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Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von körpereigenen Strukturen zur Knorpel-, Knochen-, Meniskus- und Bandscheibentherapie sowie ein Verfahren zur Gewinnung dieser körpereigenen Strukturen.
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Knorpelschädigungen wie -erkrankungen oder -degenerationen können vielfältige Ursachen haben. Allen Schädigungen gemeinsam sind aber der Verlust und die Veränderung der zwischen und über den Chondrozyten gelegenen Matrix. Als Folge wird die Knorpeloberfläche zunächst rau, dann wird Knorpelsubstanz verloren, es entwickelt sich eine Arthrose. was wiederum die Funktion des betroffenen Gelenkes einschränkt.
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Als Chondrose werden allgemein die degenerativen Veränderungen des Knorpels bezeichnet. Bei Bandscheiben kommt es dabei zu einer Verschmälerung des Zwischenwirbelabstandes eines oder mehrerer Wirbelsegmente im Vergleich zu den restlichen Wirbelkörpern, wodurch die Höhe der Zwischenwirbelräume abnimmt.. Als Ursache kommen dabei entweder angeborene oder erworbene Veränderungen in Frage, wobei letztere degenerativ, entzündlich, oder operativ ausgelöst sein können. Ist darüber hinaus auch der darunterliegende Knochen beteiligt, spricht man von Osteochondrosen. Bei den großen und kleinen Gelenken des Bewegungsapparates kommt es durch Veränderungen des Knorpel- und des Knochengewebes zur Ausbildung der Arthrose/Osteoarthritis, welche ebenfalls durch angeborene oder erworbene Veränderungen entstehen kann. Als Ursache kommen z. B. degenerative, entzündliche, posttraumatische Faktoren und Erkrankungen des Zentralnervensystems in Frage. Die sich bei einer Osteochondrose, Arthrose. Osteoarthritis aus dem Knorpelverband herauslösenden Knorpelstückchen, bzw. der sich hieraus ergebende Zustand, wird als Osteochondrosis dissecans bezeichnet, welcher auch im Rahmen eines Unfalls oder ohne heute medizinisch erkennbare Ursachen auftritt und ebenfalls die Entstehung der Arthrose/Osteoarthrits herbeiführt.
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In den vergangenen Jahrzehnten haben sich chirurgische Eingriffe zur Knorpelreparatur etabliert. Bei einer Gelenkknorpel-Reparaturbehandlung ist Ziel die Entfernung des erkrankten Knorpels und die Wiederherstellung einer Knorpeloberfläche. Eine moderne, vielversprechende und klinisch etablierte Therapie eines Knorpelschadens ist die Implantation von patienteneigenen, sogenannten autologen Chondrozyten in einer Matrix. Dieser Eingriff wird als autologe Chondrozyten-Transplantation, abgekürzt ACT (Englisch: ACI), bezeichnet. Eine ACT führt mittelfristig bei kleineren, klar umgrenzten Knorpelläsionen zu einem guten klinischem Erfolg. Allerdings können größere Defekte oder korrespondierende Defekte auf gegenüber liegenden Knorpeloberflächen damit nicht behandelt werden. Darüber hinaus führt auch die ACT zur Ausbildung lediglich eines hyalin-artigen Knorpels, dessen Qualität weder klinisch noch histologisch dem hyalinen Knorpel entspricht. Dies zeigt sich in einer verminderten biomechanischen Qualität des hyalin-artigen (Faser-)Knorpels, wodurch eine weitere Degeneration und damit auch die Entstehung der Arthrose nur aufgeschoben, aber nicht aufgehoben werden kann.
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Daher ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine gegenüber dem Stand der Technik verbesserte Therapiemöglichkeit bereitzustellen, mit der auch größere Defekte behandelt werden können.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Verwendung von Chondronen zur Behandlung von Knorpel-, Knochen-, Meniskus- oder Bandscheiben-Schäden oder Erkrankungen sowie die hieraus resultierende Arthrose/Osteoarthritis.
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Ferner wir die Erfindung durch ein Verfahren zur Gewinnung von Chondronen gelöst, mit dem körpereigene oder auch allogene und xenogene Chondrone isoliert werden können.
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Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird dadurch vollkommen gelöst. Mit dem Einsatz von Chondronen wird ein Mittel bereitgestellt, mit dem einerseits auch größere Knorpel-Defekte behandelt werden können, sowie andererseits das Langzeitüberleben der in den Chondronen enthaltenen Chondrozyten verbessert wird.
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Unter einem ”Chondron” wird dabei vorliegend die Einheit aus Chondrozyt und die diesen umgebende perizelluläre Umgebung, d. h. der perizellulären Glykokalix und der perizellulären Kapsel, verstanden. Chondrozyten und ihre perizelluläre Umgebung bilden eine strukturelle und funktionelle Einheit.
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Bei der gegenwärtig angewandten ACT werden gesunde Knorpelzylinder eines Patienten, bspw. aus dem Kniegelenk, entnommen. Hieraus werden Chondrozyten isoliert, im Labor expandiert, auf ein Trägermaterial aufgebracht und in den Knorpeldefekt implantiert. Bei der Isolierung der Chondrozyten wird die perizelluläre Matrix, und damit die Struktur des Chondrons, zerstört. Dadurch produzieren die isolierten Chondrozyten ungenügende Mengen an Glykosaminoglykan und Kollagen Typ II, wodurch die biomechanischen Eigenschaften dieses, aus der ACT gebildeten Knorpels, schlechter sind als die des originalen Knorpelgewebes.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben erkannt, dass die Isolierung von physiologisch kompletten Chondronen aus dem Knorpelgewebe und deren Einsatz zur Bildung von Knorpelersatzgewebe einen gegenüber dem im Stand der Technik bekannten Verfahren verbesserten Ansatz zur Therapie von Knorpelschäden bietet.
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Dabei ist insbesondere bevorzugt, wenn die Chondrone zur Behandlung von Knorpelschädigungen bzw. -erkrankungen der großen Gelenke wie z. B. das Knie-, Hüft-, Sprung-, Schulter- oder Ellbogengelenk oder der Wirbelsäule, insbesondere auch zur Behandlung von Bandscheibenschäden, eingesetzt werden.
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Im Bereich der Behandlungen für betroffene Gelenke und Wirbelsäulen eines Patienten, insbesondere eines Säugetieres, bspw. eines Menschen, ist nach wie vor der Bedarf an effektiven und dauerhaften Therapieverfahren groß. Zu den Knorpelschädigungen bzw. -erkrankungen von Gelenken in diesen Bereichen zählen bspw. die Osteochondrosis dissecans, die Arthrose, die Arthritis und die Osteoarthritis, also entzündliche und degenerative Gelenkerkrankungen.
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Mit der erfindungsgemäßen Verwendung von Chondronen können solche Erkrankungen, d. h. Knorpeldegenerationen und die resultierende Osteoarthritis/Arthrose gezielt behandelt, sowie ein Fortschreiten der Arthrose verhindert oder verzögert werden. Chondrone bilden, wie weiter oben bereits erläutert, eine funktionelle Einheit aus Chondrozyten mit ihrer unmittelbar umgebenden perizellulären Matrix, und können aus dieser mechanisch und enzymatisch aus Knorpelgewebe gewonnen werden. Sowohl metabolisch also auch biomechanisch haben Chondrone eine große funktionelle Bedeutung, da deren Struktur bei biomechanischen, biophysikalischen und biochemischen Interaktionen zwischen Chondrozyt und ECM eine große Rolle spielt. Ferner bilden Chondron-Pellets signifikant mehr Glykosaminoglykane und Kollagen Typ I als Chondrozyten-Pellets, weshalb sie sich für die beanspruchte Verwendung im Vergleich zu den in der ACT bisher isoliert eingesetzten Chondrozyten besonders eignen. Die Erfinder haben nämlich erkannt, dass aufgrund der erhaltenen, originalen perizellulären Matrix der Chondrone die Ausbildung einer hyalin-artigen Matrix bei Knorpelschädigungen deutlich stärker gefördert werden kann, als eine perizelluläre Matrix, die von expandierten Chondrozyten erst neu synthetisiert werden muss.
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Ferner bietet die Verwendung von Chondronen bei den aufgeführten Erkrankungen/Schädigungen den Vorteil, dass diese als wichtiges Aggrekan-Reservoir das wesentliche Markomolekül für die hydrodynamische Knorpelfunktion und für Knorpel-Proteoglykane liefern. Darüber hinaus bieten die Chondrone auch einen mechanischen Schutz für Chondrozyten vor einer biomechanischen Überlastung. Ferner sind Chondrone – im Gegensatz zu Chondrozyten – nicht immunogen, und damit in Ihrer Anwendung deutlich verträglicher als diese.
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Die erfindungsgemäße Verwendung bietet damit den Vorteil, dass nicht nur junge Patienten oder solche mit isolierten, kleineren Knorpeldefekten behandelt werden können, sondern nunmehr auch ältere Patienten und/oder Patienten mit größeren Knorpelschäden, die gegenwärtig noch durch eine Implantation künstlicher Gelenke oder nur durch konservative Maßnahmen wie Schmerzmittel etc. behandelt werden.
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In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Chondrone zur Behandlung der Arthrose/Osteoarthitis oder Osteochondrosis dissecans eingesetzt.
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Wie bereits weiter oben erwähnt wird unter ”Osteoarthritis” bzw. Arthrose eine Gelenkerkrankung mit Zerstörung der Knorpelflächen verstanden.. Mit ”Osteochondrosis dissecans” wird das Herauslösen eines Knorpelstückchens (Flake) durch z. B. einen Unfall oder auch durch andere, nicht geklärte Ursachen verstanden, was zur Ausbildung einer Arthrose/Osteoarthritis führen kann. Diese Erkrankungen treten insbesondere im Kniegelenk, im oberen Sprunggelenk, im Hüftgelenk, im Schultergelenk und im Ellbogengelenk auf, und zwar nicht nur beim Menschen, sondern auch bei Tieren, wie bei Hunden, (Renn)-Pferden, Katzen, Kühen oder Schweinen.
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In einer Weiterbildung der erfindungsgemäßen Verwendung ist bevorzugt, wenn Chondrone eingesetzt werden, die aus autologem, also körpereigenem, Knorpelmaterial gewonnen wurden.
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Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass auf körpereigenes und damit Patienten-eigenes Material zurückgegriffen werden kann, was ev. unerwünschte Reaktionen des Körpers auf die Chondrone minimiert.
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Gemäß einer wiederum anderen Ausführungsform werden aus heterologem, allogenem oder xenogenem Knorpelmaterial gewonnene Chondrone eingesetzt. Dabei wird unter ”allogenem” Material Knorpelmaterial von einem Spender der gleichen Spezies wie der zu behandelnde Patient verstanden, und unter ”xenogenem” Material Knorpelmaterial von einem Spender einer anderen Spezies als der Patient, in den die Chondrone wieder eingebracht werden sollen. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass auch Patienten behandelt werden können, bei denen nicht hinreichend gutes oder in der Menge ausreichendes Knorpelmaterial für die Isolierung von Chondronen bereitgestellt werden kann.
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Vorliegend versteht es sich, dass die Chondrone nach deren Bereitstellung entweder direkt in den zu behandelnden Bereich mit Knorpelschaden eingesetzt oder in vitro kultiviert werden können, wobei nach Kultivierung die Chondrone mit oder ohne ein entsprechendes Trägermaterial in das Gelenk eingesetzt werden kann.
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Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von aus Knorpelmaterial gewonnenen Chondronen zur in vitro Herstellung von Knorpelersatzgewebe. Diese Gewebe kann dann dem Patienten, dem das ursprüngliche Knorpelmaterial entnommen wurde, in die betroffene Stelle implantiert werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung werden dabei die Chondronen folgendermaßen gewonnen:
- a) in vitro Isolierung von Chondronen aus einer biologischen Knorpelgewebsprobe eines Patienten mittels Zerkleinern und/oder enzymatischem Verdau, insbesondere mit Dispase II und Collagenase P, wobei der Verdau vorzugsweise durch eine Inkubation mit den Enzymen über einen Zeitraum von 5 h und vorzugsweise bei 37°C unter Rühren durchgeführt wird, und anschließendem Sieben, vorzugsweise mit einem 100 μm Sieb, zur Gewinnung von Chondronen;
- b) in vitro Expandierung der Chondrone durch Kultivierung der in Schritt a) gewonnenen Chondrone in Monolayer- oder dreidimensionaler Kultur in Standardmedium;
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Schritt b) kann dabei bspw. folgenden Standardmedien durchgeführt werden: F12 + GlutaMAX, Gibco 21885 (250 ml), DMEM + GlutaMAX, Gibco 31765 (250 ml), FBS Superior, Biochrom S0615 (50 ml), PenStrep, Gibco 15140 (10 ml), Partricin (Fungizide), Biochrom A2812 (5 ml), L-Ascorbinsäure-Phosphat-Magnesiumsalz, Sigma Aldrich A8960 (0.5 ml).
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Dabei ist insbesondere bevorzugt, wenn das Knorpelersatzgewebe nach Adaption unter GMP-Bedingungen gewonnen wird.
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Erfindungsgemäß können die derart isolierten Chondrone dann direkt und mit/ohne Trägermaterial zur Behandlung und damit zur Generierung von Knorpelersatzgewebe in vivo eingesetzt werden, oder aber zur in vitro Herstellung von Knorpelersatzgewebe.
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Vorliegend wird dabei unter einer ”biologischen Probe” jedes von einem Körper eines Patienten bereits entnommene Material verstanden, vorzugsweise Gewebe, noch bevorzugter Knorpelgewebe, das lebensfähige Zellen, insbesondere Chondrone, Chondrozyten oder deren Vorläufer, Zellverbände, und/oder sonstiges zellfreies Material enthält. Dabei kann die biologische Probe eine körpereigene Probe sein, also eine Probe des Patienten, der mit den hieraus gewonnenen Chondronen behandelt werden soll, oder aber eine allogene/xenogene Probe.
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Dabei ist vorliegend insgesamt bevorzugt, wenn der Patient ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch ist. Neben der Anwendung beim Menschen, kommen selbstverständlich auch analoge Anwendungen bei anderen Säugetieren, wie Pferde, Kamele, Hunden, Katzen, etc. in Betracht, da zunehmend auch hier ein Interesse an einer effektiven Behandlung der Arthrose/Osteoarthritis/Osteochondrosis dissecans/Knorpelschaden dieser Tiere besteht.
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Erfindungsgemäß können die so gewonnenen Chondrone zur Behandlung von Knorpel-, Meniskus-, Knochen-, oder Bandscheibenschäden, -erkrankungen, oder -degenerationen, oder zur Behandlung der Arthrose/Osteoarthritis </Knorpelschaden/Osteochondrosis dissecans, insbesondere eines Menschen, eingesetzt werden.
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Die Chondrone, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können dabei ferner zusammen mit pharmazeutisch akzeptierbaren Träger- und/oder Hilfsstoffen, und ggf. therapeutisch wirksame Substanzen verabreicht werden. Dabei wird unter ”pharmazeutisch akzeptierbaren Träger- oder Hilfsstoffen” vorliegend jede in der Pharmazie im Zusammenhang mit an einen Patienten zu verabreichende Substanz/Zusammensetzung verstanden, die Zellen nicht oder nicht nachteilig beeinflusst, und/oder die pharmakologisch die Anwendung der Chondrone unterstützen oder erleichtern kann. Unter ”therapeutisch wirksamer Substanz” wird ferner jede Substanz verstanden, die für die Zwecke einer Behandlung oder Verbesserung eines Krankheitsbildes eines Patienten eingesetzt wird.
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Es versteht sich, dass die oben genannten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendet werden können, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Die Erfindung wird in der nachstehenden Beschreibung und den beigefügten Figuren näher erläutert.
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Es zeigen:
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1 (A) eine schematische Darstellung der Chondron-Organisation und der umgebenden Kollagen-Fasern mit Chondrozyt (C), perizellulärer Glykokalix (PG), perizellulärer Kapsel (PC), territorieller Matrix (M) und interteritorieller (IM) Matrix; sowie (B) eine dreidimensionale Repräsentation eines solitären Chondrons; Referenz: C. Anthony Poole; 1997;
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2 Fluoreszenzmikroskopiebild mit einer Kollagen Typ VI Färbung nach der Isolierung aus dem menschlichen Knorpelgewebe A) von Chondrozyten und B) von Chondronen; im vorliegenden Fall zwei Chondrone: B) links ein Chondron, welches eine Zelle enthält; B) rechts ein Chondron; welches zwei Zellen enthält (eigene Daten);
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3 Fluoreszenzmikroskopiebilder mit A) einer Kollagen Typ II Färbung, B) einer Kollagen Typ VI Färbung, C) einer Aggrekan-Molekül-Färbung;
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4 A) Fluoreszenzmikroskopiebilder eines Chondrons bestehend aus mehreren Zellen, B) Durchlichtmikroskopiebild desselben Chondrons, C) und D) Kollagen Typ II Fasern desselben Chondrons als Verbindung mit der extrazellulären Knorpelmatrix (eigene Daten);
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5 ein Diagramm der Genexpressionsprofile von Chondronen aus osteoarthrotischen Gelenken (OA Chondrone) sowie im Vergleich von Chondrozyten aus denselben arthrotischen Gelenken (OA Chondrozyten) und von Chondrozyten aus einem Gelenk eines jungen Patienten, welcher eine Autologe Chondrozytentransplantation (ACT) der oben dargestellten Chondrozyten erhielt (ACT Chondrozyten); und
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6 ein Diagramm für die relative Zellzahl von Chondronen und Chrondozyten nach einer bestimmten Kultivierungsdauer.
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In 1 ist in Abbildung A ein Chondrozyt in seiner perizellulären Umgebung, dem Chondron, gezeigt. Der Chondrozyt und seine perizelluläre Umgebung bilden eine funktionelle Einheit und haben eine vielfältige Bedeutung für die Funktion des hyalinen Knorpels. Wie 1 zu entnehmen ist, besteht ein Chondron aus einem einzelnen oder aus mehreren Chondrozyten (C), die von der perizellulären Glykokalix (PG) und einer fibirllären perizellulären Kapsel (PC) eingeschlossen sind. Die Kapsel definiert die perizelluläre Matrix um den Chondrozyten.
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Die Fluoreszenzmikroskopiebilder in 2 zeigen, dass lebende Chondrone aus dem menschlichen Gewebe mit ihrer intakten Struktur gewonnen werden konnten; ferner zeigen die Fluoreszenzmikroskopiebilder in 3, dass die gewonnenen Chondrone die für die Knorpel-Funktion fundamentalen Anteile Kollagen Typ II, Typ VI und Aggrekan in Mengen produzieren, die mit gängigen Techniken nachgewiesen werden können.
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4 zeigt, dass Chondrone mit ihrem Fasernetzwerk gewonnen werden können. Dies ist u. U. relevant für eine verbesserte/überlegene Funktion der Chondrone. Die Isolierung des Fasdernetzwerkes und die Verwendung von Chondronen mit und ohne dieses Fasernetzwerk ist in der Erfindung eingeschlossen.
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In 5 wird eine Genexpressionsanalyse gezeigt, welche eindeutig zeigt, dass die für die Knorpel-Funktion wichtigen Gene Kollagen Typ II, Aggrekan und COMP von Chondronen deutlich und statistisch signifikant vermehrt exprimiert werden. Diese signifikant vermehrte Genexpression der relevanten Knorpelkomponenten zeigt somit, dass Chondrone den Chondrozyten überlegen sind. Insbesondere wird gezeigt, dass die Genexpression von Chondronen selbst von osteoarthrotisch erkrankten Gelenken den Chondrozyten desselben Gelenkes wie auch eines jungen und relativ gesunden Patienten zur ACT überlegen sind.
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In 6 sind die Ergebnisse des Versuchs zum Vergleich der relativen Zellzahl von Chondronen und Chondrozyten dargestellt, wobei es sich hier zeigte, dass gewonnene Chondrone eine signifikant schnellere Proliferationsrate als Chondrozyten zeigen, so dass in einer Labor-Phase von gegebener Länge mehr lebendige Chondrone zur Transplantation zur Verfügung stehen als Chondrozyten.
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Die Einbringung von Chondronen in das menschliche oder tierische Gelenk als Therapie wurde bisher noch nicht durchgeführt, kann aber basierend auf den hierin präsentierten Daten mit den bisher klinisch erprobten, zugelassenen und in der klinischen Routine täglich verwendeten Methoden erfolgen. Die isolierten Chondrone können statt den üblicherweise verwendeten Chondrozyten in einen Träger eingebracht werden, welcher nach Ausstanzung eines Knorpeldefektes in diesen Defekt eingenäht oder eingeklebt oder eingelegt wird. Alternativ kann z. B. auch ein Gel verwendet werden, welches in den Defekt eingespritzt wird. Sämtliche zur ACT zugelassenen Methoden kommen hierfür ebenfalls in Frage.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Referenz: C. Anthony Poole; 1997 [0035]
