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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen und eine Anordnung zur Durchführung des Verfahrens.
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Eine wesentliche Aufgabe der modernen Mikrobiologie besteht darin, Probenmaterial daraufhin zu untersuchen, ob es pathogene Erreger enthält. Eine solche Untersuchung auf pathogene Erreger umfasst im Wesentlichen zwei Dinge,
- – die Bestimmung der Identität des Erregers bzw. Mikroorganismus (z. B. E. coli, Staph. aureus)
- – die Bestimmung der Resistenz gegenüber Antibiotika (im Falle von pathogenen Erregern), wobei die Angabe einer erforderlichen minimalen Hemmkonzentration (MHK) wünschenswert ist.
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Wesentliche Herausforderung bei diesen Bestimmungen ist zum einen die eindeutige Bestimmung von einer großen Zahl verschiedener Erreger (ca. 3000 Spezies) und einer großen Zahl bekannter Antibiotika (> 30). Zum anderen ist eine wesentliche Anforderung die schnelle Bekanntgabe eines Testergebnisses, welche derzeit insbesondere für den Fall der Resistenztestung im Bereich von 24–48 Stunden liegt.
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Die o. g. Untersuchungen auf Erreger-Identität (ID testing) sowie Resistenztestung (AST, antimicrobial susceptibility testing) können heutzutage manuell oder automatisch durchgeführt werden. Eine automatisierte Lösung wird auch von Siemens angeboten (Produktname Microscan).
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Das Funktionsprinzip der o. g. Untersuchungen beruht auf der Anzüchtung von bakteriellen Kolonien in kleinen Schalen, die spezifische Nährmedien (Substrate) enthalten. Teilweise werden den spezifischen Nährmedien auch Antibiotika mit verschiedenen Konzentrationen zugemischt. Die Nährmedien sind so ausgelegt, dass eine Verstoffwechslung der (oftmals transparenten) Substrate durch wachsende Bakterienkolonien eine optische Änderung auslöst, die von einer optischen Detektionseinheit gemessen werden kann. Die optische Änderung besteht zum einen in Farbumschlägen – daher der Begriff bunte Reihe – zum anderen aber auch in einer Zunahme der optischen Dichte durch sich vermehrende Bakterien – sogenannte Bakterienhöfe.
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein alternatives Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen und eine Anordnung zur Durchführung des Verfahrens anzugeben, welches einen effizienteren und schnelleren Nachweis als die oben genannten Verfahren ermöglicht.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren nach Anspruch 1 und die Anordnung nach Anspruch 9 gelöst
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Erfindungsgemäß erfolgt der Nachweis von Mikroorganismen, indem diese bebrütet (inkubiert) werden und anschließend die (gasförmigen) Metabolite der Mikroorganismen mit einem Massenspektrometer gemessen werden.
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Im Allgemeinen stellt Massenspektrometrie ein Mittel zum ”Wiegen” von individuellen Molekülen bereit, indem die Moleküle im Vakuum ionisiert werden und durch Verdampfen zum ”Fliegen” gebracht werden. Unter dem Einfluss von Kombinationen von elektrischen und magnetischen Feldern folgen die Ionen Flugbahnen in Abhängigkeit von ihrer individuellen Masse und Ladung. Auf dem Gebiet von Molekülen mit niedriger Molekülmasse ist Massenspektrometrie seit langem ein Bestandteil des routinemäßigen physikalisch-organischen Repertoires zur Analyse und Charakterisierung organischer Moleküle durch die Bestimmung der Masse des Stammmolekülions. Zusätzlich wird, indem Kollisionen dieses Stammmolekülions mit anderen Partikeln (z. B. Argonatomen) veranlasst werden, das Molekülion durch die so genannte Kollisions-induzierte Dissoziation (CID) fragmentiert, wobei sekundäre Ionen gebildet werden. Das Fragmentierungsmuster bzw. der Fragmentierungsweg ermöglicht oftmals, detaillierte Strukturinformation abzuleiten. Aufgrund der anscheinenden analytischen Vorteile von Massenspektrometrie bei der Bereitstellung einer hohen Detektionsempfindlichkeit, der Genauigkeit der Massemessungen und der Geschwindigkeit als auch einer Online-Datenübertragung auf einen Computer bestehen erhebliche Vorteile bei der Verwendung von Massenspektrometrie für die Analyse von kleinen Molekülen.
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Verfahren der Massenspektrometrie sind beispielsweise Elektrospray/Ionenspray (ESI), Ionen-Zyklotron-Resonanz (ICR) und matrixassistierte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI). MALDI-Massenspektrometrie kann verbessert werden, wenn eine Flugzeit-(time-of-flight, TOF)-Konfiguration als Massenanalysator verwendet wird. Für die Analyse von gasförmigen Komponenten (VOC's, volatile organic compounds) stehen spezielle Systeme wie das PTR-MS (proton transfer reaction) zur Verfügung.
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Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe, aufweisend die folgenden Schritte:
- a) Inkubieren der Probe unter Bedingungen, unter welchen Wachstum und/oder Stoffwechsel der Mikroorganismen stattfinden kann;
- b) Auffangen von gasförmigen Metaboliten der Mikroorganismen und weiterleiten in ein Massenspektrometer; und
- c) Nachweis von mindestens einem gasförmigen Metabolit durch Analyse im Massenspektrometer.
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Die Mikroorganismen sind bevorzugt Bakterien.
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Gemäß einem Aspekt der Erfindung kann die Probe mit einem Substrat in Kontakt gebracht werden. Dieses Substrat kann z. B. ein Nährstoff oder ein Wachstumsmedium sein, der geeignet ist, Wachstum und/oder Stoffwechsel der Mikroorganismen zu begünstigen.
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Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist dem Substrat eine wachstumshemmende Substanz zugesetzt, die auf bestimmte Mikrorganismen wachstumshemmend oder toxisch wirkt. Dies kann z. B. ein Antibiotikum sein.
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Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist dem Substrat eine isotopenmarkierte Substanz zugesetzt.
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Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist die isotopenmarkierte Substanz eine wachstumshemmende Substanz oder ein Nährstoff. Der Nährstoff kann z. B. ein Kohlehydrat, eine Aminosäure, ein Nukleotid, ein Nukleosid, ein Salz, ein Lipid oder ähnliches sein.
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Gemäß einem Aspekt der Erfindung erfolgt der Nachweis quantitativ. Dadurch kann z. B. eine Konzentration, eine relative oder eine absolute Stoffmenge gemessen werden. Quantitative Massenspektrometrieverfahren sind dem Fachmann bekannt.
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Gemäß einem Aspekt der Erfindung erfolgt eine Mehrzahl von Nachweisen über einen bestimmten Zeitraum. Ferner kann gemäß diesem Aspekt der Erfindung aus der zeitabhängigen Konzentrationsänderung des nachgewiesenen mindestens einen gasförmigen Metabolits eine Wachstumskurve bestimmt werden.
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Die Erfindung betrifft ferner eine Anordnung zum Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe, aufweisend:
- a) ein Gefäß, in welchem die Probe und optional ein Substrat aufgenommen werden kann;
- b) Mittel zum Inkubieren der Probe unter Bedingungen, unter welchen Wachstum und/oder Stoffwechsel der Mikroorganismen stattfinden kann;
- c) Mittel zum Auffangen von gasförmigen Metaboliten der Mikroorganismen sowie eine Leitung zum Weiterleiten der gasförmigen Metabolite in ein Massenspektrometer; und
- d) das Massenspektrometer zum Nachweis von mindestens einem gasförmigen Metabolit.
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Als Gefäß ist z. B. eine Petrischale, ein Probenröhrchen, eine Probenflasche oder ähnliches geeignet.
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Die Probe kann z. B. in einem Brutschrank bei 37°C inkubiert werden. Dies ist ein Beispiel für Bedingungen, unter welchen Wachstum und/oder Stoffwechsel der Mikroorganismen stattfinden kann.
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Als Mittel zum Auffangen von gasförmigen Metaboliten ist eine Auffangglocke, ein Ansaugrohr oder ähnliches geeignet. Geräte, welche automatisiert gasförmige Probenvolumina aufnehmen können, werden z. B. kommerziell als sogenannte Headspace Sampler angeboten.
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Beschreibung der Erfindung.
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Die Erfindung wird im Folgenden beispielhaft und in Zusammenhang mit den angehängten Figuren beschrieben, welche zeigen:
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1: eine Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens; und
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2: Wachstumskurven von Mikroorganismen:
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Die nachzuweisenden Mikroorganismen, z. B. Bakterien werden in einem Substrat, z. B. auf einem Nährmedium ausgebracht. Solche Nährmedien, z. B. auf Agarosebasis sind dem Fachmann bekannt.
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Die zu inkubierenden Bakterien können sich alternativ bereits in einem zu kultivierenden Medium befinden (z. B. Blut oder Urin).
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Die gasförmigen Metabolite sind typischerweise flüchtige organische Komponenten (VOC, volatile organic compounds) und können mit speziellen Massenspektrometern, denen eine Abtasteinheit vorgeschaltet ist (headspace sampler), gemessen werden. Diese speziellen Massenspektrometer zeichnen sich durch eine schonende Ionisierungsform aus, z. B. PTR-MS (Protonen-Transfer-Reaktion), so dass die gasförmigen Moleküle sehr sensitiv gemessen werden können (ppb bis ppt, part per billion bis part per trillion).
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Dem Nährmedium der Bakterienkultur kann vorab ein Nährstoff (z. B. Glucose oder Aminosäuren) hinzugefügt werden, das Isotopen-gekoppelt (gelabelt) ist. Angedacht sind insbesondere das Isotop C13 bzw. das Isotop N15. Durch den Zusatz von Isotopen-gekoppelten Substraten wird es bei einer Messung möglich sein, eindeutig auf den Stoffwechsel von Bakterien zurückzuschließen, weil z. B. das gemessene CO2 der Umgebungsluft im Massenspektrum vorwiegend C12 enthält, während das von wachsenden Bakterien abgegebene CO2 im Falle von Isotopen gekoppelten Substraten C13 enthalten wird. Ähnliches würde z. B. für Ammoniak gelten. Das Prinzip der Erfindung basierend auf der Verstoffwechselung von Substraten, die sich in fester bzw. flüssiger Phase des Nährmediums befinden und in die Umgebungsluft (gasförmige Phase) abgegeben werden, ist in 1 skizziert:
In der erfindungsgemäßen Anordnung 1 wird eine Probe mit Bakterien 23 auf einem Substrat 13, welches ein Nährmedium sein kann, ein einem Probengefäß 11 (z. B. einer Petrischale) ausgebracht.
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Aus dem Substrat 13 nehmen die Bakterien 13 einen Nährstoff 25 (z. B. Isotopen-gekoppelte C13-Glucose) auf und geben entsprechend als Metabolit 27 C13-markiertes CO2 in die Gasphase ab.
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Über eine Auffangvorrichtung 15 mit Dichtung 17 und eine Leitung 19 wird dieses an ein Massenspektrometer 21 zur Analyse geleitet.
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Bei der Messung des Stoffwechsels mit Hilfe eines Massenspektrometers ist hilfreich, die Konzentration der Markergase (z. B. CO2) in regelmäßigen zeitlichen Abständen zu messen. Der Nachweis von Isotopen gekoppelten Metaboliten wird insbesondere dann wichtig sein, wenn eine hohe Messgenauigkeit erforderlich ist.
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Durch die Messung der gasförmigen Metabolite einer Bakterienkolonie kann nämlich nachgewiesen werden, wie die Bakterien wachsen. Dabei ist von Interesse, ob die Mikroorganismen lediglich überleben (linearer Verbrauch) oder sich vermehren (exponentieller Verbrauch), weil letzteres auf erfolgreiche Zellteilung hinweist.
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Alternativ ist auch der Nachweis eines nicht stattfindenden Substratverbrauchs bzw. eines nicht stattfindenden Wachstums relevant. Wenn z. B. dem Nährmedium ein Antibiotikum zugesetzt wird, dann kann nämlich nachgewiesen werden, ob die Bakterienkolonie auf das Antibiotikum sensitiv ist (nicht wächst) oder gegenüber diesem Antibiotikum resistent ist (wächst) – in Abhängigkeit von der Konzentration des zugesetzten Antibiotikums.
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Ein Vorgehen zur Testung auf exponentielles Wachstum (Zellteilung) könnte wie folgt aussehen. Ein Metabolit (z. B. CO2), das aus einem Isotopen gekoppelten Substrat entsteht (z. B. C13 markierte Glukose), wird in regelmäßigen Zeitintervallen (z. B. 100 msek.) gemessen und aufgetragen.
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Wie in 2 gezeigt wird im Falle eines Bakterienwachstums zunächst ein exponentielles Ansteigen des Metabolits gemessen, bevor das Wachstum in eine Sättigung geht. Dieser exponentielle Anstieg kann mit Hilfe eines Massenspektrometers sehr genau und frühzeitig detektiert werden, insbesondere im Vergleich zu bisher bekannten optischen Methoden. Die Überprüfung eines exponentiellen Anstiegs des Metabolits kann z. B. durch einen Hypothesentest erfolgen, mit dem geprüft wird, ob es sich bei der logarithmischen Darstellung des Metabolits um einen linearen Zusammenhang handelt (2).
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Folgende weitere Möglichkeiten der Messung des Metabolits b seien an dieser Stelle genannt:
- – Es kann CO2 gemessen werden ohne die Verwendung von C13 Substraten. Eine Zunahme der CO2 Konzentration ist ein Hinweis auf Wachstum.
- – Es kann CO2 gemessen werden unter Verwendung von C13 Substraten, wobei ein dem Nährmedium zugesetztes Antibiotikum sowohl Isotopen gekoppelt als auch nicht Isotopen gekoppelt sein kann.
- – Es kann der Verbrauch von O2 gemessen werden.
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Insgesamt sind zwei Anwendungsgebiete für das vorgeschlagene Verfahren hervorzuheben.
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Die Analyse von Blutkulturen auf das Vorhandensein von teilungsfähigen Bakterien, wobei der Blutkultur z. B. Isotopen gekoppelte Glucose hinzugefügt werden kann, um die Messgenauigkeit zu erhöhen.
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Die Bestimmung der Resistenz von Bakterienkulturen jeglicher Art, wobei eine Vielzahl von Test gleichzeitig durchgeführt wird, indem jedem Nährmedium ein anderes Antibiotikum hinzugefügt wird.
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Durch die Erfindung können gasförmige Metabolite von bakteriellen Wachstumsprozessen (bzw. anderer Mikroorganismen) sehr empfindlich und zeitaufgelöst gemessen werden.
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Ein weiterer Aspekt liegt darin, dass dem Nährmedium verschiedene Substrate hinzugefügt werden, die die Messgenauigkeit und Anwendungsgebiete des Verfahrens erhöhen. Diese Substrate können nämlich zum einen Antibiotika verschiedener Konzentration sein. Diese Substrate können zum anderen aber auch Isotopen gekoppelte Nährstoffe (z. B. Glukose oder Aminosäuren) oder Isotopen gekoppelte Antibiotika sein.
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Ein weiterer Aspekt liegt darin, die gemessenen Metabolite zeitaufgelöst zu messen und zu überprüfen, ob es sich um einen exponentiellen oder linearen Vorgang handelt. Alternativ zu Metaboliten können auch Gase oder VOC's gemessen werden, deren Konzentration durch eine Verstoffwechslung abnimmt (z. B. O2).
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Für die beiden oben genannten Anwendungsgebiete ergeben sich folgende Vorteile:
- – Der Test auf Wachstum kann schneller zu einem positiven oder negativen Ergebnis führen als durch optische Methoden (kürzere time-to-result). Dies führt im Falle von Blutkulturen zu einem schnelleren Therapiebeginn.
- – Der Test auf Wachstum unter Verwendung von Antibiotika-Substraten (Resistenztestung) kann schneller zu einem Ergebnis führen. Dies führt zu einem schnelleren Antibiotika-Wechsel des behandelten Patienten.
- – Weiterhin wird vermutlich eine sehr viel geringere Zahl kolonienbildender Einheiten der nachzuweisenden Mikroorganismen notwendig sein, um ein detektierbares Ergebnis herbeizuführen. Dadurch kann die bisher notwendige Inkubationszeit deutlich reduziert werden.
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Letzteres soll durch folgende Rechnung veranschaulicht werden.
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Ein ”headspace sampler”, der einem Massenspektrometer vorangeschaltet ist, führt diesem in regelmäßigen zeitlichen Abständen von 1 Minute ein Volumen von 1 ml zu. Es ist bekannt, dass 22.4 Liter eines gasförmigen Stoffs eine Stoffmenge von 1 mol = 6.022·1023 Gasmoleküle unter Atmosphärendruck enthalten. => 1 ml Gasvolumen ≈ 1 / 22400 mol = 4.464·10–5 mol
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Die Sensitivität eines Massenspektrometers liegt mindestens im ppb-Bereich (parts per billion), eher sogar darunter. Daher wird es möglich sein, in 1 ml Gasvolumen Substrate in folgenden absoluten Mengen zu messen: 4.464·10–5 mol·10–9 = 4.464·10–14 mol
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Die offene Frage ist, wie viel Gas von einem Bakterium voraussichtlich produziert wird.
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Die Trockenmasse (dry weight, DW) von z. B. E. coli liegt bei 2.8·10–13 g. => 1 g E. coli ≈ 3.57·1012 bakteriellen Zellen.
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Wir wissen von anderen Experimenten das die Aufnahme von O2 bzw. die Sekretion von CO2 in folgendem Bereich liegt: 10 mmol / gDWh.
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Diese Größe kann in eine Flussmengenrate (flux rate) umgerechnet werden (pro Bakterium):
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Aus diesen Berechnungen folgt eine Anzahl von Bakterien, die mindestens notwendig ist, um deren Stoffwechsel mit dem vorgeschlagenen Verfahren mit Hilfe eines Massenspektrometers detektierbar zu machen:
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Diese Anzahl liegt bei 103 und ist damit um eine Größenordnung geringer als in herkömmlichen Verfahren, die mit einer optischen Detektion arbeiten. Dort liegt die Anzahl nämlich bei 104.
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Daher ist zu erwarten, dass der Stoffwechsel einer bakteriellen Kultur mit dem vorgeschlagenen Verfahren viel früher erkennbar ist als mit optischen Methoden.
