DE102010005723A1

DE102010005723A1 - Raman-Vorrichtung, insbesondere Raman-Mikroskop mit einer Vorrichtung zur Detektion eines Raman-Signals einer Probe

Info

Publication number: DE102010005723A1
Application number: DE102010005723A
Authority: DE
Inventors: Peter 89077 Spizig; Olaf Dr. 89233 Hollricher; Wolfram 89081 Ibach; Detlef 89233 Sanchen
Original assignee: Witec Wissenschaftliche Instrumente und Technologie GmbH
Current assignee: Witec Wissenschaftliche Instrumente und Technologie GmbH
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2011-07-28

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Raman-Vorrichtung, insbesondere ein Raman-Mikroskop mit einer Lichtquelle zum Anregen einer Lichtemission in einer Probe, wobei die Lichtquelle Photonen emittiert; einem Detektor zur Detektion der von der Probe emittierten Photonen. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Einrichtung zur Messung der Zeitdifferenz der von der Lichtquelle abgegebenen Photonen und der von der Probe aufgrund der Einwirkung der Photonen der Lichtquelle emittierten Photonen, insbesondere der Raman- und/oder Fluoreszenz-Photonen, umfasst.

Description

Die Erfindung betrifft eine Raman-Vorrichtung, insbesondere ein Raman-Mikroskop mit einer Vorrichtung zur Detektion eines Raman-Signals einer Probe sowie ein Verfahren zur Detektion des Raman-Signals einer Probe und ein Verfahren zur Abbildung der Oberfläche einer Probe.
Mit Hilfe von Raman-Messungen ist es möglich, eine Probe mit einer Lichtquelle, insbesondere einer Laserlichtquelle anzuregen und aufgrund des von der Probe emittierten Raman-Signals chemisch unterschiedliche Materialien der Probe abzubilden.
Bei Raman-Licht handelt es sich um Licht, das bei Anregung einer Probe mit monochromatischem Licht im Spektrum des an der Probe gestreuten Lichtes neben der eingestrahlten Frequenz (Rayleigh-Streuung) noch beobachtet wird. Die Frequenzen des Raman-Lichtes, die unterschiedlich zu der Frequenz des eingestrahlten Lichtes bzw. Anregungslichtes sind, entsprechen den für das zu untersuchende Material charakteristischen Energien von Rotations-, Schwingungs-, Photonen- oder Spin-Flip-Prozessen. Aus dem Raman-Spektrum beziehungsweise dem Raman-Licht lassen sich aufgrund dieser charakteristischen Energien Rückschlüsse auf die untersuchten Substanzen ziehen. Die Raman-Verschiebung gegenüber der Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes kommt durch eine Wechselwirkung des eingestrahlten Lichtes mit der Materie zustande und beruht auf einer Wechselwirkung des Lichtes mit der Materie, bei der Energie vom eingestrahlten Licht auf die Materie übertragen wird beziehungsweise Energie von der Materie auf das Licht übertragen wird. Wie hieraus hervorgeht, ist die Entstehung des Raman-Lichtes somit ein Effekt zweiter Ordnung, weswegen nur ein geringes Signal zur Verfügung steht. Hinzu kommt, dass neben der Emission von Raman-Licht bei sehr vielen Proben es auch zur Anregung von Fluoreszenzprozessen kommt, die das Raman-Signal aufgrund ihrer Intensitätsstärke überlagern. Das Fluoreszenzsignal stellt somit ein Untergrundrauschen für das Raman-Signal dar. Wenn das Untergrundrauschen zu stark wird, wird das viel schwächere Raman-Signal so überlagert, dass bei fluoreszierenden Proben in der Regel kein Raman-Spektrum aufgenommen werden kann, welches Aufschlüsse über die chemischen Eigenschaften der Probe gibt. Dies wird an der nachfolgenden statistischen Betrachtung deutlich. Wenn man annimmt, dass auf einen Detektor innerhalb eines zeitlich gleich bleibenden Messintervalls eine Anzahl an Photonen Pi auftrifft, so ist der Mittelwert aus N Einzelmessung <P> = 1/N Sum(Pi).
Die Schwankung der Einzelmessung, d. h. das Rauschen Pi ist dann Sigma = Sqrt(<P>).
Werden beispielsweise im Mittel 100 Photonen gemessen, so beträgt das Rauschen 10 Photonen. Das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) wäre somit 10.
Fallen jetzt auf einen Detektor 100 Raman-Photonen und 10000 Fluoreszenz-Photonen, so beträgt das Rauschen Sqrt(10000 + 100) ungefähr 100 Photonen. Die 100 Raman-Photonen gehen dann im Rauschuntergrund der Fluoreszenz unter, d. h. das Signal-Rausch-Verhältnis SNR ist 1. Das Rauschen des Signales verhindert somit ein Auftrennen des Meßsignales in ein Raman-Signal und ein Fluoreszenzsignal, z. B. mit mathematischen Methoden.
Ist es möglich, ein weitgehend durch Raman-Photonen erzeugtes Signal zu erhalten, so können mit Hilfe eines Raman-Mikroskopes Probenoberflächen durch Raman-Messungen an unterschiedlichen Probenarten und/oder Probentiefen abgebildet werden.
Besonders bevorzugt ist die konfokale Raman-Mikroskopie.
Die konfokale Raman-Mikroskopie mit einem Raman-Mikroskop eignet sich insbesondere dazu, chemisch unterschiedliche Materialien mit einem hohen Kontrastverhältnis abzubilden. Beispielsweise kann eine Probe bei einer zweidimensionalen konfokalen Raman-Messung mit einem Raman-Mikroskop eine Größe von beispielsweise 10.000 bis 500.000 Rasterpunkten aufweisen. Zu jedem der Punkte wird Licht aufgenommen und aus dem aufgenommenen Licht die Abbildung der Probenoberfläche gewonnen.
Um die Probenoberfläche abzurastern, wird die Probe relativ zur Anregungslichtquelle bzw. dem Detektor bewegt. Dies kann durch eine Bewegung des Detektors bzw. der Anregungslichtquelle und/oder eines Probentisches, auf dem die Probe angeordnet ist, erreicht werden.
Aufgabe der Erfindung ist es somit, eine Raman-Vorrichtung, insbesondere ein Raman-Mikroskop mit einer Vorrichtung zur Detektion eines Raman-Signals anzugeben, die es ermöglicht, auch bei starkem Untergrundrauschen, insbesondere bei fluoreszierenden Proben, Raman-Signale zu detektieren, um die Probenoberfläche abbilden zu können.
Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, dass die Vorrichtung eine Einrichtung zur Messung der Zeitdifferenz der von der Lichtquelle emittierten Photonen und der aufgrund der Einwirkung der von der Lichtquelle emittierten Photonen auf die Probe von der Probe emittierten Photonen, insbesondere der Raman-Photonen und/oder der Fluoreszenz-Photonen aufweist. Hierbei wird ausgenutzt, dass zwar Photonen gleicher Wellenlänge und Polarisation ununterscheidbare Teilchen sind, jedoch die Entstehung eines Raman-Photons sich komplett von der Entstehung eines Fluoreszenz-Photons unterscheidet. Bei der Zeitdifferenzmessung macht man es sich somit zunutze, dass das zeitliche Verhalten zwischen der Anregung des Moleküls mit Hilfe des vom Laser zur Verfügung gestellten Lichtes bei der Emission des Raman-Photons beziehungsweise des Fluoreszenz-Photons auf zeitlich völlig unterschiedlichen Skalen abläuft. So ist die Emission des Raman-Photons im Allgemeinen ein sehr schneller Prozess, der üblicherweise innerhalb von wenigen ps stattfindet. Die Fluoreszenzabklingzeiten liegen hingegen typisch im Bereich von 100 ps bis 10 ns. Zusätzlich kommt bei Fluoreszenzprozessen hinzu, dass die Emission des Fluoreszenz-Photons verzögert erfolgen kann, da die Energie des einwirkenden Photons, das heißt des Photons, das von der Lichtquelle auf die Probe auftrifft, zunächst vom Molekül aufgenommen, umgewandelt und anschließend als Fluoreszenzlicht abgestrahlt wird. Die Messung der Zeitdifferenz, das heißt der Zeit, die zwischen der Anregung der Probe durch das Laserlicht und der Detektion des jeweiligen Photons am Detektor vergeht, ermöglicht es die Photonen nach ihrer Herkunft zuzuordnen. Mit der Zeitmessung lassen sich Photonen sortieren, und zwar in Raman-Photonen und Fluoreszenz-Photonen. Im Allgemeinen dominieren die Raman-Photonen die kurzen Zeiten, d. h. die Photonen, die bereits kurz nach Aussenden des Laserpulses detektiert werden, sind im Wesentlichen Raman-Photonen, wohingegen die Photonen, die erst lange nach Aussenden des Laserpulses detektiert werden, Fluoreszenz-Photonen sind, so dass aufgrund dieser auf unterschiedlichen Zeitskalen ablaufenden Emissionsprozesse eine Sortierung der Photonen möglich ist und insbesondere ein rauscharmes Raman-Signal erhalten wird.
Zur Anregung der Probe wird insbesondere eine gepulste Lichtquelle, und für Anregung mit monochromatischem Licht eine Laserlichtquelle, insbesondere eine gepulste Laserlichtquelle verwandt. Bevorzugt stellt die Laserlichtquelle Laserimpulse mit einer Pulsbreite von 1 ps bis 100 ps, insbesondere 10 ps bis 40 ps, bevorzugt 20 ps zur Verfügung.
Die Repititionsrate derartiger Laser beträgt bevorzugt zwischen 5 MHz und 100 MHz, ganz besonders 10 bis 50 MHz. Die mittlere Leistung des Lasers liegt im Bereich 1 bis 1000 mW. Vorteilhafterweise zeigt der Laser weder eine Drift in der Linienlage noch in der Leistung und weist eine spektrale Breite von weniger als 10·1/cm auf und liegt insbesondere im Bereich 10·1/cm bis 0.1·1/cm. Die ps Pulsdauer ermöglicht eine Faserkopplung sowohl für die Anregung wie für die Detektion, d. h. das Licht des Lasers wird über eine Lichtleitfaser z. B. zu einem Objektiv geleitet, wobei mit dem Objektiv das Licht auf die Probe geleitet bzw. von der Probe aufgenommen wird. Selbstverständlich ist das Einkoppeln von Licht bzw. das Auskoppeln des Lichtes nicht auf die Faserkopplung beschränkt.
Vielmehr sind alle Arten der Ein- und Auskopplung von Licht denkbar, insbesondere auch das direkte Ein- und Auskoppeln des Lichtes.
In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Zeitdifferenzmesseinrichtung derart ausgestaltet, dass sie die Zeitdifferenz zwischen einem Synchronisierungsimpuls, der zu jedem Lichtpuls der Lichtquelle abgegeben wird, und dem Detektorimpuls, der durch die von der Probe emittierten Photonen ausgelöst wird, bestimmt wird.
Eine bevorzugte Ausgestaltung einer derartigen Zeitdifferenzmesseinrichtung ist eine Zeitdifferenzmesseinrichtung basierend auf einem Time to Digital Converter TDC. Als Time-to-Digital Converter (TDC) werden Messkreise bezeichnet, die kurze Zeitintervalle messen und in eine digitale Ausgabe umwandeln.
Der Begriff Time-to-Digital Converter wird üblicherweise dann verwendet, wenn es um Zeitdifferenzmessung im Bereich von etwa 1 ns bis hinab in den Picosekundenbereich geht.
Besonders bevorzugt sind integrierte digitale TDCs, bei denen Time-to-Digital Converter auf einem einzigen Chip integriert wird. Derartige TDCs zeigen eine Genauigkeit – bis zu 10 ps in der Einzelmessung – in Verbindung mit einem großen Dynamikbereich von bis zu 30 Bit.
Integrierte digitale Time-to-Digital Converter basieren auf der Durchlaufzeit einfacher logischer Gatter (z. B. Inverter), welche für die Quantisierung der Zeitdifferenz herangezogen werden.
Man unterscheidet zwei Arten von integrierten digitalen TDCs, und zwar:

– absolute Verzögerungszeit TDCs
– relative Verzögerungszeit TDCs.

Absolute Verzögerungszeit TDCs verwenden die absolute Verzögerungszeit von Signalen durch einfache logische Elemente zur Quantisierung der Zeitdifferenz.
Der Messkreis zählt dann die Anzahl der Gatter-Durchlaufzeiten, die in das zu messende Zeitintervall passen. Die Auflösung hängt direkt von der Basis-Zeiteinheit des Chips ab. Auflösungen im Bereich von 14 bis 100 ps können mit solchen Messkreisen erreicht werden. Die Durchlaufzeit selbst hängt von der Temperatur und der Versorgungsspannung ab.
Während bei TDCs mit absoluter Verzögerungszeit die Auflösung von der Geschwindigkeit des verwendeten Halbleiterprozesses abhängt, kann man dies bei relativen Verzögerungszeiten der TDCs umgehen. Bei diesen TDCs werden zwei Verzögerungsketten mit unterschiedlichen Basis-Durchlaufzeiten eingesetzt. Die relative Verzögerungsdifferenz dient dann als Basis für die Zeitquantisierung.
Ein Time-to-Digital-Converter (TDC) kann beispielsweise in den Controller des Raman-Mikroskops, der das Abscannen und damit die Abbildung einer Probenoberfläche mit Hilfe von Raman-Signalen ermöglicht, integriert sein.
Auch ist es möglich, dass eine einzige TDC-Elektronik mehreren Detektorkanälen, zugeordnet wird.
Bei einem Multiplexbetrieb wird jedem Detektorkanal eine eigene TDC zugeordnet.
Der Detektor zur Detektion der von der Probe emittierten Fluoreszenz- beziehungsweise Raman-Photonen ist ein Detektor, der eine Einphotonenzählung ermöglicht, beispielsweise eine Avalanche-Photodiode (APD), die auch gekühlt sein kann. Obwohl eine Avalanche Photodiode (APD) ein schlechteres Dunkelstromverhalten als ein CCD-Chip aufweist, kann man die Auslesezeit der APD auf den kurzen Zeitbereich begrenzen, in dem Raman-Photonen gemessen werden. Damit reduziert sich die Dunkelzählrate im Raman-Signal. Wird beispielsweise die Probe mit einem 20 MHz-Laser (50 ns Zeitfenster) angeregt und misst man nur die Raman-Photonen in einem 500 ps Zeitfenster, so ist nur noch der 1/100 Teil der Dunkelzählrate im Signal vorhanden. Eine APD erzielt dann ein vergleichbares Dunkelstromverhalten wie ein stark gekühlter CCD-Chip, z. B. bei –60°C.
Anstelle einer einzelnen Avalanche-Photodiode kann auch ein Avalanche-Photodioden-Array vorgesehen sein mit einer Vielzahl von Kanälen, beispielsweise 256 Kanälen. Dies ermöglicht beispielsweise die gleichzeitige Messung vieler Wellenlängen, d. h. eines Wellenlängenspektrums.
Die Avalanche-Photodioden zeichnen sich durch eine hohe Zeitauflösung aus, die bevorzugt besser als 50 ps ist. Alternativ zu einer Avalanche-Photodiode ist es auch möglich, einen Photomultiplier einzusetzen. Die Wahl des Detektors hängt von der untersuchten Wellenlänge ab. Photomultiplier werden für Wellenlängen < 400 nm, Avalanche-Photodioden für Wellenlängen > 400 nm verwandt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Licht der Lichtquelle auf dem Weg zur Probe durch ein Objektiv geleitet und so auf einem Punkt der Probenoberfläche fokussiert. Gleichzeitig kann das Objektiv dazu dienen, das von der Probe emittierte Raman- beziehungsweise Fluoreszenz-Licht aufzunehmen und an den Detektor zu leiten.
Mit Hilfe des Objektives ist insbesondere auch möglich, einen Punkt der Probe, konfokal abzubilden und damit die gesamte Probe abzurasten. Dies ermöglicht eine Abbildung der Probe auch in der Tiefe, d. h. in z-Richtung.
Bei einer konfokalen Abbildung wird eine punktförmige Quelle, vorzugsweise ein Laser, auf einen Punkt der Probe abgebildet. Anschließend wird dieser Bildpunkt vorzugsweise mit derselben Optik, d. h. mit dem gleichen Objektiv auf eine Lochblende, ein sog. Pinhole, vor einem Detektor fokussiert. Anstelle der Anordnung eines separaten Pinholes vor dem Detektor wäre es auch möglich, dass der Detektor selbst das Pinhole darstellt. Insbesondere bei Avalanche-Photodioden, die typischerweise einen Durchmesser von 50 μm aufweisen, bildet der Detektor selbst das Pinhole. Wird diese Art der Abbildung z. B. für die Mikroskopie eingesetzt, so erreicht man eine erhebliche Steigerung des Bildkontrastes, da zur Abbildung nur die Fokusebene des Objektivs beiträgt. Ausserdem ist mit der konfokalen Mikroskopie eine Abbildung des Ramansignales bzw. Fluoreszenzsignales in unterschiedlichen Probentiefen möglich.
Um das Rayleigh-Licht zu unterdrücken, ist vorgesehen, im Strahlengang von der Probe zum Detektor einen Filter vorzusehen. Bevorzugt handelt es sich bei dem Filter um einen Bandpassfilter oder ein Low-Pass-Farbglas oder um einen abstimmbaren Filter mit beispielsweise Prismen beziehungsweise Gittern. Zusätzlich zu einem Filter kann im Strahlengang von der Probe zum Detektor auch ein Spektrometer vorgesehen sein. Das Spektrometer ist dann im Strahlengang vor dem Detektor angeordnet. Die zusammen mit einem Spektrometer eingesetzten Filter sind zum Beispiel Kantenfilter oder holografische Filter. Das Spektrometer selbst kann in Spiegel- oder Linsenoptik ausgelegt sein. Der Vorteil der Ausführungsform der Vorrichtung mit Spektrometer ist, dass das Licht, das von der Probe emittiert wird, auf ein Spektrometer gegeben wird und spektral zerlegt wird. Die spektrale Zerlegung kann z. B. mit einem Gitter oder einem Prisma erfolgen. Wird das so zerlegte Licht mit einer CCD-Kamera aufgenommen, so ist es möglich ein komplettes Spektrum des von der Probe gestreuten Lichtes aufzunehmen. Sieht man innerhalb des Spektrometers einen Klappspiegel vor, so können auch spektrale Bereiche des gesammelten Lichtes auf den Detektor bspw. die Avalanche Photodiode gemäß der Erfindung gegeben werden. Der Vorteil der Zwischenschaltung eines Spektrometers liegt darin, dass z. B. durch Drehen des Gitters im Spektrometer ein beliebiger Spektralbereich für den Detektor zur Messung der Zeitdifferenz selektieren werden kann.
Die Raman-Vorrichtung, insbesondere das Raman-Mikroskop kann einen verfahrbaren Probentisch aufweisen, der es ermöglicht, durch Verfahren der Probe beispielsweise die Probenoberfläche abzubilden. Alternativ oder zusätzlich kann auch die Anregungslichtquelle bzw. der Detektor verfahren werden, um ein Abbild der Probe zu erhalten. Auch ist es möglich, räumliche Karten von spektralen Eigenschaften der Probe aufzunehmen. In Kombination mit einer konfokalen Abbildung ist auch ein Tiefenscan möglich.
Die Verfahrbarkeit des Probentisches ermöglicht ein Abrasten der Probe bzw. eines Probenbereiches, der eine Linie, eine Fläche oder ein Volumen sein kann.
Neben der Vorrichtung gibt die Erfindung auch ein Verfahren zur Detektion eines Raman-Signals an, wobei zunächst ein Lichtpuls mit einer Pulsbreite von 5 ps bis 100 ps, insbesondere 10 ps bis 40 ps zur Verfügung gestellt und auf eine Probe gelenkt wird. In einem zweiten Verfahrensschritt wird das von der Probe emittierte Licht von einem Detektor aufgenommen und anschließend mittels einer Zeitdifferenzmesseinrichtung die Zeitdifferenz zwischen dem Aussenden des Lichtpulses des Lasers und dem vom Detektor detektierten emittierten Licht bestimmt. Das Ergebnis vieler derartiger Zeitdifferenzmessungen ergibt ein Zeitdifferenzsignal in Form einer Abklingkurve.
Besonders bevorzugt ist es, wenn das von der Probe emittierte Licht vor Aufnahme durch den Detektor spektral beispielsweise mit Hilfe eines Spektrometers zerlegt wird.
Das aufgenommene Zeitdifferenzsignal kann zeitlich zerlegt werden. So können die Signale, die von langen Zeiten herrühren, eindeutig Fluoreszenzprozessen bzw. Lumineszenzprozessen zugeordnet werden. Die Fluoreszenzkurve kann dann zu kurzen Zeiten hin extrapoliert werden, so dass es im kurzen Zeitbereich, in dem sowohl Fluoreszenzprozesse wie Raman-Prozesse ablaufen, möglich ist, das Raman-Signal vom Fluoreszenzsignal zu trennen. Da das so erhaltene Raman-Signal wesentlich rauschärmer ist als das Fluoreszenzsignal, eignet sich das Raman-Signal für die Abbildung der Probenoberfläche.
Wie zuvor ausgeführt, kann ein Abbild der Probe bzw. Probenoberfläche durch Rastern der Probe erhalten werden.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand der Figuren beispielhaft ohne Beschränkung hierauf beschrieben werden.
Es zeigen:
1a den prinzipiellen Aufbau eines konfokalen Raman-Mikkroskopes
1b eine erste Variante eines Raman-Mikroskopes mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Detektion eines Raman-Signals
2 eine zweite Variante eines Raman-Mikroskopes mit einer Vorrichtung zur Detektion eines Raman-Signals
3 Zeitspektrum einer Probe aufweisend ein Fluoreszenz-Signal sowie ein Fluoreszenz und Raman-Signal
4a bis 4c Bilder einer Probenoberfläche, wobei zu jedem Punkt der Probenoberfläche die Emissionsabklingzeiten gemäß der Erfindung aufgenommen wurde.
5a Spektren an einem Punkt der Probe in vorgegebenen Zeitbereichen eines Zeitspektrums
5b korrigierte Raman-Spektren, aufgenommen mit einer konventionellen CCD-Kamera und einer Zeitdifferenzmesseinrichtung
6 Zeitspektren bei unterschiedlichen Wellenlängen
7 Spektrum an einem Punkt der Probe aufgenommen von einer CCD-Kamera.
Obwohl vorliegende Erfindung nachfolgend anhand eines konfokalen Raman-Mikroskopes als Beispiel für eine Raman-Vorrichtung beschrieben wird, ist die Erfindung hierauf nicht beschränkt.
In 1a ist der prinzipielle Aufbau eines konfokalen Raman-Mikroskopes zur Aufnahme einer Probenoberfläche dargestellt. Mit Hilfe der konfokalen Raman-Mikroskopie können chemische Eigenschaften und Phasen von flüssigen und festen Komponenten analysiert werden bis in den Bereich des durch Beugung begrenzten Auflösungsvermögens von ungefähr 200 Nanometern. Durch den konfokalen Aufbau wird eine Tiefenauflösung zur Verfügung gestellt, die es erlaubt, die Probe in die Tiefe zu analysieren, ohne beispielsweise Schnitte wie bei der Elektronenmikroskopie durchführen zu müssen.
Bei der konfokalen Mikroskopie wird eine punktförmige Lichtquelle, vorzugsweise ein Laser, auf einen Punkt der Probe abgebildet. Anschließend wird dieser Bildpunkt vorzugsweise mit derselben Optik auf eine Lochblende, ein so genanntes Pin-Hole, vor einem Detektor fokussiert. Die Größe der Lochblende muss dabei kleiner als die beugungsbegrenzte Abbildung des Beleuchtungsbildes sein. Das Bild wird nun dadurch erzeugt, dass ein Punkt der Beleuchtungsquelle über die Probe gerastert wird, die Probe also Punkt für Punkt abgetastet wird. Mit dieser Art der Abbildung erreicht man eine erhebliche Steigerung des Bildkontrastes, da zur Abbildung nur die Fokusebene des Objektivs beiträgt. Außerdem kann die Auflösung aufgrund der Faltung des Beugungspunktes in der Apertur der Lochblende um etwa den Faktor √2 auf λ/3 reduziert werden Zusätzlich kann man ein dreidimensionales Bild der Probenstruktur mit einer axialen Auflösung von etwa einer Wellenlänge erhalten.
Betreffend die konfokale Mikroskopie wird beispielsweise auf die DE 199 02 234 A1 verwiesen.
In 1a ist ein Aufbau eines konfokalen Raman-Mikroskopes beispielsweise des Mikroskopes alpha300 R der Witec GmbH, D – 89081 Ulm, Deutschland, dargestellt. Bei dem konfokalen Raman-Mikroskop 1000 wird das Licht einer Lichtquelle 1010 an einem Strahlteilerspiegel 1012 nach einer Strahlaufweitung 1014 in Richtung der Probe 1016 auf den Probentisch 1018 gelenkt. Der umgelenkte Lichtstrahl 1019 wird dabei durch eine geeignete Optik auf einen Punkt 1020 auf der Probe 1016 fokussiert. Das Licht des Lasers 1010 wechselwirkt mit der Materie der Probe 1016. Es entsteht zum einen von der Probe zurückgestreutes Rayleigh-Licht derselben Wellenlänge wie das eingestrahlte Licht, zum anderen requenzverschobenes Licht. Das Rayleigh-Licht tritt bei Einsatz geeigneter Maßnahmen nicht in die Detektionsoptik ein. Eine mögliche geeignete Maßnahme wäre das Einbringen eines Strahlteilers 1012 in den Strahlengang.
Das zum Rayleigh-Licht, frequenzverschobene Raman-Licht und/oder Fluoreszenzlicht durchtritt den Strahlenteiler 1012. Hinter dem Strahlenteiler 1012 ist das Raman-Licht und/oder Fluoreszenzlicht mit Bezugsziffer 1022 gekennzeichnet. Über ein nicht dargestelltes Pin-Hole wird das Raman-Licht 1022 in eine Lichtleitfaser 1030 eingekoppelt und gelangt in vorliegender Ausführung zu einem Spektrometer 1040. Im Spektrometer 1040 wird der Strahl mit Raman-Licht durch eine geeignete Optik wieder aufgeweitet, ergebend den Strahl 1042, der auf einen Gitterspektralfilter 1044 trifft. Der Gitterspektralfilter 1044 beugt das Licht entsprechend seiner Wellenlänge in unterschiedliche Richtungen, so dass ein spektrales Signal aufgenommen werden kann. Das gebeugte Licht wird von einem Detektor oder einem Detektorarray 50, umfassend beispielsweise eine oder mehrere Avalanche-Dioden, aufgenommen, die eine Einzel-Photonenzählung zulassen.
Das aufgenommene Licht des Detektors 50 wird dann an einen Time-to-Digital Converter (TDC) 10000 übertragen. Mit Hilfe eines Time-to-Digital-Converters wird die Zeitdifferenz zwischen dem Anregungspuls des Lasers 1010 und dem durch die Anregung entstehenden Raman oder Fluoreszenzphoton bestimmt. Der TDC kann einem Detektor zugeordnet sein. Will man ein ganzes Spektrum aufnehmen, so wird ein Detektorarray verwandt, wobei bevorzugt jedem Detektor des Detektorarrays ein TDC zugeordnet ist. Des Weiteren ist die Steuerung 20000 des Probentisches 1018 gezeigt. Das Abrastern der Probe 1016 kann durch Verschieben des als Verschiebetisch 1110 ausgelegten Probentisches erfolgen oder durch Verschieben des Lichtstrahles des Anregungslichtes. Der Rasterbereich des Verschiebetisches 1110 in der X-, Y-Ebene kann zwischen 10 nm und 1000 cm liegen.
Das Bild der Probe entsteht dann durch Abrastern in der X-, Y-Ebene, beispielsweise in Pfeilrichtung 1130.
Zur Justage beziehungsweise zur Beobachtung kann auch Licht einer Weißlichtquelle 1120 auf die Probe 1016 eingekoppelt werden.
In 1b ist ein erster Aufbau eines Raman-Mikroskopes mit einer Vorrichtung gemäß der Erfindung schematisch dargestellt. Der erste Aufbau umfasst eine Lichtquelle 3 zum Anregen einer Lichtemission in einer Probe 5. Das Licht der Lichtquelle wird mit 7 bezeichnet und über ein Strahlteilerbauteils 9 durch ein Objektiv 11 auf die Probenoberfläche 12 gelenkt. Die Probe selbst ist auf einem Probentisch 13 aufgebracht, der in alle drei Raumrichtungen x, y und z verfahrbar ist. Hierdurch ist es möglich, dass die Probe 5 an unterschiedliche Punkte verfahren werden kann und somit mit Hilfe eines zweidimensionalen Scans, beispielsweise in x- und y-Richtung die gesamte Probenoberfläche abgebildet werden kann. Zusätzlich ist auch ein Scan in z-Richtung möglich.
Das auf die Probenoberfläche 12 auftreffende Licht 7 der Lichtquelle 3 tritt in Wechselwirkung mit dem Material der Probe 5. Neben dem Raleigh-Licht mit gleicher Frequenz wie das eingestrahlte Laserlicht 7 entsteht durch Anregung der Materie in der Probe 5 Fluoreszenzlicht und Ramanlicht. Das Fluoreszenz- und Ramanlicht ist mit der Bezugsziffer 20 gekennzeichnet. Durch einen Filter 30, beispielsweise einen Kantenfilter wird das von der Probe 5 gesteuerte Anregungs- bzw. Raleigh-Licht, das durch den Strahlteiler hindurchtritt, gefiltert, so dass nach dem Filter nur noch das Raman- und Fluoreszenzlicht 20 vorliegt, das auf einen Detektor 50 mit Hilfe einer Linse 60 fokussiert wird. Im Falle einer konfokalen Abbildung ist vor dem Detektor ein Pinhole 40 angeordnet. Alternativ kann der Detektor selbst das Pinhole darstellen. Das Objektiv 1 ist derart ausgelegt, dass das Licht des Lasers, d. h. das Anregungslicht 7 auf die Probe fokussiert wird. Gleichzeitig wird das Objektiv 11 auch dazu verwendet, das von der Probe 5 gestreute Licht gleicher Wellenlänge, wie das Anregungslicht und das erzeugte Raman- und Fluoreszenzlicht 20 wieder zu sammeln und über den Strahlteiler an den Detektor weiterzuleiten. Der Detektor ist bevorzugt eine gekühlte Avalanchefotodiode, die als Einzelphotonen empfindlicher Detektor ausgelegt sein kann. Bevorzugt ist die erfindungsgemäße Lichtquelle 3 eine gepulste Laserlichtquelle, wobei Lichtpulse mit einer Pulsdauer im Bereich 5 ps bis 100 ps und einer Repitionrate von 5 MHz bis 100 MHz abgeben werden. Mit Aussenden eines jeden Laserpulses, wird auch ein Synchronision-Signal SYNC an eine Zeiterfassungselektronik 70 übermittelt.
Des Weiteren wird über die Leitung 80, sobald vom Detektor ein Photon detektiert wird, dass entweder einer Fluoreszenz- und Ramanphoton ist, ein Signal an die Zeiterfassungelektronik 70 gesandt. Mit Hilfe der Zeiterfassungselektronik 70 ist es dann möglich eine Zeitdifferenz Δt zwischen dem Laserpuls, dargestellt durch das SYNC-Signal, und dem Detektorsignal, das über Leitung 80 der Zeiterfassungsmesseinrichtung 80 zugeführt wird, zu bestimmen. Bevorzugt umfasst die Zeiterfassungselektronik 70 einen Time-to-digital-converter (TDC).
Der Begriff Time-to-Digital Converter wird üblicherweise dann verwendet, wenn es um Zeitdifferenzmessung im Bereich von etwa 1 ns bis hinab in den Picosekundenbereich geht.
Besonders bevorzugt sind integrierte digitale TDCs, bei denen der Time-to-Digital Converter auf einem einzigen Chip integriert wird. Derartige TDCs zeigen eine Genauigkeit – bis zu 10 ps in der Einzelmessung – in Verbindung mit einem großen Dynamikbereich von bis zu 30 Bit.
Integrierte digitale Time-to-Digital Converter basieren auf der Durchlaufzeit einfacher logischer Gatter (z. B. Inverter), welche für die Quantisierung der Zeitdifferenz herangezogen werden.
Durch die Messung der Zeitdifferenz mit Hilfe des TDC zwischen dem vom Laser mit jedem Laserpuls erzeugten Synchronisationsimpuls SYNC zu den vom Detektor detektierten Photonen kann die Zeit zwischen Anregungspuls und erzeugtem Raman- bzw. Fluoreszenzphotonen bestimmt werden. Durch Betrachtung vieler Photonen kann dann das Zeitverhalten des in der Probe erzeugten Fluoreszenz- bzw. Ramanlichtes ermittelt werden.
Während bei der Ausführungsform gemäß 1b eine spektrale Zerlegung nicht erfolgt, ist dies beim Aufbau gemäß 1a oder 2 möglich. Beim Aufbau gemäß 2 sind gleiche Bauteile wie in 1b mit denselben Bezugsziffern bezeichnet.
Wiederum wird als Lichtquelle 3 bevorzugt eine gepulste Laserlichtquelle verwandt. Das von der gepulsten Laserlichtquelle erzeugte Licht 7 wird über ein Objektiv 11 auf die Oberfläche 12 einer Probe 5 gelenkt. Durch das Licht 7 der Laserlichtquelle wird in der Probe 5 Fluoreszenz- bzw. Ramanlicht 20 angeregt, das wiederum vom Objektiv 11 aufgenommen und durch den Strahlteiler nunmehr nicht direkt einem Detektor 50 mit Pinhole 50, sondern einem Spektrometer 100, wie in 1a gezeigt, zugeführt wird. Im Spektrometer wird beispielsweise mit Hilfe eines Spiegels 110 das Licht 20 auf ein Gitter 120 gelenkt und spektral zerlegt. Der Filter 30 zur Unterdrückung des Raleigh bzw. gestreuten Lichtes 7 gleicher Wellenlänge wie der Laserwellenlänge ist im Strahlengang vor dem Spektrometer 100 angeordnet, so dass nur Raman- und Fluoreszenzlicht 20 in das Spektrometer 100 gelangen.
Das mit dem Anregungsimpuls des Lasers erzeugte der Raman- bzw. Fluoreszenzlicht kann nach seiner spektralen Zerlegung im Spektrometer beispielsweise direkt auf eine CCD-Kamera 130 gelenkt werden, und so ein komplettes Spektrum des von der Probe gestreuten Lichtes 7 und insbesondere des emittierten Raman- und Fluoreszenzlichtes 20 aufgenommen werden. Möchte man eine erfindungsgemäße zeitaufgelöste Messung durchführen, so kann man mit Hilfe eines Spiegels 140 nach spektralen Zerlegung des Lichtes am Gitter 120 einen spektralen Bereich auf einen Detektor 50, bevorzugt einer Einzelphotonenempfindliche Avalanche-Photodiode ausgekoppelt werden.
Ist der Spiegel 140 verstellbar ausgebildet, beispielsweise als Klappspiegel, so ist es möglich zum einen das gesamte Spektrum in einer ersten Stellung auf die CCD-Kamera zu lenken und in einer zweiten Stellung der Avalanche-Photodiode 50 zuzuleiten.
Wie im ersten Falle erfolgt die Messung der Zeitdifferenz mit Hilfe einer TDC-Elektronik durch Aufnahme des Synchronisationssignals SYNC des gepulsten Lasers 3 und der Erfassung der einzelnen Raman- bzw. Fluoreszenz-Photonen mit Hilfe des Detektors 30 bzw. der Avalanche-Photodiode.
Gegenüber dem im Wesentlichen gleichen Aufbau wie in 1b hat die Ausführungsform gemäß 1a bzw. 2 den Vorteil, dass durch Drehen des Gitters 20 im Spektrometer 100 ein beliebiger Spektralbereich für den einzelphotonenempfindlichen Detektor 30 selektiert werden kann. Aufgrund der höheren Zahl von optischen Komponenten ist jedoch die gemessene Signalintensität an dem Detektor bzw. der Photodiode 30 geringer als im Falle des Ausführungsbeispiels gemäß 1b.
Bei den Aufbauten gemäß 1a, 1b und 2 wird die Probe 5 auf einem Probentisch 13 gelagert. Hierdurch ist es möglich durch Rastern der Proben von der Probenoberfläche eine Abbildung zu erzeugen, beispielsweise in Form einer räumlichen Abbildung der zeitaufgelösten spektralen Eigenschaften der Probe. Möchte man lediglich im μm-Bereich eine Probe abrastern, so kann die Verschiebung des Verschiebetisches, beispielsweise mit Hilfe von Piezo-Elementen in einer x-y-Ebene erfolgen. Um Hysterse-Effekt bei der Verwendung von Piezo-Elementen auszugleichen, kann der Tisch kapazitiv geregelt werden. Die Angabe des Rasterbereiches des Verschiebetisches im μm-Bereich ist nur beispielshaft, möglich sind Rasterbereiche von 10 nm–1000 cm. Die Rasterung erfolgt bei Rasterbereich > 1 mm dann beispielsweise mit Hilfe von Motoren, beispielsweise Schrittmotoren.
Wie oben ausgeführt entsteht das Bild der Probe durch Abrastern, beispielsweise mit Hilfe eines Verschiebetisches in der x-y-Ebene. Anstelle eines Verschiebens in der x-y-Ebene mit Hilfe eines Verschiebetisches kann auch die Lichtquelle oder die Einkoppelfaser verschoben werden.
Mit dem Objektiv 11 kann eine Fokussierung des eingekoppelten Lichtes auf einen Punkt vorgenommen werden und der Bildpunkt auf eine Lochblende 40 ein sogenanntes Pinhole vor dem Detektor 50 fokussiert werden. Es ist dann möglich eine konfokale Abbildung eines Punktes auf der Probe vorzunehmen und durch Änderung der Fokuslage ein Tiefenscannen, d. h. ein Scannen in z-Richtung der Probe 5 vorzunehmen.
Im nachfolgenden Ausführungsbeispiel ist in den 3–4c ein derartiger Tiefenscan an einem Probenpunkt bzw. über einen Bereich der Probe mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß 1 detaillierter beschrieben.
Als Probe wurde ein Schichtsystem untersucht bestehend aus einem Objektträger (Glas), einer fluoreszierenden Probe und Polymerfolie sowie Luft.
Wird der konfokale Fokus so gelegt, dass dieser sich in Luft befindet, so werden von der Avalanche-Photodiode 50 in 1 lediglich Fluoreszenzphotonen detektiert. In 3 ist dies deutlich ersichtlich. In 3 ist die Anzahl der Photonen (cts) die von der Avalanche-Photodiode 50 in 1 im Lauf der Zeit t aufgenommen werden, dargestellt.
Wie man aus 3 ersieht, ergibt sich für die Fluoreszenz eine Abklingkurve 200, d. h. die ersten Photonen werden in diesem Ausführungsbeispiel nach ca. 17 ns gezählt, die letzten der Fluoreszenz zuzurechnenden Photonen nach etwa 33 ns. Die Anzahl der Fluoreszenz-Photonen fällt etwa von 17 ns expotenziell ab. Die genannte Zeiten sind lediglich beispielhaft, da die angegebenen absoluten Zeiten Laufzeiteffekte beispielsweise durch Kabellängen oder eine Detektorelektronik beinhalten. Die Zeit, die in 3 aufgetragen ist, ist die Zeitdifferenz, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung ermittelt wurde und die Zeitdifferenz zwischen dem Anregungspuls und dem bzw. den in der Avalanche-Photodiode 30 detektierten Photonen angibt. Bevorzugt wird die Zeitdifferenz gemäß der Erfindung mit einem Time-to-Digital-Converter (TDC) bestimmt.
Bringt man nun den konfokalen Fokus aus der Luft in das Material ein, so werden nicht nur Fluoreszenzphotonen, sondern auch Raman-Photonen detektiert. Im Allgemeinen ist das Signal des nichtaufgelösten Raman-Lichtes cirka 10 mal schwächer als das des Fluoreszenzlichtes. Als Zeitsignal, ist jedoch das Ramansignal, wie 3 zeigt, deutlich detektierbar. Da der Raman-Prozess stets gegenüber dem Fluoreszenzprozess der Prozess mit deutlich schnelleren Emissionsabklingzeiten ist, werden die am Anfang, d. h. im Bereich von ca. 16,5 ns bis 16,8 ns detektierten Photonen des in der Tiefe aufgenommenen Signales 210 in 3 im Wesentlichen dem Raman-Licht zugeordnet. Das Signal 210 für Zeiten im Bereich größer 18 ns werden hingegen dem Floureszenzlicht zugeordnet. Im Bereich für Zeiten länger als 18 ns decken sich die Kurven des Signales 210 und des reinen Floureszenzsignales 200 praktisch vollständig. Wie aus 3 hervorgeht, unterscheiden sich die Emisionsabklingzeiten von Raman- und Fluoreszenzphotenen deutlich. Während das Raman-Signal fast vollständig abgeklungen ist, werden immer noch Fluoreszenzphotonen von der Avalanche-Photodiode 30 gemäß 1 detektiert. Das von den Ramanphotonen herrührende Signal in der Kurve 210 in 3 wird mit 210.1 bezeichnet, dass vom Emissionsverhalten der Fluoreszenzphotonen herrührende Signal mit 210.2.
Wie zu 1a bis 2 beschrieben, kann die Probe an unterschiedliche Punkte verfahren werden. Nimmt man an jedem Punkt der Probe Zeitspektren, wie in 3 dargestellt, auf, so lassen sich bei Integration über bestimmte Zeitbereiche des Zeitspektrums gemäß 3 unterschiedliche Bilder der Probenoberfläche erzeugen. Insbesondere ist es möglich, vom gemeinsamen Raman- und Fluoreszenzsignal das Fluoreszenzsignal abzuziehen und so ein sehr rauscharmes Ramansignal zu erhalten. Dies ist in den 4a bis 4c gezeigt. 4a zeigt ein Bild einer Probe, bei der über den gesamten Zeitraum, d. h. von 0 bis 33 ns des Zeitspektrums gemäß 3 die Photonen integriert wurden. Das Bild gemäß 4a zeigt ein starkes Rauschen. Integriert man, wie in 4c gezeigt lediglich über einen Bereich von 16,5 ns bis 16,8 ns die von der Avalanche-Photodiode detektierten Photonen, wie in 3 dargestellt und mit 230 bezeichnet, so erhält man im wesentlichen nur ein Abbild, das von den Raman-Photonen erzeugt wird. In 4b ist eine Differenz der Bilder gemäß 4a und 4b gezeigt, d. h. 4b zeigt lediglich die Fluoreszenzphotonen da bei der Aufnahme gemäß 4a sowohl Fluoreszenz- wie Raman-Photonen integriert wurden, bei der Aufnahme gemäß 4c aber im Wesentlichen Raman-Photonen. Alle Bilder 4a, 4b und 4c sind in ihrer Dynamik gleich skaliert, lediglich der Offset der Skalierung wurde verschoben. Sowohl 4a, wie 4b zeigen ein starkes Rauschen. Die 4c, die ein Abbild der Ramanphotonen ist, zeigt ein deutlich geringeres Rauschen.
Neben einer Abbildung der Tiefe einer Probe ist es möglich dieselbe Probe, die in den 3–4c untersucht wird auch spektral zu untersuchen beispielsweise mit einem Aufbau gemäß 2. Anstelle eines Ort-Zeit-Scans wurde mit Hilfe der Vorrichtung gemäß 2 ein Spektrum-Zeit-Scan aufgenommen. Bei einem derartigen Spektrum-Zeit-Scan nimmt man für jede Wellenlänge ein Zeitspektrum auf, in dem man beispielsweise das Gitter des Spektrometers dreht. Die aufgenommenen Zeitspektren bei unterschiedlichen Wellenlängen können wieder durch zeitliches Filtern ausgewertet werden und ergeben die in 5a dargestellten Kurven. Hierbei ist dargestellt, die Anzahl der Photonen (cts) über der Wellenlänge 1/cm. Hierbei wurde über den gesamten Zeitbereich des Zeitspektrums integriert. Das sich hieraus ergebende Spektrum 300 zeigt sowohl ein Fluoreszenzspektrum sowie ein überlagertes Raman-Spektrum. Die prominente Bande des überlagerten Raman-Spektrums liegt bei v = 2900·1/cm. Integriert man ausschließlich Photonen im Zeitbereich 18,6 ns bis 33 ns so ergibt sich das Spektrum 310. Wie zu erkennen ist, weist diese Spektrum 310 keine prominente Bande, die auf Raman-Photonen hindeutet auf, und stellt somit ausschließlich das Fluoreszenzspektrum dar. Wertet man lediglich kurze Zeiten des Zeitspektrums beispielsweise zwischen 18,1 ns und 18,4 ns aus, so wird im Wesentlichen ein Raman-Spektrum 320 erhalten.
5b zeigt im Vergleich ein Raman-Spektrum 800, das mit der erfindungsgemäßen Zeitdifferenz-Messmethode aufgenommen wurde, zu einem Raman-Spektrum 510, das mit einer konventionellen CCD-Kamera nach einem Gitterspektrometer aufgenommen und bei dem mit Hilfe eines Fit-Programmes, der Fluoreszenzuntergrund angefittet und abgezogen wurde.
Wie deutlich zu erkennen, ergibt sich für die konventionelle Messung mit CCD-Kamera und Korrektur ein sehr verrauschtes Spektrum, wohingegen bei dem mit Hilfe der Zeiterfassungsmethode aufgenommenen Spektrum 800 das Rauschen deutlich geringer ist.
Dies ist darauf zurückzuführen, dass der Rauschanteil der Fluoreszenz weit höher ist als der Rauschanteil des Raman-Signals. Bei der ersten Methode, bei der lediglich von dem von der CCD-Kamera aufgenommenen Spektrum das Fluoreszenzspektrum mathematisch abgezogen wurde, ist das Rauschen deutlich höher als bei dem mit Hilfe der Zeiterfassung ermittelten Raman-Spektrum.
5b zeigt sehr eindrücklich die Vorteile der erfindungsgemäßen Messmethode, bei der mit Hilfe der Zeitdifferenz-Messeinrichtung die Photonen zeitlich zugeordnet werden, gegenüber einer Messmethode, die eine zeitliche Zuordnung nicht vornimmt, sondern lediglich die Intensität von Photonen auf integriert.
In 6 sind für bestimmte Wellenlängen die Zeitspektren, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Zeitdifferenz-Messverfahrens aufgenommen wurden, dargestellt. Nimmt man beispielsweise bei einer Wellenzahl v = 1400 1/cm eine Zeit auf, so ergibt sich Kurve 410. Kurve 410 zeigt sowohl eine Ramanzeitkurve bzw. ein Ramanzeitsignal 410.1 wie eine Fluoreszenzzeitkurve bzw. ein Fluoreszenzzeitsignal 410.2. Hierbei ist das Ramanzeitsignal 410.1 im Bereich der kurzen Zeiten das heisst im Bereich von 18,1 bis 18.4 ns prominent und wird mit 430 gekennzeichnet. Wird hingegen die Wellenzahl v = 1500 1/cm ausgewählt, so ergibt sich das Zeitspektrum 420, das im Wesentlichen auf Fluoreszenzprozessen beruht.
Wird nunmehr der Spiegel 140 in 2 so gestellt, dass das Licht nicht mehr auf die Photodiode 50 und die nachgeschaltete Zeiterfassungsmessung gesandt wird, sondern auf den CCD-Chip 130, so kann ein konventionelles Spektrum 900 wie in 7 dargestellt aufgenommen werden. Bei dem konventionellen Spektrum 900 lässt sich Fluoreszenz- und Ramanlicht nur schwierig trennen, beispielsweise, indem man das Fluoreszenzsignal, wie in 5b beschrieben, mathematisch abzieht. Dies führt allerdings zu wesentlich verrauschteren Spektren als im Fall der erfindungsgemäßen Messmethode.
Mit der Erfindung wird erstmals eine Vorrichtung angegeben, die es erlaubt, aufgrund von Zeitmessung der Photonen die Raman-Photonen von den Fluoreszenzphotonen zu trennen und so Fluoreszenzuntergrundrauschen stark zu unterdrücken, was eine hochaufgelöste Aufnahme von Ramanspektren oder zweidimensionalen Scans von Probenoberfläche auf der Basis von Ramansignal auch bei fluoreszierenden Proben ermöglicht.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 19902234 A1 [0055]

Claims

Raman-Vorrichtung, insbesondere Raman-Mikroskop mit einer Lichtquelle (3) zum Anregen einer Lichtemission in einer Probe (5), wobei die Lichtquelle Photonen emittiert; einem Detektor (50) zur Detektion der von der Probe in der Lichtemission emittierten Photonen, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Einrichtung (80) zur Messung der Zeitdifferenz der von der Lichtquelle abgegebenen Photonen (7) und der von der Probe aufgrund der Einwirkung der Photonen der Lichtquelle emittierten Photonen, insbesondere der Raman- und/oder Fluoreszenz-Photonen (20), umfasst.
Raman-Vorrichtung, insbesondere Raman-Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle eine gepulste Lichtquelle, bevorzugt eine gepulste Laserlichtquelle, insbesondere eine gepulste Laserlichtquelle mit einem Lichtpuls von 5 ps bis 100 ps, insbesondere 10 ps bis 40 ps Dauer, ganz bevorzugt ein gepulste Laserlichtquelle mit einem Lichtpuls von 5 ps bis 100 ps, insbesondere 10 ps bis 40 ps Dauer und einer Repititionsrate von 5 MHz bis 100 MHz, ganz besonders von 10 MHz bis 50 MHz, ist.
Raman-Vorrichtung, insbesondere Raman-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (80) zur Messung der Zeitdifferenz derart ausgestaltet ist, dass die Zeitdifferenz zwischen einem Synchronisierungsimpuls (SYNC) zu jedem Lichtpuls der Lichtquelle und dem bzw. den vom Detektor (50) von der Probe aufgenommenen Photon(en), insbesondere Raman- und Floureszenzphoton(en) (20) bestimmt wird.
Raman-Vorrichtung, insbesondere Raman-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (80) zur Messung der Zeitdifferenz einen Time-to-Digital-Converter, insbesondere in Form eines integrierten Bauteils, umfasst.
Raman-Vorichtung, insbesondere Raman-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Strahlengang von der Lichtquelle (3) zur Probe (5) wenigstens ein Objektiv (11) vorgesehen ist, mit dem das Licht (7) der Lichtquelle (3) auf die Probe (5) fokussiert und das von der Probe emittierte Licht (7, 20) gesammelt wird.
Raman-Vorrichtung, insbesondere Raman-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Strahlengang von der Probe (5) zum Detektor (50) ein Filter (30) und/oder ein Spektrometer (100) vorgesehen ist.
Verfahren zur Detektion des Raman und/oder Fluoreszenzsignales einer Probe umfassend folgende Schritte: – es wird mittels eines gepulsten Lasers ein Lichtpuls bevorzugt mit 5 ps bis 100 ps, insbesondere 10 ps bis 40 ps Dauer zur Verfügung gestellt; – das Licht des Laserpulses wird auf eine Probe gelenkt; – das von der Probe emittierte Licht wird von einem Detektor aufgenommen; – mittels einer Zeitdifferenzmesseinrichtung (80) wird die Zeitdifferenz zwischen dem Lichtpuls des Lasers und dem vom Detektor detektierten von der Probe emittierten Licht bestimmt, ergebend ein Zeitdifferenzsignal (210, 410).
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das von der Probe emittierte Licht vor Aufnahme durch den Detektor spektral zerlegt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass dass das Zeitdifferenzsignal (210, 410) in ein Fluoreszenzsignal (200, 410.2) und ein Ramansignal aufgespalten wird, insbesondere durch Zuordnung von schnell emittierten Photonen zum Ramansignal und langsam emittierten Photonen zum Fluoreszenzsignal.
Verfahren zur Abbildung der Oberfläche einer Probe, wobei die Probe auf einem verfahrbaren Probentisch angeordnet ist, umfassend die folgenden Schritte: – die Probe wird in eine erste Position verbracht und mit einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 wenigstens ein Zeitdifferenzsignal aufgenommen und gegebenenfalls hieraus ein rauscharmes Raman-Signal gewonnen; – nach Aufnahme des Zeitdifferenzsignals wird in einem weiteren Schritt die Probe an einem weiteren Punkt verfahren und dort wiederum ein Zeitdifferenzsignal gemäß einem der Verfahren 7 bis 9 aufgenommen und gegebenenfalls hieraus ein rauscharmes Raman-Signal gewonnen, wobei die Schritte solange wiederholt werden, bis ein Probenbereich abgerastert ist, beispielsweise eine Linie, eine Fläche oder ein Volumen.