DE102010040705A1

DE102010040705A1 - Blütenextrakt von Primula flos zur Behandlung und Prophylaxe von Entzündungen oder viralen Infektionen

Info

Publication number: DE102010040705A1
Application number: DE102010040705A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Popp Michael
Original assignee: Bionorica SE
Current assignee: Bionorica SE
Priority date: 2010-09-14
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2012-03-15
Also published as: WO2012035082A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche einen Blütenextrakt von Primula flos zur Behandlung und Prophylaxe von Entzündungen und/oder viralen Infektionen enthält.

Description

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche einen Blütenextrakt von Primula flos zur Behandlung und Prophylaxe von Entzündungen und/oder viralen Infektionen enthält.
Die Primeln sind eine Pflanzengattung aus der Familie der Primulaceae. Etwa 400 Arten gehören zu dieser Gattung. Primeln sind meist ausdauernde, selten einjährige, krautige Pflanzen. Die zwittrigen, fünfzähligen Blüten sind oft heterostyl. Die fünf grünen Kelchblätter sind glockenförmig oder zylindrisch verwachsen. Die fünf Kronblätter sind röhrig verwachsen und enden in fünf glattrandigen Kronzipfeln. Die Echte Schlüsselblume (Primula veris L.) gehört zur Gattung der Primulaceae und hieß früher Primula officinalis. Der botanische Name stammt aus dem Lateinischen: »Primula« ist eine Verkleinerungsform von prima (= die erste), »veris« leitet sich von ver (= der Frühling) ab, somit lautet die wörtliche Übersetzung »Frühlingserstling«. Noch heute heißt die Echte Schlüsselblume vielfach auch Wiesen-Schlüsselblume oder Wiesen-Primel.
Das Europäische Arzneibuch (Pharmacopoea Europaea) kennt drei Drogenarten, die von Primula(e) veris L. und/oder Primula(e) elatior (L.) HILL. stammen und zwar Primula(e) flos cum calycibus, die getrockneten, ganzen Blüten mit Kelchen und Primula(e) flos sine calycibus, die Schlüsselblumenblüten ohne Kelch, also die nach Entfernung des Kelches sorgfältig getrockneten Blüten. Die dritte Drogenart ist Primula(e) radix, nämlich den getrockneten Wurzelstock mit Wurzeln. Weiterhin ist Primula flos z. B. in EMEA Doc. Ref. EMEA/HMPC/64684/2007 beschrieben.
Die Primeln sind als Heilpflanzen beschrieben. Die Blüten, insbesondere die Kelchblätter enthalten (Triterpen)Saponine, besonders die Primulasäure. In den übrigen Blütenteilen kommen hauptsächlich Flavonoide, Carotinoide, Spuren von ätherischem Öl, und Enzyme (Primverase) vor. Blütentee wird als mild wirkendes Sekretolytikum (schleimlösendes Mittel) bei Husten verwendet. Weiterhin wird die Blüte als Nervenmittel gegen Kopfschmerzen, Neuralgien, Gliederzittern, Schwindelgefühl und als Herztonikum genutzt.
Die hellgelben Blüten von Primula flos erscheinen von März bis Mai.
Basbuel et al. (Antimitotic and antibacterial effects of the Primula veris L. flower extracts. Caryologia; 2008, 61(1): 88–91) haben beobachtet, dass Blütenextrakte von Primula veris inhibitorische Wirkung gegen Bakterien zeigen.
Entzündungsreaktionen werden im Wesentlichen durch die vier klassischen Symptome Schmerz, Wärme, Rötung und Schwellung charakterisiert. Eine Übersicht über die unterschiedlichen Grundlagen von Entzündungen ist in der Arbeit von D. Gemsa und K. Resch in Immunologie. Grundlagen. Klinik. Praxis, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1997, Seiten 135–158 zu finden. Zentrales Ereignis aller Entzündungsreaktionen ist der Einstrom von Leukozyten in einen Entzündungsherd. Die rekrutierten Leukozyten schütten proinflammatorische, permeabilitätssteigernde und toxische Substanzen aus oder lösen die Ausschüttung solcher Substanzen durch anderen Zellen aus (Zytokine, Enzyme, Mediatoren, Prostaglandine, Sauerstoffradikale). Dies führt zur erhöhten Durchblutung sowie zur Aktivierung und zum erhöhten Durchsatz von Immunzellen, welche an der Elimination des Erregers und am Abtransport von Abbauprodukten beteiligt sind. Makrophagen sezernieren Entzündungsmediatoren wie IL-1 und TNFα. Diese Zytokine rekrutieren Gefäßendothelzellen und parenchymale oder mesenchymale Zellen, um am Entzündungsprozeß teilzunehmen. Dadurch werden noch mehr Enzyme, Lipidmediatoren sowie reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies produziert, welche die Entzündung vorantreiben und die Gewebeschädigung verstärken. Die Entzündungsreaktion ist ein sehr komplexer Vorgang, welcher durch verschiedenste Elemente des angeborenen sowie des erworbenen, zellulären und u. U. humoralen Immunsystems sowie durch Mediatoren und gewebedegradierende Enzyme vermittelt wird.
Im Stand der Technik gibt es verschiedene Wirkstoffe um Entzündungen oder virale Infektionen zu behandeln, jedoch verbleibt das Bedürfnis an verbesserten oder alternativen Medikationen bestehen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Entzündungen oder viraler Infektionen bereitzustellen.
Die Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Entzündungen oder viralen Infektionen, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung einen Blütenextrakt enthält, der aus Primula flos gewonnen wird. Vorzugsweise enthält die pharmazeutische Zusammensetzung den Blütenextrakt in Form eines alkoholischen oder alkoholisch-wässerigen Extrakts zur oralen oder topischen Verabreichung.
Beispiele für besonders geeignete pharmakologisch verträgliche Träger sind dem Fachmann bekannt und umfassen gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen wie z. B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Detergentien, sterile Lösungen, etc. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Träger umfassen, können mittels bekannter konventioneller Methoden formuliert werden. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können einem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung kann oral, parenteral, intravenös, intraperitoneal, subcutan, intramuskulär, lokal, intranasal, intrabronchial oder intradermal, oder über einen Katheter an einer Stelle in einer Arterie erfolgen. Die Art der Dosierung wird vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie z. B. der Körpergröße bzw. dem Gewicht, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten, aber auch von dem speziell zu verabreichenden Mittel, der Dauer und Art der Verabreichung, und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann für die Behandlung von einer der folgenden Virusinfektionen verwendet werden: Rous-Sarkom-Virus-Infektion, Rhinovirus-Infektion, Adenovirusinfektion, Herpes-simplex-Virusinfektion, Poliovirusinfektion, Pockenvirusinfektion, Parvovirusinfektion, Papovavirusinfektion, Hepadnavirusinfektion, Orthomyovirusinfektion, Paramyxovirusinfektion, Coronavirusinfektion, Picornavirusinfektion, Reovirusinfektion, Togavirusinfektion, Flavivirusinfektion, Arenavirusinfektion, Rhabdovirusinfektion, Retrovirusinfektion.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann außerdem Konservierungsmittel und andere Zusätze umfassen, wie z. B. antimikrobielle Verbindungen, Antioxidantien und Komplexbildner. Des Weiteren können Verbindungen wie z. B. Interleukine, Interferone, oder ein unspezifisches immunmodulatorisches Agens enthalten sein. Ebenso können Zytostatika, Antibiotika und Kombinationen davon enthalten sein.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung beeinflusst bestimmte Verbindungen des Arachidonsäure-Pathways. Die Arachidonsäure stellt die biosynthetische Vorstufe für zahlreiche Mediatorstoffe dar. Über einen Cyclooxigenase-Weg werden Prostaglandine, Thromboxane und Prostacyclin gebildet, über einen Lipoxygenase-Weg Leukotriene. Eine wichtige Wirkung der Prostaglandine ist die Auslösung von Entzündungen. Mittel, welche beispielsweise die Prostaglandinsynthese blockieren, wirken entzündungshemmend.
Überraschenderweise inhibiert der erfindungsgemäße Blütenextrakt von Primula flos hervorragend die Aktivität der Cyclooxygenase-2 (COX-2). Ferner blockiert der erfindungsgemäße Blütenextrakt von Primula flos die 5-Lipoxygenase-Aktivität (5-Lox) (siehe Tabelle 2) und ist außerdem in der Lage die TNFα-Produktion zu inhibieren. TNFα ist bei lokalen und systemischen Entzündungen beteiligt. Die Sekretion von IFNγ und GM-CSF wird durch den erfindungsgemäßen Blütenextrakt von Primula flos schwach inhibiert.
Es hat sich völlig überraschend herausgestellt, dass die erfindungsgemäßen Blütenextrakte eine effektive antientzündliche Wirkung aufweisen, und zwar vorzugsweise zur Behandlung. von PGE2- und/oder 5-LOX-vermittelter Erkrankungen oder krankhafter Zustände, insbesondere chronische Entzündungen wie rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Asthma, COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease), allergische Rhinitis, entzündliche Hauterkrankungen, insbesondere atopische Dermatitis, Psoriasis, Osteoporose und Krebs, insbesondere Lungenkrebs, oder krankhafte Zustände, insbesondere Schmerz und Fieber.
Ein bevorzugter Blütenextrakt aus Primula flos ist dadurch gekennzeichnet, dass die Extrakte mittels eines Extraktionsmittels aus 40–60 Vol.-%, insbesondere 50 Vol.-% Ethanol und 40–60 Vol.-%, insbesondere 50 Vol.-% Wasser aus dem Pflanzenmaterial über mindestens 24 h unter Rühren und anschließendem Vakuumverdampfen des Lösungsmittels herstellbar sind, siehe Beispiele. Die Blüten werden zuvor zerkleinert und getrocknet.
In vorteilhafter und an sich bekannter Weise können die Blütenextrakte der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines antientzündlichen oder antiviralen Mittels verwendet werden. Derartige antientzündliche oder antivirale Mittel können zur Prophylaxe und/oder zur Behandlung von Entzündungserkrankungen oder virale Infektionen oral oder topisch z. B. auf Haut und Schleimhäuten in Form einer ihrer Anwendung entsprechenden galenischen Formulierung eingesetzt werden.
Die galenischen Formulierungen der antientzündlichen oder antiviralen Mittel der vorliegenden Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass die oralen Formulierungen wie Dragees, Tabletten, Filmtabletten, Pulver, Kapseln oder flüssige Verdünnungen, insbesondere Tropfen, Säfte oder Sirupe umfassen.
Bei Einsatz zur topischen Applikation eignen sich insbesondere Sprays, Salben, Emulsionen, Puder, Pulver, flüssige oder feste Präparate für die Inhalation, Kompressen, Wund- und Zahnfleischeinlagen, Tamponaden, Tonsillenpinsellösungen, Gurgellösungen oder Spüllösungen für Nase und Ohr. Dabei sind die oben angesprochenen Tamponaden auch für zahnärztliche Anwendungen geeignet.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung können die wäßrig/alkoholischen Blütenextrakte in eine Trockenmasse überführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Gefriertrocknung der Blütenextrakte durchgeführt. Andere Trocknungsverfahren sind jedoch ebenfalls einsetzbar.
Sowohl die erfindungsgemäßen Blütenextrakte als auch deren wässrige Suspensionen und Trockenmassen zeigen eine antientzündliche oder antivirale Wirkung.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Arzneimittel, bestehend aus einem erfindungsgemäßen Blütenextrakt der genannten Pflanzen(drogen), wie oben beschrieben, oder Trockenmasse oder einem erfindungsgemäßen antientzündlichen oder antiviralen Mittel zur Behandlung von Entzündungserkrankungen/viralen Infektionskrankheiten oder die Verwendung der erfindungsgemäßen antientzündlichen oder antiviralen Mittel als Arzneimittel für Mensch und Tier.
Ferner betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Formulierung enthaltend ein erfindungsgemäßes Arzneimittel bzw. antientzündliches oder antivirales Mittel.
Die antientzündlichen oder antiviralen Mittel können in Form von pharmazeutischen Zubereitungen in Dosierungseinheiten zubereitet werden. Dies bedeutet, dass die Zubereitung in Form einzelner Teile, z. B. Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Suppositorien und Ampullen vorliegen, deren Wirkstoffgehalt einem Bruchteil oder einem Vielfachen einer Einzeldosis entsprechen. Die Dosierungseinheiten können z. B. 1, 2, 3 oder 4 Einzeldosen oder 1/2, 1/3 oder 1/4 einer Einzeldosis enthalten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise die Menge Wirkstoff, die bei einer Applikation verabreicht wird und die gewöhnlich einer ganzen, einer halben, einem Drittel oder einem Viertel einer Tagesdosis entspricht.
Unter nicht-toxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen sind feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und Formulierungshilfsmittel jeder Art zu verstehen.
Als bevorzugte pharmazeutische Formulierungen seien Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Granulate, Suppositorien, Lösungen, Saft, Suspensionen und Emulsionen, Pasten, Salben, Gele, Cremes, Lotions, Puder und (Nasen)Sprays genannt. Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können den oder die Wirkstoffe neben den üblichen Trägerstoffen enthalten, wie a) Füll- und Streckmittel, z. B. Stärken, Milchzucker, Rohrzucker, Glukose, Mannit und Kieselsäure, b) Bindemittel, z. B. Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, c) Feuchthaltemittel, z. B. Glycerin, d) Sprengmittel, z. B. Agar-Agar, Calciumcarbonat und Natriumcarbonat, e) Lösungsverzögerer, z. B. Paraffin und f) Resorptionsbeschleuniger, z. B. quartäre Ammoniumverbindungen, g) Netzmittel, z. B. Cetylalkohol, Glycerinmonostearat, h) Adsorptionsmittel, z. B. Kaolin und Bentonit und i) Gleitmittel, z. B. Talkum, Calcium- und Magnesiumstearat und feste Polyethylenglykole oder Gemische der unter a) bis i) aufgeführten Stoffe.
Die Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können mit den üblichen, gegebenenfalls Opakisierungsmittel enthaltenden Überzügen und Hüllen versehen sein und auch so zusammengesetzt sein, daß sie den oder die Wirkstoffe nur oder bevorzugt in einem bestimmten Teil des Intestinaltraktes gegebenenfalls verzögert abgeben, wobei als Einbettungsmassen z. B. Polymersubstanzen und Wachse verwendet werden können. Der oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls mit einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikroverkapselter Form vorliegen.
Suppositorien können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Trägerstoffe enthalten, z. B. Polyethylenglykole, Fette, z. B. Kakaofett und höhere Ester (z. B. C14-Alkohol mit C16-Fettsäure) oder Gemische dieser Stoffe. Salben, Pasten, Cremes und Gele können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, z. B. tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant-Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Gemische dieser Stoffe.
Puder und Sprays können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, z. B. Milchzucker, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikat und Polyamidpulver oder Gemische dieser Stoffe. Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel enthalten.
Lösungen und Emulsionen können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe wie Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, z. B. Wasser, Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl, Erdnußöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Ricinusöl und Sesamöl, Glycerin, Glycerinformal, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykole und Fettsäureester des Sorbitans oder Gemische dieser Stoffe enthalten.
Suspensionen können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe wie flüssige Verdünnungsmittel, z. B. Wasser, Ethylalkohol, Propylenglykol, Suspendiermittel, z. B. ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit- und Sorbitan-Ester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Stoffe enthalten. Die genannten Formulierungsformen können auch Färbemittel, Konservierungsstoffe sowie geruchs- und geschmacksverbessernde Zusätze, z. B. Pfefferminzöl und Eukalyptusöl und Süßmittel, z. B. Saccharin, enthalten.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Blütenextrakte Gegenstand einer dermatologischen Zusammensetzung, wie oben ausgeführt oder ein Kosmetikum sein.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein Kosmetikum oder dermatologische Zusammensetzung oder ein Mittel zur Körper- und Schönheitspflege enthaltend ein antientzündliches Mittel oder antivirales Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung.
In einer weiteren Ausführungsform kann die erfindungsgemäße kosmetische oder dermatologische Zubereitung zur topischen Verwendung in Form einer Salbe, Creme, Gel, Lotion (Hautmilch), Paste oder vorzugsweise Emulsion erfolgen. Ebenfalls sind wasserfreie Systeme möglich.
Zu den erfindungsgemäß geeigneten wasserfreien Systemen gehören reine Ölzubereitungen wie z. B. Hautöle. Ebenfalls einsetzbare Pasten enthaltend die erfindungsgemäße Zubereitung, zeichnen sich dadurch aus, das sie aus den gleichen oder ähnlichen Bestandteilen wie eine Emulsion bestehen, jedoch im Wesentlichen wasserfrei sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Zubereitung als weiteren Bestandteil einen Emulgator beinhalten. In einer ganz bevorzugten Ausführung kann dieser Emulgator ein O/W-Emulgator sein.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Blütenextrakte aus den Pflanzen wird auf die technischen Lehren, die Gegenstand von EP 1368605B1 , EP 0753306B1 sind, verwiesen.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeispielen. Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung ohne die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken.
Beispiele:
Herstellung eines alkoholischen Blütenextrakts von Primula flos
Ein 2-Liter Rundkolben (braunes Glas) wird mit 1,6 Liter 50% EtOH/H₂O_dest (v/v) gefüllt. 200 g der entsprechenden Blüte wird abgewogen. Sofern notwendig, wird das Blütenmaterial mit einer Mörser zerkleinert. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt (1000 rpm). Nach alkoholischer Extraktion, wird durch Gießen der Mischung in einen lichtgeschützten Rundkolben ein Filtrierungsschritt durchgeführt. Die Extrakte werden mit flüssigem Stickstoff überzogen und in einem Kühlschrank bei 4-8°C aufbewahrt. Alle Chargen werden zusammengeführt um mögliche Unterschiede in der Extraktion zu vermeiden. Die Extraktlösungen werden konzentriert, in einer speed vac getrocknet und dann tiefgefroren (–20°C) und lyophilisiert (Vakuum 0,05–0,1 mbar) für mindestens 24 Stunden. Sofort danach werden Aliquots von 1 g in Glasröhrchen abgewogen und bei –20°C aufbewahrt.
Wirkungen von Primula flos auf den Arachidonsäure-Pathway
Blütenextrakte von Primula flos beeinflussen weder die Expression von NFkB1 (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells) noch die Expression von Cyclooxygenase-2 (COX-2) (siehe Tabelle 1). NF-κB ist ein spezifischer Transkriptionsfaktor. Die Aktivierung von NF-κB gilt als kritisch für die Entstehung von Entzündungen. COX-2 ist ein Enzym, das Arachidonsäure zu Prostaglandin H2 in zwei Schritten oxidiert. Die Synthese von COX-2 wird u. a. bei Entzündungen induziert.
a) Keine Inhibierung der NFkB1-Expression
5 × 10⁵ THP-1 Zellen (humane Makrophagen-Zelllinie)/ml werden mit Vitamin D₃ (10 ng/ml) für 2 Tage inkubiert. Die Zellen werden mit Extrakt von Primula flos behandelt mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml für 1 Stunde und werden mit LPS (100 ng/ml) für weitere 3 Stunden stimuliert. Zellen, die mit 0,1% DMSO behandelt wurden, werden als Referenzwert verwendet. Parthenolid (15 μgM) wird als Positivkontrolle verwendet. Die Gesamt-RNA wird mit dem GenElute^TM Mammalian Total RNA Kit (Sigma, USA) extrahiert, in cDNA mit dem High Capacity cDNA Archive Kit (Applied. Biosystems, USA) revers transkribiert und mit qPCR analysiert. Die Primer und Sonde zur Detektion von NFkB1 wird mit der Primer Express 2.0.0 Software (Applied Biosystems, USA) konstruiert. Die Primer und Sonde zur Detektion von GAP-DH ist ein PreDeveloped TaqMan^® Assay VIC-MGB (Applied Biosystems, USA).
Die Expression von NFkB1 umgerechnet auf GAP-DH wird mit der SDS 1.2.3 Software (Applied Biosystems, USA) berechnet, die auf der vergleichenden Ct-Quantifizierungsmethode beruht. Die Untersuchung wird an zwei unterschiedlichen Tagen durchgeführt und jede Probe wird in Doppelbestimmung untersucht.
b) Keine Inhibierung der COX-2-Expression
2 × 10⁵ THP-1 Zellen/ml werden mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (10 ng/ml) für 2 Tage inkubiert. Die Zellen werden dann mit Extrakt von Primula flos mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml für 1 Stunde behandelt und werden mit LPS (100 ng/ml) für eine weitere Stunde stimuliert. Zellen, die mit 0,1% DMSO behandelt wurden, wurden als Referenzwert verwendet. Dexamethason (500 nM) wird als Positivkontrolle verwendet. Die Gesamt-RNA wird mit dem GenElute^TM Mammalian Total RNA Kit (Sigma, USA) extrahiert, in cDNA mit dem High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, USA) revers transkribiert und mit qPCR analysiert. Die Primer und Sonde zur Detektion von COX-2 wird mit der Primer Express 2.0.0 Software (Applied Biosystems, USA) konstruiert. Die Primer und Sonde zur Detektion von GAP-DH ist ein PreDeveloped TaqMan^® Assay VIC-MGB (Applied Biosystems, USA). Die Expression von COX-2 umgerechnet auf GAP-DH wird mit der SDS 1.2.3 Software (Applied Biosystems, USA) berechnet, die auf der vergleichenden Ct-Quantifizierungsmethode beruht. Die Untersuchung wird an zwei unterschiedlichen Tagen durchgeführt und jede Probe wird in Doppelbestimmung untersucht. Tabelle 1: Keine Inhibierung der Expression von NFkB1 and COX-2 in %

Positivkontrolle⁽¹⁾ Primula flos Charge 1⁽²⁾

NFkB1 Expression⁽²⁾ 100 7.6

COX-2 Expression⁽²⁾ 100 –32.4

(1) Positivkontrolle als 100% Inhibierung
(2) NFkB1-Expression: Parthenolid als Positivkontrolle
COX-2-Expression: Dexamethason als Positivkontrolle
(3) untersuchte Konzentration 50 μg/ml
Wirkungen von Primula flos auf den Arachidonsäure-Pathway (COX-1, COX-2 und 5-LOX) und auf die NO-Produktion
Der Blütenextrakt von Primula flos inhibiert hervorragend die Aktivität von induzierbarem COX-2, fast bis zu 100% der Positivkontrolle. Ferner blockiert der Exktrakt von Primula flos, im Vergleich zur Positivkontrolle, fast 50% der 5-Lipoxygenase(5-Lox)-Aktivität (siehe Tabelle 2).
Die Aktivität von COX-1 wird durch den Extrakt nur schwach reduziert. Die NO-Produktion wird durch Extrakt von Primula flos nicht inhibiert (siehe Tabelle 2). a) Analyse der Inhibierung der Enzyme COX-1 und COX-2

Test-Kit: Assay Designs: PGE2 Correlate EIA Kit (Cat. No. 900-001)

Enzyme: Cayman Chemical Company:

COX-1 (Schaf) von Widder-Samenblase

COX-2 von Schaf Plazenta Kotyledonen
Gemäß dem Test-Kit (PGE2 Correlate EIA Kit) Protokoll wird das entsprechende Enzym (0,2 U/well) inkubiert mit dem entsprechenden Puffer, dem Extrakt von Primula flos und Arachidonsäure (5 μM, Cayman Chemical Company) bei 37 CC in 96 well-Platten. Die Endkonzentration vom Primula flos-Extrakt ist 50 μg/ml. Als Positivkontrollen werden Indomethacin (Endkonzentration in der Testmischung: 1,25 μM) für COX-1 verwendet und NS-398 (Endkonzentration in der Testmischung: 5 μM) wird für COX-2 verwendet.
PGE2-Produktion wird mit ELISA (405 nm) nach dem Herstellerverfahren quantifiziert.
Die Untersuchung wird an zwei unterschiedlichen Tagen durchgeführt und jede Probe wird in Doppelbestimmung untersucht. Die Inhibierung von COX-1 und COX-2 wird mittels der produzierten Menge von PGE2 berechnet. b) Analyse der Inhibierung vom Enzym 5-LOX

Test-Kit: Assay Designs: LTB4 Correlate EIA Kit

Enzym: stimulierte humane polymorphkernige Leukozyten mit 5-Lox-Aktivität.
Die Zellsuspension wird mit Extrakt von Primula flos und Arachidonsäure (4,43 μM, Cayman Chemical Company) bei 37°C in 96-well-Platten inkubiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zusatz von Ameisensäure gestoppt. Die Endkonzentration des Extrakts von Primula flos beträgt 50 μg/ml. Zileuton (Endkonzentration in der Testmischung: 10 μM) wird als Positivkontrolle verwendet.
Das produzierte LTB4 wird mit ELISA (405 nm) nach dem Herstellerverfahren quantifiziert. Die Untersuchung wird an zwei unterschiedlichen Tagen durchgeführt und jede Probe wird in Doppelbestimmung untersucht. Die Inhibierung von 5-LOX wird mittels der produzierten Menge von LTB4 berechnet.
c) Analyse der Inhibierungsaktivität auf induzierbare NO-Synthase (iNOS)
Zelllinie: RAW 264.7 Makrophagen
Zellen werden mit 0,5 μg/ml Lipopolysaccharid (LPS) und 50 U/ml Interferon in Anwesenheit oder Abwesenheit vom Extrakt von Primula flos stimuliert. Die iNOS-Wirkungen werden bestimmt durch die Messung der Nitrit-Freisetzung, welche ein Indikator für die Aktivität der iNOS ist. Die NO-Konzentration wird photometrisch als stabiles Produkt Nitrit in den Zellkulturüberständen gemessen mit Hilfe der Griess-Untersuchungsmethode durch Vergleich mit einer Natriumnitirit-Standardkurve. Die Aktivität wird bezogen auf Nitritakkumulation von Zellen, die mit LPS/IFN-γ/DMSO (0,1%) behandelt sind. N^G-Monomethyl-L-Argininmonoacetat (100 μM) wird als Positivkontrolle verwendet. Tabelle 2: Inhibierung von COX-1, COX-2 und 5-LOX und NO-Produktion in %

Positivkontrolle⁽¹⁾ Primula flos Charge 1⁽³⁾ Primula flos Charge 2⁽³⁾

COX-1⁽²⁾ 100 31.7 35.7

COX-2⁽²⁾ 100 96.5 98.2

5-LOX⁽²⁾ 100 48.6 33.9

NO-Produktion⁽²⁾ 100 10.5 25.1

(1) Positivkontrolle als 100% Inhibierung
(2) COX-1: Indomethacin verwendet als Positivkontrolle
COX-2: NS-398 verwendet als Positivkontrolle
5-LOX: Zileuton verwendet als Positivkontrolle
NO-production: L-NMMA verwendet als Positivkontrolle
(3) untersuchte Konzentration 50 μg/ml
Wirkungen von Primula flos auf die Zytokin-Freisetzung
Der Blütenextrakt von Primula flos inhibiert die TNFα-Produktion in stimulierten Monozyten. Die Sekretion von IL-6 und IL-10 wird nicht beeinflusst (siehe Tabelle 3). Die Zytokinsektretion von IFγ und GM-CSF wird in stimulierten Lymphozyten schwach inhibiert, während IL-2 Sekretion nicht blockiert werden kann (siehe Tabelle 4).
Methode:
Mononukleare Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) werden durch Dichtegradienten-Zentrifugation von heparinisierten Blutproben isoliert; danach werden Monozyten durch die Adhärenz-Methode hergestellt und kultiviert. Nach Vorinkubation mit Testverbindungen für 30 Minuten werden die Zellen mit LPS oder Anti-CD3/Anti-CD28-Beads stimuliert. Zytokinmessungen in Kulturüberständen werden mittels Sandwich-ELISA unter Verwendung von abgestimmten Antikörperpaaren durchgeführt. Stimulierte Zellen bei Abwesenheit der Verbindung werden 100% gesetzt. Die Messwerte der behandelten Zellen werden als Prozentsatz der Zytokinproduktion der Kontrollen ausgedrückt.
Analyse:

1. Sekretion von IL-6, IL-10, TNFα in LPS-stimulierten Monozyten.
2. Sekretion von IL-2, IFNγ und GM-CSF in CD3/28-stimulierten Lymphozyten.

Tabelle 3: Inhibierung von IL-6, IL-10, TNFα in LPS-stimulierten Monozyten durch Primula flos

Positivkontrolle⁽¹⁾ Primula flos Charge 1⁽³⁾

TNFα⁽²⁾ 100 46.1

IL-6⁽²⁾ 100 –15.1

IL-10⁽²⁾ 100 –20.8

(1) Positivkontrolle als 100% Inhibierung
(2) TNFα, IL-6, I1-10: LPS verwendet als Positivkontrolle
(3) untersuchte Konzentration 50 μg/ml Tabelle 4: Inhibierung von IL-2, IFNγ und GM-CSF in CD3/28-stimulierten Lymphozyten durch Primula flos

Positivkontrolle* Primula flos Charge 1

IL-2 100 –10.2

IFNγ 100 39.4

GM-CSF 100 27.8

(1) Positivkontrolle als 100% Inhibierung
(2) IL-2, IFNγ, GM-CSF: CD3/CD28 verwendet als Positivkontrolle.
(3) untersuchte Konzentration 50 μg/ml
Wirkungen von Primula flos auf virale Aktivität
Überraschenderweise inhibiert der Blütenextrakt von Primula flos die virale Aktivität von für die Atemwege relevante virale Stämme. Insbesondere bei den Viren Rous-Sarkom-Virus (RSV) und humanes Rhinovirus Typ 14 (HRV 14) kann eine ausgezeichnete Inhibierung der viralen Aktivität gezeigt werden. Eine schwache Inhibierung der viralen Aktivität ist beim Adenovirus 5 zu verzeichnen (Tabelle 5).
Die Wirksamkeit der Erfindung bei der Behandlung von Virusinfektionen wird beispielhaft anhand der folgenden Experimente erläutert.
Die in vitro Zytotoxizität der Testsubstanzen wird auf virussensitiven Zellen analysiert. Die Testsubstanzen und die entsprechenden Verdünnungen werden eine Stunde nach den viralen Infektionen zu den Zellkulturen zugegeben.
Analysen der in vitro Zytoxität mit dem MTT-Test (MTT = 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) werden an Tag 1 und 5 durchgeführt nach der Zugabe der Substanzen zu den entsprechenden Zellkulturen. Zellen werden für 2 bis 4 Stunden mit einer MTT-Lösung inkubiert. Nach Auflösung der Formazankristalle in DMSO wird die optische Dichte (OD) der Zellkulturüberstände in einem Photometer bei 570 nm analysiert.
Bewertung der in vitro antiviralen Aktivität
Virusempfängliche HeLa- und HEp-2-Zellen werden mit HRV 14, RSV bzw. Adeno 5 infiziert. Als Readout zur Quantifizierung der antiviralen Aktivität dient ein Plaque-Reduktions-Assay (plaque-forming units (PFU)/ml für HRV 14, RSV oder Analysen von cytopathischen Effekten (CPE) für Adeno 5. Als interner Standard zur Überprüfung der Testsysteme dient gegen RSV Ribavirin (Virazol). Im Fall von HRV 14 wird ein interner Laborstandard verwendet. Die Wirksamkeit der Referenzsubstanzen wird in den Testsystemen bestimmt.
Berechnung der relativen Inhibierung (% Inhibierung) der Infektiosität
Nach 4–5 Tagen der in vitro-Kultur sind Virusplaques oder virusspezifische cytopathische Effekte (CPE) sichtbar als ungefärbte Spots oder Läsionen nach Fixierung und Färbung der Zellmonolayer. Die Anzahl von Plaques oder CPE-Läsionen der nicht behandelten Mediumkontrolle definiert 100% Infektion. Die Anzahl der Plaques oder CPE-Läsionen der Testsubstanz behandelten Zellkulturen (Mittelwerte sind abgeleitet von 4 Wiederholungen und zwei unabhängigen Experimenten) werden entsprechend gezählt und verglichen mit der Anzahl der Plaques oder CPE-Läsionen der Mediumkontrolle. Tabelle 5: Wirkung von Primula flos auf die virale Aktivität – EC50 (mittlere effektive Konzentration)

Virusstamm Primula flos

EC₅₀ in μg/ml

RSV 62.5

HRV 14 58.3

Adeno 5 > 100
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 1368605 B1 [0037]
EP 0753306 B1 [0037]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

EMEA Doc. Ref. EMEA/HMPC/64684/2007 [0003]
Basbuel et al. (Antimitotic and antibacterial effects of the Primula veris L. flower extracts. Caryologia; 2008, 61(1): 88–91) [0006]
D. Gemsa und K. Resch in Immunologie. Grundlagen. Klinik. Praxis, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1997, Seiten 135–158 [0007]
NS-398 [0046]

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und Prophylaxe von Entzündungen und/oder viralen Infektionen enthaltend Blütenextrakt aus Primula flos.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Blütenextrakt aus Primula flos in Form eines alkoholischen oder alkoholisch-wässerigen Extrakts vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 und 2, wobei der Blütenextrakt aus Primula flos die Aktivität der Cyclooxygenase-2, 5-Lipoxygenase und/oder die Sekretion von TNFα inhibiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Behandlung und Prophylaxe von viralen Infektionen ausgewählt aus der Gruppe Rous-Sarkom-Virus-Infektion, Rhinovirus-Infektion, Adenovirus-Infektion.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 4, wobei der Blütenextrakt die Aktivität der Viren aus der Gruppe bestehend aus Rous-Sarkom-Virus, humanes Rhinovirus Typ 14, Adenovirus 5 inhibiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur oralen Verabreichung, ggfs. weitere Hilfsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, in Form einer galenischen Formulierung, insbesondere eine orale Formulierung wie Dragees, Tabletten, Filmtabletten, Kapseln, flüssige Verdünnungen, insbesondere Tropfen, Säfte, Sirupe oder eine Formulierung zur topischen Anwendung wie Sprays, Salben, Emulsionen, Puder, Pulver, flüssige oder feste Präparate für die Inhalation, Kompressen, Wund- und Zahnfleischeinlagen, Tamponaden, Tonsillenpinsellösungen, Gurgellösungen oder Spüllösungen für Nase und Ohr oder Lyophilisat.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Prophylaxe und Behandlung von chronischen Entzündungen wie rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Asthma, COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease), allergische Rhinitis, entzündliche Hauterkrankungen, insbesondere atopische Dermatitis, Psoriasis, Osteoporose und Krebs, insbesondere Lungenkrebs, oder krankhafte Zustände, insbesondere Schmerz und Fieber.
Kosmetikum oder dermatologische Zusammensetzung oder ein Mittel zur Körper- und Schönheitspflege enthaltend eine Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur topischen Anwendung, insbesondere zur Prophylaxe von Hautentzündungen, wie atopische Dermatitis, Psoriasis.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung und Prophylaxe von Entzündungen und/oder viralen Infektionen.