RU2807137C1 - Способ определения пленкообразующей функции псевдомонад на базе масс-спектрометрии методом MALDI-ToF - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ определения пленкообразующей функции псевдомонад на базе масс-спектрометрии методом MALDI-ToF. Исследуемые культуры псевдомонад высевают в плотную среду Мюллер-Хинтон агар, разлитый в чашки Петри методом истощающего штриха с целью получения одиночных колоний. Далее посевы инкубируют при температуре от 36,5 до 37,5°С в течение от 20 до 24 часов. Далее в пробирку с матрицей HCCA (α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid) добавляют 250 мкл стандартного раствора OS: 50% ацетонитрила, 47,5% воды и 2,5% трифторуксусной кислоты. Полученную суспензию перемешивают на лабораторной мешалке при комнатной температуре до полного растворения сухого вещества. Затем биоматериал наносят тонким слоем на гладкую мишень. Затем покрывают 1 мкл раствора матрицы HCCA и высушивают при комнатной температуре. После полного высыхания проводят идентификацию на MALDI-ToF масс-спектрометре пиков масса/заряд со значениями 2348, 2361, 3171, 4174, 8889 Да. Техническим результатом заявленного изобретения является расширение функциональных возможностей способа, а также сокращение трудоемкости за счет внесения использования меньшего количества реагентов и сокращения времени подготовки биологических проб бактерий, а также повышение точности идентификации микроорганизмов за счет обнаружения паттерна с величиной m/z, находящегося в диапазоне 2261, 2348, 2362, 3173, 4175, 8886 Да, ответственного за биопленкообразования у псевдомонад. 3 табл., 1 пр.

Description

Изобретение относится к протеомным методам исследований микроорганизмов при помощи масс-спектрометрии. Способ может использоваться при анализе результатов исследований микробиологии, генетики, биотехнологии и экологии. Используется при определении по повторяющимся значениям отношения массы к заряду (m/z) белковых структур, предположительно отвечающих за образование биопленок, и характерным для псевдомонад с высоковыраженной способностью к пленкообразованию.

Существует проблема в создании безопасной среды для пребывания пациентов в стационарах и обеспечения качества медицинской помощи как приоритетных задач здравоохранения. Стафилококковые инфекции признаны одними из наиболее опасных, осложняющими результат оказания медицинской помощи в стационарных и особенно в родовспомогательных учреждениях. Широкое использование антибиотикотерапии привело к возникновению некультивируемых форм микроорганизмов. Наибольшая опасность заключается в способности стафилококков при кратном попадании в организм других людей рекультивироваться (оживляться) и восстанавливать свою патогенность. В связи с этим существует проблема быстрого и достоверного обнаружения стафилококковой инфекции как при диспансеризации населения, так и при госпитализации в стационары, роддома.

Из уровня техники известен «Способ калибровки системы газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС), оснащенной специальным программным обеспечением, для определения маркеров микроорганизмов в исследуемой пробе материала биологического происхождения» по патенту РФ № 2501011 от 10.01.2012 (МПК G01N 33/48, G01N 30/00). Данный способ калибровки системы газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ - МС), оснащенной программным обеспечением, для определения маркеров микроорганизмов в исследуемой пробе материала биологического происхождения, заключается в том, что проводят качественный и количественный хромато-масс-спектрометрический анализ исследуемого биологического материала на содержание жирных кислот и оксикислот, выделяют и производят идентификацию отдельного таксона микроорганизма по его (таксона) профильным и маркерным признакам, для чего определяют специфические ионы маркеров микроорганизмов методом масс-фрагментографии с последующим выявлением полного сообщества микроорганизмов (возбудителей, таксонов) в исследуемом материале биологического происхождения, используя метод внутреннего стандарта (шаблона) идентифицируют компоненты пробы по жирным кислотам и оксикислотам путем сравнения полученных данных со стандартной базой данных, и определяют их количественное содержание, отличающийся тем, что перед измерением серии рутинных клинических проб исследуемого материала, собирают произвольную пробу фекалий, принимая ее в качестве эталонной смеси, на основе эталонной смеси строят хроматограмму, и по полученным качественным и количественным характеристикам сообщества микроорганизмов пробы данной эталонной смеси, осуществляют определение пиков специфических ионов на шкале времен удержания для дальнейшего расчета состава сообщества микроорганизмов в последующей серии клинических проб по маркерам этих микроорганизмов, причем качественные и количественные характеристики сообщества микроорганизмов произвольной пробы фекалий принимают за необходимое и достаточное количество, характеризующее любой исследуемый материал биологического происхождения, а идентификацию специфического иона осуществляют на основании детектирования пиков хроматограммы маркеров из стандартной (тестовой) базы данных. Недостатками аналога является то, что, во-первых, в данном способе используются не чистые культуры бактерий, а пробы, содержащие неизвестное количество разных бактерий, определяемых в ходе исследования при помощи газовой хромато-масс-спектрометрии; а во-вторых, способ не предполагает маркирование в протеомном спектре локуса (паттерна), определяющего признак (свойство) биопленкообразования.

Наиболее близким аналогом является метод определения степени биопленкообразования, описанный в работе Чернухи М.Ю., Данилина Г.А., Алексеева Г.В., Шагиняна И.А., Гинцбурга А.Л. «Роль регуляторной системы «quorum sensing» в образовании биопленок бактериями Burkholderia Cepacia и Pseudomonas Aeruginosa» // «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии». - 2009. - №. 4. - С. 39-43. Методика изучения биопленкообразования. Способность к биопленкообразованию изучалась согласно методике (Чернуха, 2009). День 1 - пересев культур на пробирки со скошенным МПА. Инкубация 2-е суток при температуре 37°C. День 3 - оценка роста. Перевес колоний на жидкую среду МПБ. Инкубирование 2-е суток при 37°С. День 5 - приготовление разведений 1/100 и 1/1000 проросших культур. Внесение полученных разведений и МПБ, используемого в качестве контроля, в лунки 96-луночного микропланшета для ИФА по 100 мкл. Инкубация в эксикаторе с притертой крышкой 2-е суток при температуре 37°С. День 7 - внесение в каждую лунку опыта и контроля по 150 мкл стерилизованной воды, затем по 20 мкл красителя кристалл-виолет. Инкубация в термостате 45 минут. Отмывка 3 раза дистиллированной водой. Добавление в лунки опыта и контроля по 200 мкл 96-% этилового спирта. Снятие показаний оптической плотности при значении светофильтра 450 нм на приборе Multiskan FC. Усреднение и подсчет результатов, выраженный в виде отношения оптической плотности опыта к оптической плотности контроля. При значениях более 1,1 считается, что бактериальная культура имеет высокую степень биопленкообразования, в интервале от 1,1 до 0,7 включительно - обладающая средней степенью биопленкообразования, ниже 0,7 - низкой степенью образования биопленок. Недостатками данного способа является трудоемкий, длительный процесс поэтапного выделения чистых культур и наращивания биопленок, составляющий 7 суток. Также данный метод направлен на выращивание биопленок с использованием полистироловых 96-луночных планшетов, сканированных на приборе Multiscan при длине волны λ=450 нм и носит субъективный характер оценки степени биопленкообразования (>1,1 - высокая; 0,7-1,1 - средняя; <0,7 - низкая). Использование высокотехнологических подходов в идентификации бактерий на базе масс-спектрометрии заключается в снижении трудоемкости за счет внесения использования меньшего количества реагентов и сокращения времени подготовки биологических проб бактерий, и в то же время обеспечивающих высокую точность идентификации микроорганизмов.

Задача заявленного изобретения состояла в разработке нового способа, позволяющего определить степень биопленкообразования в краткие сроки с меньшими трудозатратами и высокой эффективностью. Техническим результатом заявленного изобретения является расширение функциональных возможностей способа, а также сокращение трудоемкости за счет внесения использования меньшего количества реагентов и сокращения времени подготовки биологических проб бактерий, а также повышение точности идентификации микроорганизмов за счет обнаружения паттерна с величиной m/z, находящегося в диапазоне 2261, 2348, 2362, 3173, 4175, 8886 Да, ответственного за биопленкообразования у псевдомонад, выявляемый в чистых культурах микроорганизмов и выполняемый масс-спектрометром Microflex Biotyper, Brucker (Германия) на базе метода MALDI-ToF (времяпролетной матрично-диссоциированной лазерной десорбции-ионизации), с использованием программного обеспечения Flex Analisys.

Сущность изобретения заключается в том, что способ определения пленкообразующей функции псевдомонад на базе масс-спектрометрии методом MALDI-ToF, отличается тем, что исследуемые культуры псевдомонад высевают в плотную среду Мюллер-Хинтон агар, разлитый в чашки Петри методом истощающего штриха с целью получения одиночных колоний, далее посевы инкубируют при температуре от 36,5 до 37,5 °С в течение от 20 до 24 часов, далее в пробирку с матрицей HCCA (α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid) добавляют 250 мкл стандартного раствора OS (50% ацетонитрила, 47,5% воды и 2,5% трифторуксусной кислоты), полученную суспензию перемешивают на лабораторной мешалке (Vortex) при комнатной температуре до полного растворения сухого вещества, затем биоматериал наносят тонким слоем на гладкую мишень, затем покрывают 1 мкл раствора матрицы HCCA (α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid) и высушивают при комнатной температуре, после полного высыхания проводят идентификацию на MALDI-ToF масс-спектрометре пиков масса/заряд со значениями 2348, 2361, 3171, 4174, 8889 Да.

Изобретение относится к протеомным методам исследований микроорганизмов, выполняемым масс-спектрометром Microflex Biotyper, Brucker (Германия) на базе метода MALDI-ToF (времяпролетной матрично-диссоциированной лазерной десорбции-ионизации) с использованием обнаружения отношений 6 мажорных значений массы к заряду (m/z) 2261, 2348, 2362, 3173, 4175, 8886 в масс-спектрах псевдомонад с повторяемостью свыше 10 раз по селективным ионам, расцененным, как характерные маркеры биопленкообразования. В частности, метод относится к биохимическим методам исследования с применением масс-спектрометрии в технологии Maldi-ToF. Способ может использоваться при анализе результатов исследований микробиологии, генетики, биотехнологии и экологии. Используется при определении по повторяющимся значениям отношения m/z белковых структур, предположительно отвечающих за образование биопленок, и характерным для псевдомонад с высоковыраженной способностью к пленкообразованию. Белки, полисахариды и внеклеточная ДНК (вДНК) являются основными структурными компонентами ЭПС. Белки представляют собой существенный компонент внеклеточного полимерного вещества биопленки, которые имеют решающее значение для поддержания и стабильности матрикса биопленки.

Заявленный способ заключается в следующем. Для идентификации видов бактерий методом MALDI-TOF MS использовали настольный масс-спектрометр Microflex с базой данных MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Germany). Подготовку к исследованию чистых культур Pseudomonas aeruginosa штаммов и проведение анализа осуществляли по инструкции к прибору в соответствии с СОП «Метод прямого нанесения». В заявленном способе используют следующие реактивы: 1. HCCA (α-циано-4-гидроксикоричная кислота), в конкретном примере исполнения применяют HCCA порционную производителя Bruker Daltonics (# 8255344 или # 255344); 2. Стандартный раствор (OS, 50% ацетонитрила, 47,5% воды и 2,5% трифторуксусной кислоты). Вначале исследуемые культуры псевдомонад высевают в плотную среду Мюллер-Хинтон агар, разлитый в чашки Петри методом истощающего штриха с целью получения одиночных колоний. Затем посевы инкубируют при 36,5-37,5°С в течение 20-24 часов. Далее в пробирку с матрицей HCCA (α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid) добавляют 250 мкл стандартного раствора OS (50% ацетонитрила, 47,5% воды и 2,5% трифторуксусной кислоты). Полученную суспензию перемешивают на лабораторной мешалке (Vortex) при комнатной температуре до полного растворения сухого вещества. Далее одиночную колонию Pseudomonas aeruginosa наносят тонким слоем непосредственно на точку мишени, начиная от середины точки. Затем точки с нанесенным биоматериалом покрывают 1 мкл раствора матрицы HCCA и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания матрицы. Уровень идентификации бактерий трактовали по критериям, указанным в инструкции: 2.300-3.000 высокая вероятность идентификации вида; 2.000-2.299 надежная идентификация рода, вероятная идентификация вида; 1,700-1.999 вероятная идентификация рода; 0.00-1.699 ненадежная идентификация. Все повторности были определены с высокой вероятностью идентификации вида. Профили микроорганизмов получали с использованием Microflex LT MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) с программным обеспечением FlexControl (BrukerDaltonics). Визуализацию проводили с помощью программного обеспечения Flex analysis3.3 (BrukerDaltonics). Микроорганизмов Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием раздела Statistica Microsoft Excel.

Пример №1. Параллельно было произведено определение степени биопленкообразования по методике Чернухи М.Ю. и др. (2009). Согласно полученным данным, 40% имели среднюю степень биопленкообразования, 60% - высокую степень биопленкообразования.

Таблица 1. Сравнение способов исследования биопленкообразования: по времени, затраченному на исследование
Наименование этапов	Время, затраченное на этап
	Чернуха М.Ю. и др., 2009	Предлагаемый способ
Подготовка чистых культур	18-24 часа	18-24 часа
Возможное количество одномоментно исследуемых культур	12 повторов	84 повтора
Подготовка культур к исследованию	7 суток	20-40 минут
Проведение исследования	Сканирование на приборе Multiscan при λ=450 нм - 90 минут	Масс-спектрометрическое исследование - 40 минут
Средние временные затраты	187,5-193,5 часа	19-25 часов

Ускорение получения результатов в 9 раз. Увеличение объемов в 7 раз.

Таблица 2. Пример 1. Показатели m/z P. aeruginosa со средней биопленкообразующей способностью
№	№ культуры P. aeruginosa	Степень биопленкообразования (числовой показатель в условных единицах оптической плотности)	Показатели m/z, Да
1	2797	Средняя (1,02)	-
2	641	Средняя (1,07)	-
3	71	Средняя (1,01)	-
4	730	Средняя (0,89)	-
5	732	Средняя (1,05)	-
6	733	Средняя (1,03)	-

Показатели m/z 2261, 2345, 2360, 3175, 4175, 8888 Да не были выявлены у P. aeruginosa со средней биопленкообразующей способностью.

Таблица 3. Пример 2. Показатели m/z P. aeruginosa с высокой биопленкообразующей способностью
№	№ культуры P. aeruginosa	Степень биопленкообразования (числовой показатель в условных единицах оптической плотности)	Показатели m/z, Да
1	2610	Высокая (1,1)	2345, 4175,
2	11	Высокая (1,11)	2348, 3173, 4176
3	2595	Высокая (1,12)	2261, 2346, 3171, 4175
4	2691	Высокая (1,2)	2348, 2361, 3171, 4174, 8889
5	2699	Высокая (1,23)	2260, 2346, 2364, 3174, 4173
6	2611	Высокая (1,29)	2261, 2348, 2362, 3173, 4174
7	2582	Высокая (1,41)	2259, 2349, 2364, 3172, 4176, 8884
8	2647	Высокая (1,47)	2259, 2350, 2363, 3172, 4175, 8883
9	292	Высокая (1,51)	2262, 2349, 2360, 3170, 4176, 8888

Были обнаружены показатели m/z 2261, 2345, 2360, 3175, 4175, 8888 Да у P. aeruginosa с высокой биопленкообразующей способностью с вероятностью совпадения 95% по критерию Стьюдента.

Способность к биопленкообразованию изучалась согласно методике Чернухи М.Ю. (2009). День 1 - пересев культур на пробирки со скошенным МПА. Инкубация 2-е суток при температуре 37°C. День 3 - оценка роста. Перевес колоний на жидкую среду МПБ. Инкубирование 2-е суток при 37°С. День 5 - приготовление разведений 1/100 и 1/1000 проросших культур. Внесение полученных разведений и МПБ, используемого в качестве контроля, в лунки 96-луночного микропланшета для ИФА по 100 мкл. Инкубация в эксикаторе с притертой крышкой 2-е суток при температуре 37°С. День 7 - внесение в каждую лунку опыта и контроля по 150 мкл стерилизованной воды, затем по 20 мкл красителя кристалл-виолет. Инкубация в термостате 45 минут. Отмывка 3 раза дистиллированной водой. Добавление в лунки опыта и контроля по 200 мкл 96% этилового спирта. Снятие показаний оптической плотности при значении светофильтра 450 нм на приборе Multiskan FC. Усреднение и подсчет результатов, выраженный в виде отношения оптической плотности опыта к оптической плотности контроля. При значениях более 1,1 считается, что бактериальная культура имеет высокую степень биопленкообразования, в интервале от 1,1 до 0,7 включительно - обладающая средней степенью биопленкообразования, ниже 0,7 - низкой степенью образования биопленок.

Claims (1)

1. Способ определения пленкообразующей функции псевдомонад, включающий посев исследуемых культур псевдомонад в плотную среду Мюллер-Хинтон агар, разлитый в чашки Петри, методом истощающего штриха с целью получения одиночных колоний, инкубацию посевов при температуре от 36,5 до 37,5°С в течение от 20 до 24 часов, добавление в пробирку с матрицей HCCA 250 мкл стандартного раствора OS, перемешивание полученной суспензии при комнатной температуре до полного растворения сухого вещества, нанесение биоматериала тонким слоем на гладкую мишень, покрывание 1 мкл раствора матрицы HCCA и высушивание при комнатной температуре, после полного высыхания проводят идентификацию на MALDI-ToF масс-спектрометре пиков масса/заряд со значениями 2348, 2361, 3171, 4174, 8889 Да.