Sechste gentechnische Modifikation zur Verstärkung der Acyl-ACP-Thioester-Synthese
  • Erfindungsgemäß weisen die Mikroorganismen eine sechste gentechnische Modifikation auf, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Acyl-ACP-Thioester aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Ein Überblick über entsprechend wünschenswerte gentechnische Modifikationen ist der der WO2008119082 , Abschnitt 1 (Fatty Acid Production Increase/Product Production Increase) zu entnehmen. Dies hat den technischen Effekt, dass die durch die erste gentechnische Modifikation verstärkte Bildung von Carbonsäuren und Carbonsäurederivaten, aber auch von durch die zweite, dritte, vierte oder fünfte gentechnische Modifikation vermehrt gebildeten Carbonsäuren und Carbonsäurederivaten, noch weiter verstärkt wird.
  • Bevorzugte Mikroorganismen zur Herstellung von Alkan-1-olen, Alkan-1-alen, Alkan-1-aminen, Alkanen, Olefinen, Alken-1-alen, Alken-1-olen und Alken-1-aminen
  • Sollen die erfindungsgemäßen Mikroorganismen in einem Verfahren zur Herstellung von Alkan-1-den, Alkan-1-alen, Alkan-1-aminen, Alkanen, Alken-1-alen, Alken-1-olen und Alken-1-aminen und terminalen Olefinen, welche gegenenenfalls weitere Doppelbindungen enthalten verwendet werden, kann es vorteilhaft sein, wenn die erfindungsgemäßen Mikroorganismen eine siebte gentechnische Veränderung umfassend eine verglichen zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität mindestens eines Enzyms E1 aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe:
    E1B P450 Alkanhydroxylasen, welche bevorzugt die folgenden Reaktionen katalysieren: reduziertes Häm + Alkansäure(ester) = oxidiertes Häm + ω-Hydroxy-Alkansäure(ester) + H2O,
    2 reduziertes Häm + Alkansäure(ester) = 2 oxidiertes Häm + + 2H2O oder
    3 reduziertes Häm + Alkansäure(ester) = Alkanmonoxygenase + 3 oxidiertes Häm + ω-Carboxy-Alkansäure(ester) + 3H2O und bevorzugt
    Bestandteil eines Reaktionssystems bestehend aus den zwei Enzym-Komponenten „Cytochrom P450 Alkanhydroxylase und NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase der EC 1.6.2.4” oder
    Bestandteil eines Reaktionssystems bestehend aus den drei Enzym-Komponenten „Cytochrom P450 Alkanhydroxylase vom CYP153-Typ, Ferredoxin-NAD(P)+-Reduktasen der EC 1.18.1.2 oder EC 1.18.1.3 und Ferredoxin” darstellen, und
    E1b AlkB Alkanhydroxylasen der EC 1.14.15.3, welche bevorzugt die folgenden Reaktionen katalysiert: reduziertes Rubredoxin + Alkansäure(ester) = oxidiertes Rubredoxin + ω-Hydroxy-Alkansäure(ester) + H2O,
    2 reduzierte Rubredoxine + Alkansäure(ester) = 2 oxidierte Rubredoxine + ω-Oxo-Alkansäure(ester) + 2H2O oder
    3 reduzierte Rubredoxine + Alkansäure(ester) = Alkanmonoxygenase + 3 oxidierte Rubredoxine + ω-Carboxy-Alkansäure(ester) + 3H2O und bevorzugt
    Bestandteil eines Reaktionssystems bestehend aus den drei Enzym-Komponenten „AlkB Alkanhydroxylase der EC 1.14.15.3, AlkT Rubredoxin-NAD(P)+-Reduktase der EC 1.18.1.1 oder der EC 1.18.1.4 und Rubredoxin AlkG” darstellen,
    E1c Fettalkoholoxidasen der EC 1.1.3.20, welche bevorzugt mindestens eine der folgenden irreversiblen Reaktionen katalysiert:
    Alkan-1-ol + O2 = Alkan-1-al + H2O2 oder
    Alkan-1-al + O2 = Alkansäure + H2O2,
    E1d AlkJ Alkoholdehydrogenasen der EC 1.1.99.-, welche bevorzugt mindestens eine der folgenden reversiblen Reaktionen katalysiert.
    Alkan-1-ol + oxidierter Akzeptor = Alkan-1-al + reduzierter Akzeptor oder
    Alkan-1-al + oxidierter Akzeptor = Alkansäure + reduzierter Akzeptor,
    E1e Alkoholdehydrogenase der EC 1.1.1.1 oder EC 1.1.1.2, welche bevorzugt mindestens eine der folgenden reversiblen Reaktionen katalysiert:
    Alkan-1-ol + NAD(P)+ = Alkan-1-al + NAD(P)H + H+ oder
    Alkan-1-al + NAD(P)+ = Alkansäure + NAD(P)H + H+ und
    E1f Aldehyddehydrogenasen der EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4 oder EC 1.2.1.5, welche bevorzugt die folgende reversible Reaktion katalysiert:
    Alkan-1-al + NAD(P)+ = Alkansäure + NAD(P)H + H+
  • Insbesondere für die Herstellung von Alkan-1-olen kann es vorteilhaft sein, wenn die erfindungsgemäßen Mikroorganismen eine verglichen zu ihrem Wildtyp erhöhte Aktivität mindestens eines Enzyms E1e und E1f aufweisen.
  • Die WO2010062480 A2 beschreibt insbesondere in den Ausführungsbeispielen 3, 4, 6 und 7 Mikroorganismen, die verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E1e und deren Sequenzen insbesondere in der sowie den Ausführungsbeispielen 2 bis 7.
  • Sollten die erfindungsgemäßen Mikroorganismen in einem Verfahren zur Herstellung von Alkan-1-olen, Alkan-1-alen, Alkan-1-aminen und Alkanen verwendet werden, ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt, wenn die Aktivität solcher Enzyme E1a bis E1f vermindert wird, welche die oben beschriebenen Reaktionen von einem Alkan-1-al zur korrespondierenden Alkansäure katalysieren.
  • Sollten die erfindungsgemäßen Mikroorganismen in einem Verfahren zur Herstellung von Alkan-1-alen, Alkan-1-aminen, Alkanen und 1-Alkenen verwendet werden, ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt, wenn die Aktivität solcher Enzyme E1a bis E1e vermindert wird, welche die oben beschriebene Umwandlung von einem Alkan-1-al zum korrespondierenden Alkan-1-ol katalysieren.
  • Sollten die erfindungsgemäßen Mikroorganismen in einem Verfahren zur Herstellung von Alkan-1-olen verwendet werden, ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt, wenn die Aktivität solcher Enzyme E1a bis E1e vermindert wird, welche die oben beschriebene Umwandlung von einem Alkan-1-ol zum korrespondierenden Alkan-1-al katalysieren.
  • Bestimmte Enzyme E1a
  • In diesem Zusammenhang bevorzugte P450 Alkanhydroxylasen E1a sind ausgewählt aus der Liste
    Figure 00870001
    Figure 00880001
    Figure 00890001
    Figure 00900001
    Figure 00910001
    Figure 00920001
    Figure 00930001
    Figure 00940001
    Figure 00950001
    Figure 00960001
    Figure 00970001
    Figure 00980001
    Figure 00990001
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E1a generell insbesondere die Umsetzung von Laurinsäure und/oder Laurinsäuremethylester zu ω-Hydroxy-Laurinsäure und/oder ω-Hydroxy-Laurinsäuremethylester verstanden wird.
  • Bestimmte Enzyme E1b
  • Erfindungsgemäß bevorzugte AlkB Alkanhydroxylasen E1b sind ausgewählt aus der Liste
    Figure 00990002
    Figure 01000001
    Figure 01010001
    Figure 01020001
    Figure 01030001
    Figure 01040001
    Figure 01050001
    Figure 01060001
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E1b generell insbesondere die Umsetzung von Laurinsäure und/oder Laurinsäuremethylester zu ω-Hydroxy-Laurinsäure und/oder ω-Hydroxy-Laurinsäuremethylester verstanden wird.
  • Bestimmte Enzyme E1c
  • In diesem Zusammenhang bevorzugte eukaryotische Fettalkoholoxidasen E1c sind ausgewählt aus der Liste
    Figure 01070001
    Figure 01080001
    Figure 01090001
    Figure 01100001
    sowie
    Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60%, bevorzugt bis zu 25%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100% Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E1c generell insbesondere die Umsetzung von Dodekan-1-ol zu Dodekan-1-al bzw. Dodekan-1-al zu Dodekansäure verstanden wird.
  • Bestimmte Enzyme E1d
  • Solche bevorzugten AlkJ Alkoholdehydrogenasen sind ausgewählt aus
    Figure 01110001
    Figure 01120001
    Figure 01130001
    Figure 01140001
    Figure 01150001
    darstellt
    und die Carbonsäure und Carbonsäurederivate eine Kohlenstoffkettenlänge des Carbonsäureteils aufweisen, wie in der folgenden Tabelle dargestellt:
    Enzym Ei ausgewählt aus Kohlenstoffkettenlänge
    AAC49269.1, CAB60830.1, AAC49179.1, AAC49784.1, ABB71579.1, CAC19934.1 sowie die SEQ ID NR: 26, 29, 33, 38, 40, 97 und 99 der WO2011008565 C8
    AAC49269.1, CAB60830.1, AAC49179.1, AAC49784.1, ABB71579.1, CAC19934.1 sowie die SEQ ID NR: 73, 75, 87 und 89 der WO2011008565. C10
    Q41635.1, Q39473.1, AAC49180.1, CAC19934.1, AAC72881.1, AAC49783.1, AAC49784.1 sowie die SEQ ID NR: 49 und 51 der WO2011008565 . C12
    Q41635.1, Q39473.1, AAC49180.1, CAC19934.1, AAC72881.1 AAC49783.1, AAC49784.1 sowie die SEQ ID NR: 49, 51, 53, 55, 61, 63, 67, 69, 77, 79, 83 und 85 der WO2011008565 . C14
  • Die oben erwähnten Deletionen von Aminosäurereste gegenüber den in der obigen Tabelle durch Verweise angegebenen Sequenzen beziehen sich insbesondere auf Deletionen am N- und/oder C-Terminus, insbesondere am N-Terminus. Besonders bevorzugt handelt es sich bei vorgenanntem N-Terminus um den einer pflanzlichen Plastiden-Targeting-Sequenz. Solche pflanzlichen Plastiden-Targeting-Sequenzen lassen sich zum Beispiel mit Hilfe der durch das Vorhersage-Tool TargetP 1.1 (www.cbs.dtu.dklservices/TargetP/) benutzten und in den folgenden Veröffentlichungen beschriebenen Algorithmen, bevorzugt ohne Verwendung von cutoffs, vorhersagen:
    Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence. Olof Emanuelsson, Henrik Nielsen, Søren Brunak and Gunnar von Heijne. J. Mol. Biol., 300: 1005–1016, 2000 und Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Søren Brunak and Gunnar von Heijne. Protein Engineering, 10: 1–6, 1997.
  • Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte Mikroorganismen (abgekürzt MO) sind hervorragend geeignet für die Produktion von Carbonsäuren und weisen in der folgenden Tabelle beschriebene erhöhte bzw. erniedrigte Enzymaktivitäten (abgekürzt E) auf, wobei diese zusätzlich vorteilhaft kombiniert sein können mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erhöhten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die 3-Ketoacyl-ACP(Acyl Carrrier Protein)-Synthase III (EC 2.3.1.41), insbesondere jene aus Pflanzen, bevorzugt jene aus Pflanzen, deren Samen Fettsäuren mit Alkylresten kürzer als 14 C-Atome enthalten, und besonders bevorzugt jene aus Pflanzen der Gattungen Cuphea, Elaeis, Cocos, Umbellularia und Cinnamomum sowie Genprodukte ausgewählt aus AccA, AccB, AccC, AccD, AceE, AceF, Lpd, AcpP, FabA, FabB, FabD, FabF, FabG, FabH, FabI, FabZ, PanD, PanK, UdhA, PntA oder PntB. Es können beliebige Kombinationen von mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten vorteilhaft erhöht werden. Zusätzlich vorteilhaft kann es des weiteren sein, wenn der Mikroorganismus mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erniedrigten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die Genprodukte ausgewählt aus TdcE, PflA, PflB, PflC, PflD, PoxB, YgfG, AckA, AckB, TdcD, Pta, LdhA, AdhE, MgsA, FdnG, FdnH, FdnI, FdhF, FdoG, FdoH, FdoI, PrpC, PrpD, PrpF, PrpB, TdcD, Pdc, PorA, PorB, PorC, PorD, AlsS, IlvB, IlvM, IlvN, IlvG, IlvI, IlvH, AlsD, ButB, Thl, ThlA, ThlB, PhaA, PhaB, Crt, BdhA, BdhB, Adc, Adh, CtfB, AtoA, AtoD, LdhL, GltA, FabR, FhuA, Dld, LldA oder LldP, einzeln oder in beliebiger Kombination, ausgestattet ist.
    Figure 01180001
  • Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte Mikroorganismen (abgekürzt MO) sind hervorragend geeignet für die Produktion von Carbonsäure-Estern und weisen in der folgenden Tabelle beschriebene erhöhte bzw. erniedrigte Enzymaktivitäten (abgekürzt E) auf, wobei diese zusätzlich vorteilhaft kombiniert sein können mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erhöhten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die 3-Ketoacyl-ACP(Acyl Carrrier Protein)-Synthase III (EC 2.3.1.41), insbesondere jene aus Pflanzen, bevorzugt jene aus Pflanzen, deren Samen Fettsäuren mit Alkylresten kürzer als 14 C-Atome enthalten, und besonders bevorzugt jene aus Pflanzen der Gattungen Cuphea, Elaeis, Cocos, Umbellularia und Cinnamomum sowie Genprodukte ausgewählt aus AccA, AccB, AccC, AccD, AceE, AceF, Lpd, AcpP, FabA, FabB, FabD, FabF, FabG, FabH, FabI, FabZ, PanD, PanK, UdhA, PntA oder PntB. Es können beliebige Kombinationen von mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten vorteilhaft erhöht werden. Zusätzlich vorteilhaft kann es des weiteren sein, wenn der Mikroorganismus mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erniedrigten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die Genprodukte ausgewählt aus TdcE, PflA, PflB, PflC, PflD, PoxB, YgfG, AckA, AckB, TdcD, Pta, LdhA, AdhE, MgsA, FdnG, FdnH, FdnI, FdhF, FdoG, FdoH, FdoI, PrpC, PrpD, PrpF, PrpB, TdcD, Pdc, PorA, PorB, PorC, PorD, AlsS, IlvB, IlvM, IlvN, IlvG, IlvI, IlvH, AlsD, ButB, Thl, ThlA, ThlB, PhaA, PhaB, Crt, BdhA, BdhB, Adc, Adh, CtfB, AtoA, AtoD, LdhL, GltA, FabR, FhuA, Dld, LldA oder LldP, einzeln oder in beliebiger Kombination, ausgestattet ist.
    Figure 01190001
    Figure 01200001
    Figure 01210001
    Figure 01220001
    Figure 01230001
  • Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte Mikroorganismen (abgekürzt MO) sind hervorragend geeignet für die Produktion von Alkan-1-olen und Alkan-1-alen und weisen in der folgenden Tabelle beschriebene erhöhte bzw. erniedrigte Enzymaktivitäten (abgekürzt E) auf, wobei diese zusätzlich vorteilhaft kombiniert sein können mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erhöhten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die 3-Ketoacyl-ACP(Acyl Carrrier Protein)-Synthase III (EC 2.3.1.41), insbesondere jene aus Pflanzen, bevorzugt jene aus Pflanzen, deren Samen Fettsäuren mit Alkylresten kürzer als 14 C-Atome enthalten, und besonders bevorzugt jene aus Pflanzen der Gattungen Cuphea, Elaeis, Cocos, Umbellularia und Cinnamomum sowie Genprodukte ausgewählt aus AccA, AccB, AccC, AccD, AceE, AceF, Lpd, AcpP, FabA, FabB, FabD, FabF, FabG, FabH, FabI, FabZ, PanD, PanK, UdhA, PntA oder PntB. Es können beliebige Kombinationen von mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten vorteilhaft erhöht werden. Zusätzlich vorteilhaft kann es des weiteren sein, wenn der Mikroorganismus mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erniedrigten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die Genprodukte ausgewählt aus TdcE, PflA, PflB, PflC, PflD, PoxB, YgfG, AckA, AckB, TdcD, Pta, LdhA, AdhE, MgsA, FdnG, FdnH, FdnI, FdhF, FdoG, FdoH, FdoI, PrpC, PrpD, PrpF, PrpB, TdcD, Pdc, PorA, PorB, PorC, PorD, AlsS, IlvB, IlvM, IlvN, IlvG, IlvI, IlvH, AlsD, ButB, Thl, ThlA, ThlB, PhaA, PhaB, Crt, BdhA, BdhB, Adc, Adh, CtfR, AtoA, AtoD, LdhL, GltA, FabR, FhuA, Dld, LldA oder LldP, einzeln oder in beliebiger Kombination, ausgestattet ist.
    Figure 01240001
    Figure 01250001
    Figure 01260001
    Figure 01270001
    Figure 01280001
  • Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte Mikroorganismen (abgekürzt MO) sind hervorragend geeignet für die Produktion von Alkanen und weisen in der folgenden Tabelle beschriebene erhöhte bzw. erniedrigte Enzymaktivitäten (abgekürzt E) auf, wobei diese zusätzlich vorteilhaft kombiniert sein können mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erhöhten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die 3-Ketoacyl-ACP(Acyl Carrrier Protein)-Synthase III (EC 2.3.1.41), insbesondere jene aus Pflanzen, bevorzugt jene aus Pflanzen, deren Samen Fettsäuren mit Alkylresten kürzer als 14 C-Atome enthalten, und besonders bevorzugt jene aus Pflanzen der Gattungen Cuphea, Elaeis, Cocos, Umbellularia und Cinnamomum sowie Genprodukte ausgewählt aus AccA, AccB, AccC, AccD, AceE, AceF, Lpd, AcpP, FabA, FabB, FabD, FabF, FabG, FabH, FabI, FabZ, PanD, PanK, UdhA, PntA oder PntB. Es können beliebige Kombinationen von mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten vorteilhaft erhöht werden. Zusätzlich vorteilhaft kann es des weiteren sein, wenn der Mikroorganismus mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erniedrigten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die Genprodukte ausgewählt aus TdcE, PflA, PflB, PflC, PflD, PoxB, YgfG, AckA, AckB, TdcD, Pta, LdhA, AdhE, MgsA, FdnG, FdnH, FdnI, FdhF, FdoG, FdoH, FdoI, PrpC, PrpD, PrpF, PrpB, TdcD, Pdc, PorA, PorB, PorC, PorD, AlsS, IlvB, IlvM, IlvN, IlvG, IlvI, IlvH, AlsD, ButB, Thl, ThlA, ThlB, PhaA, PhaB, Crt, BdhA, BdhB, Adc, Adh, CtfB, AtoA, AtoD, LdhL, GltA, FabR, FhuA, Dld, LldA oder LldP, einzeln oder in beliebiger Kombination, ausgestattet ist.
    Figure 01290001
    Figure 01300001
    Figure 01310001
    Figure 01320001
    Figure 01330001
  • Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte Mikroorganismen (abgekürzt MO) sind hervorragend geeignet für die Produktion von terminalen Olefinen und weisen in der folgenden Tabelle beschriebene erhöhte bzw. erniedrigte Enzymaktivitäten (abgekürzt E) auf, wobei diese zusätzlich vorteilhaft kombiniert sein können mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erhöhten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die 3-Ketoacyl-ACP(Acyl Carrrier Protein)-Synthase III (EC 2.3.1.41), insbesondere jene aus Pflanzen, bevorzugt jene aus Pflanzen, deren Samen Fettsäuren mit Alkylresten kürzer als 14 C-Atome enthalten, und besonders bevorzugt jene aus Pflanzen der Gattungen Cuphea, Elaeis, Cocos, Umbellularia und Cinnamomum sowie Genprodukte ausgewählt aus AccA, AccB, AccC, AccD, AceE, AceF, Lpd, AcpP, FabA, FabB, FabD, FabF, FabG, FabH, FabI, FabZ, PanD, PanK, UdhA, PntA oder PntB. Es können beliebige Kombinationen von mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten vorteilhaft erhöht werden. Zusätzlich vorteilhaft kann es des weiteren sein, wenn der Mikroorganismus mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erniedrigten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die Genprodukte ausgewählt aus TdcE, PflA, PflB, PflC, PflD, PoxB, YgfG, AckA, AckB, TdcD, Pta, LdhA, AdhE, MgsA, FdnG, FdnH, FdnI, FdhF, FdoG, FdoH, FdoI, PrpC, PrpD, PrpF, PrpB, TdcD, Pdc, PorA, PorB, PorC, PorD, AlsS, IlvB, IlvM, IlvN, IIvG, IlvI, IlvH, AlsD, ButB, Thl, ThlA, ThlB, PhaA, PhaB, Crt, BdhA, BdhB, Adc, Adh, CtfB, AtoA, AtoD, LdhL, GltA, FabR, FhuA, Dld, LldA oder LldP, einzeln oder in beliebiger Kombination, ausgestattet ist.
    Figure 01340001
    Figure 01350001
  • Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte Mikroorganismen (abgekürzt MO) sind hervorragend geeignet für die Produktion von Alkan-1-aminen und weisen in der folgenden Tabelle beschriebene erhöhte bzw. erniedrigte Enzymaktivitäten (abgekürzt E) auf, wobei diese zusätzlich vorteilhaft kombiniert sein können mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erhöhten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die 3-Ketoacyl-ACP(Acyl Carrrier Protein)-Synthase III (EC 2.3.1.41), insbesondere jene aus Pflanzen, bevorzugt jene aus Pflanzen, deren Samen Fettsäuren mit Alkylresten kürzer als 14 C-Atome enthalten, und besonders bevorzugt jene aus Pflanzen der Gattungen Cuphea, Elaeis, Cocos, Umbellularia und Cinnamomum sowie Genprodukte ausgewählt aus AccA, AccB, AccC, AccD, AceE, AceF, Lpd, AcpP, FabA, FabB, FabD, FabF, FabG, FabH, FabI, FabZ, PanD, PanK, UdhA, PntA oder PntB. Es können beliebige Kombinationen von mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten vorteilhaft erhöht werden. Zusätzlich vorteilhaft kann es des weiteren sein, wenn der Mikroorganismus mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erniedrigten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die Genprodukte ausgewählt aus TdcE, PflA, PflB, PflC, PflD, PoxB, YgfG, AckA, AckB, TdcD, Pta, LdhA, AdhE, MgsA, FdnG, FdnH, FdnI, FdhF, FdoG, FdoH, Fdo, PrpC, PrpD, PrpF, PrpB, TdcD, Pdc, PorA, PorB, PorC, PorD, AlsS, IlvB, IlvM, IlvN, IlvG, IlvI, IlvH, AlsD, ButB, Thl, ThlA, ThlB, PhaA, PhaB, Crt, BdhA, BdhB, Adc, Adh, CtfB, AtoA, AtoD, LdhL, GltA, FabR, FhuA, Dld, LldA oder LldP, einzeln oder in beliebiger Kombination, ausgestattet ist.
    Figure 01360001
    Figure 01370001
    Figure 01380001
    Figure 01390001
    Figure 01400001
    Figure 01410001
    Figure 01420001
    Figure 01430001
    Figure 01440001
  • Verwendung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der vorgenannten Mikroorganismen zur Herstellung von organischen Substanzen, insbesondere von Fettsäuren, Fettsäureestern, Alkan-1-alen, Alkan-1-olen und Alkan-1-aminen, Alken-1-alen, Alken-1-olen, Alken-1-aminen, Alkanen und Alkenen, insbesondere 1-Alkenen, welche gegebenenfalls eine weitere Doppelbindung aufweisen können. Im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Mikroorganismen als bevorzugte organische Substanzen und bevorzugte Mikroorganismen herausgestellte sind im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verwendung ebenfalls bevorzugt. Welche erfindungsgemäßen Organismen bevorzugt für bestimmte organische Substanzen verwendet werden, ist im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Mikroorganismen bereits hervorgehoben.
  • Verfahren zur Herstellung einer organischen Substanz aus einer einfachen Kohlenstoffquelle
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer organischen Substanz, insbesondere von Fettsäuren, Fettsäureestern, Alken-1-alen, Alken-1-olen und Alkan-1-aminen, Alken-1-alen, Alken-1-olen, Alken-1-aminen, Alkanen und Alkenen, insbesondere 1-Alkenen, welche gegebenenfalls eine weitere Doppelbindung aufweisen können, aus einer einfachen Kohlenstoffquelle umfassend die Verfahrensschritte
    • I) in Kontakt Bringen eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus mit einem Medium beinhaltend die einfache Kohlenstoffquelle,
    • II) Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen, die es dem Mikroorganismus ermöglichen aus der einfachen Kohlenstoffquelle die organische Substanz zu bilden und
    • III) gegebenenfalls Isolierung der gebildeten organischen Substanz.
  • In dem erfindungsgemäßen Verfahren können die erfindungsgemäßen Mikroorganismen kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder repeated-fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion der organischen Substanz mit dem Nährmedium in Kontakt gebracht und somit kultiviert werden. Denkbar ist auch ein semi-kontinuierliches Verfahren, wie es in der GB-A-1009370 beschrieben wird. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) oder im Lehrbuch von Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben. Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. in dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugte erfindungsgemäße Mikoorganismen bevorzugt eingesetzt. Als einfache Kohlenstoffquelle werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren die oben als bevorzugt genannten eingesetzt. Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, Ammoniak, Ammoniumhydroxid oder Ammoniakwasser verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogen-phosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden. Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen.
  • Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dieses in einem Zwei-Phasen-System durchgeführt, beinhaltend
    • A) eine wässrige Phase, sowie
    • B) eine organische Phase,
    wobei die Bildung der organischen Substanz durch den Mikroorganismus im Verfahrensschritt II) in der wässrigen Phase erfolgt und sich die gebildete organische Substanz in der organischen Phase anreichert. Auf dieses Weise ist es möglich, die gebildete organische Substanz in situ zu extrahieren. Bevorzugte organische Substanzen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, sind die oben als bevorzugt genannten Substanzen, insbesondere die Fettsäuren und Fettsäurederivate.
  • In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll. Welche erfindungsgemäßen Organismen bevorzugt in bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren für bestimmte organische Substanzen eingesetzt werden, ist im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Mikroorganismen bereits hervorgehoben.
  • Beispiele:
  • Beispiel 1: Herstellung eines E. coli-Expressionsvektors für die Überexpression des Gens alkL aus P. putida GPo1
  • Zur Herstellung eines E. coli-Expressionsvektors für die Überexpression des Pseudomonas putida-Gens alkL (SEQ ID NR: 01) wurde dieses Gen synthetisch hergestellt und dann wie der Promotor Placuv5 (SEQ ID NR: 34) aus einem pJ294-Derivat unter Einbringung homologer Bereiche zur Rekombinationsklonierung amplifiziert. Gleichzeitig wurden über die verwendeten Oligonukleotide eine Schnittstelle stromaufwärts des Promotors und eine Schnittstelle stromabwärts des Stopcodons von alkL eingeführt. Bei der Amplifikation des Gens alkL und des Promotors Placuv5 aus den jeweiligen pJ294-Derivaten als Matrize kamen folgende Oligonukleotide zum Einsatz: Promotorbereich:
    Figure 01480001
  • Folgende Parameter wurden für die PCR eingesetzt: 1×: initiale Denaturierung, 98°C, 0:30 min; 35×: Denaturierung, 98°C, 0:30 min, Annealing, 50,5°C, 0:45 min; Elongation, 72°C, 0:15 min; 1×: terminale Elongation, 72°C, 5 min. Für die Amplifikation wurde der PhusionTM High-Fidelity Master Mix von New England Biolabs (Frankfurt) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Jeweils 100 μl der PCR-Reaktionen wurden anschließend auf einem 2%igen Agarosegel aufgetrennt. Die Durchführung der PCR, der Agarosegel-Elektrophorese, Ethidiumbromidfärbung der DNA und Bestimmung der PCR-Fragmentgrößen erfolgte in dem Fachmann bekannter Art und Weise. In beiden Fällen konnten PCR-Fragmente der erwarteten Größe amplifiziert werden. Diese betrug für den Promotorbereich 654 Basenpaare und für das alkL-Konstrukt 728 Basenpaare. Zur Isolierung der DNA aus einem Agarosegel wurde die Ziel-DNA mit einem Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten und mit dem „Quick Gel Extraktion Kit” von Qiagen (Hilden) aufgereinigt. Die Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Im nächsten Schritt wurden die PCR-Produkte zusammen mit dem BamHI-KpnI-geschnittenen pCDFDuet-1 (71340-3, Merck, Darmstadt) mittels in vitro-Klonierung unter Verwendung des „In-Fusion Advantage PCR Cloning Kits” von Clontech (Saint-Germain-en-Laye) unter Erhalt des resultierenden Vektors rekombiniert. Die Verwendung entsprach den Empfehlungen des Herstellers.
  • pCDFDuet-1 ist ein E. coli-Vektor, der in dem Organismus eine Spectinomycin/Streptomycin-Resistenz vermittelt sowie einen ColDF13 Replikationsursprung trägt. Die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5α-Zellen (New England Biolabs, Frankfurt) erfolgte in dem Fachmann bekannter Art und Weise. Die Richtigkeit des Plasmids wurde durch eine Restriktionsanalyse mit XbaI kontrolliert. Die Authentizität der inserierten Fragmente wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft. Der fertiggestellte E. coli-Expressionsvektor wurden als pCDF[alkL] (SEQ ID NR: 07) bezeichnet.
  • Beispiel 2: Herstellung von Expressionsvektoren für die Gene fatB2 und fatB1 aus Cuphea hookeriana sowie fatB2 aus Cuphea palustris
  • Zur Herstellung von Expressionsvektoren für die Gene fatB2 und fatB1 aus Cuphea hookeriana (SEQ ID NR. 08 bzw. SEQ ID NR. 09) bzw. fatB2 aus Cuphea palustris (SEQ ID NR. 10) wurden diese Gene für die Expression in Escherichia coli codonoptimiert. Die Gene wurden zusammen mit einem tac-Promotor synthetisiert und gleichzeitig eine Schnittstelle stromaufwärts des Promotors und eine Schnittstelle stromabwärts des Terminators eingeführt. Die synthetisierten DNA-Fragmente Ptac-ChFatB2, Ptac-ChFatB1 und Ptac-CpFatB2, wurden mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und NotI verdaut und in den entsprechend geschnittenen Vektor pJ294 (DNA 2.0 Inc.; Menlo Park, CA, USA) ligiert. Die fertiggestellten E. coli-Expressionsvektoren wurden als pJ294[Ptac-ChFATS2_optEc] (SEQ ID NR. 11), pJ294[Ptac-CpFATB2_optEc] (SEQ ID NR. 12) und pJ294[Ptac-ChFATB1_optEc] (SEQ ID NR. 13) bezeichnet.
  • Beispiel 3: Chromatografische Quantifizierung von Produkten
  • Die Quantifizierung von Fettsäuren erfolgte nach Derivatisierung als Fettsäuremethylester mittels Gaschromatografie. Zu den Proben, bestehend aus 2 ml Kulturbrühe, wurden nach Zugabe von 1 ml Aceton und 2 ml Wasser 50 μl Heptadecansäure (10 g/l gelöst in Ethanol) als interne Referenzsubstanz zugesetzt. Die Proben wurden mit 200 μl Essigsäure angesäuert und mit 10 ml einer 1:1 (v/v) Chloroform/Methanol-Mischung versetzt. Die Proben wurden mindestens 1 min kräftig durchmischt. Anschließend wurde die Chloroformphase entnommen und eingedampft. Der trockene Rückstand wurde in 1 ml 1,25 M methanolischer Salzsäure aufgenommen und zur Veresterung der enthaltenen Fettsäuren bei 50°C über Nacht inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 ml gesättigter Natriumcarbonatlösung abgestoppt (alle Substanzen Sigma-Aldrich, Steinheim). Die Extraktion der Fettsäuremethylester erfolgte durch Zugabe von 1 ml n-Heptan und 15 sekündiges kräftiges Durchmischen. Die Heptanphase wurde mittels Gaschromatografie vermessen. Für die Trennung von Fettsäuremethylestern wurde die Kapillarsäule SPTM-2560 mit den Maßen 100 m × 0,25 mm und einer Filmdicke von 0,2 um (Supelco, Sigma-Aldrich, Steinheim) als stationäre Phase eingesetzt. Als Trägergas wurde Helium verwendet. Die Trennung erfolgte innerhalb von 45 min mit einer Injektortemperatur von 260°C, Detektortemperatur von 260°C und Säulentemperatur von 140°C zu Beginn, gehalten für 5 min und erhöht auf 240°C mit einer Rate von 4°C/min und gehalten für 15 min. Das Injektionsvolumen betrug 1 μl, die Splitrate 1:20 und der Durchfluss des Trägergases 1 ml/min. Die Detektion erfolgte mittels Flammenionisationsdetektor (GC Perkin Elmer Clarus 500, Perkin Elmer, Rodgau). Heptadecansäure (Sigma-Aldrich, Steinheim) wurde als interne Referenzsubstanz zur Quantifizierung der Fettsäuremethylester verwendet. Die Referenzsubstanzen C8:0-Me Caprylsäuremethylester, C10:0-Me Caprinsäuremethylester, C12:0-Me Laurinsäuremethylester, C14:0-Me Myristinsäuremethylester, C16:0-Me Palmitmnsäuremethylester, C16:1-Me Palmitoleinsäuremethylester, 018:0-Me Stearinsäuremethylester, C18:1-Me Ölsäuremethylester (GLC Standard Mix GLC-20 1892-1AMP, GLC-30 1893-1AMP, GLC-50 1894-1AMP, Sigma-Aldrich, Steinheim) wurden zur Kalibrierung verwendet. Die unteren Bestimmungsgrenzen lagen für alle Fettsäuremethylester bei einer Konzentration von 10 mg/l.
  • Beispiel 4: Produktion von Fettsäuren durch E. coli-Stämme mit Deletion im Gen fadE, welcher die Gene alkL aus Pseudomonas putida GPo7 in verschiedenen Modifikationen und faFB2 aus Cuphea hookeriana überexprimiert.
  • Zunächst wurde ein E. coli Stamm mit Deletion im Gen fadE (SEQ ID NR. 14) konstruiert. Zur Herstellung der Gendeletion wurde ein Plasmid konstruiert, welches die DNA-Sequenz ΔfadE (SEQ ID Nr. 15) trägt. Diese Sequenz wurde synthetisiert und besteht aus homologen Bereichen 500 Basenpaare stromaufwärts und stromabwärts des fadE-Gens sowie der Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease NotI am 5'- und 3'-Ende. Die Sequenz ΔfadE wurde mit der Restriktionsendonuclease NotI verdaut und in den entsprechend geschnittenen Vektor pKO3 ligiert. Die Konstruktion des Stammes E. coli W3110 ΔfadE erfolgte mit Hilfe des pKO3-ΔfadE Konstruktes (SEQ ID NR. 16) mit dem Fachmann bekannten Methoden (siehe Link AJ, Phillips D, Church GM. J. Bacteriol. 1997. 179(20).). Die DNA-Sequenz nach Deletion ist in SEQ ID NR. 17 wiedergegeben. Zur Erzeugung von E. coli-Stämmen mit dem Expressionsvektor für das Gen alkL aus Pseudomonas putida GPo1 in Kombination mit dem Expressionsvektor für das Gen fatB2 aus Cuphea hookeriana wurden elektrokompetente Zellen von E. coli W3110 ΔfadE hergestellt. Dies geschah in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise. Diese wurden mit den Plasmiden pCDFDuet-1 oder pCDF[alkL] in Kombination mit pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc] transformiert und auf LB-Platten mit Spectinomycin (100 μg/ml) und Ampicillin (100 μg/ml) ausplattiert. Transformanten wurden durch Plasmidpräparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Präsenz der korrekten Plasmide überprüft. So wurden folgende E. coli-Stämme erzeugt:
    • • E. coli W3110 ΔfadE pCDFDuet-1/pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc]
    • • E. coli W3110 ΔfadE pCDF[alkL]/pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc]
  • Diese Stämme wurden verwendet, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Fettsäuren zu untersuchen. Dabei wurde wie folgt vorgegangen:
    Die Stämme wurden einem mehrstufigen aeroben Kultivierungsprozess unterzogen. Die zu untersuchenden Stämme wurden zunächst in Luria-Bertani Bouillon nach Miller (Merck, Darmstadt) als 5 ml-Vorkultur aus je einer Einzelkolonie angezogen. Der nächste Kultivierungsschritt erfolgte in M9-Medium. Das Medium, bestehend aus 38 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat, 22 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 8,6 mM Natriumchlorid, 37 mM Ammoniumchlorid, 2% (w/v) Glucose, 2 mM Magnesiumsulfat-Heptahydrat (alle Substanzen von Merck, Darmstadt) und 0,1% (v/v) Spurenelemente-Lösung, wurde mit 25%iger Ammoniumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die zugegebene Spurenelemente-Lösung bestehend aus 9,7 mM Mangan(II)chlorid-Tetahydrat, 6,5 mM Zinksulfat-Heptahydrat, 2,5 mM Natrium-EDTA (Titriplex 111), 4,9 mM Borsäure, 1 mM Natriummolybdat-Dihydrat, 32 mM Calciumchlorid-Dihydrat, 64 mM Eisen(II)sulfat-Heptahydrat und 0,9 mM Kupfer(II)chlorid-Dihydrat gelöst in 37%iger Salzsäure (alle Substanzen von Merck, Darmstadt), wurde vor Zugabe in das M9-Medium sterilfiltiert. 10 ml M9-Medium wurden mit 100 μg/ml Spectinomycin und 100 μg/ml Ampicillin in 100 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikane vorgelegt und mit 0,5 ml aus der Vorkultur inokuliert. Die Kultivierung erfolgte bei 37°C und 200 U/min in einem Inkubationsschüttler. Nach einer Kultivierungsdauer von 8 Stunden wurden 50 ml M9-Medium mit 100 μg/ml Spectinomycin und 100 μg/ml Ampicillin in einem 250 ml Erlenmeyerkolben mit Schikane vorgelegt und mit der 10 ml-Kultur inokuliert, so dass eine optische Dichte (600 nm) von 0,2 erreicht wurde. Die Kultivierung erfolgte bei 30°C und 200 U/min in einem Inkubationsschüttler. Bei Erreichen einer optischen Dichte (600 nm) von 0,4 bis 0,5 wurde die Genexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert (Zeitpunkt t0). Die Stämme wurden mindestens weitere 24 Stunden bei gleichbleibenden Bedingungen kultiviert. Während der Kultivierung wurden Proben von 2 ml entnommen und die Konzentration von Fettsäuren unterschiedlicher Kohlenstoffkettenlängen analog zu Beispiel 3 quantifiziert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Tabelle 1: Produktion von Fettsäuren mit E. coli W3110 ΔfadE, der fafB2 aus C. hookeriana sowie alkL aus P. putida GPo1 überexprimiert. Angegeben sind die Konzentrationen von Fettsäuren unterschiedlicher Kohlenstoffkettenlänge nach 29 Stunden Inkubation.
    Figure 01520001
  • Somit wurde gezeigt, dass die Stämme mit alkL wesentlich mehr Caprylsäure, Caprinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Stearinsäure und Ölsäure bilden, als die Stämme ohne alkL. Das zeigt, dass die Verstärkung von alkL förderlich für die Herstellung von Fettsäuren verschiedener Kettenlänge und Sättigungsgrade aus nicht verwandten Kohlenstoffquellen ist.
  • Beispiel 5: Herstellung eines E. coli-Expressionsvektors für die Gene fadD aus Escherichia coli und atfA aus Acinetobacter sp. ADP1
  • Zur Herstellung des E. coli-Expressionsvektors für die Gene fadD (SEQ ID NR: 18) aus Escherichia coli und atfA mit Terminator (SEQ ID NR: 19) aus Acinetobacter sp. ADP1 unter Kontrolle eines tac-Promotor wurden diese Gene aus chromosomaler DNA von E. coli W3110 bzw. Acinetobacter calcoaceticus ADP1 per PCR unter Einbringung homologer Bereiche zur Rekombinationsklonierung amplifiziert. Der synthetische fac-Promotor (SEQ ID NR: 20) wurde mit Ribosombindungsstelle aus einem pJ294-Derivat unter Einbringung homologer Bereiche amplifiziert. Die Präparation der chromosomalen DNA von E. coli W3110 bzw. Acinetobacter calcoaceticus ADP1 erfolgte mittels DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers. Bei der Amplifikation der Gene fadD aus E. coli sowie atfA aus Acinetobacter sp. ADP1 mit chromosomaler DNA von E. coli W3110 bzw. Acinetobacter calcoaceticus ADP1 als Matrize, sowie der Amplifikation des synthetischen Promotors Ptac aus einem pJ294-Derivat kamen folgende Oligonukleotide zum Einsatz: Ptac:
    Figure 01530001
    fadD [E. coli]:
    Figure 01530002
    atfA [Acinetobacter sp. ADP1]:
    Figure 01530003
  • Folgende Parameter wurden für die PCR eingesetzt: 1×: initiale Denaturierung, 103°C, 3:00 min; 35×: Denaturierung, 98°C, 0:10 min, Annealing, 65°C, 0:15 min; Elongation, 72°C, 0:45 min; 1×: terminale Elongation, 72°C, 10 min. Für die Amplifikation wurde der PhusionTM High-Fidelity Master Mix von New England Biolabs (Frankfurt) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Jeweils 50 μl der PCR-Reaktionen wurden anschließend auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt. Die Durchführung der PCR, der Agarose-Gelelektrophorese, Ethidiumbromidfärbung der DNA und Bestimmung der PCR-Fragmentgrößen erfolgte in dem Fachmann bekannter Art und Weise. In allen Fällen konnten PCR-Fragmente der erwarteten Größe amplifiziert werden. Diese betrugen für den Promotorbereich Ptac 607 bp, für fadD 1778 bp und für atfA 1540 bp, Zur Isolierung der DNA aus einem Agarosegel wurde die Ziel-DNA mit einem Skalpell aus dem Gel isoliert und mit dem Quick Gel Extraktion Kit von Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt. Die aufgereinigten PCR-Produkte wurden mit dem EcaNI/NdeI-geschnittenen Vektor pCDFDuetTM-1 (71340-3, Merck, Darmstadt) mittels in-vitro Klonierung unter Verwendung des Geneart Seamless Cloning and Assembly Kit der Firma Invitrogen (Darmstadt) rekombiniert. Die Verwendung entsprach den Empfehlungen des Herstellers. pCDFDuet-1 ist ein E. coli-Vektor, der in dem Organismus eine Spectinomycin/Streptomycin-Resistenz vermittelt sowie einen ColDF13 Replikationsursprung trägt. Die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5α-Zellen (New England Biolabs, Frankfurt) erfolgte in dem Fachmann bekannter Art und Weise. Die Richtigkeit des Plasmids wurde durch eine Restriktionsanalyse mit XbaI kontrolliert. Die Authentizität der inserierten Fragmente wurde mittels DNA-Sequenzierung überprüft. Der fertig gestellte E. coli-Expressionsvektor wurde als pCDF[fadD-atfA] (SEQ ID NR: 27), bezeichnet.
  • Beispiel 6: Herstellung eines E. coli-Expressionsvektors für die Gene fadD aus Escherichia coli, atfA aus Acinetobacter sp. ADP1 und alkL aus Pseudomonas putida GPo1
  • Zur Herstellung eines E. coli-Expressionsvektors für die Gene fadD aus Escherichia coli, atfA aus Acinetobactersp. ADP1 und alkL aus Pseudomonas putida GPo1 wird das Plasmid pCDF[alkL] (SEQ ID NR: 07) mit FseI und XhoI verdaut, um im Anschluß das Fragment, welches das alkL-Gens aus Pseudomonas putida GPo1 unter Kontrolle des Placuv5-Promotors trägt (siehe Beispiel 1), zu isolieren.
  • Das verdaute Plasmid wird zu diesem Zweck auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt. Die Durchführung der Restriktionsverdaus, der Agarose-Gelelektrophorese, Ethidiumbromidfärbung der DNA und Bestimmung der Restriktionsfragmentgrößen erfolgt in dem Fachmann bekannter Art und Weise. Zur Isolierung der DNA aus einem Agarosegel wird die Ziel-DNA mit einem Skalpell aus dem Gel isoliert und mit dem Quick Gel Extraktion Kit von Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt. Das aufgereinigte Restriktionsfragment wird anschließend mit dem ebenfalls mit FseI und XhoI geschnittenen Vektor-Fragment (7290 bp) von pCDF[fadD-atfA] (SEQ ID NR: 27) ligiert. Ligation des DNA-Fragments und Transformation chemisch kompetenter E. coli DHSa-Zellen (New England Biolabs, Frankfurt) erfolgen in dem Fachmann bekannter Art und Weise. Die Richtigkeit der entstandenen Plasmide wird durch eine Restriktionsanalyse mit FseI und XhoI kontrolliert. Die Authentizität der inserierten Fragmente wird mittels DNA-Sequenzierung überprüft. Der fertig gestellte E. coli-Expressionsvektor wird als pCDF[fadD-atfA]-[alkL] (SEQ ID NR: 28), bezeichnet.
  • Beispiel 7: Chromatografische Quantifizierung von Produkten
  • Die Quantifizierung von Fettsäureestern erfolgt mittels Gaschromatografie. Zu den Proben, bestehend aus 1 ml Kulturbrühe, werden nach Zugabe von 100 μl Heptadecansäuremethylester-Lösung (5 g/l gelöst in Aceton) 1,1 ml n-Heptan zugegeben und die Proben dann 15 Sekunden kräftig gevortexed Durchmischen. Die Heptanphase wird mittels Gaschromatografie vermessen. Für die Trennung von Fettsäuremestern wird die Kapillarsäule SPTM-2560 mit den Maßen 100 m × 0,25 mm und einer Filmdicke von 0,2 μm (Supelco, Sigma-Aldrich, Steinheim) als stationäre Phase eingesetzt. Als Trägergas wird Helium verwendet. Die Trennung erfolgt innerhalb von 45 min mit einer Injektortemperatur von 260°C, Detektortemperatur von 260°C und Säulentemperatur von 140°C zu Beginn, gehalten für 5 min und erhöht auf 240°C mit einer Rate von 4°C/min und gehalten für 15 mm. Das Injektionsvolumen beträgt 1 μl, die Splitrate 1:20 und der Durchfluss des Trägergases 1 ml/min. Die Detektion erfolgt mittels Flammenionisationsdetektor (GC Perkin Elmer Clarus 500, Perkin Elmer, Rodgau). Heptadecansäuremethylester (Sigma-Aldrich, Steinheim) wird als interne Referenzsubstanz zur Quantifizierung der Fettsäureester verwendet. Die Referenzsubstanzen 08:0-Me Caprylsäuremethylester, C10:0-Me Caprinsäuremethylester, C12:0-Me Laurinsäuremethylester, C14:0-Me Myristinsäuremethylester, C16:0-Me Palmitinsäuremethylester, C16:1-Me Palmitoleinsäuremethylester, C18:0-Me Stearinsäuremethylester, C18:1-Me Ölsäuremethylester (GLC Standard Mix GLC-20 1892-1AMP, GLC-30 1893-1AMP, GLC-50 1894-1AMP; Sigma-Aldrich, Steinheim) C8:0-Et Caprylsäureethylester, C10:0-Et Caprinsäureethylester, C12:0-Et Laurinsäureethylester, C14:0-Et Myristinsäureethylester, C16:0-Et Palmitinsäureethylester, C18:0-Et Stearinsäureethylester, C18:1-Et Ölsäureethylester (alle von Sigma-Aldrich, Steinheim) und C16:1-Et Palmitoleinsäureethylester (Biomol, Hamburg) werden zur Kalibrierung verwendet. Die unteren Bestimmungsgrenzen liegen für alle Fettsäureester bei einer Konzentration von 10 mg/l.
  • Beispiel 8: Produktion von Fettsäureestern durch E. coli-Stämme mit Deletion im Gen fadE, welcher die Gene alkL aus Pseudomonas putida GPo1, fatB2 aus Cuphea hookeriana, fadD aus E. coli und atfA aus Acinetobacter sp. ADP1 überexprimiert.
  • Zur Erzeugung von E. coli-Stämmen mit dem Expressionsvektor für die Gene alkL aus Pseudomonas putida GPo1, fadD aus Escherichia coli und atfA aus Acinetobacter sp. ADP1 aus Pseudomonas putida GPo1 in Kombination mit dem Expressionsvektor für das Gen fatB2 aus Cuphea hookeriana werden elektrokompetente Zellen von E. coli W3110 ΔfadE (siehe Beispiel 4) hergestellt. Dies geschah in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise. Diese werden mit den Plasmiden pCDF[fadD-atfA] (SEQ ID NR: 27) bzw. pCDF[fadD-atfA]-[alkL] (SEQ ID NR: 28) in Kombination mit pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc] (SEQ ID NR. 11), pJ294[Ptac-CpFATB2_optEc] (SEQ ID NR: 12) bzw. pJ294[Ptac-ChFATB1_aptEc] (SEQ ID NR: 13) transformiert und auf LB-Platten mit Spectinomycin (100 μg/ml) und Ampicillin (100 μg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Präsenz der korrekten Plasmide überprüft. So werden folgende E. coli-Stämme erzeugt:
    • • E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-/pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc]
    • • E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-[alkL]/pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc]
    • • E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]/pJ294[Ptac-CpFATB2_optEc]
    • • E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-[alkL]/pJ294[Ptac-CpFATB2_optEc]
    • • E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]/pJ294[Ptac-ChFATB1_optEc]
    • • E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-[alkL]/pJ294[Ptac-ChFATB1_optEc]
  • Diese Stämme werden verwendet, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Fettsäureestern zu untersuchen. Dabei wird wie folgt vorgegangen:
    Die Stämme werden einem mehrstufigen aeroben Kultivierungsprozess unterzogen. Die zu untersuchenden Stämme werden zunächst in Luria-Bertani Bouillon nach Miller (Merck, Darmstadt) als 5 ml-Vorkultur aus je einer Einzelkolonie angezogen. Der nächste Kultivierungsschritt erfolgt in M9-Medium. Das Medium, bestehend aus 38 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat, 22 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 8,6 mM Natriumchlorid, 37 mM Ammoniumchlorid, 2% (w/v) Glucose, 2 mM Magnesiumsulfat-Heptahydrat (alle Substanzen von Merck, Darmstadt) und 0,1% (v/v) Spurenelemente-Lösung, wird mit 25%iger Ammoniumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die zugegebene Spurenelemente-Lösung bestehend aus 9,7 mM Mangan(II)chlorid-Tetahydrat, 6,5 mM Zinksulfat-Heptahydrat, 2,5 mM Natrium-EDTA (Titriplex III), 4,9 mM Borsäure, 1 mM Natriummolybdat-Dihydrat, 32 mM Calciumchlorid-Dihydrat, 64 mM Eisen(II)sulfat-Heptahydrat und 0,9 mM Kupfer(II)chlorid-Dihydrat gelöst in 37%iger Salzsäure (alle Substanzen von Merck, Darmstadt), wird vor Zugabe in das M9-Medium sterilfiltiert. 10 ml M9-Medium werden mit 100 μg/ml Spectinomycin und 100 μg/ml Ampicillin in 100 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikane vorgelegt und mit 0,5 ml aus der Vorkultur inokuliert. Die Kultivierung erfolgt bei 37°C und 200 U/min in einem Inkubationsschüttler, Nach einer Kultivierungsdauer von 8 Stunden werden 50 ml M9-Medium mit 100 μg/ml Spectinomycin und 100 μg/ml Ampicillin in einem 250 ml Erlenmeyerkolben mit Schikane vorgelegt und mit der 10 ml-Kultur inokuliert, so dass eine optische Dichte (600 nm) von 0,2 erreicht wird. Die Kultivierung erfolgt bei 30°C und 200 U/min in einem Inkubationsschüttler. Bei Erreichen einer optischen Dichte (600 nm) von 0,4 bis 0,5 wird die Genexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert (Zeitpunkt t0). Die Stämme werden mindestens weitere 24 Stunden bei gleichbleibenden Bedingungen kultiviert. Während der Kultivierung werden Proben von 2 ml entnommen und die Konzentration von Fettsäuremethylestern bzw. Fettsäureethylestern unterschiedlicher Kohlenstoffkettenlängen analog zu Beispiel 7 quantifiziert. Dabei wird gezeigt, dass die Stämme E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-/pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc] und E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-[alkL]/pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc] vor allem in der Lage sind, C8:0-Me Caprylsäuremethylester, C10:0-Me Caprinsäuremethylester, C16:0-Me Palmitinsäuremethylester, C16:1-Me Palmitoleinsäuremethylester und C18:1-Me Ölsäuremethylester (bei Zugabe von Methanol) bzw. C8:0-Et Caprylsäureethylester, C10:0-Et Caprinsäureethylester, C16:0-Et Palmitinsäureethylester, C16:1-Et Palmitoleinsäureethylester und C18:1-Et Ölsäureeethylester (bei Zugabe von Ethanol) zu bilden.
  • Weiterhin wird gezeigt, dass die Stämme E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-/pJ294[Ptac-CpFATB2_optEc] und E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-[alkL]/pJ294Ptac-CpFATB2_optEc] vor allem in der Lage sind, C12:0-Me Laurinsäuremethylester, C14:0-Me Myristinsäuremethylester, C16:0-Me Palmitinsäuremethylester, C16:1-Me Palmitoleinsäuremethylester, C18:0-Me Stearinsäuremethylester und C18:1-Me Ölsäuremethylester (bei Zugabe von Methanol) bzw. C12:0-Et Laurinsäureethylester, C14:0-Et Myristinsäureethylester, C16:0-Et Palmitinsäureethylester, C16:1-Et Palmitoleinsäureethylester und C18:1-Et Ölsäureeethylester (bei Zugabe von Ethanol) zu bilden. Weiterhin wird gezeigt, dass die Stämme E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-/pJ294[Ptac-ChFATB1_optEc] und E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-[alkL]/pJ294[Ptac-ChFATB1_optEc] vor allem in der Lage sind, C14:0-Me Myristinsäuremethylester, C16:0-Me Palmitinsäuremethylester, C16:1-Me Palmitoleinsäuremethylester, C18:0-Me Stearinsäuremethylester und C18:1-Me Ölsäuremethylester (bei Zugabe von Methanol) bzw. C14:0-Et Myristinsäureethylester, C16:0-Et Palmitinsäureethylester, C16:1-Et Palmitoleinsäureethylester und C18:1-Et Ölsäureeethylester (bei Zugabe von Ethanol) zu bilden. Schließlich wird gezeigt, dass die in diesem Beispiel benannten Stämme E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-[alkL]/pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc], E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-[alkL]/pJ294[Ptac-CpFATB2_optEc] und E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]-[alkL]/pJ294[Ptac-ChFATB1_optEc]t, wesentlich mehr der jeweiligen Fettsäuremethylester (bei Zugabe von Methanol) bzw. Fettsäureethylester (bei Zugabe von Ethanol bilden), als die Stämme E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]/pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc], E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]/pJ294[Ptac-CpFATB2_optEc] und E. coli W3110 ΔfadE pCDF[fadD-atfA]/pJ294[Ptac-ChFATB1_optEc], Das zeigt, dass die Verstärkung des alkL-Genproduktes förderlich für die Herstellung von Fettsäureestern mit verschiedenen Kettenlängen der Alkylkette sowohl des Fettsäure- als auch des Alkoholrestes der Fettsäureester bzw. unterschiedlichem Sättigungsgrad der Alkylkette der Fettsäure aus nicht verwandten Kohlenstoffquellen ist. SEQUENCE LISTING
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Claims (13)

  1. Mikroorganismus, der eine erste gentechnische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp mehr organische Substanz aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermag, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus eine zweite gentechnische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp mehr alkL-Genprodukt bildet.
  2. Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Carbonsäuren, insbesondere mit 3 bis 34 Kohlenstoffatomen Carbonsäureester, insbesondere mit 3 bis 34 Kohlenstoffatomen im Carbonsäureanteil, bei denen die Alkoholkomponente sich ableitet von Methanol, Ethanol oder anderen primären Alkoholen mit 3-18 Kohlenstoffatomen, Alkane mit 3 bis 34 Kohlenstoffatomen, Alkane mit 3 bis 34 Kohlenstoffatomen, einwertige Alkohole mit 3 bis 34 Kohlenstoffatomen, Aldehyde mit 3 bis 34 Kohlenstoffatomen, einwertige Amine mit 3 bis 34 Kohlenstoffatomen, sowie substituierte Verbindungen der vorgenannten Gruppenmitglieder, die insbesondere als weitere Substituenten einen oder mehrer Hydroxy-, Amin-, Keto-, Carboxyl-, Methyl-, Ethyl-, Cyclopropyl- oder Epoxy-Funktionen tragen.
  3. Mikroorganismus gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe der Fettsäuren, Fettsäureester, Alkan-1-ale, Alkan-1-ole und Alkan-1-amine, Alkane und Alkene, insbesondere 1-Alkene.
  4. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das alkL-Genprodukt kodiert wird von alkL-Genen aus gramnegativen Bakterien, insbesondere der Gruppe enthaltend, bevorzugt bestehend aus Pseudomonas sp., Azotobacter sp., Desulfitobacterium sp., Burkholderia sp., bevorzugt Burkholderia cepacia, Xanthomonas sp., Rhodobacter sp., Ralstonia sp., Delftia sp. und Rickettsia sp., Oceanicaulis sp., Caulobacter sp., Marinobacter sp. und Rhodopseudomonas sp., bevorzugt Pseudomonas putida, Oceanicaulis alexandrii, Mariobacter aquaeolei, insbesondere Pseudomonas putida GPo1 und P1, Oceanicaulis alexandrii HTCC2633, Caulobacter sp. K31 und Marinobacter aquaeolei VT8.
  5. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das alkL-Genprodukt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteine kodiert durch SEQ ID NR. 1 und SEQ ID NR. 3 und Proteine mit Polypeptidsequenz SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 30, SEQ ID NR. 31, SEQ ID NR. 32 und SEQ ID NR. 33 und Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60% der Aminosäurereste gegenüber SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 30, SEQ ID NR. 31, SEQ ID NR. 32 oder SEQ ID NR. 33 durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50% der Aktivität des Proteins mit der jeweiligen Bezugssequenz SEQ ID NR. 2, Nr. 30, SEQ ID NR. 31, SEQ ID NR. 32 oder SEQ ID NR. 33 besitzen.
  6. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus der Gruppe der gram-negativen Bakterien.
  7. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der ersten gentechnischen Modifikation um eine verglichen zu der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme handelt, ausgewählt aus der Gruppe Ei Acyl-ACP-Thioesterase, bevorzugt der EC 3.1.2.14 oder EC 3.1.2.22, Eii Acyl-CoA-Thioesterase, bevorzugt der EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 1.2.20 oder EC 3.12.22, Eiib Acyl-CoA:ACP-Transacylase, Eiii Polyketidsynthase, welche eine Reaktion katalysiert, die an der Synthese von Carbonsäuren und Carbonsäure-Estern mitwirkt, und Eiv Hexansäuresynthase.
  8. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er eine dritte gentechnische Modifikation aufweist, die eine verglichen mit der enzymatischen Aktivität des Wildtypes des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme Eiib, Ev, Evi oder Evii ausgewählt aus der Gruppe Eiib Acyl-CoA:ACP-Transacylase, Ev Wachsester-Synthase oder Alkohol-O-Acyltransferase, bevorzugt der EC 2.3.1.75 oder EC 2.3.1.84, Evi Acyl-CoA-Synthetase, bevorzugt der EC 6.2.1.3, und Evii Acyl-Thioesterase, bevorzugt der EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.4, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20 oder EC 3.1.2.22, umfasst.
  9. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er eine vierte gentechnische Modifikation aufweist, die eine verglichen mit der enzymatischen Aktivität des Wildtypes des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme Eiib, Ev, Evi oder Evii ausgewählt aus der Gruppe Eiib Acyl-CoA:ACP-Transacylase, Evi Acyl-CoA-Synthetase, bevorzugt der EC 6.2.1.3, Eviii Acyl-CoA-Reduktase, bevorzugt der EC 1.2.1.42 oder EC 1.2.1.50, Eix Fettsäurereduktase, bevorzugt der EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.20 oder EC 1.2.1.48, Ex Acyl-ACP-Reduktase, bevorzugt der EC 1.2.1.80, Exi Cytochrom P450 Fettsäuredecarboxylase, welche die Umsetzung einer Alkansäure mit n Kohlenstoffatomen zu einem entsprechenden terminalen Olefin mit n – 1 Kohlenstoffatomen, insbesondere von Dodecansäure zu Undec-10-en-Säure katalysiert, Exii Alkan-1-al-Decarbonylase, welche die Umsetzung eines Alkan-1-als (n Kohlenstoffatome) zu einem entsprechenden Alkan (n – 1 Kohlenstoffatome) bzw. terminalen Olefin (n – 1 Kohlenstoffatome) katalysiert, und Exiii Alkan-1-al-Transaminase, welche die Umsetzung eines Alkan-1-als zu einem entsprechenden Alkan-1-amin katalysiert. umfasst.
  10. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er neben der ersten und zweiten gentechnischen Modifikation eine fünfte gentechnische Modifikation enthält, die eine verglichen mit der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus verminderten Aktivität mindestens eines der Enzyme, ausgewählt aus der Gruppe Ea Acyl-CoA-Synthetase (EC 6.2.1.3), welche die Synthese eines Acyl-Coenzym A-Thioesters katalysiert, Eb Acyl-CoA-Dehydrogenase (EC 1.3.99.-, EC 1.3.99.3, EC 1.3.99.13), welche die Oxidation eines Acyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden Enoyl-Coenzym A-Thioester katalysiert, Ec Acyl-CoA-Oxidase (EC 1.3.3.6), welche die Oxidation eines Acyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden Enoyl-Coenzym A-Thioester katalysiert, Ed Enoyl-CoA-Hydratase (EC 4.2.1.17, EC 4.2.1.74), welche die Hydratisierung eines Enoyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Thioester katalysiert, Ef 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase (EC 1.1.1.35, EC 1.1.1.211), welche die Oxidation eines 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden 3-Oxoacyl-Coenzym A-Thioester katalysiert und Eg Acetyl-CoA-Acyltransferase (EC 2.3.1.16), welche den Transfer eines Acetylrestes von einem 3-Oxoacyl-Coenzym A-Thioester auf Coenzyme A überträgt und somit ein um zwei Kohlenstoffatome verkürzten Acyl-Coenzym A-Thioester erzeugt, aufweist.
  11. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er eine siebte gentechnische Veränderung umfassend eine verglichen zu seinem Wildtyp verminderte Aktivität mindestens eines Enzyms E1, ausgewählt aus der Gruppe E1 P450 Alkanhydroxylasen, E1b AlkB Alkanhydroxylasen der EC 1.14.15.3, E1c Fettalkoholoxidasen der EC 1.1.3.20, E1d AlkJ Alkoholdehydrogenasen der EC 1.1.99.-, E1e Alkoholdehydrogenase der EC 1.1.1.1 oder EC 1.1.1.2 und E1f Aldehyddehydrogenasen der EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4 oder EC 1.2.1.5 aufweist.
  12. Verwendung eines Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche zur Herstellung von organischen Substanzen, insbesondere von Fettsäuren, Fettsäureestern, Alkan-1-alen, Alkan-1-olen und Alkan-1-aminen, Alken-1-alen, Alken-1-olen, Alken-1-aminen, Alkanen und Alkenen, insbesondere 1-Alkenen, welche gegebenenfalls eine weitere Doppelbindung aufweisen können.
  13. Verfahren zur Herstellung einer organischen Substanz, Fettsäuren, Fettsäureestern, Alkan-1-alen, Alkan-1-olen und Alkan-1-aminen, Alken-1-alen, Alken-1-olen, Alken-1-aminen, Alkanen und Alkenen, insbesondere 1-Alkenen, welche gegebenenfalls eine weitere Doppelbindung aufweisen können, aus einer einfachen Kohlenstoffquelle umfassend die Verfahrensschritte I) in Kontakt Bringen eines Mikroorganismus gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einem Medium beinhaltend die einfache Kohlenstoffquelle, II) Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen, die es dem Mikroorganismus ermöglichen aus der einfachen Kohlenstoffquelle die organischen Substanz zu bilden und III) gegebenenfalls Isolierung der gebildeten organischen Substanz.
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