DE102009043743A1 - Zellspezifisch wirksame Moleküle auf Grundlage von siRNA sowie Applikationskits zu deren Herstellung und Verwendung - Google Patents
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Abstract
Aufgabe war es, eine Verbindung zwischen der siRNA sowie ein oder mehreren Peptiden zu schaffen, bei welcher die siRNA nach Peptidabspaltung aktiviert wird, ohne dass durch den verbleibenden Linker und/oder verbleibende Peptidreste die biologische Wirksamkeit der in der Zelle aktivierten siRNA nennenswert beeinträchtigt wird. Erfindungsgemäß werden das oder die Peptide (3) über einen speziellen Amino-Cn-Linker, beispielsweise einen Amino-C6-Linker (1), an die siRNA (2) gekoppelt, welcher trotz seines Verbleibens an der siRNA und Verbleibens eventueller Peptidreste keine oder nur unwesentliche hemmende Beeinträchtigung der biologischen Wirksamkeit der siRNA ausübt. Anwendung finden diese Moleküle beispielsweise zur Beeinflussung der Genexpression von vorzugsweise erkrankten und infizierten Organen bzw. Zellen oder zur Reduktion der Expression gewünschter Gene in Zellgemischen.
Description
- Die Erfindung betrifft spezielle biologisch wirksame Moleküle auf Grundlage von „short interfering RNA” (siRNA). Die besagten biologisch wirksamen Moleküle interagieren nach ihrer Aktivierung mit der mRNA des Zielgens und bilden zusammen mit speziellen Endoribonukleasen einen RNA-Proteinkomplex mit der Bezeichnung „RISC” (RNA induced silencing complex). Der RISC Komplex bindet an die Target-mRNA, wobei Endonukleasen die Ziel-mRNA schneiden. Auf diese Weise wird die Genexpression verhindert und somit das Entstehen von Zielproteinen gehemmt.
- Die zellspezifisch aktivierbaren, biologisch wirksamen Moleküle können beispielsweise zur Bekämpfung und Wachstumshemmung anormaler Zellen, insbesondere bei der Tumorbehandlung, bei der Behandlung von Virus-Infektionen, bei alterungsspezifischen Behandlungen etc. eingesetzt werden. Allgemein können die zellspezifisch aktivierbaren, biologisch wirksamen Moleküle zur Modulation der Genexpression der Zielzellen genutzt werden. Dabei kann die Expression von Genen nicht nur verringert, sondern auch erhöht werden, indem durch die biologisch aktiven Moleküle eine Verringerung der Expression der Negativ-Regulatoren des Zielgens erreicht wird.
- Die Hemmung der Genexpression durch Einbringen von kurzen (19-23bp), doppelsträngigen RNA-Molekülen (siRNA) in eukaryotische Zellen, die spezifisch für einen Sequenzabschnitt der mRNA eines Zielgens ist, wurde bereits beschrieben (Elbashir SM et al.: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 411 (6836), 494–8; Liu Y et al.: Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43 (7), 1921–7;
US 5,898,031 ;US 7,056,704 ). - Mit Hilfe solcher Moleküle wird nicht das Ablesen eines Gens und die Produktion einer mRNA verhindert, sondern es wird durch die siRNA ein zelleigener Mechanismus initiiert, der die Target-mRNA abbaut. Schließlich wird, wie vorbeschrieben, die Bildung eines spezifischen Proteins unterdrückt, ohne die Expression weiterer Gene zu beeinträchtigen (post-transcriptional gene silencing).
- Um die Expression eines Gens zu unterdrücken, können die siRNA Moleküle dabei insbesondere über Transfektionsreagenzien und Elektroporation direkt in die Zelle eingebracht werden (Zhang M et al.: Downregulation enhanced green fluorescence protein gene expression by RNA interference in mammalian cells, RNA Biol. 2004 May, 1 (1), 74–7; Gilmore IR et al.: Delivery strategies for siRNA-mediated gene silencing, Epub 2004 May 22., Curr Drug Deliv. 2006 Apr, 3 (2), 147–5;
US 6,506,559 ). - Von Nachteil ist dabei, dass die siRNA relativ instabil ist, was durch chemische Modifikationen verbessert werden kann (
US 6,107,094 ). - Ein spezielles Problem der therapeutischen Anwendung von biologisch wirksamen Molekülen ist eine Applikation in vivo. Für eine solche Applikation wurden Möglichkeiten entwickelt, die siRNA zu stabilisieren, um den Abbau zu vermindern (Morrissey et. al.: „Chemical Modifications of Synthetic siRNA", Pharmaceutical Discovery, May 1, 2005), und es wurden Transfektionsreagenzen, beispielsweise Nanopartikel, in vivo jetPEITM (Polyplus), entwickelt, welche auch in vivo die siRNA in Zellen einbringen (Vernejoul et al.: Antitumor effect of in vivo somatostatin receptor subtype 2 gene transfer in primary and metastatic pancreatic cancer models, Cancer Research 62, 2002, 6124–31; Urban-Klein B, Werth S, Abuharbeid S, Czubayko F, Aigner A: RNAi-mediated gene-targeting through systemic application of polyethylenimine (PEI)-complexed siRNA in vivo, Gene Ther 12 (5), 2005, 461–6.).
- Ebenfalls wurden Methoden entwickelt, verstärkt Zellen eines Zielgewebes mit siRNA in vivo zu transfizieren (Ikeda et. al.: „Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA", Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 8, August 2006).
- Die Verabreichung von biologisch aktiven Substanzen in vivo ist allerdings auf Grund der systemischen Wirkung oft problematisch. Das Einbringen dieser Substanzen selektiv in Zielzellen erfolgt nicht ausreichend spezifisch. Dies ist besonders bei siRNA Molekülen von Nachteil, die selektiv und ausschließlich in Zielzellen zur Wirkung kommen sollen. Durch gewebs- bzw. zellspezifisch-markierte Transfektionsreagenzien (z. B. Antikör per/Antigen-markierte Nanopartikel, TAT-Protein-Flankierung, u. a.) wird keine genügend große Zellspezifität erreicht. Fehltransfektionen sind die Folge.
- Weiterhin ist bekannt, siRNA-Moleküle durch Bindung von Fluorochromen in ihrer biologischen Wirkung zu inaktivieren und durch Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge in ihre aktive Form wieder zu überführen (QN Nguyen et al.: Light controllable siRNAs regulate gene suppression and phenotypes in cells, Biochim Biophys Acta, 2006). Diese Aktivierung wird von außen initiiert und erfolgt in keiner Weise zellspezifisch. Dadurch wirken die besagten siRNA-Moleküle nach ihrer Aktivierung wiederum auch ungewollt in allen anderen transfizierten Zellen und nicht nur in den bestimmungsgemäßen Zielzellen.
- Außerdem kann auch dieser Mechanismus nur schwer in vivo angewandt werden.
- Des Weiteren ist bekannt, siRNA Moleküle durch Bindung von Peptiden in ihrer biologischen Wirkung zu inaktivieren, welche so gestaltet sind, dass diese Peptide in Zielzellen durch Zielzell-spezifisch aktive Peptidasen abgespaltet werden, während sie in nicht-Zielzellen inaktiv bleiben (
WO002008098569A2 - Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine Verbindung zwischen der siRNA sowie ein oder mehreren Peptiden zu schaffen, bei welcher die siRNA nach Peptidabspaltung aktiviert wird, ohne dass durch den verbleibenden Linker und/oder verbleibende Peptidreste die biologische Wirksamkeit der in der Zelle aktivierten siRNA nennenswert beeinträchtigt wird.
- Erfindungsgemäß wird ein spezieller Amino-Cn-Linker (mit Cn = C1, C2, C3, C4, C5 oder C6), beispielsweise ein Amino-C6-Linker, vorgeschlagen, über welchen die siRNA an ihrem 3'- oder/und 5'-Ende mit dem zumindest einem Peptid kovalent gekoppelt ist. Durch diese kovalente Bindung werden die biologisch wirksamen siRNA Moleküle inaktiviert. Es findet somit nach einer Transfektion solcher inaktiven Moleküle keine Hemmung einer spezifischen Genexpression statt, solang auch nur eine der gebundenen Peptide durch das Nichtvorhandensein des entsprechenden zielzellentypischen Enzyms an den siRNA-Molekülen verbleibt.
- Zur Aktivierung der biologisch-wirksamen Moleküle werden das oder die Peptide von der siRNA abgespalten, wobei der Amino-Cn-Linker und eventuell ein Peptidrest an der siRNA verbleibt.
- Wenngleich auch der vorgeschlagene spezielle Linker nach der Abtrennung des oder der Peptide vom Molekül an der siRNA verbleibt (und auch ggf. Peptidreste bei der Abpaltung zurückbleiben), zeigt sich überraschend, dass mit dem Verbleiben dieses Linkers und ggf. der besagten Peptidreste so gut wie keine (oder, sofern überhaupt, dann nur unwesentliche) Beeinträchtigung der aktivierten siRNA Wirksamkeit des gespaltenen Moleküls gegeben ist, obwohl es in der fachmännischen Erwartung liegt, dass jeglicher an der siRNA verbleibende Molekülteil eine die biologische Wirksamkeit der siRNA einschränkende Wirksamkeit ausüben würde. Linker, wie auch der für das siRNA Molekül vorgeschlagene Amino-Cn-Linker, sind an sich bekannt, werden aber in der Praxis nicht zur Verbindung mit abspaltbaren Peptiden eingesetzt. Über solche Verwendungen, ist auch in der Fachwelt nicht bekannt geworden. Mit der Erfindung bleiben die Moleküle auf siRNA-Basis, welche durch die zellspezifischen Enzyme der Zielzelle nicht aufgebrochen werden (vgl. (
WO002008098569A2 - Der erfindungsgemäße Effekt wurde anhand des Amino-C6-Linkers nachgewiesen, wobei es sich allerdings gezeigt hat, dass auch kleinere oder größere Strukturen dieses Linkertyps (wie Amino-C2, -C3, -C4, -C5-Linker) mit vergleichbarer Wirkung Anwendung finden können.
- Durch ein geeignetes Transfektionssystem, beispielsweise Nanopartikel oder Hüllmoleküle wie Liposomen, können die inaktivierten Wirkstoffmoleküle bekannter Weise in die Zielzellen transfiziert werden. Dort werden die besagten inaktivierenden kovalenten Bindungen durch das oder die zellspezifischen Enzyme, welche für die Bindungssequenzen des oder der Kopplungspeptide relevant sind, zelltypisch aufgebrochen, wodurch das nunmehr in der Zielzelle befindliche und von Peptiden gelöste Molekül in seiner biologischen Wirksamkeit aktiviert wird. Dieses bindet darauf hin an die spezifische mRNA der Zielzelle und hemmt dadurch in ebenfalls bekannter Weise die Genexpression in dieser speziellen Zelle.
- In allen anderen Zellen des Organismus als die vorbestimmten Zielzellen, in welche die besagten inaktiven Molekülkonstrukte ebenfalls gelangen können, bleiben die Wirkstoffmoleküle zuverlässig inaktiv, da die kovalenten Bindungen zwischen dem biologisch wirksamen Molekül, insbesondere siRNA, und dem oder den Peptiden durch das Nichtvorhandensein des oder der zielzellenspezifischen Enzyme vollständig (keine Peptidbindung wurde aufgebrochen) oder teilweise (nicht alle Peptidbindungen wurden aufgebrochen) bestehen bleiben. Das biologisch wirksame Molekül geht auf Grund der weiterhin kovalenten Peptidbindung keine Bindung mit der mRNA dieser Zelle ein, bzw. es wird kein RISC initiiert.
- Wenngleich beispielsweise bei der Tumorbehandlung die zu transfizierenden erfindungsgemäßen Molekülkonstrukte in ihrer inaktiven (gebundenen) Form nicht nur in bzw. an tumorerkrankte Zielzellen gelangen, sondern (was in der Praxis kaum zu vermeiden ist) auch gesunde Zellen erreichen können, werden selektiv ausschließlich in oder an den tumorerkrankten Zielzellen mit dem dortigen zellspezifischen Enzymen das besagte Molekül in seiner biologischen Wirkung aktiviert und die wirkstoffbezogene Expression des Zielgens wirkungsvoll gehemmt. Diese Genexpression und damit die Proteinbildung für den Fortbestand der gesunden Zellen bleibt trotz der in diesen nicht erkrankten (bzw. für die beabsichtigte biologische Wirkung nicht zweckbestimmten) Zellen befindlichen, jedoch permanent inaktiven Molekülkonstrukte von diesem Wirkstoff unberührt.
- Durch die vorgeschlagene hochselektive Wirkung der Moleküle infolge Zielzellenenzymspezifischer Inaktivität/Aktivierung können die zu transfizierenden biologisch inaktiven Molekülkonstrukte bei entsprechender Peptid-Bindung (mit definierten Aminosäurekombinationen) systemisch verabreicht werden.
- Die Molekülkonstrukte können zum besseren Transport in bzw. an die Zielzellen sowie zu ihrer Stabilisierung außerdem an weitere Stoffe (beispielsweise Nanopartikel als Trägersystem) gebunden werden.
- Durch Anwendung der Erfindung können diese Fehltransfektionen zwar nicht verhindert werden, jedoch sind die fehltransfizierten Moleküle in diesen anderen Zellen als die Zielzellen, wenngleich nach wie vor unerwünscht, biologisch nicht wirksam. Dieser Status bleibt auch trotz der Molekülaktivierung in oder an den Zielzellen unverändert, so dass die biologische Wirkung selektiv ausschließlich in den Zielzellen erfolgt und im Gegensatz zu den bekannten Mechanismen eine hochgradig zellselektive Modulation der Genexpression erreicht wird.
- Weiterhin kann in Betracht gezogen werden, anstatt 18-23bp große siRNA Moleküle, auch kleinere doppelsträngige RNA-Moleküle zu verwenden.
- Die Verwendungsmöglichkeiten solcher Moleküle mit einer kovalenten Bindung der siRNA an ein oder mehrere Peptide sind bereits in der
WO002008098569A2 - Vorteilhaft ist ein Applikationskit, in welchem die einzusetzenden biologisch wirksamen Moleküle mit den auswählbaren Peptiden (vgl.
WO002008098569A2 - Es bietet sich an, einen solchen Applikationskit spezifisch für ausgewählte Zielzellen und Zielgene sowie je nach Anwendungsbereich (in vitro oder in vivo) bereitzustellen.
- Die Erfindung soll nachstehend anhand des in der Zeichnung dargestellten Amino-C6-Linkers als Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
- Es zeigen:
-
1 : inaktiviertes siRNA-Molekül durch Kopplung der siRNA über den Amino-C6-Linker mit dem Peptid; chemische Struktur des Amino-C6-Linkers -
2 : zellspezifisch aktiviertes siRNA-Molekül, bei dem die Peptidbindung aufgebrochen ist und am siRNA-Molekül der Amino-C6-Linker sowie ein Peptidrest verbleiben -
3 : Enzymaktivität von Caspase-4 in Ziel- und Nichtzielzellen -
4 : Darstellung der zellspezifischen Reduktion der Expression des GFP-Gens durch Peptid-inhibierte siRNA -
1 zeigt als Beispiel eines Amino-Cn-Linkers mit Cn = C1, C2, C3, C4, C5 oder C6 die chemische Struktur eines an sich bekannten Amino-C6-Linkers1 . Über diesen Amino-C6-Linker1 ist eine siRNA2 zu deren biologischen Inaktivierung (Inaktivierung der Wirkung der siRNA in einer Zelle) mit einem Peptid3 gekoppelt. Der Amino-C6-Linker1 ist über das 5'-Ende des Antisense-Stranges der siRNA2 mit derselben verbunden. Solange das Peptid3 an dieses siRNA-Molekül gebunden ist, bleibt das siRNA-Molekül biologisch inaktiviert. - Wenn die Peptidbindung durch ein zellspezifisches Enzym einer Zielzelle, in die das inaktivierte siRNA-Molekül gemäß
1 transfiziert wurde, aufgebrochen wird (vollständige Abspaltung aller Peptide3 ), erfolgt eine biologische Aktivierung des verbleibenden siRNA-Moleküls, indem die an sich bekannte und mit der Molekül-Transfektion beabsichtigte zellspezifische Wirkung der siRNA aktiviert wird (siehe auchWO002008098569A2 - Überraschender Weise erfolgt diese Aktivierung, wenngleich der Amino-C6-Linker
1 und ggf. ein Rest des Peptids3 nach besagtem Aufbruch der Peptidbindung an dem Rest des siRNA-Moleküls verbleiben (vgl.2 ), so dass trotz dieses Verbleibens die besagte biologische Wirkung der siRNA2 durch den am Molekül verbleibenden Amino-C6-Linker1 sowie die Rudimente des Peptides4 nicht bzw. nicht nennenswert beeinträchtigt wird. - In
3 ist die zellspezifische Aktivität des Spaltenzyms Caspase-4 dargestellt. Dabei ist das Enzym Caspase-4 in den Zielzellen (Jeg-3 Chorionkarzinomzellen; dunkler Diagrammbalken) aktiv, während es in den Nicht-Zielzellen (Human Embryonic Kidney, HEK; heller Diagrammbalken) nicht aktiv ist. Daraus resultierend wird eine siRNA, die durch Bindung des Zielpeptides für Caspase-4 über die Linkerstruktur aus1 inhibiert wurde, in den Zielzellen, welche aktive Caspase-4 enthalten, gespalten und auf diese Weise aktiviert. -
4 zeigt die Nachweisfluoreszenzintensitäten bei der Einbringung einer Kontroll siRNA ohne Funktion, einer siRNA zur Reduktion der Expression des GFP-Gens sowie einer Peptid-inhibierten siRNA, welche durch Caspase-4 aktiviert werden kann. Die Verringerung der Fluoreszenz korreliert hierbei mit der biologischen Aktivität der siRNA. Es ist zu beobachten, dass in den Zielzellen (JEG-3 Chorionkarzinomzellen; dunkler Diagrammbalken) die siRNA aktiviert und somit die Expression des GFP-Gens reduziert wird, während es in den Nicht-Zielzellen (Human Embryonic Kidney, HEK; heller Diagrammbalken) zu keiner Reduktion der Expression dieses Gens kommt. Auch wenn an der aktivierten siRNA die Linker-Struktur und ein Peptidrest verbleibt (In diesem Fall ein Amino-C6-Linker mit gebundenem Glycin), ist die Wirkung der siRNA vergleichbar der Wirkung normaler siRNA. -
- 1
- Amino-C6-Linker
- 2
- siRNA
- 3
- Peptid zur Inaktivierung der siRNA
- 4
- Peptidrest
- ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
- Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
- Zitierte Patentliteratur
-
- - US 5898031 [0003]
- - US 7056704 [0003]
- - US 6506559 [0005]
- - US 6107094 [0006]
- - WO 002008098569 A2 [0012, 0016, 0025, 0026, 0035]
- Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Elbashir SM et al.: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 411 (6836), 494–8 [0003]
- - Liu Y et al.: Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43 (7), 1921–7 [0003]
- - Zhang M et al.: Downregulation enhanced green fluorescence protein gene expression by RNA interference in mammalian cells, RNA Biol. 2004 May, 1 (1), 74–7 [0005]
- - Gilmore IR et al.: Delivery strategies for siRNA-mediated gene silencing, Epub 2004 May 22., Curr Drug Deliv. 2006 Apr, 3 (2), 147–5 [0005]
- - Morrissey et. al.: „Chemical Modifications of Synthetic siRNA”, Pharmaceutical Discovery, May 1, 2005 [0007]
- - Vernejoul et al.: Antitumor effect of in vivo somatostatin receptor subtype 2 gene transfer in primary and metastatic pancreatic cancer models, Cancer Research 62, 2002, 6124–31 [0007]
- - Urban-Klein B, Werth S, Abuharbeid S, Czubayko F, Aigner A: RNAi-mediated gene-targeting through systemic application of polyethylenimine (PEI)-complexed siRNA in vivo, Gene Ther 12 (5), 2005, 461–6 [0007]
- - Ikeda et. al.: „Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA”, Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 8, August 2006 [0008]
- - QN Nguyen et al.: Light controllable siRNAs regulate gene suppression and phenotypes in cells, Biochim Biophys Acta, 2006 [0010]
Claims (11)
- Zellspezifisch wirksame Moleküle auf Grundlage von siRNA zur biologisch inaktiven Transfektion in eine Zielzelle, um in dieser nach biologischer Aktivierung durch Bindung an mRNA und unter Formierung eines ”RISC”-Komplexes die Expression von Genen zu hemmen, wobei die siRNA zum Zweck ihrer biologischen Inaktivierung mit wenigstens einem Peptid über einen Linker gekoppelt ist, der nach der biologischen Aktivierung des Moleküls an der siRNA verbleibt, dadurch gekennzeichnet, dass die siRNA (
2 ) über einen Amino-Cn-Linker (1 ) mit Cn = C1, C2, C3, C4, C5 oder C6 an das wenigstens ein Peptid (3 ) gekoppelt ist. - Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Amino-Cn-Linker ein Amino-C6-Linker vorgesehen ist.
- Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Amino-Cn-Linker ein Amino-C5-Linker verwendet wird.
- Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Amino-Cn-Linker ein Amino-C4-Linker vorgesehen ist.
- Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Amino-Cn-Linker ein Amino-C3-Linker eingesetzt wird.
- Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Amino-Cn-Linker ein Amino-C2-Linker dient.
- Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Amino-Cn-Linker ein Amino-C1-Linker vorgesehen ist.
- Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass an dem biologisch wirksamen Molekül mit dem über den Amino-Cn-Linker zumindest einen kovalent gebundenen Peptid ein Transfektionssystem zur Transfektion in oder Bindung an die Zielzellen kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt ist, beispielsweise ein Trägersystem wie Nanopartikel, Ligand/Antikörper/Antigenmarkierung oder Moleküle wie Nanopartikel, Polymere oder Lipide, mit denen die selektiv aktivierbaren biologisch wirksamen Moleküle zu ihrer Transfektion umhüllt werden, oder Lipid-basierte Methoden oder eine TAT-Protein-Flankierung.
- Applikationskit zur Anwendung und Verabreichung der zellspezifisch wirksamen Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, bestehend zumindest aus – wenigstens einer Ampulle (Ampulle A), welche eine zum Zweck der Inaktivierung an ein ausgewähltes Peptid gebundene siRNA mit einem an diese gebundenem Amino-Cn-Linker enthält, – wenigstens einer weiteren Ampulle (Ampulle B) mit einem Transfektionssystem, beispielsweise Nanopartikel oder Lipide, – Verdünnungs- und Reaktionspuffer für die Inhalte der Ampullen A und B, – einer oder mehreren Sonden bzw. Spritzen mit Kanüle und andere benötigte Materialien zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das die Zielzellen enthaltende Medium sowie – einer Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung
- Applikationskit gemäß Anspruch 13, enthaltend wenigstens eine weitere Substanz, beispielsweise Antikörper zur semi-selektiven Bindung der biologisch wirksamen Moleküle an Zielzellen und/oder Polyethylenglycolketten, zur Verankerung des Peptids und der biologisch wirksamen Moleküle.
- Applikationskit zur Herstellung der zellspezifisch wirksamen Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, bestehend zumindest aus – einer Ampulle (Ampulle A), welche das oder die Peptide enthält, welche zum Zwecke der Inaktivierung der siRNA an diese gebunden werden können, – einer Ampulle (Ampulle B) mit Reaktionspuffern zur Bindung des oder der Peptide an die siRNA – einer Ampulle (Ampulle C) zur Modifikation der Peptide nach der Bindung an die siRNA – einer Ampulle (Ampulle D) mit weiteren Reaktionspuffern – einem System zur Aufreinigung der Teil- oder Endprodukte nach der Bindung der Peptide an die siRNA – eines oder mehrerer Injektionsmittel, wie Sonden oder Spritzen mit Kanüle zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten, sowie weitere benötigte Materialien wie Dialysemembranen oder Reaktionsgefäße, sowie – einer Vorschrift zur Anwendung
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CN2010800117960A CN102348799A (zh) | 2009-03-13 | 2010-03-12 | 基于siRNA的细胞特异性有效的分子和用于制备其的应用试剂盒及其用途 |
EP10718039A EP2406375A1 (de) | 2009-03-13 | 2010-03-12 | ZELLSPEZIFISCH WIRKSAME MOLEKÜLE AUF GRUNDLAGE VON siRNA SOWIE APPLIKATIONSKITS ZU DEREN HERSTELLUNG UND VERWENDUNG |
PCT/DE2010/000284 WO2010102615A1 (de) | 2009-03-13 | 2010-03-12 | ZELLSPEZIFISCH WIRKSAME MOLEKÜLE AUF GRUNDLAGE VON siRNA SOWIE APPLIKATIONSKITS ZU DEREN HERSTELLUNG UND VERWENDUNG |
JP2011553281A JP2012520060A (ja) | 2009-03-13 | 2010-03-12 | siRNAに基づく細胞特異的な有効分子、該分子製造のための適用キット及び該分子の使用 |
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5898031A (en) | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
US6506559B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
US7056704B2 (en) | 2000-12-01 | 2006-06-06 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. | RNA interference mediating small RNA molecules |
WO2008098569A2 (de) | 2007-02-15 | 2008-08-21 | Friedrich-Schiller-Universität Jena | Biologisch wirksame moleküle, insbesondere auf grundlage von pna und sirna, verfahren zu deren zellspezifischen aktivierung sowie applikationskit zur verabreichung |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6589503B1 (en) | 1998-06-20 | 2003-07-08 | Washington University | Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy |
IL129427A0 (en) | 1999-04-13 | 2000-02-17 | Yeda Res & Dev | Preparation of biologically active molecules |
US20030166512A1 (en) * | 2002-02-13 | 2003-09-04 | Medbridge, Inc. | Protein carrier system for therapeutic oligonucleotides |
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EP1968643A2 (de) * | 2005-12-16 | 2008-09-17 | Diatos | Zell-penetrierende peptid-konjugate zur abgabe von nukleinsäuren in eine zelle |
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---|---|---|---|---|
US5898031A (en) | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
US6107094A (en) | 1996-06-06 | 2000-08-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides and ribonucleases for cleaving RNA |
US6506559B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
US7056704B2 (en) | 2000-12-01 | 2006-06-06 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. | RNA interference mediating small RNA molecules |
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Non-Patent Citations (12)
Title |
---|
Elbashir SM et al.: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 411 (6836), 494-8 |
Gilmore IR et al.: Delivery strategies for siRNA-mediated gene silencing, Epub 2004 May 22., Curr Drug Deliv. 2006 Apr, 3 (2), 147-5 |
Ikeda et. al.: "Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA", Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 8, August 2006 |
KIM,Sun Hwa,et.al.:Prostate cancer cell-specific VEGF siRNA delivery system using cell targeting peptide conjugated polyplexes.In:Journal of Drug Targeting,2009,17(4),S.311-317 bstr.$ * |
Liu Y et al.: Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43 (7), 1921-7 |
Morrissey et. al.: "Chemical Modifications of Synthetic siRNA", Pharmaceutical Discovery, May 1, 2005 |
QN Nguyen et al.: Light controllable siRNAs regulate gene suppression and phenotypes in cells, Biochim Biophys Acta, 2006 |
TARATULA,O.,et.al.:Surface-engineered targeted PPI dendrimer for efficient intracellular and intratumoral siRNA delivery.In:J. of Controlled Release 140,2009,S.284-293 Abstr.,Fig.1 KIM,Sun Hwa,et.al.:Prostate cancer cell-specific VEGF siRNA delivery system using cell targeting peptide conjugated polyplexes.In:Journal of Drug Targeting,2009,17(4),S.311-317 Abstr. |
TARATULA,O.,et.al.:Surface-engineered targeted PPI dendrimer for efficient intracellular and intratumoral siRNA delivery.In:J. of Controlled Release 140,2009,S.284-293 bstr.,Fig.1$ * |
Urban-Klein B, Werth S, Abuharbeid S, Czubayko F, Aigner A: RNAi-mediated gene-targeting through systemic application of polyethylenimine (PEI)-complexed siRNA in vivo, Gene Ther 12 (5), 2005, 461-6 |
Vernejoul et al.: Antitumor effect of in vivo somatostatin receptor subtype 2 gene transfer in primary and metastatic pancreatic cancer models, Cancer Research 62, 2002, 6124-31 |
Zhang M et al.: Downregulation enhanced green fluorescence protein gene expression by RNA interference in mammalian cells, RNA Biol. 2004 May, 1 (1), 74-7 |
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