CN102348799A - 基于siRNA的细胞特异性有效的分子和用于制备其的应用试剂盒及其用途 - Google Patents

基于siRNA的细胞特异性有效的分子和用于制备其的应用试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

基于siRNA的细胞特异性有效分子和用于制备其的应用试剂盒及其用途。本发明的目的是产生siRNA与一个或多个肽之间的连接，其中所述siRNA在肽分离后被激活而剩余的接头和/或剩余的肽残基不明显地破坏细胞中激活的siRNA的生物学效力。根据本发明，一个或多个肽(3)通过诸如氨基C6接头(1)的特定氨基Cn接头偶联至siRNA(2)，所述接头不破坏或仅不明显地破坏所述siRNA的生物学效力，尽管其保留在siRNA上以及尽管任何肽残基保留在siRNA上。2.3所述分子用于，例如影响优选疾病或感染的器官或细胞的基因表达或者降低细胞混合物中期望基因的表达。

Description

基于siRNA的细胞特异性有效的分子和用于制备其的应用试剂盒及其用途
背景技术
本发明涉及基于“短干扰RNA”(siRNA)的特异性生物学有效分子。当激活后，所述生物学有效分子与靶基因的RNA相互作用，并与特定的内切核糖核酸酶形成称为“RISC”(RNA诱导的沉默复合物)的RNA蛋白复合物。RISC复合物结合靶mRNA，并且内切核酸酶切割靶mRNA。以这种方式抑制了基因表达，并由此防止形成靶蛋白。
可以使用能够细胞特异性激活的生物学有效分子在例如衰老特异性治疗中等来防止异常细胞并抑制它们的生长，特别是治疗肿瘤和病毒感染。通常，能够细胞特异性激活的生物学有效分子可以用于调节靶细胞的基因表达。但是通过生物学活性分子，其不仅可以降低基因的表达，还可以通过降低靶基因的负调节基因表达来增加基因表达。
已经描述了在真核细胞中通过引入短(19-23bp)双链RNA分子(siRNA)来抑制基因表达，该RNA分子对靶基因的mRNA序列片段是特异性的：Elbashir SM et al.：Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interferencein cultured mammalian cells，Nature，2001 May 24，411(6836)，494-8；Liu Y etal.：Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression bypeptide nucleic acids，Biochemistry，2004 Feb.24，43(7)，1921-7；US 5,898,031；US 7,056,704)。
此类分子并不抑制基因的阅读和mRNA的产生，但是siRNA引发破坏靶mRNA的细胞自身的机制。最后，抑制了特定蛋白的形成而不破坏其他基因的表达(转录后基因沉默)。
为了抑制基因的表达，可以通过转染试剂和电穿孔将siRNA直接引入细胞。(Zhang M et al.：Downregulation enhanced green fluorescence proteingene expression by RNA interference in mammalian cells，RNA Biol.2004 May，1(1)，74-7；Gilmore IR et al.：Delivery strategies for siRNA-mediated genesilencing，Epub 2004 May 22.，Curr Drug Deliv.2006 Apr.，3(2)，147-5；US 6,506,559)。
这种方法的劣势在于siRNA较不稳定，但是这可以通过化学修饰而加以改善(US 6,107,094)。
生物学有效分子的治疗应用中的一个特殊问题是体内应用。对于此类应用已经提出了方法来稳定siRNA以减少分解(Morrissey et.al.：ChemicalModifications of Synthetic siRNA，Pharmaceutical Discovery，May 1，2005)，并且还开发了诸如纳米颗粒体内-jetPEITM(Polyplus)的转染试剂来在体内将siRNA引入细胞(Vernejoul et al.：Antitumor effect of in vivo somatostatinreceptor subtype 2 gene transfer in primary and metastatic pancreatic cancermodels，Cancer Research 62，2002，6124-31；Urban-Klein B，Werth S，Abuharbeid S，Czubayko F，Aigner A：RNAi-mediated gene-targeting throughsystemic application of polyethylenimine(PEI)-complexed siRNA in vivo，Gene Ther 12(5)，2005，461-6.).
而且，还开发了方法来在体内增加靶细胞的siRNA细胞转染(Ikeda et.al.：Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA，Pharmaceutical Research，Vol.23，No.8，August 2006)。
然而，体内施用生物学活性物质通常伴随全身效果的问题。将这些物质选择性引入靶细胞并非足够特异性的。对于仅对靶细胞具有选择效果的siRNA分子这尤为不利。通过组织或细胞特异性标记的转染试剂(如抗体/抗原-标记的纳米颗粒、TAT蛋白侧翼等)并未实现足够高的细胞特异性。结果是错误的转染。
另一种已知方法是通过偶联荧光染料来使siRNA的生物学效果失活，并通过用特定波长的光照射所述分子来将所述分子再转变为它们的活性结构。(QN Nguyen et al.：Light controllable siRNAs regulate gene suppressionand phenotypes in cells，Biochim Biophys Acta，2006)。这种激活从外部引发，并且无论如何都不是细胞特异性的。因此，所述siRNA分子在激活后不仅在相应靶细胞中具有效果，而且意外地在所有其他转染细胞中具有效果。
而且，也难以在体内应用这种机制。
还已知通过偶联形成的肽来使siRNA的生物学效果失活，从而这些肽在靶细胞中通过靶细胞特异性活性肽酶而被分离，而它们在非靶细胞中保持无活性(WO002008098569A2)。以这种方式可以高选择性地激活靶细胞中基于siRNA的分子而不存在所述分子对其他细胞的细胞功能的不利效果。
实践证实，siRNA与肽的连接并非不存在问题，而且在分离一个或多个肽后，保留在siRNA上的接头(linker)或者剩余的肽残基破坏靶细胞中siRNA的效力。尽管siRNA在肽偶联时有效地失活，但是在肽分离后保留在siRNA上的经检验的接头以及可能的所述肽残基对引入RNA干扰具有不利效果，因而破坏siRNA的生物学效力。
发明内容
本发明的目的是产生siRNA与一个或多个肽之间的连接，其中所述siRNA在肽分离后被激活而剩余的接头和/或剩余的肽残基不会显著地破坏细胞中激活的siRNA的生物学效力。
根据本发明，提供了特别的氨基Cn接头(Cn＝C1、C2、C3、C4、C5或C6)，例如氨基C6接头，由此siRNA在其3’和/或5’端共价偶联至至少一个肽。这种共价偶联使生物学有效siRNA分子失活。因此，特异性基因表达在转染此类失活分子后未受抑制，只要甚至仅有一个偶联的肽保留在siRNA分子上，这是由于不存在特异于靶细胞特的相应酶。
为了激活生物学有效分子，将一个或多个肽从siRNA分离，并且氨基Cn接头以及可能的肽残基保留在siRNA上。
即使本发明的特别的接头在所述一个或多个肽的分离后仍保留在siRNA上(以及可能的肽残基在分离后也保留在siRNA上)，还是令人惊奇地发现保留的接头以及可能的所述保留的肽残基对所分离分子的经激活siRNA的效力几乎没有不利影响(或者如果有不利影响也是不明显的)，尽管本领域技术人员会预期到保留在siRNA上的该分子的任何部分会降低siRNA的生物学效力。接头，即提供给siRNA分子的氨基Cn接头本身是已知的，但是尚未用于可分离肽的偶联。甚至本领域技术人员也不了解此类应用。在本发明中，不被靶细胞的细胞特异性酶破坏的基于siRNA的分子(见WO002008098569A2)在转染入或转染至靶细胞后，可靠地保持无活性，并且在分子断裂时被激活而具有siRNA的生物学效力。
本发明的创造性效果已经通过氨基C6接头得到证实，而测试表明，所述接头类型的更小或更大的结构(如氨基C2、C3、C4、C5接头)也可以被使用而具有类似的效果。
如已知的，合适的转染系统例如纳米颗粒或包被分子如脂质体可以用于将失活的活性成分分子转染入靶细胞中。在靶细胞中，所述失活的共价键可以通过细胞特异性方式由一种或多种细胞特异性酶所断裂，所述细胞特异性酶与一个或多个偶联肽的键合序列是相关的，因此目前在靶细胞中并与肽分离的分子的生物学效力被激活。然后，所述分子偶联至靶细胞的特异的mRNA，并因此以也是已知的方式抑制该特异性细胞中的基因表达。
在所述分子构建体也可以进入的生物体不同于预定靶细胞的所有其他细胞中，活性分成分子可靠地保持无活性，这是由于不存在一种或多种靶细胞特异性酶而使得生物学有效分子特别是siRNA与一个或多个肽之间的共价键被完全(没有肽键被破坏)或部分(并非所有的肽键均被破坏)保留。由于仍然存在共价肽键，生物学活性分子不与该细胞的mRNA连接。
尽管，例如在肿瘤治疗中，要转染的本发明的分子构建体不仅以它们的失活(偶联)形式进入或到达肿瘤疾病靶细胞，而且可以到达健康细胞(这在实际治疗中几乎不可避免)，所述分子的生物学效力仅选择性地在肿瘤疾病靶细胞中或靶细胞处通过该处存在的细胞特异性酶而被激活，而受到活性成分影响的靶基因的表达则有效地被抑制。用于健康细胞继续存在的这种基因表达和由此的蛋白形成则不受该活性成分的影响，尽管该分子构建体存在于这些非疾病细胞(或对于预期的生物学效果并非期望的细胞)中，因为它们在那里是永久性无活性的。
由于通过靶细胞酶特异性失活/激活而实现的所述分子的高选择性效力，要转染的具有合适肽偶联的生物学失活分子构建体可以全身施用。
所述分子构建体可以偶联至其他物质(例如作为载体系统的纳米颗粒)以保证它们更好的转运和稳定。
在本发明中，错误的转染是不可避免的，但是错误转染的分子，即使它们仍然是不期望的，在并非靶细胞的细胞中是生物学失活的。即使靶细胞中或靶细胞处的分子激活，这种状态也不会改变，从而生物学效力仅选择性地在靶细胞中形成，与已知的机制相反，实现了基因表达的高细胞选择性调控。
而且，还可以考虑使用更小的双链RNA分子代替18-23bp的siRNA分子。
具有siRNA与一个或多个肽的共价键的此类分子的应用可能性还描述于WO002008098569A2。
有利的是使用应用试剂盒，其中提供了生物学有效分子，该生物学有效分子要被引入并经由可选择性接头与选择性肽偶联(见WO002008098569A2)。以安瓿形式的所述应用试剂盒应当含有所有要求的成分，实际上还含有如下的选择：合适的转染系统(如纳米颗粒或脂质)、其他添加剂(如抗体、配体和聚乙二醇)以及一种或多种探针或者具有套管的注射器用于将混合物从安瓿内容物中注射入含有靶细胞的介质。根据用于应用和施用所述分子的附加说明书，用户可以制备用于预期用途的合适应用混合物并进行应用。此外，能够用于制备所述生物学有效分子的应用试剂盒也是可行的。
合适的措施使提供此类应用试剂盒，其特异性地用于所选择的靶细胞和靶基因以及用于应用的个别范围(体外或体内)。
附图说明
如附图所示，提供使用氨基C6接头的实施方案更详细地解释本发明。
图1：通过经氨基C6接头将siRNA与肽偶联而失活的siRNA分子；氨基C6接头的化学结构
图2：细胞特异性激活的siRNA分子，其中肽键被断裂而氨基C6接头以及肽残基保留在siRNA分子上
图3：靶细胞和非靶细胞中胱天蛋白酶-4的酶活性
图4：通过肽抑制的siRNA而使GFP基因表达细胞特异性减少的图示
图1示出Cn＝C1、C2、C3、C4、C5或C6的氨基Cn接头的实例，氨基C6接头的化学结构本身已知。通过这种氨基C6接头1，siRNA 2与肽3偶联以用于其生物学失活(在细胞中siRNA效果的失活)。氨基C6接头1与siRNA 2通过所述siRNA的反义链的5’端而偶联。只要所述肽偶联至该siRNA分子，siRNA分子保持生物学失活。
如图2所示，如果肽键被失活siRNA分子所转染入的靶细胞中的细胞特异性酶所破坏(全部肽3的完全分离)，则剩余的siRNA分子会通过激活分子转染所意图的siRNA的已知细胞特异性效果而生物学激活(还参见WO002008098569A2)。
令人惊讶地，在所述肽键的锻炼后(见图2)，尽管氨基C6接头1以及可能的肽3的残基保留在siRNA分子的残基上，仍然发生这种激活，即所述siRNA 2的生物学效果未被保留在该分子上的氨基C6接头1和肽4的残基损害或显著损害。
图3示出切割酶胱天蛋白酶-4的细胞特异性活性。其中，胱天蛋白酶-4在靶细胞(Jeg-3绒毛膜癌细胞；黑条块)中是有活性的，但是在非靶细胞(人胚肾，HEK；亮条块)中是无活性的。因此，通过图1的接头结构与胱天蛋白酶-4的靶肽偶联而被抑制的siRNA在含有胱天蛋白酶-4的靶细胞中被分离并以这种方式激活。
图4表示当引入无功能的对照siRNA、用于减少GFP基因表达的siRNA以及可以由胱天蛋白酶-4激活的肽抑制siRNA时检测的荧光强度。荧光的减少与siRNA的生物学活性相关。可以观察到siRNA在靶细胞(Jeg-3绒毛膜癌细胞；黑条块)中被激活，因此GFP基因的表达减少，而在非靶细胞(人胚肾，HEK；亮条块)中，该基因的表达未减少。即使接头结构和肽残基(在这种情况下是与甘氨酸键合的氨基C6接头)仍保留在激活的siRNA上，该siRNA的效果仍然可以与正常siRNA的效果相当。
标示列表
1-氨基C6接头
2-siRNA
3-用于失活siRNA的肽
4-肽残基

Claims (12)

1.基于siRNA的细胞特异性有效分子，其用于生物学无活性地转染入靶细胞以在其通过结合至mRNA并形成RISC复合物而生物学激活之后抑制靶细胞中的基因表达，所述siRNA通过接头偶联至至少一个肽以用于其生物学失活，并且所述接头在所述分子的生物学激活后保留在所述siRNA上，其中所述siRNA(2)通过Cn＝C1、C2、C3、C4、C5或C6的氨基Cn接头(1)偶联至所述至少一个肽(3)。
2.如权利要求1所述的细胞特异性有效分子，其中氨基C6接头被提供为氨基Cn接头。
3.如权利要求1所述的细胞特异性有效分子，其中氨基C5接头被用作氨基Cn接头。
4.如权利要求1所述的细胞特异性有效分子，其中氨基C4接头被提供为氨基Cn接头。
5.如权利要求1所述的细胞特异性有效分子，其中氨基C3接头被用作氨基Cn接头。
6.如权利要求1所述的细胞特异性有效分子，其中将氨基C2接头提供为氨基Cn接头。
7.如权利要求1所述的细胞特异性有效分子，其中氨基C1接头被提供为氨基Cn接头。
8.如权利要求1所述的细胞特异性有效分子，其中转染系统共价或非共价地偶联至所述生物学有效分子，并且所述至少一个肽通过所述氨基Cn接头共价偶联以用于将所述分子转染入或转染至靶细胞，所述转染系统例如载体系统如纳米颗粒、配体/抗体/抗原标记物或分子，如纳米颗粒、聚合物或脂质，其用于将可选择性激活的生物学有效分子包被以进行它们的转染，或者基于脂质的方法或TAT蛋白侧翼。
9.用于应用或施用如权利要求1-8中一项或多项所述的细胞特异性有效分子的应用试剂盒，其由以下部分组成：
10.至少一个安瓿(安瓿A)，其含有siRNA，所述siRNA偶联至用于失活目的经选择的肽，并且氨基Cn接头偶联至所述siRNA；
-至少另一个安瓿(安瓿B)，其含有转染系统，如纳米颗粒或脂质；
-用于所述安瓿A和安瓿B的内容物的稀释和反应缓冲剂；
-一种或多种探针或者具有套管的注射器和其他所需材料，其用于将混合物从所述安瓿内容物注射入含有所述靶细胞的介质，以及
-用于应用和施用的说明书。
11.如权利要求13所述的应用试剂盒，其含有至少一种其他物质，例如用于所述生物学有效分子半选择性偶联至靶细胞的抗体和/或聚乙二醇链，用于锚定所述肽和所述生物学有效分子。
12.用于制备如权利要求1-8中一项或多项所述的细胞特异性有效分子的应用试剂盒，其至少由以下部分组成：
-一个安瓿(安瓿A)，其含有可以偶联至siRNA以用于其失活的一个或多个肽；
-一个安瓿(安瓿B)，具有用于将所述一个或多个肽偶联至所述siRNA的反应缓冲剂；
-一个安瓿(安瓿C)，其用于在所述肽偶联至所述siRNA后修饰所述肽；
-一个安瓿(安瓿D)，具有其他反应缓冲剂；
-系统，其用于在所述肽偶联至所述siRNA后纯化亚产物或终产物；
-一种或多种注射装置，如探针或者具有套管的注射器，用于将混合物从所述安瓿内容物注射，以及其他所需材料，如渗析膜或反应容器；以及
-用于应用的说明书。
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