DE102010005723A1

DE102010005723A1 - Raman device i.e. Raman microscope, for recording sample surface, has time difference measuring device measuring photons and Raman and/or fluorescence photons emitted by sample based on effect of photons of light source

Info

Publication number: DE102010005723A1
Application number: DE102010005723A
Authority: DE
Inventors: Peter 89077 Spizig; Olaf Dr. 89233 Hollricher; Wolfram 89081 Ibach; Detlef 89233 Sanchen
Original assignee: Witec Wissenschaftliche Instrumente und Technologie GmbH
Current assignee: Witec Wissenschaftliche Instrumente und Technologie GmbH
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2011-07-28

Abstract

The device has a light source (3) i.e. laser light source, for stimulating light emission in a sample (5), where the light source emits photons (7). A detector (50) e.g. avalanche photodiode, detects the photons emitted by the sample in the light emission. A time difference measuring device (80) measures the photons emitted by the light source and photons i.e. Raman and/or fluorescence photons (20), emitted by the sample based on an effect of photons of the light source. A lens (11) is provided in an optical path of the light source. Independent claims are also included for the following: (1) a method for detecting Raman and/or fluorescence signal of a sample (2) a method for forming a surface of a sample.

Description

Die Erfindung betrifft eine Raman-Vorrichtung, insbesondere ein Raman-Mikroskop mit einer Vorrichtung zur Detektion eines Raman-Signals einer Probe sowie ein Verfahren zur Detektion des Raman-Signals einer Probe und ein Verfahren zur Abbildung der Oberfläche einer Probe.The invention relates to a Raman device, in particular a Raman microscope with a device for detecting a Raman signal of a sample and a method for detecting the Raman signal of a sample and a method for imaging the surface of a sample.

Mit Hilfe von Raman-Messungen ist es möglich, eine Probe mit einer Lichtquelle, insbesondere einer Laserlichtquelle anzuregen und aufgrund des von der Probe emittierten Raman-Signals chemisch unterschiedliche Materialien der Probe abzubilden.By means of Raman measurements, it is possible to excite a sample with a light source, in particular a laser light source, and to image chemically different materials of the sample on the basis of the Raman signal emitted by the sample.

Bei Raman-Licht handelt es sich um Licht, das bei Anregung einer Probe mit monochromatischem Licht im Spektrum des an der Probe gestreuten Lichtes neben der eingestrahlten Frequenz (Rayleigh-Streuung) noch beobachtet wird. Die Frequenzen des Raman-Lichtes, die unterschiedlich zu der Frequenz des eingestrahlten Lichtes bzw. Anregungslichtes sind, entsprechen den für das zu untersuchende Material charakteristischen Energien von Rotations-, Schwingungs-, Photonen- oder Spin-Flip-Prozessen. Aus dem Raman-Spektrum beziehungsweise dem Raman-Licht lassen sich aufgrund dieser charakteristischen Energien Rückschlüsse auf die untersuchten Substanzen ziehen. Die Raman-Verschiebung gegenüber der Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes kommt durch eine Wechselwirkung des eingestrahlten Lichtes mit der Materie zustande und beruht auf einer Wechselwirkung des Lichtes mit der Materie, bei der Energie vom eingestrahlten Licht auf die Materie übertragen wird beziehungsweise Energie von der Materie auf das Licht übertragen wird. Wie hieraus hervorgeht, ist die Entstehung des Raman-Lichtes somit ein Effekt zweiter Ordnung, weswegen nur ein geringes Signal zur Verfügung steht. Hinzu kommt, dass neben der Emission von Raman-Licht bei sehr vielen Proben es auch zur Anregung von Fluoreszenzprozessen kommt, die das Raman-Signal aufgrund ihrer Intensitätsstärke überlagern. Das Fluoreszenzsignal stellt somit ein Untergrundrauschen für das Raman-Signal dar. Wenn das Untergrundrauschen zu stark wird, wird das viel schwächere Raman-Signal so überlagert, dass bei fluoreszierenden Proben in der Regel kein Raman-Spektrum aufgenommen werden kann, welches Aufschlüsse über die chemischen Eigenschaften der Probe gibt. Dies wird an der nachfolgenden statistischen Betrachtung deutlich. Wenn man annimmt, dass auf einen Detektor innerhalb eines zeitlich gleich bleibenden Messintervalls eine Anzahl an Photonen Pi auftrifft, so ist der Mittelwert aus N Einzelmessung <P> = 1/N Sum(Pi).Raman light is light that is still observed when a sample of monochromatic light is excited in the spectrum of the light scattered on the sample, in addition to the incident frequency (Rayleigh scattering). The frequencies of the Raman light, which are different from the frequency of the incident light or excitation light, correspond to the energies of rotational, oscillation, photon or spin-flip processes characteristic of the material to be investigated. From the Raman spectrum or the Raman light, conclusions can be drawn on the investigated substances on the basis of these characteristic energies. The Raman shift compared to the wavelength of the incident light is due to an interaction of the incident light with matter and is based on an interaction of light with matter, in which energy is transferred from the incident light to matter or energy from matter to the matter Light is transmitted. As can be seen from this, the formation of the Raman light is thus a second-order effect, which is why only a small signal is available. In addition, in addition to the emission of Raman light in many samples, there is also the excitation of fluorescence processes, which superimpose the Raman signal due to their intensity. The fluorescence signal thus represents a background noise for the Raman signal. If the background noise is too strong, the much weaker Raman signal is superimposed so that in the case of fluorescent samples usually no Raman spectrum can be recorded, which provides information about the chemical Properties of the sample gives. This becomes clear in the following statistical analysis. Assuming that a number of photons Pi is incident on a detector within a measurement interval that is the same in time, the average of N single measurement is <P> = 1 / N Sum (Pi).

Die Schwankung der Einzelmessung, d. h. das Rauschen Pi ist dann Sigma = Sqrt(<P>).The variation of the single measurement, d. H. the noise Pi is then Sigma = Sqrt (<P>).

Werden beispielsweise im Mittel 100 Photonen gemessen, so beträgt das Rauschen 10 Photonen. Das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) wäre somit 10.If, for example, an average of 100 photons is measured, the noise is 10 photons. The signal-to-noise ratio (SNR) would thus be 10.

Fallen jetzt auf einen Detektor 100 Raman-Photonen und 10000 Fluoreszenz-Photonen, so beträgt das Rauschen Sqrt(10000 + 100) ungefähr 100 Photonen. Die 100 Raman-Photonen gehen dann im Rauschuntergrund der Fluoreszenz unter, d. h. das Signal-Rausch-Verhältnis SNR ist 1. Das Rauschen des Signales verhindert somit ein Auftrennen des Meßsignales in ein Raman-Signal und ein Fluoreszenzsignal, z. B. mit mathematischen Methoden.If 100 Raman photons and 10,000 fluorescence photons now fall on a detector, the noise Sqrt (10000 + 100) is approximately 100 photons. The 100 Raman photons then go under in the background noise of the fluorescence, d. H. the signal-to-noise ratio SNR is 1. The noise of the signal thus prevents a separation of the measurement signal into a Raman signal and a fluorescence signal, for. B. with mathematical methods.

Ist es möglich, ein weitgehend durch Raman-Photonen erzeugtes Signal zu erhalten, so können mit Hilfe eines Raman-Mikroskopes Probenoberflächen durch Raman-Messungen an unterschiedlichen Probenarten und/oder Probentiefen abgebildet werden.If it is possible to obtain a signal largely generated by Raman photons, sample surfaces can be imaged by Raman measurements on different sample types and / or sample depths with the aid of a Raman microscope.

Besonders bevorzugt ist die konfokale Raman-Mikroskopie.Particularly preferred is confocal Raman microscopy.

Die konfokale Raman-Mikroskopie mit einem Raman-Mikroskop eignet sich insbesondere dazu, chemisch unterschiedliche Materialien mit einem hohen Kontrastverhältnis abzubilden. Beispielsweise kann eine Probe bei einer zweidimensionalen konfokalen Raman-Messung mit einem Raman-Mikroskop eine Größe von beispielsweise 10.000 bis 500.000 Rasterpunkten aufweisen. Zu jedem der Punkte wird Licht aufgenommen und aus dem aufgenommenen Licht die Abbildung der Probenoberfläche gewonnen.Confocal Raman microscopy with a Raman microscope is particularly suitable for imaging chemically different materials with a high contrast ratio. For example, in a two-dimensional confocal Raman measurement with a Raman microscope, a sample may have a size of, for example, 10,000 to 500,000 halftone dots. Light is recorded at each of the points and the image of the sample surface is obtained from the recorded light.

Um die Probenoberfläche abzurastern, wird die Probe relativ zur Anregungslichtquelle bzw. dem Detektor bewegt. Dies kann durch eine Bewegung des Detektors bzw. der Anregungslichtquelle und/oder eines Probentisches, auf dem die Probe angeordnet ist, erreicht werden.To scan the sample surface, the sample is moved relative to the excitation light source or detector. This can be achieved by a movement of the detector or the excitation light source and / or a sample table on which the sample is arranged.

Aufgabe der Erfindung ist es somit, eine Raman-Vorrichtung, insbesondere ein Raman-Mikroskop mit einer Vorrichtung zur Detektion eines Raman-Signals anzugeben, die es ermöglicht, auch bei starkem Untergrundrauschen, insbesondere bei fluoreszierenden Proben, Raman-Signale zu detektieren, um die Probenoberfläche abbilden zu können.The object of the invention is thus to provide a Raman device, in particular a Raman microscope with a device for detecting a Raman signal, which makes it possible to detect Raman signals even in strong background noise, especially in fluorescent samples to the To be able to image sample surface.

Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, dass die Vorrichtung eine Einrichtung zur Messung der Zeitdifferenz der von der Lichtquelle emittierten Photonen und der aufgrund der Einwirkung der von der Lichtquelle emittierten Photonen auf die Probe von der Probe emittierten Photonen, insbesondere der Raman-Photonen und/oder der Fluoreszenz-Photonen aufweist. Hierbei wird ausgenutzt, dass zwar Photonen gleicher Wellenlänge und Polarisation ununterscheidbare Teilchen sind, jedoch die Entstehung eines Raman-Photons sich komplett von der Entstehung eines Fluoreszenz-Photons unterscheidet. Bei der Zeitdifferenzmessung macht man es sich somit zunutze, dass das zeitliche Verhalten zwischen der Anregung des Moleküls mit Hilfe des vom Laser zur Verfügung gestellten Lichtes bei der Emission des Raman-Photons beziehungsweise des Fluoreszenz-Photons auf zeitlich völlig unterschiedlichen Skalen abläuft. So ist die Emission des Raman-Photons im Allgemeinen ein sehr schneller Prozess, der üblicherweise innerhalb von wenigen ps stattfindet. Die Fluoreszenzabklingzeiten liegen hingegen typisch im Bereich von 100 ps bis 10 ns. Zusätzlich kommt bei Fluoreszenzprozessen hinzu, dass die Emission des Fluoreszenz-Photons verzögert erfolgen kann, da die Energie des einwirkenden Photons, das heißt des Photons, das von der Lichtquelle auf die Probe auftrifft, zunächst vom Molekül aufgenommen, umgewandelt und anschließend als Fluoreszenzlicht abgestrahlt wird. Die Messung der Zeitdifferenz, das heißt der Zeit, die zwischen der Anregung der Probe durch das Laserlicht und der Detektion des jeweiligen Photons am Detektor vergeht, ermöglicht es die Photonen nach ihrer Herkunft zuzuordnen. Mit der Zeitmessung lassen sich Photonen sortieren, und zwar in Raman-Photonen und Fluoreszenz-Photonen. Im Allgemeinen dominieren die Raman-Photonen die kurzen Zeiten, d. h. die Photonen, die bereits kurz nach Aussenden des Laserpulses detektiert werden, sind im Wesentlichen Raman-Photonen, wohingegen die Photonen, die erst lange nach Aussenden des Laserpulses detektiert werden, Fluoreszenz-Photonen sind, so dass aufgrund dieser auf unterschiedlichen Zeitskalen ablaufenden Emissionsprozesse eine Sortierung der Photonen möglich ist und insbesondere ein rauscharmes Raman-Signal erhalten wird.According to the invention, this is achieved in that the device comprises a device for measuring the time difference of the photons emitted by the light source and the photons emitted by the sample due to the action of the photons emitted by the light source, in particular the Raman photons and / or the Has fluorescence photons. It is exploited that, although photons of the same wavelength and Polarization are indistinguishable particles, but the formation of a Raman photon is completely different from the formation of a fluorescence photon. In the time difference measurement, it makes use of the fact that the temporal behavior between the excitation of the molecule with the help of the light provided by the laser at the emission of the Raman photon or the fluorescence photon proceeds on time completely different scales. So the emission of the Raman photon is generally a very fast process, which usually takes place within a few ps. The fluorescence decay times, on the other hand, are typically in the range of 100 ps to 10 ns. In addition, in fluorescence processes, the emission of the fluorescence photon can be delayed because the energy of the acting photon, that is, the photon incident on the sample from the light source, is first picked up by the molecule, converted, and then emitted as fluorescent light , The measurement of the time difference, ie the time that elapses between the excitation of the sample by the laser light and the detection of the respective photon at the detector, makes it possible to assign the photons according to their origin. With the measurement of time, photons can be sorted into Raman photons and fluorescence photons. In general, the Raman photons dominate the short times, ie the photons that are already detected shortly after the laser pulse is emitted are essentially Raman photons, whereas the photons that are detected only long after the laser pulse is emitted are fluorescence photons , so that due to these running on different time scales emission processes, a sorting of the photons is possible and in particular a low-noise Raman signal is obtained.

Zur Anregung der Probe wird insbesondere eine gepulste Lichtquelle, und für Anregung mit monochromatischem Licht eine Laserlichtquelle, insbesondere eine gepulste Laserlichtquelle verwandt. Bevorzugt stellt die Laserlichtquelle Laserimpulse mit einer Pulsbreite von 1 ps bis 100 ps, insbesondere 10 ps bis 40 ps, bevorzugt 20 ps zur Verfügung.In particular, a pulsed light source is used to excite the sample, and a laser light source, in particular a pulsed laser light source, is used for excitation with monochromatic light. Preferably, the laser light source provides laser pulses having a pulse width of 1 ps to 100 ps, in particular 10 ps to 40 ps, preferably 20 ps.

Die Repititionsrate derartiger Laser beträgt bevorzugt zwischen 5 MHz und 100 MHz, ganz besonders 10 bis 50 MHz. Die mittlere Leistung des Lasers liegt im Bereich 1 bis 1000 mW. Vorteilhafterweise zeigt der Laser weder eine Drift in der Linienlage noch in der Leistung und weist eine spektrale Breite von weniger als 10·1/cm auf und liegt insbesondere im Bereich 10·1/cm bis 0.1·1/cm. Die ps Pulsdauer ermöglicht eine Faserkopplung sowohl für die Anregung wie für die Detektion, d. h. das Licht des Lasers wird über eine Lichtleitfaser z. B. zu einem Objektiv geleitet, wobei mit dem Objektiv das Licht auf die Probe geleitet bzw. von der Probe aufgenommen wird. Selbstverständlich ist das Einkoppeln von Licht bzw. das Auskoppeln des Lichtes nicht auf die Faserkopplung beschränkt.The repetition rate of such lasers is preferably between 5 MHz and 100 MHz, very particularly 10 to 50 MHz. The average power of the laser is in the range 1 to 1000 mW. Advantageously, the laser exhibits neither a drift in the line position nor in the power and has a spectral width of less than 10 · 1 / cm and is in particular in the range 10 · 1 / cm to 0.1 · 1 / cm. The ps pulse duration allows fiber coupling for both excitation and detection, i. H. the light of the laser is transmitted via an optical fiber z. B. directed to a lens, with the lens, the light is passed to the sample or recorded by the sample. Of course, the coupling of light or the decoupling of the light is not limited to the fiber coupling.

Vielmehr sind alle Arten der Ein- und Auskopplung von Licht denkbar, insbesondere auch das direkte Ein- und Auskoppeln des Lichtes.Rather, all types of coupling and decoupling of light are conceivable, in particular the direct coupling and decoupling of the light.

In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Zeitdifferenzmesseinrichtung derart ausgestaltet, dass sie die Zeitdifferenz zwischen einem Synchronisierungsimpuls, der zu jedem Lichtpuls der Lichtquelle abgegeben wird, und dem Detektorimpuls, der durch die von der Probe emittierten Photonen ausgelöst wird, bestimmt wird.In an advantageous embodiment, the time difference measuring device is designed such that it determines the time difference between a synchronization pulse, which is emitted at each light pulse of the light source, and the detector pulse, which is triggered by the photons emitted by the sample.

Eine bevorzugte Ausgestaltung einer derartigen Zeitdifferenzmesseinrichtung ist eine Zeitdifferenzmesseinrichtung basierend auf einem Time to Digital Converter TDC. Als Time-to-Digital Converter (TDC) werden Messkreise bezeichnet, die kurze Zeitintervalle messen und in eine digitale Ausgabe umwandeln.A preferred embodiment of such a time difference measuring device is a time difference measuring device based on a Time to Digital Converter TDC. Time-to-digital converters (TDCs) are measuring circuits that measure short time intervals and convert them into a digital output.

Der Begriff Time-to-Digital Converter wird üblicherweise dann verwendet, wenn es um Zeitdifferenzmessung im Bereich von etwa 1 ns bis hinab in den Picosekundenbereich geht.The term time-to-digital converter is usually used when it comes to time difference measurement in the range of about 1 ns down to the picosecond range.

Besonders bevorzugt sind integrierte digitale TDCs, bei denen Time-to-Digital Converter auf einem einzigen Chip integriert wird. Derartige TDCs zeigen eine Genauigkeit – bis zu 10 ps in der Einzelmessung – in Verbindung mit einem großen Dynamikbereich von bis zu 30 Bit.Particularly preferred are integrated digital TDCs, in which time-to-digital converter is integrated on a single chip. Such TDCs show accuracy - up to 10 ps in single measurement - in conjunction with a large dynamic range of up to 30 bits.

Integrierte digitale Time-to-Digital Converter basieren auf der Durchlaufzeit einfacher logischer Gatter (z. B. Inverter), welche für die Quantisierung der Zeitdifferenz herangezogen werden.Integrated digital time-to-digital converters are based on the throughput time of simple logic gates (eg inverters), which are used for the quantization of the time difference.

Man unterscheidet zwei Arten von integrierten digitalen TDCs, und zwar:

– absolute Verzögerungszeit TDCs
– relative Verzögerungszeit TDCs.

There are two types of integrated digital TDCs, namely:

- absolute delay time TDCs
- relative delay time TDCs.

Absolute Verzögerungszeit TDCs verwenden die absolute Verzögerungszeit von Signalen durch einfache logische Elemente zur Quantisierung der Zeitdifferenz.Absolute Delay Time TDCs use the absolute delay time of signals through simple logic elements to quantize the time difference.

Der Messkreis zählt dann die Anzahl der Gatter-Durchlaufzeiten, die in das zu messende Zeitintervall passen. Die Auflösung hängt direkt von der Basis-Zeiteinheit des Chips ab. Auflösungen im Bereich von 14 bis 100 ps können mit solchen Messkreisen erreicht werden. Die Durchlaufzeit selbst hängt von der Temperatur und der Versorgungsspannung ab.The measuring circuit then counts the number of gate cycle times that fit in the time interval to be measured. The resolution depends directly on the base time unit of the chip. Resolutions in the range of 14 to 100 ps can be achieved with such measuring circuits. The cycle time itself depends on the temperature and the supply voltage.

Während bei TDCs mit absoluter Verzögerungszeit die Auflösung von der Geschwindigkeit des verwendeten Halbleiterprozesses abhängt, kann man dies bei relativen Verzögerungszeiten der TDCs umgehen. Bei diesen TDCs werden zwei Verzögerungsketten mit unterschiedlichen Basis-Durchlaufzeiten eingesetzt. Die relative Verzögerungsdifferenz dient dann als Basis für die Zeitquantisierung.While in TDCs with absolute delay time the resolution of the speed Depending on the semiconductor process used, one can avoid this with relative delay times of the TDCs. These TDCs use two delay chains with different base cycle times. The relative delay difference then serves as the basis for the time quantization.

Ein Time-to-Digital-Converter (TDC) kann beispielsweise in den Controller des Raman-Mikroskops, der das Abscannen und damit die Abbildung einer Probenoberfläche mit Hilfe von Raman-Signalen ermöglicht, integriert sein.For example, a time-to-digital converter (TDC) can be integrated into the controller of the Raman microscope, which enables the scanning and thus the imaging of a sample surface with the aid of Raman signals.

Auch ist es möglich, dass eine einzige TDC-Elektronik mehreren Detektorkanälen, zugeordnet wird.It is also possible that a single TDC electronics is assigned to multiple detector channels.

Bei einem Multiplexbetrieb wird jedem Detektorkanal eine eigene TDC zugeordnet.In a multiplex mode, each detector channel is assigned its own TDC.

Der Detektor zur Detektion der von der Probe emittierten Fluoreszenz- beziehungsweise Raman-Photonen ist ein Detektor, der eine Einphotonenzählung ermöglicht, beispielsweise eine Avalanche-Photodiode (APD), die auch gekühlt sein kann. Obwohl eine Avalanche Photodiode (APD) ein schlechteres Dunkelstromverhalten als ein CCD-Chip aufweist, kann man die Auslesezeit der APD auf den kurzen Zeitbereich begrenzen, in dem Raman-Photonen gemessen werden. Damit reduziert sich die Dunkelzählrate im Raman-Signal. Wird beispielsweise die Probe mit einem 20 MHz-Laser (50 ns Zeitfenster) angeregt und misst man nur die Raman-Photonen in einem 500 ps Zeitfenster, so ist nur noch der 1/100 Teil der Dunkelzählrate im Signal vorhanden. Eine APD erzielt dann ein vergleichbares Dunkelstromverhalten wie ein stark gekühlter CCD-Chip, z. B. bei –60°C.The detector for detecting the fluorescence or Raman photons emitted by the sample is a detector that allows one-photon counting, for example an avalanche photodiode (APD), which may also be cooled. Although an avalanche photodiode (APD) has worse dark current performance than a CCD chip, one can limit the read-out time of the APD to the short time range in which Raman photons are measured. This reduces the dark count rate in the Raman signal. For example, if the sample is excited with a 20 MHz laser (50 ns time window) and only the Raman photons are measured in a 500 ps time window, only 1/100 of the dark count rate is present in the signal. An APD then achieves comparable dark current performance as a highly cooled CCD chip, e.g. At -60 ° C.

Anstelle einer einzelnen Avalanche-Photodiode kann auch ein Avalanche-Photodioden-Array vorgesehen sein mit einer Vielzahl von Kanälen, beispielsweise 256 Kanälen. Dies ermöglicht beispielsweise die gleichzeitige Messung vieler Wellenlängen, d. h. eines Wellenlängenspektrums.Instead of a single avalanche photodiode, an avalanche photodiode array may be provided with a plurality of channels, for example 256 channels. This allows, for example, the simultaneous measurement of many wavelengths, i. H. a wavelength spectrum.

Die Avalanche-Photodioden zeichnen sich durch eine hohe Zeitauflösung aus, die bevorzugt besser als 50 ps ist. Alternativ zu einer Avalanche-Photodiode ist es auch möglich, einen Photomultiplier einzusetzen. Die Wahl des Detektors hängt von der untersuchten Wellenlänge ab. Photomultiplier werden für Wellenlängen < 400 nm, Avalanche-Photodioden für Wellenlängen > 400 nm verwandt.The avalanche photodiodes are characterized by a high time resolution, which is preferably better than 50 ps. As an alternative to an avalanche photodiode, it is also possible to use a photomultiplier. The choice of detector depends on the wavelength studied. Photomultipliers are used for wavelengths <400 nm, avalanche photodiodes for wavelengths> 400 nm.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Licht der Lichtquelle auf dem Weg zur Probe durch ein Objektiv geleitet und so auf einem Punkt der Probenoberfläche fokussiert. Gleichzeitig kann das Objektiv dazu dienen, das von der Probe emittierte Raman- beziehungsweise Fluoreszenz-Licht aufzunehmen und an den Detektor zu leiten.In a particularly preferred embodiment, the light of the light source is passed through a lens on the way to the sample and thus focused on a point of the sample surface. At the same time, the objective can be used to pick up the Raman or fluorescence light emitted by the sample and to conduct it to the detector.

Mit Hilfe des Objektives ist insbesondere auch möglich, einen Punkt der Probe, konfokal abzubilden und damit die gesamte Probe abzurasten. Dies ermöglicht eine Abbildung der Probe auch in der Tiefe, d. h. in z-Richtung.With the aid of the objective, it is also possible, in particular, to confocally image one point of the sample and thus to scan the entire sample. This allows a mapping of the sample also in depth, d. H. in the z direction.

Bei einer konfokalen Abbildung wird eine punktförmige Quelle, vorzugsweise ein Laser, auf einen Punkt der Probe abgebildet. Anschließend wird dieser Bildpunkt vorzugsweise mit derselben Optik, d. h. mit dem gleichen Objektiv auf eine Lochblende, ein sog. Pinhole, vor einem Detektor fokussiert. Anstelle der Anordnung eines separaten Pinholes vor dem Detektor wäre es auch möglich, dass der Detektor selbst das Pinhole darstellt. Insbesondere bei Avalanche-Photodioden, die typischerweise einen Durchmesser von 50 μm aufweisen, bildet der Detektor selbst das Pinhole. Wird diese Art der Abbildung z. B. für die Mikroskopie eingesetzt, so erreicht man eine erhebliche Steigerung des Bildkontrastes, da zur Abbildung nur die Fokusebene des Objektivs beiträgt. Ausserdem ist mit der konfokalen Mikroskopie eine Abbildung des Ramansignales bzw. Fluoreszenzsignales in unterschiedlichen Probentiefen möglich.In a confocal imaging, a point source, preferably a laser, is imaged onto a point on the sample. Subsequently, this pixel is preferably with the same optics, i. H. with the same lens on a pinhole, a so-called pinhole, focused in front of a detector. Instead of arranging a separate pinhole in front of the detector, it would also be possible for the detector itself to represent the pinhole. Particularly in the case of avalanche photodiodes, which typically have a diameter of 50 μm, the detector itself forms the pinhole. If this type of illustration z. B. used for microscopy, one achieves a significant increase in the image contrast, since only the focal plane of the lens contributes to the image. In addition, with confocal microscopy, imaging of the Raman signal or fluorescence signal in different sample depths is possible.

Um das Rayleigh-Licht zu unterdrücken, ist vorgesehen, im Strahlengang von der Probe zum Detektor einen Filter vorzusehen. Bevorzugt handelt es sich bei dem Filter um einen Bandpassfilter oder ein Low-Pass-Farbglas oder um einen abstimmbaren Filter mit beispielsweise Prismen beziehungsweise Gittern. Zusätzlich zu einem Filter kann im Strahlengang von der Probe zum Detektor auch ein Spektrometer vorgesehen sein. Das Spektrometer ist dann im Strahlengang vor dem Detektor angeordnet. Die zusammen mit einem Spektrometer eingesetzten Filter sind zum Beispiel Kantenfilter oder holografische Filter. Das Spektrometer selbst kann in Spiegel- oder Linsenoptik ausgelegt sein. Der Vorteil der Ausführungsform der Vorrichtung mit Spektrometer ist, dass das Licht, das von der Probe emittiert wird, auf ein Spektrometer gegeben wird und spektral zerlegt wird. Die spektrale Zerlegung kann z. B. mit einem Gitter oder einem Prisma erfolgen. Wird das so zerlegte Licht mit einer CCD-Kamera aufgenommen, so ist es möglich ein komplettes Spektrum des von der Probe gestreuten Lichtes aufzunehmen. Sieht man innerhalb des Spektrometers einen Klappspiegel vor, so können auch spektrale Bereiche des gesammelten Lichtes auf den Detektor bspw. die Avalanche Photodiode gemäß der Erfindung gegeben werden. Der Vorteil der Zwischenschaltung eines Spektrometers liegt darin, dass z. B. durch Drehen des Gitters im Spektrometer ein beliebiger Spektralbereich für den Detektor zur Messung der Zeitdifferenz selektieren werden kann.In order to suppress the Rayleigh light, it is provided to provide a filter in the beam path from the sample to the detector. The filter is preferably a bandpass filter or a low-pass colored glass or a tunable filter with, for example, prisms or gratings. In addition to a filter, a spectrometer can also be provided in the beam path from the sample to the detector. The spectrometer is then arranged in the beam path in front of the detector. The filters used with a spectrometer are, for example, edge filters or holographic filters. The spectrometer itself can be designed in mirror or lens optics. The advantage of the embodiment of the device with spectrometer is that the light emitted by the sample is placed on a spectrometer and spectrally decomposed. The spectral decomposition can z. B. done with a grid or a prism. If the thus decomposed light is recorded with a CCD camera, it is possible to record a complete spectrum of the light scattered by the sample. If a folding mirror is provided within the spectrometer, spectral regions of the collected light can also be applied to the detector, for example the avalanche photodiode according to the invention. The advantage of the interposition of a spectrometer is that z. B. by turning the grating in the spectrometer any spectral range for the Detector for measuring the time difference can be selected.

Die Raman-Vorrichtung, insbesondere das Raman-Mikroskop kann einen verfahrbaren Probentisch aufweisen, der es ermöglicht, durch Verfahren der Probe beispielsweise die Probenoberfläche abzubilden. Alternativ oder zusätzlich kann auch die Anregungslichtquelle bzw. der Detektor verfahren werden, um ein Abbild der Probe zu erhalten. Auch ist es möglich, räumliche Karten von spektralen Eigenschaften der Probe aufzunehmen. In Kombination mit einer konfokalen Abbildung ist auch ein Tiefenscan möglich.The Raman device, in particular the Raman microscope, may have a movable sample table which makes it possible, for example, to image the sample surface by moving the sample. Alternatively or additionally, the excitation light source or the detector can also be moved in order to obtain an image of the sample. It is also possible to record spatial maps of spectral properties of the sample. In combination with a confocal image, a depth scan is also possible.

Die Verfahrbarkeit des Probentisches ermöglicht ein Abrasten der Probe bzw. eines Probenbereiches, der eine Linie, eine Fläche oder ein Volumen sein kann.The movability of the sample table allows a snapping of the sample or a sample area, which may be a line, a surface or a volume.

Neben der Vorrichtung gibt die Erfindung auch ein Verfahren zur Detektion eines Raman-Signals an, wobei zunächst ein Lichtpuls mit einer Pulsbreite von 5 ps bis 100 ps, insbesondere 10 ps bis 40 ps zur Verfügung gestellt und auf eine Probe gelenkt wird. In einem zweiten Verfahrensschritt wird das von der Probe emittierte Licht von einem Detektor aufgenommen und anschließend mittels einer Zeitdifferenzmesseinrichtung die Zeitdifferenz zwischen dem Aussenden des Lichtpulses des Lasers und dem vom Detektor detektierten emittierten Licht bestimmt. Das Ergebnis vieler derartiger Zeitdifferenzmessungen ergibt ein Zeitdifferenzsignal in Form einer Abklingkurve.In addition to the device, the invention also provides a method for detecting a Raman signal, wherein initially a light pulse with a pulse width of 5 ps to 100 ps, in particular 10 ps to 40 ps is provided and directed to a sample. In a second method step, the light emitted by the sample is received by a detector and then determined by means of a time difference measuring device, the time difference between the emission of the light pulse of the laser and the emitted light detected by the detector. The result of many such time difference measurements gives a time difference signal in the form of a decay curve.

Besonders bevorzugt ist es, wenn das von der Probe emittierte Licht vor Aufnahme durch den Detektor spektral beispielsweise mit Hilfe eines Spektrometers zerlegt wird.It is particularly preferred if the light emitted by the sample is spectrally decomposed, for example with the aid of a spectrometer, before it is picked up by the detector.

Das aufgenommene Zeitdifferenzsignal kann zeitlich zerlegt werden. So können die Signale, die von langen Zeiten herrühren, eindeutig Fluoreszenzprozessen bzw. Lumineszenzprozessen zugeordnet werden. Die Fluoreszenzkurve kann dann zu kurzen Zeiten hin extrapoliert werden, so dass es im kurzen Zeitbereich, in dem sowohl Fluoreszenzprozesse wie Raman-Prozesse ablaufen, möglich ist, das Raman-Signal vom Fluoreszenzsignal zu trennen. Da das so erhaltene Raman-Signal wesentlich rauschärmer ist als das Fluoreszenzsignal, eignet sich das Raman-Signal für die Abbildung der Probenoberfläche.The recorded time difference signal can be decomposed in time. Thus, the signals resulting from long times can be clearly assigned to fluorescence processes or luminescence processes. The fluorescence curve can then be extrapolated for short times so that it is possible to separate the Raman signal from the fluorescence signal in the short time range in which both fluorescence processes and Raman processes take place. Since the resulting Raman signal is much lower in noise than the fluorescence signal, the Raman signal is suitable for imaging the sample surface.

Wie zuvor ausgeführt, kann ein Abbild der Probe bzw. Probenoberfläche durch Rastern der Probe erhalten werden.As stated previously, an image of the sample or sample surface can be obtained by scanning the sample.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand der Figuren beispielhaft ohne Beschränkung hierauf beschrieben werden.The invention will now be described by way of example with reference to the figures, without limitation thereto.

Es zeigen:Show it:

1a den prinzipiellen Aufbau eines konfokalen Raman-Mikkroskopes 1a the basic structure of a confocal Raman microscope

1b eine erste Variante eines Raman-Mikroskopes mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Detektion eines Raman-Signals 1b a first variant of a Raman microscope with a device according to the invention for the detection of a Raman signal

2 eine zweite Variante eines Raman-Mikroskopes mit einer Vorrichtung zur Detektion eines Raman-Signals 2 a second variant of a Raman microscope with a device for detecting a Raman signal

3 Zeitspektrum einer Probe aufweisend ein Fluoreszenz-Signal sowie ein Fluoreszenz und Raman-Signal 3 Time spectrum of a sample comprising a fluorescence signal and a fluorescence and Raman signal

4a bis 4c Bilder einer Probenoberfläche, wobei zu jedem Punkt der Probenoberfläche die Emissionsabklingzeiten gemäß der Erfindung aufgenommen wurde. 4a to 4c Images of a sample surface, wherein at each point of the sample surface the emission decay times were taken according to the invention.

5a Spektren an einem Punkt der Probe in vorgegebenen Zeitbereichen eines Zeitspektrums 5a Spectra at one point of the sample in given time ranges of a time spectrum

5b korrigierte Raman-Spektren, aufgenommen mit einer konventionellen CCD-Kamera und einer Zeitdifferenzmesseinrichtung 5b corrected Raman spectra taken with a conventional CCD camera and a time difference measuring device

6 Zeitspektren bei unterschiedlichen Wellenlängen 6 Time spectra at different wavelengths

7 Spektrum an einem Punkt der Probe aufgenommen von einer CCD-Kamera. 7 Spectrum at a point of the sample taken by a CCD camera.

Obwohl vorliegende Erfindung nachfolgend anhand eines konfokalen Raman-Mikroskopes als Beispiel für eine Raman-Vorrichtung beschrieben wird, ist die Erfindung hierauf nicht beschränkt.Although the present invention will be described below with reference to a confocal Raman microscope as an example of a Raman device, the invention is not limited thereto.

In 1a ist der prinzipielle Aufbau eines konfokalen Raman-Mikroskopes zur Aufnahme einer Probenoberfläche dargestellt. Mit Hilfe der konfokalen Raman-Mikroskopie können chemische Eigenschaften und Phasen von flüssigen und festen Komponenten analysiert werden bis in den Bereich des durch Beugung begrenzten Auflösungsvermögens von ungefähr 200 Nanometern. Durch den konfokalen Aufbau wird eine Tiefenauflösung zur Verfügung gestellt, die es erlaubt, die Probe in die Tiefe zu analysieren, ohne beispielsweise Schnitte wie bei der Elektronenmikroskopie durchführen zu müssen.In 1a is the basic structure of a confocal Raman microscope for recording a sample surface shown. Using confocal Raman microscopy, chemical properties and phases of liquid and solid components can be analyzed down to the diffraction-limited resolving power of approximately 200 nanometers. The confocal design provides a depth resolution that allows the sample to be analyzed in depth, without having to make cuts such as in electron microscopy.

Bei der konfokalen Mikroskopie wird eine punktförmige Lichtquelle, vorzugsweise ein Laser, auf einen Punkt der Probe abgebildet. Anschließend wird dieser Bildpunkt vorzugsweise mit derselben Optik auf eine Lochblende, ein so genanntes Pin-Hole, vor einem Detektor fokussiert. Die Größe der Lochblende muss dabei kleiner als die beugungsbegrenzte Abbildung des Beleuchtungsbildes sein. Das Bild wird nun dadurch erzeugt, dass ein Punkt der Beleuchtungsquelle über die Probe gerastert wird, die Probe also Punkt für Punkt abgetastet wird. Mit dieser Art der Abbildung erreicht man eine erhebliche Steigerung des Bildkontrastes, da zur Abbildung nur die Fokusebene des Objektivs beiträgt. Außerdem kann die Auflösung aufgrund der Faltung des Beugungspunktes in der Apertur der Lochblende um etwa den Faktor √2 auf λ/3 reduziert werden Zusätzlich kann man ein dreidimensionales Bild der Probenstruktur mit einer axialen Auflösung von etwa einer Wellenlänge erhalten.In confocal microscopy, a point light source, preferably a laser, is imaged onto a point on the sample. Subsequently, this pixel is preferably focused with the same optics on a pinhole, a so-called pin-hole, in front of a detector. The size of the pinhole must be smaller than the be diffraction-limited image of the illumination image. The image is now generated by rasterizing a point of the illumination source over the sample so that the sample is scanned point by point. This type of imaging achieves a significant increase in image contrast since only the focus plane of the lens contributes to imaging. In addition, the resolution due to the convolution of the diffraction point in the aperture of the pinhole can be reduced by about a factor of √2 to λ / 3. In addition, a three-dimensional image of the sample structure with an axial resolution of about one wavelength can be obtained.

Betreffend die konfokale Mikroskopie wird beispielsweise auf die DE 199 02 234 A1 verwiesen.Concerning the confocal microscopy is for example on the DE 199 02 234 A1 directed.

In 1a ist ein Aufbau eines konfokalen Raman-Mikroskopes beispielsweise des Mikroskopes alpha300 R der Witec GmbH, D – 89081 Ulm, Deutschland, dargestellt. Bei dem konfokalen Raman-Mikroskop 1000 wird das Licht einer Lichtquelle 1010 an einem Strahlteilerspiegel 1012 nach einer Strahlaufweitung 1014 in Richtung der Probe 1016 auf den Probentisch 1018 gelenkt. Der umgelenkte Lichtstrahl 1019 wird dabei durch eine geeignete Optik auf einen Punkt 1020 auf der Probe 1016 fokussiert. Das Licht des Lasers 1010 wechselwirkt mit der Materie der Probe 1016. Es entsteht zum einen von der Probe zurückgestreutes Rayleigh-Licht derselben Wellenlänge wie das eingestrahlte Licht, zum anderen requenzverschobenes Licht. Das Rayleigh-Licht tritt bei Einsatz geeigneter Maßnahmen nicht in die Detektionsoptik ein. Eine mögliche geeignete Maßnahme wäre das Einbringen eines Strahlteilers 1012 in den Strahlengang.In 1a is a structure of a confocal Raman microscope, for example, the microscope alpha300 R Witec GmbH, D - 89081 Ulm, Germany, shown. At the confocal Raman microscope 1000 becomes the light of a light source 1010 at a beam splitter mirror 1012 after a beam expansion 1014 in the direction of the sample 1016 on the sample table 1018 directed. The redirected light beam 1019 is thereby by a suitable optics to a point 1020 on the test 1016 focused. The light of the laser 1010 interacts with the matter of the sample 1016 , On the one hand, Rayleigh light of the same wavelength backscattered from the sample emerges as the incident light, and on the other hand, light shifted in frequency. The Rayleigh light does not enter the detection optics when using appropriate measures. One possible suitable measure would be the introduction of a beam splitter 1012 in the beam path.

Das zum Rayleigh-Licht, frequenzverschobene Raman-Licht und/oder Fluoreszenzlicht durchtritt den Strahlenteiler 1012. Hinter dem Strahlenteiler 1012 ist das Raman-Licht und/oder Fluoreszenzlicht mit Bezugsziffer 1022 gekennzeichnet. Über ein nicht dargestelltes Pin-Hole wird das Raman-Licht 1022 in eine Lichtleitfaser 1030 eingekoppelt und gelangt in vorliegender Ausführung zu einem Spektrometer 1040. Im Spektrometer 1040 wird der Strahl mit Raman-Licht durch eine geeignete Optik wieder aufgeweitet, ergebend den Strahl 1042, der auf einen Gitterspektralfilter 1044 trifft. Der Gitterspektralfilter 1044 beugt das Licht entsprechend seiner Wellenlänge in unterschiedliche Richtungen, so dass ein spektrales Signal aufgenommen werden kann. Das gebeugte Licht wird von einem Detektor oder einem Detektorarray 50, umfassend beispielsweise eine oder mehrere Avalanche-Dioden, aufgenommen, die eine Einzel-Photonenzählung zulassen.The Rayleigh light, frequency-shifted Raman light and / or fluorescent light passes through the beam splitter 1012 , Behind the beam splitter 1012 is the Raman light and / or fluorescent light with reference numeral 1022 characterized. An unillustrated pin hole becomes the Raman light 1022 in an optical fiber 1030 coupled and passes in the present embodiment to a spectrometer 1040 , In the spectrometer 1040 the beam is re-expanded with Raman light by suitable optics, resulting in the beam 1042 pointing to a grating spectral filter 1044 meets. The grating spectral filter 1044 diffracts the light according to its wavelength in different directions, so that a spectral signal can be recorded. The diffracted light is from a detector or detector array 50 comprising, for example, one or more avalanche diodes picked up allowing for single photon counting.

Das aufgenommene Licht des Detektors 50 wird dann an einen Time-to-Digital Converter (TDC) 10000 übertragen. Mit Hilfe eines Time-to-Digital-Converters wird die Zeitdifferenz zwischen dem Anregungspuls des Lasers 1010 und dem durch die Anregung entstehenden Raman oder Fluoreszenzphoton bestimmt. Der TDC kann einem Detektor zugeordnet sein. Will man ein ganzes Spektrum aufnehmen, so wird ein Detektorarray verwandt, wobei bevorzugt jedem Detektor des Detektorarrays ein TDC zugeordnet ist. Des Weiteren ist die Steuerung 20000 des Probentisches 1018 gezeigt. Das Abrastern der Probe 1016 kann durch Verschieben des als Verschiebetisch 1110 ausgelegten Probentisches erfolgen oder durch Verschieben des Lichtstrahles des Anregungslichtes. Der Rasterbereich des Verschiebetisches 1110 in der X-, Y-Ebene kann zwischen 10 nm und 1000 cm liegen.The recorded light of the detector 50 is then sent to a Time-to-Digital Converter (TDC) 10000 transfer. With the help of a time-to-digital converter, the time difference between the excitation pulse of the laser 1010 and the Raman or fluorescent photon produced by the excitation. The TDC may be associated with a detector. If you want to record a whole spectrum, so a detector array is used, preferably each detector of the detector array is associated with a TDC. Furthermore, the controller 20000 of the sample table 1018 shown. Scanning the sample 1016 can by moving the as a translation table 1110 designed sample table or by moving the light beam of the excitation light. The grid area of the moving table 1110 in the X, Y plane can be between 10 nm and 1000 cm.

Das Bild der Probe entsteht dann durch Abrastern in der X-, Y-Ebene, beispielsweise in Pfeilrichtung 1130.The image of the sample is then created by scanning in the X, Y plane, for example in the direction of the arrow 1130 ,

Zur Justage beziehungsweise zur Beobachtung kann auch Licht einer Weißlichtquelle 1120 auf die Probe 1016 eingekoppelt werden.For adjustment or for observation can also light of a white light source 1120 to the test 1016 be coupled.

In 1b ist ein erster Aufbau eines Raman-Mikroskopes mit einer Vorrichtung gemäß der Erfindung schematisch dargestellt. Der erste Aufbau umfasst eine Lichtquelle 3 zum Anregen einer Lichtemission in einer Probe 5. Das Licht der Lichtquelle wird mit 7 bezeichnet und über ein Strahlteilerbauteils 9 durch ein Objektiv 11 auf die Probenoberfläche 12 gelenkt. Die Probe selbst ist auf einem Probentisch 13 aufgebracht, der in alle drei Raumrichtungen x, y und z verfahrbar ist. Hierdurch ist es möglich, dass die Probe 5 an unterschiedliche Punkte verfahren werden kann und somit mit Hilfe eines zweidimensionalen Scans, beispielsweise in x- und y-Richtung die gesamte Probenoberfläche abgebildet werden kann. Zusätzlich ist auch ein Scan in z-Richtung möglich.In 1b a first construction of a Raman microscope with a device according to the invention is shown schematically. The first structure includes a light source 3 for exciting a light emission in a sample 5 , The light from the light source comes with 7 and a beam splitter device 9 through a lens 11 on the sample surface 12 directed. The sample itself is on a sample table 13 applied, which is movable in all three spatial directions x, y and z. This makes it possible for the sample 5 can be moved to different points and thus with the help of a two-dimensional scan, for example in the x and y direction, the entire surface of the sample can be mapped. In addition, a scan in z-direction is possible.

Das auf die Probenoberfläche 12 auftreffende Licht 7 der Lichtquelle 3 tritt in Wechselwirkung mit dem Material der Probe 5. Neben dem Raleigh-Licht mit gleicher Frequenz wie das eingestrahlte Laserlicht 7 entsteht durch Anregung der Materie in der Probe 5 Fluoreszenzlicht und Ramanlicht. Das Fluoreszenz- und Ramanlicht ist mit der Bezugsziffer 20 gekennzeichnet. Durch einen Filter 30, beispielsweise einen Kantenfilter wird das von der Probe 5 gesteuerte Anregungs- bzw. Raleigh-Licht, das durch den Strahlteiler hindurchtritt, gefiltert, so dass nach dem Filter nur noch das Raman- und Fluoreszenzlicht 20 vorliegt, das auf einen Detektor 50 mit Hilfe einer Linse 60 fokussiert wird. Im Falle einer konfokalen Abbildung ist vor dem Detektor ein Pinhole 40 angeordnet. Alternativ kann der Detektor selbst das Pinhole darstellen. Das Objektiv 1 ist derart ausgelegt, dass das Licht des Lasers, d. h. das Anregungslicht 7 auf die Probe fokussiert wird. Gleichzeitig wird das Objektiv 11 auch dazu verwendet, das von der Probe 5 gestreute Licht gleicher Wellenlänge, wie das Anregungslicht und das erzeugte Raman- und Fluoreszenzlicht 20 wieder zu sammeln und über den Strahlteiler an den Detektor weiterzuleiten. Der Detektor ist bevorzugt eine gekühlte Avalanchefotodiode, die als Einzelphotonen empfindlicher Detektor ausgelegt sein kann. Bevorzugt ist die erfindungsgemäße Lichtquelle 3 eine gepulste Laserlichtquelle, wobei Lichtpulse mit einer Pulsdauer im Bereich 5 ps bis 100 ps und einer Repitionrate von 5 MHz bis 100 MHz abgeben werden. Mit Aussenden eines jeden Laserpulses, wird auch ein Synchronision-Signal SYNC an eine Zeiterfassungselektronik 70 übermittelt.That on the sample surface 12 incident light 7 the light source 3 interacts with the material of the sample 5 , In addition to the Raleigh light with the same frequency as the irradiated laser light 7 arises from the excitation of matter in the sample 5 Fluorescent light and Raman light. The fluorescence and Raman light is indicated by the reference numeral 20 characterized. Through a filter 30 For example, an edge filter becomes that of the sample 5 controlled excitation or Raleigh light, which passes through the beam splitter, filtered, so that after the filter only the Raman and fluorescent light 20 present, that on a detector 50 with the help of a lens 60 is focused. In the case of a confocal image, a pinhole is in front of the detector 40 arranged. Alternatively, the detector itself may represent the pinhole. The objective 1 is designed such that the light of the laser, ie the excitation light 7 focused on the sample. At the same time, the lens becomes 11 also used that from the sample 5 scattered light of the same wavelength as the excitation light and the generated Raman and fluorescent light 20 collect again and forward via the beam splitter to the detector. The detector is preferably a cooled avalanche photodiode which may be designed as a single photon sensitive detector. The light source according to the invention is preferred 3 a pulsed laser light source, wherein light pulses with a pulse duration in the range 5 ps to 100 ps and a Repitionrate of 5 MHz to 100 MHz will deliver. With the emission of each laser pulse, a sync signal SYNC is also sent to a time-recording electronics 70 transmitted.

Des Weiteren wird über die Leitung 80, sobald vom Detektor ein Photon detektiert wird, dass entweder einer Fluoreszenz- und Ramanphoton ist, ein Signal an die Zeiterfassungelektronik 70 gesandt. Mit Hilfe der Zeiterfassungselektronik 70 ist es dann möglich eine Zeitdifferenz Δt zwischen dem Laserpuls, dargestellt durch das SYNC-Signal, und dem Detektorsignal, das über Leitung 80 der Zeiterfassungsmesseinrichtung 80 zugeführt wird, zu bestimmen. Bevorzugt umfasst die Zeiterfassungselektronik 70 einen Time-to-digital-converter (TDC).Furthermore, over the line 80 as soon as the detector detects a photon that is either a fluorescence and Raman photon, it sends a signal to the time-acquisition electronics 70 sent. With the help of time recording electronics 70 it is then possible a time difference .DELTA.t between the laser pulse, represented by the SYNC signal, and the detector signal, via line 80 the time attendance measuring device 80 is fed to determine. Preferably, the time detection electronics comprises 70 a time-to-digital converter (TDC).

Besonders bevorzugt sind integrierte digitale TDCs, bei denen der Time-to-Digital Converter auf einem einzigen Chip integriert wird. Derartige TDCs zeigen eine Genauigkeit – bis zu 10 ps in der Einzelmessung – in Verbindung mit einem großen Dynamikbereich von bis zu 30 Bit.Particularly preferred are integrated digital TDCs, in which the time-to-digital converter is integrated on a single chip. Such TDCs show accuracy - up to 10 ps in single measurement - in conjunction with a large dynamic range of up to 30 bits.

Durch die Messung der Zeitdifferenz mit Hilfe des TDC zwischen dem vom Laser mit jedem Laserpuls erzeugten Synchronisationsimpuls SYNC zu den vom Detektor detektierten Photonen kann die Zeit zwischen Anregungspuls und erzeugtem Raman- bzw. Fluoreszenzphotonen bestimmt werden. Durch Betrachtung vieler Photonen kann dann das Zeitverhalten des in der Probe erzeugten Fluoreszenz- bzw. Ramanlichtes ermittelt werden.By measuring the time difference by means of the TDC between the synchronization pulse SYNC generated by the laser with each laser pulse to the photons detected by the detector, the time between excitation pulse and generated Raman or fluorescence photons can be determined. By observing many photons, the time behavior of the fluorescence or Raman light generated in the sample can then be determined.

Während bei der Ausführungsform gemäß 1b eine spektrale Zerlegung nicht erfolgt, ist dies beim Aufbau gemäß 1a oder 2 möglich. Beim Aufbau gemäß 2 sind gleiche Bauteile wie in 1b mit denselben Bezugsziffern bezeichnet.While in the embodiment according to 1b a spectral decomposition is not done, this is the structure according to 1a or 2 possible. When building according to 2 are the same components as in 1b denoted by the same reference numerals.

Wiederum wird als Lichtquelle 3 bevorzugt eine gepulste Laserlichtquelle verwandt. Das von der gepulsten Laserlichtquelle erzeugte Licht 7 wird über ein Objektiv 11 auf die Oberfläche 12 einer Probe 5 gelenkt. Durch das Licht 7 der Laserlichtquelle wird in der Probe 5 Fluoreszenz- bzw. Ramanlicht 20 angeregt, das wiederum vom Objektiv 11 aufgenommen und durch den Strahlteiler nunmehr nicht direkt einem Detektor 50 mit Pinhole 50, sondern einem Spektrometer 100, wie in 1a gezeigt, zugeführt wird. Im Spektrometer wird beispielsweise mit Hilfe eines Spiegels 110 das Licht 20 auf ein Gitter 120 gelenkt und spektral zerlegt. Der Filter 30 zur Unterdrückung des Raleigh bzw. gestreuten Lichtes 7 gleicher Wellenlänge wie der Laserwellenlänge ist im Strahlengang vor dem Spektrometer 100 angeordnet, so dass nur Raman- und Fluoreszenzlicht 20 in das Spektrometer 100 gelangen.Again, as a light source 3 preferably a pulsed laser light source related. The light generated by the pulsed laser light source 7 is about a lens 11 on the surface 12 a sample 5 directed. By the light 7 the laser light source is in the sample 5 Fluorescence or Raman light 20 stimulated, in turn, from the lens 11 taken and by the beam splitter now not directly a detector 50 with pinhole 50 but a spectrometer 100 , as in 1a shown, is supplied. In the spectrometer, for example, with the help of a mirror 110 the light 20 on a grid 120 steered and spectrally dissected. The filter 30 to suppress the Raleigh or scattered light 7 the same wavelength as the laser wavelength is in the beam path in front of the spectrometer 100 arranged so that only Raman and fluorescent light 20 into the spectrometer 100 reach.

Das mit dem Anregungsimpuls des Lasers erzeugte der Raman- bzw. Fluoreszenzlicht kann nach seiner spektralen Zerlegung im Spektrometer beispielsweise direkt auf eine CCD-Kamera 130 gelenkt werden, und so ein komplettes Spektrum des von der Probe gestreuten Lichtes 7 und insbesondere des emittierten Raman- und Fluoreszenzlichtes 20 aufgenommen werden. Möchte man eine erfindungsgemäße zeitaufgelöste Messung durchführen, so kann man mit Hilfe eines Spiegels 140 nach spektralen Zerlegung des Lichtes am Gitter 120 einen spektralen Bereich auf einen Detektor 50, bevorzugt einer Einzelphotonenempfindliche Avalanche-Photodiode ausgekoppelt werden.The Raman or fluorescence light generated with the excitation pulse of the laser, for example, after its spectral decomposition in the spectrometer directly on a CCD camera 130 and so a complete spectrum of the light scattered by the sample 7 and in particular the emitted Raman and fluorescent light 20 be recorded. If you want to perform a time-resolved measurement according to the invention, then you can with the help of a mirror 140 after spectral decomposition of the light at the grid 120 a spectral range to a detector 50 , Preferably, a single-photon-sensitive avalanche photodiode are coupled out.

Ist der Spiegel 140 verstellbar ausgebildet, beispielsweise als Klappspiegel, so ist es möglich zum einen das gesamte Spektrum in einer ersten Stellung auf die CCD-Kamera zu lenken und in einer zweiten Stellung der Avalanche-Photodiode 50 zuzuleiten.Is the mirror 140 designed adjustable, for example as a folding mirror, so it is possible for one thing to direct the entire spectrum in a first position on the CCD camera and in a second position of the avalanche photodiode 50 be forwarded.

Wie im ersten Falle erfolgt die Messung der Zeitdifferenz mit Hilfe einer TDC-Elektronik durch Aufnahme des Synchronisationssignals SYNC des gepulsten Lasers 3 und der Erfassung der einzelnen Raman- bzw. Fluoreszenz-Photonen mit Hilfe des Detektors 30 bzw. der Avalanche-Photodiode.As in the first case, the time difference is measured by means of TDC electronics by recording the synchronization signal SYNC of the pulsed laser 3 and the detection of the individual Raman or fluorescence photons by means of the detector 30 or the avalanche photodiode.

Gegenüber dem im Wesentlichen gleichen Aufbau wie in 1b hat die Ausführungsform gemäß 1a bzw. 2 den Vorteil, dass durch Drehen des Gitters 20 im Spektrometer 100 ein beliebiger Spektralbereich für den einzelphotonenempfindlichen Detektor 30 selektiert werden kann. Aufgrund der höheren Zahl von optischen Komponenten ist jedoch die gemessene Signalintensität an dem Detektor bzw. der Photodiode 30 geringer als im Falle des Ausführungsbeispiels gemäß 1b.Compared to the substantially same structure as in 1b has the embodiment according to 1a respectively. 2 the advantage of that by turning the grid 20 in the spectrometer 100 an arbitrary spectral range for the single photon sensitive detector 30 can be selected. Due to the higher number of optical components, however, the measured signal intensity at the detector or photodiode is 30 less than in the case of the embodiment according to 1b ,

Bei den Aufbauten gemäß 1a, 1b und 2 wird die Probe 5 auf einem Probentisch 13 gelagert. Hierdurch ist es möglich durch Rastern der Proben von der Probenoberfläche eine Abbildung zu erzeugen, beispielsweise in Form einer räumlichen Abbildung der zeitaufgelösten spektralen Eigenschaften der Probe. Möchte man lediglich im μm-Bereich eine Probe abrastern, so kann die Verschiebung des Verschiebetisches, beispielsweise mit Hilfe von Piezo-Elementen in einer x-y-Ebene erfolgen. Um Hysterse-Effekt bei der Verwendung von Piezo-Elementen auszugleichen, kann der Tisch kapazitiv geregelt werden. Die Angabe des Rasterbereiches des Verschiebetisches im μm-Bereich ist nur beispielshaft, möglich sind Rasterbereiche von 10 nm–1000 cm. Die Rasterung erfolgt bei Rasterbereich > 1 mm dann beispielsweise mit Hilfe von Motoren, beispielsweise Schrittmotoren. In the superstructures according to 1a . 1b and 2 will be the sample 5 on a sample table 13 stored. This makes it possible to generate an image by scanning the samples from the sample surface, for example in the form of a spatial image of the time-resolved spectral properties of the sample. If you only want to scan a sample in the μm range, the displacement of the displacement table can take place in an xy plane, for example with the aid of piezo elements. To compensate for hysteresis effect when using piezo elements, the table can be controlled capacitively. The indication of the raster range of the translation stage in the μm range is only an example, raster ranges of 10 nm-1000 cm are possible. The rastering takes place at raster area> 1 mm then, for example, with the help of motors, such as stepper motors.

Wie oben ausgeführt entsteht das Bild der Probe durch Abrastern, beispielsweise mit Hilfe eines Verschiebetisches in der x-y-Ebene. Anstelle eines Verschiebens in der x-y-Ebene mit Hilfe eines Verschiebetisches kann auch die Lichtquelle oder die Einkoppelfaser verschoben werden.As stated above, the image of the sample is formed by scanning, for example by means of a displacement stage in the x-y plane. Instead of shifting in the x-y plane by means of a translation stage, the light source or the feed-in fiber can also be shifted.

Mit dem Objektiv 11 kann eine Fokussierung des eingekoppelten Lichtes auf einen Punkt vorgenommen werden und der Bildpunkt auf eine Lochblende 40 ein sogenanntes Pinhole vor dem Detektor 50 fokussiert werden. Es ist dann möglich eine konfokale Abbildung eines Punktes auf der Probe vorzunehmen und durch Änderung der Fokuslage ein Tiefenscannen, d. h. ein Scannen in z-Richtung der Probe 5 vorzunehmen.With the lens 11 Focusing of the coupled light can be made to a point and the pixel on a pinhole 40 a so-called pinhole in front of the detector 50 be focused. It is then possible to make a confocal image of a point on the sample and by changing the focus position deep scanning, ie scanning in the z-direction of the sample 5 make.

Im nachfolgenden Ausführungsbeispiel ist in den 3–4c ein derartiger Tiefenscan an einem Probenpunkt bzw. über einen Bereich der Probe mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß 1 detaillierter beschrieben.In the following embodiment is in the 3 - 4c Such a depth scan at a sample point or over a region of the sample with a device according to the invention according to FIG 1 described in more detail.

Als Probe wurde ein Schichtsystem untersucht bestehend aus einem Objektträger (Glas), einer fluoreszierenden Probe und Polymerfolie sowie Luft.As a sample, a layer system was examined consisting of a glass slide, a fluorescent sample and polymer film and air.

Wird der konfokale Fokus so gelegt, dass dieser sich in Luft befindet, so werden von der Avalanche-Photodiode 50 in 1 lediglich Fluoreszenzphotonen detektiert. In 3 ist dies deutlich ersichtlich. In 3 ist die Anzahl der Photonen (cts) die von der Avalanche-Photodiode 50 in 1 im Lauf der Zeit t aufgenommen werden, dargestellt.If the confocal focus is placed so that it is in air, then the avalanche photodiode 50 in 1 only detected fluorescence photons. In 3 this is clearly visible. In 3 is the number of photons (cts) that of the avalanche photodiode 50 in 1 are recorded over time t.

Wie man aus 3 ersieht, ergibt sich für die Fluoreszenz eine Abklingkurve 200, d. h. die ersten Photonen werden in diesem Ausführungsbeispiel nach ca. 17 ns gezählt, die letzten der Fluoreszenz zuzurechnenden Photonen nach etwa 33 ns. Die Anzahl der Fluoreszenz-Photonen fällt etwa von 17 ns expotenziell ab. Die genannte Zeiten sind lediglich beispielhaft, da die angegebenen absoluten Zeiten Laufzeiteffekte beispielsweise durch Kabellängen oder eine Detektorelektronik beinhalten. Die Zeit, die in 3 aufgetragen ist, ist die Zeitdifferenz, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung ermittelt wurde und die Zeitdifferenz zwischen dem Anregungspuls und dem bzw. den in der Avalanche-Photodiode 30 detektierten Photonen angibt. Bevorzugt wird die Zeitdifferenz gemäß der Erfindung mit einem Time-to-Digital-Converter (TDC) bestimmt.How to get out 3 see, results for the fluorescence a decay curve 200 That is, the first photons are counted in this embodiment after about 17 ns, the last of the fluorescence attributable photons after about 33 ns. The number of fluorescence photons decreases approximately 17 ns exponentially. Said times are merely exemplary, since the specified absolute times include run-time effects, for example due to cable lengths or detector electronics. The time in 3 is the time difference, which was determined with the aid of the device according to the invention and the time difference between the excitation pulse and the or in the avalanche photodiode 30 indicates detected photons. Preferably, the time difference is determined according to the invention with a time-to-digital converter (TDC).

Bringt man nun den konfokalen Fokus aus der Luft in das Material ein, so werden nicht nur Fluoreszenzphotonen, sondern auch Raman-Photonen detektiert. Im Allgemeinen ist das Signal des nichtaufgelösten Raman-Lichtes cirka 10 mal schwächer als das des Fluoreszenzlichtes. Als Zeitsignal, ist jedoch das Ramansignal, wie 3 zeigt, deutlich detektierbar. Da der Raman-Prozess stets gegenüber dem Fluoreszenzprozess der Prozess mit deutlich schnelleren Emissionsabklingzeiten ist, werden die am Anfang, d. h. im Bereich von ca. 16,5 ns bis 16,8 ns detektierten Photonen des in der Tiefe aufgenommenen Signales 210 in 3 im Wesentlichen dem Raman-Licht zugeordnet. Das Signal 210 für Zeiten im Bereich größer 18 ns werden hingegen dem Floureszenzlicht zugeordnet. Im Bereich für Zeiten länger als 18 ns decken sich die Kurven des Signales 210 und des reinen Floureszenzsignales 200 praktisch vollständig. Wie aus 3 hervorgeht, unterscheiden sich die Emisionsabklingzeiten von Raman- und Fluoreszenzphotenen deutlich. Während das Raman-Signal fast vollständig abgeklungen ist, werden immer noch Fluoreszenzphotonen von der Avalanche-Photodiode 30 gemäß 1 detektiert. Das von den Ramanphotonen herrührende Signal in der Kurve 210 in 3 wird mit 210.1 bezeichnet, dass vom Emissionsverhalten der Fluoreszenzphotonen herrührende Signal mit 210.2.If one introduces the confocal focus from the air into the material, not only fluorescence photons but also Raman photons are detected. In general, the signal of the unresolved Raman light is about 10 times weaker than that of the fluorescent light. As a time signal, however, the Raman signal is how 3 shows clearly detectable. Since the Raman process is always the process with significantly faster emission decay times compared to the fluorescence process, the photons detected at the beginning, ie in the range from about 16.5 ns to 16.8 ns, become the signal recorded in the depth 210 in 3 essentially associated with the Raman light. The signal 210 for times greater than 18 ns, however, are assigned to the fluorescent light. In the range for times longer than 18 ns, the curves of the signal coincide 210 and the pure fluorescence signal 200 practically complete. How out 3 As can be seen, the emission decay times of Raman and fluorescence photons differ significantly. While the Raman signal has almost completely decayed, fluorescence photons are still being emitted by the avalanche photodiode 30 according to 1 detected. The signal originating from the Raman photons in the curve 210 in 3 will with 210.1 denotes that the emission behavior of the fluorescence photons resulting signal with 210.2 ,

Wie zu 1a bis 2 beschrieben, kann die Probe an unterschiedliche Punkte verfahren werden. Nimmt man an jedem Punkt der Probe Zeitspektren, wie in 3 dargestellt, auf, so lassen sich bei Integration über bestimmte Zeitbereiche des Zeitspektrums gemäß 3 unterschiedliche Bilder der Probenoberfläche erzeugen. Insbesondere ist es möglich, vom gemeinsamen Raman- und Fluoreszenzsignal das Fluoreszenzsignal abzuziehen und so ein sehr rauscharmes Ramansignal zu erhalten. Dies ist in den 4a bis 4c gezeigt. 4a zeigt ein Bild einer Probe, bei der über den gesamten Zeitraum, d. h. von 0 bis 33 ns des Zeitspektrums gemäß 3 die Photonen integriert wurden. Das Bild gemäß 4a zeigt ein starkes Rauschen. Integriert man, wie in 4c gezeigt lediglich über einen Bereich von 16,5 ns bis 16,8 ns die von der Avalanche-Photodiode detektierten Photonen, wie in 3 dargestellt und mit 230 bezeichnet, so erhält man im wesentlichen nur ein Abbild, das von den Raman-Photonen erzeugt wird. In 4b ist eine Differenz der Bilder gemäß 4a und 4b gezeigt, d. h. 4b zeigt lediglich die Fluoreszenzphotonen da bei der Aufnahme gemäß 4a sowohl Fluoreszenz- wie Raman-Photonen integriert wurden, bei der Aufnahme gemäß 4c aber im Wesentlichen Raman-Photonen. Alle Bilder 4a, 4b und 4c sind in ihrer Dynamik gleich skaliert, lediglich der Offset der Skalierung wurde verschoben. Sowohl 4a, wie 4b zeigen ein starkes Rauschen. Die 4c, die ein Abbild der Ramanphotonen ist, zeigt ein deutlich geringeres Rauschen.How to 1a to 2 described, the sample can be moved to different points. Taking time spectra at each point of the sample, as in 3 shown, on, it can be when integrated over certain time ranges of the time spectrum according to 3 create different images of the sample surface. In particular, it is possible to subtract the fluorescence signal from the common Raman and fluorescence signal and thus obtain a very low-noise Raman signal. This is in the 4a to 4c shown. 4a shows an image of a sample at which over the entire period, ie from 0 to 33 ns of the time spectrum according to 3 the photons were integrated. The picture according to 4a shows a strong noise. Integrated, as in 4c show only over a range of 16.5 ns to 16.8 ns the photons detected by the avalanche photodiode, as in 3 shown and with 230 essentially, only an image produced by the Raman photons is obtained. In 4b is a difference of the pictures according to 4a and 4b shown, ie 4b shows only the fluorescence photons as in the recording according to 4a Both fluorescence and Raman photons have been integrated, as recorded 4c but essentially Raman photons. All pictures 4a . 4b and 4c are scaled equal in their dynamics, only the offset of the scaling has been shifted. Either 4a , as 4b show a strong noise. The 4c , which is an image of the Raman photons, shows a significantly lower noise.

Neben einer Abbildung der Tiefe einer Probe ist es möglich dieselbe Probe, die in den 3–4c untersucht wird auch spektral zu untersuchen beispielsweise mit einem Aufbau gemäß 2. Anstelle eines Ort-Zeit-Scans wurde mit Hilfe der Vorrichtung gemäß 2 ein Spektrum-Zeit-Scan aufgenommen. Bei einem derartigen Spektrum-Zeit-Scan nimmt man für jede Wellenlänge ein Zeitspektrum auf, in dem man beispielsweise das Gitter des Spektrometers dreht. Die aufgenommenen Zeitspektren bei unterschiedlichen Wellenlängen können wieder durch zeitliches Filtern ausgewertet werden und ergeben die in 5a dargestellten Kurven. Hierbei ist dargestellt, die Anzahl der Photonen (cts) über der Wellenlänge 1/cm. Hierbei wurde über den gesamten Zeitbereich des Zeitspektrums integriert. Das sich hieraus ergebende Spektrum 300 zeigt sowohl ein Fluoreszenzspektrum sowie ein überlagertes Raman-Spektrum. Die prominente Bande des überlagerten Raman-Spektrums liegt bei v = 2900·1/cm. Integriert man ausschließlich Photonen im Zeitbereich 18,6 ns bis 33 ns so ergibt sich das Spektrum 310. Wie zu erkennen ist, weist diese Spektrum 310 keine prominente Bande, die auf Raman-Photonen hindeutet auf, und stellt somit ausschließlich das Fluoreszenzspektrum dar. Wertet man lediglich kurze Zeiten des Zeitspektrums beispielsweise zwischen 18,1 ns und 18,4 ns aus, so wird im Wesentlichen ein Raman-Spektrum 320 erhalten.In addition to mapping the depth of a sample, it is possible to have the same sample in the 3 - 4c is also investigated spectrally, for example, with a structure according to 2 , Instead of a place-time scan was using the device according to 2 a spectrum-time scan was taken. In such a spectrum-time scan, a time spectrum is taken for each wavelength, for example by rotating the grating of the spectrometer. The recorded time spectra at different wavelengths can be evaluated again by temporal filtering and yield the in 5a illustrated curves. Here, the number of photons (cts) over the wavelength 1 / cm is shown. This was integrated over the entire time range of the time spectrum. The resulting spectrum 300 shows both a fluorescence spectrum and a superimposed Raman spectrum. The prominent band of the superimposed Raman spectrum is v = 2900 x 1 / cm. Integrating only photons in the time range from 18.6 ns to 33 ns results in the spectrum 310 , As can be seen, this spectrum exhibits 310 no prominent band, which points to Raman photons, and thus represents only the fluorescence spectrum. If one evaluates only short times of the time spectrum, for example, between 18.1 ns and 18.4 ns, so is essentially a Raman spectrum 320 receive.

5b zeigt im Vergleich ein Raman-Spektrum 800, das mit der erfindungsgemäßen Zeitdifferenz-Messmethode aufgenommen wurde, zu einem Raman-Spektrum 510, das mit einer konventionellen CCD-Kamera nach einem Gitterspektrometer aufgenommen und bei dem mit Hilfe eines Fit-Programmes, der Fluoreszenzuntergrund angefittet und abgezogen wurde. 5b shows in comparison a Raman spectrum 800 obtained with the time difference measuring method according to the invention, to a Raman spectrum 510 , which was recorded with a conventional CCD camera after a grating spectrometer and in which by means of a Fit program, the fluorescence background was attached and subtracted.

Wie deutlich zu erkennen, ergibt sich für die konventionelle Messung mit CCD-Kamera und Korrektur ein sehr verrauschtes Spektrum, wohingegen bei dem mit Hilfe der Zeiterfassungsmethode aufgenommenen Spektrum 800 das Rauschen deutlich geringer ist.As can be clearly seen, the conventional measurement with CCD camera and correction results in a very noisy spectrum, whereas in the spectrum recorded using the time-acquisition method 800 the noise is much lower.

Dies ist darauf zurückzuführen, dass der Rauschanteil der Fluoreszenz weit höher ist als der Rauschanteil des Raman-Signals. Bei der ersten Methode, bei der lediglich von dem von der CCD-Kamera aufgenommenen Spektrum das Fluoreszenzspektrum mathematisch abgezogen wurde, ist das Rauschen deutlich höher als bei dem mit Hilfe der Zeiterfassung ermittelten Raman-Spektrum.This is because the noise of the fluorescence is much higher than the noise of the Raman signal. In the first method, in which only the fluorescence spectrum was mathematically subtracted from the spectrum recorded by the CCD camera, the noise is significantly higher than in the case of the Raman spectrum determined with the aid of time recording.

5b zeigt sehr eindrücklich die Vorteile der erfindungsgemäßen Messmethode, bei der mit Hilfe der Zeitdifferenz-Messeinrichtung die Photonen zeitlich zugeordnet werden, gegenüber einer Messmethode, die eine zeitliche Zuordnung nicht vornimmt, sondern lediglich die Intensität von Photonen auf integriert. 5b shows very impressively the advantages of the measuring method according to the invention, in which the photons are time-allocated with the aid of the time-difference measuring device, compared to a measuring method which does not carry out a temporal assignment but merely integrates the intensity of photons.

In 6 sind für bestimmte Wellenlängen die Zeitspektren, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Zeitdifferenz-Messverfahrens aufgenommen wurden, dargestellt. Nimmt man beispielsweise bei einer Wellenzahl v = 1400 1/cm eine Zeit auf, so ergibt sich Kurve 410. Kurve 410 zeigt sowohl eine Ramanzeitkurve bzw. ein Ramanzeitsignal 410.1 wie eine Fluoreszenzzeitkurve bzw. ein Fluoreszenzzeitsignal 410.2. Hierbei ist das Ramanzeitsignal 410.1 im Bereich der kurzen Zeiten das heisst im Bereich von 18,1 bis 18.4 ns prominent und wird mit 430 gekennzeichnet. Wird hingegen die Wellenzahl v = 1500 1/cm ausgewählt, so ergibt sich das Zeitspektrum 420, das im Wesentlichen auf Fluoreszenzprozessen beruht.In 6 For certain wavelengths, the time spectra recorded using the time difference measuring method according to the invention are shown. If, for example, a time is taken at a wave number v = 1400 1 / cm, the result is a curve 410 , Curve 410 shows both a Raman time curve and a Ramanzeitsignal 410.1 like a fluorescence time curve or a fluorescence time signal 410.2 , Here is the Ramanzeitsignal 410.1 in the range of short times that means in the range of 18.1 to 18.4 ns prominently and becomes with 430 characterized. If, on the other hand, the wavenumber v = 1500 1 / cm is selected, then the time spectrum results 420 which is based essentially on fluorescence processes.

Wird nunmehr der Spiegel 140 in 2 so gestellt, dass das Licht nicht mehr auf die Photodiode 50 und die nachgeschaltete Zeiterfassungsmessung gesandt wird, sondern auf den CCD-Chip 130, so kann ein konventionelles Spektrum 900 wie in 7 dargestellt aufgenommen werden. Bei dem konventionellen Spektrum 900 lässt sich Fluoreszenz- und Ramanlicht nur schwierig trennen, beispielsweise, indem man das Fluoreszenzsignal, wie in 5b beschrieben, mathematisch abzieht. Dies führt allerdings zu wesentlich verrauschteren Spektren als im Fall der erfindungsgemäßen Messmethode.Will now be the mirror 140 in 2 so posed that the light is no longer on the photodiode 50 and the downstream timing measurement is sent but to the CCD chip 130 so can a conventional spectrum 900 as in 7 be recorded represented. In the conventional spectrum 900 it is difficult to separate fluorescence and Raman light, for example by using the fluorescence signal as in 5b described, subtracts mathematically. However, this leads to significantly more noisy spectra than in the case of the measuring method according to the invention.

Mit der Erfindung wird erstmals eine Vorrichtung angegeben, die es erlaubt, aufgrund von Zeitmessung der Photonen die Raman-Photonen von den Fluoreszenzphotonen zu trennen und so Fluoreszenzuntergrundrauschen stark zu unterdrücken, was eine hochaufgelöste Aufnahme von Ramanspektren oder zweidimensionalen Scans von Probenoberfläche auf der Basis von Ramansignal auch bei fluoreszierenden Proben ermöglicht.The invention provides for the first time an apparatus which, by timing the photons, allows the Raman photons to be separated from the fluorescence photons, thus greatly suppressing fluorescence background noise, resulting in high resolution uptake of Raman spectra or two-dimensional scans of sample surface based on Raman signal also possible with fluorescent samples.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

DE 19902234 A1 [0055]

Claims

Raman device, in particular Raman microscope with a light source ( 3 ) for exciting a light emission in a sample ( 5 ), wherein the light source emits photons; a detector ( 50 ) for detecting the photons emitted by the sample in the light emission, characterized in that the device comprises a device ( 80 ) for measuring the time difference of the photons emitted by the light source ( 7 ) and the photons emitted by the sample due to the action of the photons of the light source, in particular the Raman and / or fluorescence photons ( 20 ).

Raman device, in particular Raman microscope according to claim 1, characterized in that the light source is a pulsed light source, preferably a pulsed laser light source, in particular a pulsed laser light source with a light pulse of 5 ps to 100 ps, in particular 10 ps to 40 ps duration, all preferably a pulsed laser light source with a light pulse of 5 ps to 100 ps, in particular 10 ps to 40 ps duration and a repetition rate of 5 MHz to 100 MHz, more particularly from 10 MHz to 50 MHz.

Raman device, in particular Raman microscope according to one of claims 1 to 2, characterized in that the device ( 80 ) for measuring the time difference is such that the time difference between a synchronization pulse (SYNC) for each light pulse of the light source and the detector (s) 50 ) photon (s) taken by the sample, in particular Raman and fluorescence photon (s) ( 20 ) is determined.

Raman device, in particular Raman microscope according to one of claims 1 to 3, characterized in that the device ( 80 ) for measuring the time difference comprises a time-to-digital converter, in particular in the form of an integrated component.

Raman-Vorichtung, in particular Raman microscope according to one of claims 1 to 4, characterized in that in a beam path from the light source ( 3 ) for trial ( 5 ) at least one lens ( 11 ) is provided, with which the light ( 7 ) of the light source ( 3 ) to the test ( 5 ) and the light emitted by the sample ( 7 . 20 ) is collected.

Raman device, in particular Raman microscope according to one of claims 1 to 5, characterized in that in a beam path of the sample ( 5 ) to the detector ( 50 ) a filter ( 30 ) and / or a spectrometer ( 100 ) is provided.

Method for detecting the Raman and / or fluorescence signal of a sample comprising the following steps: - a pulse of light is preferably provided by means of a pulsed laser at 5 ps to 100 ps, in particular 10 ps to 40 ps duration; - The light of the laser pulse is directed to a sample; The light emitted by the sample is picked up by a detector; By means of a time difference measuring device ( 80 ) determines the time difference between the light pulse of the laser and the light emitted by the sample detected by the detector, resulting in a time difference signal ( 210 . 410 ).

A method according to claim 7, characterized in that the light emitted by the sample is spectrally decomposed before being picked up by the detector.

Method according to one of Claims 7 and 8, characterized in that the time difference signal ( 210 . 410 ) into a fluorescence signal ( 200 . 410.2 ) and a Raman signal is split, in particular by assignment of rapidly emitted photons to the Raman signal and slowly emitted photons to fluorescence signal.

A method of imaging the surface of a sample, wherein the sample is mounted on a traveling stage, comprising the following steps: - The sample is placed in a first position and recorded with a method according to one of claims 7 to 9 at least one time difference signal and optionally obtained therefrom a low-noise Raman signal; - After recording the time difference signal, the sample is moved in a further step at a further point and there again a time difference signal according to one of the methods 7 to 9 and optionally obtained therefrom a low-noise Raman signal, wherein the steps are repeated until a sample area is scanned, for example, a line, an area or a volume.