KR20210124238A - Ｒｎａ 조절을 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

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브라이언 씨. 디킨슨
시몬 라우치
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더 유니버서티 오브 시카고
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Abstract

RNA 조절을 위한 시스템 및 방법. 본 개시 내용의 측면은 RNA 조절 시스템과 관련되며, 상기 시스템은 i) RNA 헤어핀 결합 도메인; ii) RNA 표적화 영역 및 적어도 하나의 헤어핀 구조를 포함하는 RNA 표적화 분자(상기 RNA 표적화 분자의 헤어핀 구조는 i)에 특이적으로 결합함); 및 iii) RNA 조절 도메인; 각각 중 적어도 하나를 포함한다.

Description

ＲＮＡ 조절을 위한 시스템 및 방법
본 발명은 일반적으로 화학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 RNA를 조절하기 위한 시스템의 용도에 관한 것이다.
프로그램 가능한 핵산-결합 단백질은 유전체 연구 및 편집 기술에 혁신을 일으켰고(Chandrasegaran and Carroll, 2016; Filipovska et al., 2011; Gootenberg et al., 2018; Hilton et al., 2015; Joung and Sander, 2012; Kearns et al., 2015; Strutt et al., 2018), 인간의 질병들을 치료하기 위한 새로운 치료 기회를 열어주고 있다(Liao et al., 2017; Monteys et al., 2017). 특히, 박테리아 면역 방어 메커니즘으로서 진화된 CRISPR/Cas9 시스템은 세포 DNA를 부위-특이적으로 연구하고 조작하는 능력을 완전히 바꾸어 놓았다(Cong et al., 2013; Jiang et al., 2013; O’Connell et al., 2014; Wiedenheft et al., 2012). 이전의 방법들(Desjarlais and Berg, 1993; Hockemeyer et al., 2011; Joung and Sander, 2012; Schierling et al., 2012)과 비교하여 CRISPR/Cas 시스템의 주요 이점은 이들이 실질적으로 임의의 관심 자리를 표적화하도록 용이하게 프로그램 가능하다는 것이다. CRISPR/Cas 시스템은 디스플레이된 가이드 RNA(gRNA)의 염기쌍 상호작용을 사용하여 표적 핵산 서열과 상호작용하는 리보핵산단백질 복합체이다. 염기쌍-가이드된 표적화의 단순한 성질은 가이드 가닥 상의 핵산 서열을 간단히 변화시킴으로써 규정된 핵산 서열과 상호작용하는 시스템을 프로그램할 가능성을 열어준다.
DNA를 직접적으로 표적화하는 것은 상당한 임상적 파급효과를 가질 것이지만, 많은 유전자에 대한 미묘한 변경을 수반하는 질병은 DNA 편집 기술을 사용하여 표적화하기 어려울 것이다(Fuxman Bass et al., 2015). 추가로, 영구적인 유전자 변경의 잠재적 부작용 또는 위험은 용인되지 않을 수 있다. 예를 들어, 향상된 상처 치유 반응을 활성화하기 위한 표적화를 원할 수 있는 유전자는 암 발생에 대한 위험이 있을 수 있는 표적일 가능성이 있으며, 이는 영구적인 DNA-기반 전략을 위험하게 만든다. RNA 수준에서 정보 흐름을 표적화하는 것은, 부작용이 나타나는 경우 치료를 중단시키는 능력, DNA 수준에서 변경되기에 너무 위험할 수 있는 유전자를 표적화하는 능력, 및 숙주 유전체에 대한 영구적인 변경 없이 유전자 발현을 조작하는 능력을 포함하는(그러나 이에 제한되지 않는), 치료적 개입을 위한 여러 기회를 제공한다. 유전체 수준에서 전사를 억제 또는 증강시키는 것은 유전자 발현을 제어하는 하나의 가능성을 제공하지만(Du et al., 2017; Fuxman Bass et al., 2015; Qi et al., 2013), 최근에 발견된 RNA 후성전사체 조절 메커니즘은 RNA 전사물의 편집, 분해, 수송 및 번역을 포함하는 표적에 대한 광범위한 RNA 조절 방법을 제공한다(Nishikura, 2010; Roundtree et al., 2017; Zhao et al., 2017). 이러한 후성전사체 조절층의 메커니즘 및 결과는 이제 밝혀지기 시작하고 있지만, RNA를 통한 정보 흐름이 엄격하게 조절되어, 기본적인 연구 발견 뿐만 아니라 치료 개발 둘 모두에 대한 많은 새로운 기회를 제공하는 것이 명백하다.
dCas9 DNA 표적화 시스템과 유사한 프로그램 가능한 RNA 표적화 도구는 후성전사체 조절 메커니즘을 연구하는 데 그리고 치료 용도를 위해 매우 유망하다. RNA 표적화를 위한 현재의 도구는 큰 복합체의 전달을 포함하고 면역원성 문제를 제기한다. 기본적인 과학 관점에서 볼 때, 전달 매개체(또는, '전달체')의 큰 크기는 조사 중인 RNA에 잠재적인 교란을 일으켜, RNA 조절 메커니즘 연구를 복잡하게 만들 수 있다. 번역 관점에서, 큰 크기는 바이러스 패키징 또는 직접 단백질 전달에 대한 문제를 나타낸다. 또한 DNA 편집 요법은 일회성, 비가역적 치료로 구성될 가능성이 높지만, RNA 표적화 요법은 지속적으로 투여되어야 하므로 전달 문제가 특히 중요하다. 더욱이 최근에 사람들의 85%가 이미 CRISPR/Cas 단백질에 대한 순환 항체를 가지고 있다는 것이 발견되었으며(Kim et al., 2018; Wagner et al., 2018), 이는 면역원성 문제가 임상 적용에서 문제가 될 수 있음을 시사한다. 따라서, RNA를 표적화할 수 있고 면역 반응을 활성화지 않고 효율적으로 전달될 수 있는 개선된 시스템이 당업계에 필요하다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 1월 4일 출원된 미국 가출원 제62/788,571호, 2019년 4월 9일 출원된 미국 가출원 제62/831,342호, 2019년 9월 20일 출원된 미국 가출원 제62/903,080호, 및 2019년 11월 1일 출원된 미국 가출원 제62/929,339호의 우선권을 주장하고, 이의 내용들은 그 전체가 참조로 포함된다.
정부 지원 진술
본 발명은 미국 국립보건원(The National Institutes of Health)에 의해 수여된 GM119840 및 HG008935 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
현재 RNA 표적화 시스템의 큰 크기와 미생물 유래 성질을 극복하기 위해, 본 발명자들은 프로그램 가능한 RNA 효과기 단백질(RNA effector protein)을 조작하기 위한 일반적인 방법인 CRISPR/Cas-영감 RNA 표적화 시스템(CIRTS)을 제시한다. CRISPR/Cas 기반 시스템과 유사하게, CIRTS는 왓슨-크릭-프랭클린(Watson-Crick-Franklin) 염기쌍 상호작용을 사용하여 전사체에서 단백질 카고(protein cargo) 부위를 선택적으로 전달하는 리보핵산단백질 복합체이다. 본 발명자들은 분해를 위한 뉴클레아제, 분해를 위한 탈아데닐화 조절 기구, 또는 강화된 단백질 생산을 위한 번역 활성화 기구를 포함하는 전사체에 일정 범위 또는 조절 단백질을 전달하는 CIRTS를 쉽게 조작할 수 있음을 보여준다. 그러나 CIRTS는 현재 가장 작은 CRISPR/Cas 시스템보다 최대 5배 작으며 전적으로 인간 부분으로부터 조작될 수 있다.
본 개시 내용의 측면은 RNA 조절 시스템 또는 방법과 관련되며, 상기 시스템 또는 방법은 i) RNA 헤어핀 결합 도메인; ii) RNA 표적화 영역 및 적어도 하나의 헤어핀 구조를 포함하는 RNA 표적화 분자 -상기 RNA 표적화 분자의 헤어핀 구조는 i)에 특이적으로 결합함-; 및 iii) RNA 조절 도메인; 각각 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 다음이 포함된다: i) 및 ii), i) 및 iii), ii) 및 iii), 또는 i), ii), 및 iii). 본원에 개시된 일 구현예는 이 조합들 중 어느 하나를 함유한다.
추가 측면은 하나 이상의 핵산 벡터를 포함하는 벡터 시스템에 관한 것으로, 상기 벡터 시스템은 i) RNA 헤어핀 결합 도메인; ii) RNA 표적화 영역 및 적어도 하나의 헤어핀 구조를 포함하는 RNA 표적화 분자 - 상기 RNA 표적화 분자의 상기 헤어핀 구조는 i)에 특이적으로 결합함 -, 및 iii) RNA 조절 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
추가 측면은 융합 단백질에 관한 것으로, 상기 융합 단백질은 RNA 헤어핀 결합 단백질 및 RNA 조절 도메인 및 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다.
추가 측면은 RNA 표적화 분자에 작동 가능하게 연결된 RNA 조절 도메인을 포함하는 접합체에 관한 것으로, 상기 RNA표적화 분자는 RNA 표적화 영역 및 적어도 하나의 헤어핀 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 RNA 조절 도메인 및 상기 RNA 표적화 분자는 펩타이드 결합을 통해 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 링커를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 RNA 조절 도메인 및 상기 RNA 표적화 분자는 비공유 상호작용을 통해 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 RNA 조절 도메인은 제1 이량체화 도메인에 공유 결합되고 상기 RNA 표적화 분자는 제2 이량체화 도메인에 공유 결합되며 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 이량체화하여 비공유 또는 공유 연결을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 접합체는 하나 이상의 핵 국소화 신호(NLS)를 포함한다.
추가 측면은 본 개시 내용의 시스템을 포함하는 전달 매개체에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 전달 매개체는 리포솜(들), 입자(들), 엑소좀(들), 미세소포(들), 유전자총 또는 하나 이상의 핵산 벡터(들)을 포함한다.
추가 측면은 본 개시 내용의 시스템, 전달 매개체, 또는 융합 단백질을 포함하는 조성물 또는 세포에 관한 것이다.
추가 측면은 상기 표적 RNA를 본 개시 내용의 시스템, 조성물, 또는 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는 적어도 하나의 RNA를 조절하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 RNA를 조절하는 것은 상기 RNA를 절단하는 단계, 탈메틸화하는 단계, 메틸화하는 단계, 번역 활성화하는 단계, 번역 억제하는 단계, 분해 촉진하는 단계, 또는 그에 결합하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 표적 RNA는 조절된다. 일부 구현예에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 표적 RNA는 조절된다. 일부 구현예에서, 다수의 RNA는 동일한 RNA 조절 도메인에 의해 또는 동일한 활성을 가진 조절 도메인에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 상이한 RNA들은 예컨대 상기 RNA를 절단, 탈메틸화, 메틸화, 번역 활성화, 번역 억제, 분해 촉진, 또는 그에 결합함으로써, 상이한 활성으로 조절된다.
일부 구현예에서, 상기 RNA 조절 도메인은 RNA에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 RNA 조절 도메인은 RNA 결합 활성을 갖지 않은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 RNA 조절 도메인은 변형된 RNA에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 RNA 조절 도메인은 m6A 변형된 RNA에 결합하지 않는다.
추가 측면은 조절된 표적 RNA를 포함하는 세포 또는 이의 자손에 관한 것으로, 상기 표적 RNA는 본 개시 내용의 방법에 따라서 조절되었다. 추가 측면은 본 개시 내용의 하나 이상의 세포를 포함하는 다세포 생물에 관한 것이다. 추가 측면은 본 개시 내용의 하나 이상의 세포를 포함하는 식물 또는 동물에 관한 것이다. 추가 측면은 본 개시 내용의 시스템, 벡터, 전달 매개체, 또는 융합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다.
추가 측면은 대상체에서 표적 RNA를 조절하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 개시 내용의 시스템 또는 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
용어 “RNA 헤어핀”은 줄기-루프 분자내 염기쌍을 가진 RNA 분자를 지칭한다. 헤어핀은 동일한 가닥의 두 영역(일반적으로 반대 방향으로 읽을 때 뉴클레오타이드 서열에서 상보적)이 염기쌍을 형성하여 쌍을 이루지 않은 루프로 끝나는 이중 나선을 형성할 때 발생할 수 있다. 본 개시 내용은 RNA 표적화 영역 및 하나 이상의 헤어핀을 포함하는 조작된 RNA 표적화 분자에 관한 것이다. 따라서, 본 개시 내용의 조작된 RNA 분자는 비천연으로 발생하는 키메라 분자이다.
용어 “RNA 표적화 영역”은 표적 RNA에 혼성화할 수 있는 RNA의 영역을 지칭한다. 표적 RNA는 질병 관련 RNA이거나 현재 시스템 및 방법에 따른 조절 표적인 RNA일 수 있다.
“RNA 조절 도메인”은 RNA에 대한 활성을 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 활성의 예로는 메틸화 활성, RNA-결합 활성, 뉴클레아제 활성, 및 번역 활성화 또는 억제 활성이 포함된다. RNA 조절 도메인을 포함하는 활성 및 단백질의 추가 예는 본 개시 내용 전반에 걸쳐 설명한다.
일부 구현예에서, 상기 RNA 헤어핀 결합 도메인 및 상기 RNA 조절 도메인은 작동 가능하게 연결된다. “작동가능하게 연결된(operably linked)”이라는 용어는 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 연결된 두 개의 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 상기 두 개의 단백질은 펩타이드 결합을 통해 공유 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 비공유 연결된다. 본 개시 내용의 하나 이상의 단백질은 서로에 대해 강한 친화성을 갖는 한 쌍의 부속 단백질에 대한 연결을 통해 다른 단백질에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 부속 단백질은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, SunTag는 펩타이드에 대한 강한 친화성을 갖는 항체를 포함하는 상기와 같은 하나의 시스템이다. 본 개시 내용의 하나의 단백질, 폴리펩타이드 또는 도메인이 SunTag 펩타이드에 연결되고 본 개시 내용의 다른 단백질, 폴리펩타이드 또는 도메인이 항체에 연결되어 SunTag 펩타이드 및 항체의 상호작용을 통해 두 단백질, 폴리펩타이드 또는 도메인이 작동가능하게 연결되도록 할 수 있다. 추가 예에는 비오틴과 아비딘/스트렙타비딘 및 스파이태그(spytag)와 스파이캐처(spycatcher)가 포함된다.
일부 구현예에서, 시스템은 자극제의 존재시 연결되는 2개의 연결되지 않은 폴리펩타이드로서 RNA 조절 도메인 및 헤어핀 결합 도메인을 제공함으로써 유도될 수 있다(inducible). 유도는, 예를 들어 광 유도 또는 화학적 유도에 의한 것일 수 있다. 이러한 유도성(inducibility)은 원하는 순간에 RNA 조절의 활성화를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 상기 RNA 조절 도메인은 제1 이량체화 도메인에 공유 결합되고 상기 RNA 헤어핀 결합 도메인은 제2 이량체화 도메인에 공유 결합되며 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 이량체화하여 비공유 또는 공유 연결을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 이량체화는 유도성이다. 일부 측면에서, 이량체화는 리간드에 이량체화 도메인의 결합을 통해 유도된다. 유도성(inducible)이라는 말은 예를 들어 리간드, 화학물질, 온도 변화, 또는 빛과 같은 자극에 반응하여 형성되는 이량체화를 지칭한다.
광 유도성(light inducibility)은 예를 들어 제1 및 제2 이량체화 도메인이 CRY2PHR 및 CIBN을 포함하는 융합 복합체를 설계함으로써 달성된다. 이 시스템은 살아있는 세포에서 단백질 상호작용의 광 유도에 특히 유용하며 본원에 참조로 포함된 문헌[Konermann S, et al. Nature. 2013;500:472-476]에 자세히 설명되어 있다.
적합한 이량체화 도메인 및 상응하는 리간드는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Liang, F.S., Ho, W.Q., 및 Crabtree, G.R. (2011)]을 참조한다. 본원에 참조로 포함된 문헌[Engineering the ABA plant stress pathway for regulation of induced proximity. Sci. Signal. 4, rs2]은 본 개시 내용의 구현예에서 유용한 적합한 이량체화/리간드 시스템을 설명한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 또는 제2 이량체화 도메인 중 하나는 PYR/PYR1-유사(PYL1)를 포함하고, 상기 제1 또는 제2 이량체화 도메인 중 다른 하나는 ABA 비민감성(insensitive) 1(ABI1)을 포함하고, 상기 리간드는 아브시스산(ABA) 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함한다. 이량체화 도메인은 전체 단백질의 단편 또는 부분일 수 있고 치환 또는 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 FKBP12를 포함하고 상기 리간드는 FK1012 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 또는 제2 이량체화 도메인 중 하나는 FK506 결합 단백질(FKBP)을 포함하고, 상기 제1 또는 제2 도메인 중 다른 하나는 포유동물 Rap mTOR의 표적의 FKBP-Rap 결합 도메인(Frb)을 포함하고, 상기 리간드는 라파마이신(Rap) 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함한다.
유도체(derivative)는 각각 그들의 이량체화 도메인 또는 리간드에 대한 결합을 유지하거나 강화된 결합을 갖는 변형된 리간드 및 도메인을 지칭한다. 단편(fragment)은 리간드에 대한 결합을 유지하는 이량체화 도메인의 인접 부분을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이량체화 도메인은 변형된 단편일 수 있다.
일부 구현예에서, i), ii), 및/또는 iii)은 인간의 것이거나 인간 유래인 것이다. 일부 구현예에서, 시스템, 접합체, 및/또는 융합 단백질은 비면역원성이다. 인간 단백질, 폴리펩타이드, 도메인 또는 핵산은 인간 유전체에서 유래하지만 비인간 시스템에서 재조합으로 생산될 수 있는, 단백질, 폴리펩타이드, 도메인 또는 핵산을 지칭한다. “인간 유래(human-derived)”라는 말은 인간 유전체에서 유래하지만 비인간 시스템에서 재조합으로 생산될 수 있는, 단백질, 폴리펩타이드, 도메인 또는 핵산의 변이체 또는 단편인 단백질, 폴리펩타이드, 도메인, 또는 핵산을 지칭한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질, 접합체, 시스템, 또는 i), ii), 및/또는 iii)과 같은 이의 부분은 인간에서 발현되거나 인간에게 투여될 때 비면역원성 및/또는 비독성이다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 핵산 또는 폴리펩타이드는 합성되고, 비천연이고/이거나 자연에서 자연적으로 발생하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 시스템은 안정화제 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 안정화제 폴리펩타이드는 핵산에 비특이적으로 결합하는 양이온성 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드는 인간 유래이다. 일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드는 RNA 조절 도메인 및/또는 RNA 헤어핀 결합 도메인에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드는 ORF5 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드는 서열번호: 5, 이의 변이체, 또는 서열번호: 5에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성 또는 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드는 HEBGF 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드는 서열번호: 19, 이의 변이체, 또는 서열번호: 19에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성 또는 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드는 β-디펜신 3 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드는 서열번호: 20, 이의 변이체, 또는 서열번호: 20에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성 또는 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드, 접합체, 융합 단백질, 접합체, RNA 조절 도메인 및/또는 RNA 헤어핀 결합 도메인은 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5kDa 미만이거나 초과이거나 또는 최대 또는 적어도 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5kDa(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)이다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인 및 헤어핀 결합 도메인을 포함하는 총 복합체는 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5kDa 미만이거나 초과이거나 또는 최대 또는 적어도 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5kDa(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)이다. 일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드, RNA 조절 도메인 및 헤어핀 결합 도메인을 포함하는 총 복합체는 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5kDa 미만이거나 초과이거나 또는 최대 또는 적어도 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5kDa(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)이다.
일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인은 U1A(TBP6.7), SLBP, 또는 이들의 변이체로부터 유래한 RNA 헤어핀 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인은 U1A(TBP6.7), SLBP, Ku70, 뉴클레오린, 또는 이들의 변이체로부터 유래한 RNA 헤어핀 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인은 서열번호: 7 또는 18, 이의 변이체, 또는 서열번호: 7 또는 18에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성 또는 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 TAR 헤어핀 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 서열번호: 1 또는 서열번호: 1에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드의 TAR 헤어핀 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 SLBP 헤어핀 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 서열번호: 2 또는 서열번호: 2에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드의 SLBP 헤어핀 지지체를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 정확히 하나의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 적어도 하나의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 정확히 두 개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 적어도 두 개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 정확히 세 개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 적어도 세 개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 정확히 네 개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 적어도 네 개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 정확히 다섯 개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 적어도 다섯 개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 정확히 1 내지 4개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 정확히 1 내지 3개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 정확히 1 내지 2개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 2 내지 4개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 2 내지 3개의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 적어도, 최대, 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 RNA 헤어핀 결합 단백질에 결합하지 않는 적어도 하나의 헤어핀 및 RNA 헤어핀 결합 단백질에 결합하는 적어도 하나의 헤어핀을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 하나 초과의 RNA 결합 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 2개, 3개 또는 4개의 헤어핀 구조를 포함하고 적어도 2개의 RNA 결합 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 시스템은 적어도 2개의 조절 도메인을 포함하고, 각각의 조절 도메인은 상이한 RNA 결합 분자에 결합한다.
일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트, 고정된 뉴클레오타이드, 에틸렌 가교된 뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산, 5’E-VP와 같은 변형을 포함하거나 모르폴리노로 변형된다. 일부 구현예에서, 상기 변형은 본원에 기재된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인은 U1A, 이의 변이체 또는 서열번호: 7에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성 또는 상동성을 갖는 폴리펩타이드의 RNA 헤어핀 결합 도메인을 포함하고, RNA 표적화 분자는 TAR 헤어핀 지지체 또는 서열번호: 1에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인은 SLBP, 이의 변이체 또는 서열번호: 18에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성 또는 상동성을 갖는 폴리펩타이드의 RNA 헤어핀 결합 도메인을 포함하고, RNA 표적화 분자는 SLBP 헤어핀 지지체 또는 서열번호: 2에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인은 ku70 또는 이의 변이체의 RNA 헤어핀 결합 도메인을 포함하고, RNA 표적화 분자는 헤어핀 지지체 또는 서열번호: 83에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인은 뉴클레오린 또는 이의 변이체의 RNA 헤어핀 결합 도메인을 포함하고, RNA 표적화 분자는 헤어핀 지지체 또는 서열번호: 84 내지 86 중 하나에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인, 안정화제 폴리펩타이드, 또는 RNA 헤어핀 결합 도메인은 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 서열번호: 6, 21, 22, 23, 또는 25를 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열번호: 6, 21, 22, 23, 또는 25에 대해 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성 또는 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 경직성 링커(rigid linker)이다. 일부 구현예에서, 링커는 가요성 링커(flexible linker)이다. 일부 구현예에서, 링커는 글리신 및 세린 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 4개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 또는 최대 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 아미노산(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)이다.
일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드는 cJun, HBEGF, HRX, NDEK, NHGF, 베타-디펜신 3, 또는 scGFP로부터 유래한 RNA-결합 폴리펩타이드와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 RNA 조절 도메인의 카르복시 말단에서 안정화제 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 RNA 조절 도메인의 아미노 말단에서 안정화제 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 RNA 조절 도메인의 카르복시 말단에서 RNA 헤어핀 결합 도메인 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 RNA 조절 도메인의 아미노 말단에서 RNA 헤어핀 결합 도메인 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인은 RNA 헤어핀 결합 도메인 폴리펩타이드의 카르복시 말단에서 안정화제 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인은 RNA 헤어핀 결합 도메인 폴리펩타이드의 아미노 말단에서 안정화제 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, RNA 표적화 영역은 적어도 12개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 영역은 적어도, 최대 또는 정확히 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 또는 79개의 아미노산(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 뉴클레아제, 메틸라아제, 데메틸라아제(demethylase), 번역 활성제, 번역 억제인자, 단일 가닥 RNA 절단 활성, 이중 가닥 RNA 절단 활성, 또는 RNA 결합 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 본원에 설명된 활성을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 Pin 뉴클레아제 도메인 또는 m6A 판독자 단백질(reader protein) 또는 이의 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 SMG6, YTHDF1, 또는 YTHDF2로부터 유래한 도메인 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 ADAR 단백질로부터 유래한 도메인 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 인간 ADAR 단백질로부터 유래한 도메인 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 서열번호: 9, 11, 15, 16, 17, 또는 123 내지 125에 대해 적어도, 최대, 또는 정확히 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성 또는 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 나선 영역을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 나선 영역은 서열번호: 24에 대해 적어도, 최대, 또는 정확히 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성 또는 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 표적 RNA의 번역을 증가시킨다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 표적 RNA의 분해를 증가시킨다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 표적 RNA의 국소화를 변형한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 표적 RNA의 처리를 변형한다.
일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 IFIT2, eIF4a, eIF4e, PABP, PAIP, SLBP, BOLL, ICP27, YTHDF1, YTHDF2, 또는 YTHDF3로부터 유래한 RNA 조절 활성을 가진 폴리펩타이드와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 YTHDF2, TOB2, ZFP36, CNOT7, RNaseA, RNaseL, RNaseP, RNase4, RNase1, RNaseU2, 또는 HRSP12로부터 유래한 RNA 조절 활성을 가진 폴리펩타이드와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 표적 RNA에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 발현을 증가시키고 여기서 RNA 조절 도메인은 IFIT2, eIF4a, eIF4e, PABP, PAIP, SLBP, BOLL, ICP27, YTHDF1, 또는 YTHDF3을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 YTHDF2, TOB2, ZFP36, CNOT7, RNaseA, RNaseL, RNaseP, RNase4, RNase1, RNaseU2, 또는 HRSP12로부터 유래한 RNA 조절 활성을 가진 폴리펩타이드와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 표적 RNA에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 발현을 감소시키고 여기서 RNA 조절 도메인은 YTHDF2, TOB2, ZFP36, CNOT7, RNaseA, RNaseL, RNaseP, RNase4, RNase1, RNaseU2, 또는 HRSP12를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 핵 배출 신호(NES)가 RNA 조절 도메인, RNA 헤어핀 결합 도메인 및/또는 안정화제 폴리펩타이드에 융합된다. 일부 구현예에서, NES는 RNA 조절 도메인, RNA 헤어핀 결합 도메인 및/또는 안정화제 폴리펩타이드의 카르복시 말단에 있다. 일부 구현예에서, NES는 RNA 조절 도메인, RNA 헤어핀 결합 도메인 및/또는 안정화제 폴리펩타이드의 아미노 말단에 있다. 일부 구현예에서, NES는 서열번호: 8에 대해 적어도, 최대, 또는 정확히 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성 또는 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 핵 국소화 신호(NLS)가 RNA 조절 도메인, RNA 헤어핀 결합 도메인 및/또는 안정화제 폴리펩타이드에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 RNA 조절 도메인, RNA 헤어핀 결합 도메인 및/또는 안정화제 폴리펩타이드의 카르복시 말단에 있다. 일부 구현예에서, NLS는 RNA 조절 도메인, RNA 헤어핀 결합 도메인 및/또는 안정화제 폴리펩타이드의 아미노 말단에 있다. 일부 구현예에서, NES는 서열번호: 13에 대해 적어도, 최대, 또는 정확히 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 동일성 또는 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, ii)의 RNA 표적화 영역은 원핵 또는 진핵 세포에서 표적 RNA에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 인간 세포 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 시험관 내 또는 생체 내에 있다.
일부 구현예에서, 본 시스템은 각 i), ii), 및 iii) 중 적어도 두 개를 포함한다. 일부 구현예에서, i), ii), 및 iii)의 적어도 두 개는 동일한 세포 내에서 발현된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 적어도 두 개의 표적 RNA를 조절하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 시스템은 적어도, 최대, 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50개 또는 그 이상(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 i), ii), 및 iii)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도, 최대, 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50개 또는 그 이상(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 표적 RNA가 세포 내에서 조절된다.
일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 RNA를 절단하거나, RNA 번역을 촉진하거나, RNA 번역을 억제하거나, 또는 RNA의 염기 서열을 변형한다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 벡터는 i), ii), 및/또는 iii)을 암호화하는 뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 더 포함한다. 이전에 설명된 NLS 및 NES에 더하여 조절 요소는 또한 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 인핸서 등을 포함한다. 다른 조절 요소는 당업계에 공지되어 있고 본원에 기술되어 있으며 본 개시 내용의 구현예에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산 벡터는 진핵 세포 내 발현을 위해 최적화된다. 일부 구현예에서, 세포 내 또는 벡터로부터 유래한 도메인, RNA, 또는 폴리펩타이드의 발현은 구성적(constitutive)이다. 일부 구현예에서, 세포 내 또는 벡터로부터 유래한 도메인, RNA, 또는 폴리펩타이드의 발현은 조건적(conditional)이다. 일부 구현예에서, i), ii), 및 iii)은 단일 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, i), ii), iii), 및 안정화제 폴리펩타이드는 단일 벡터 상에서 암호화된다. 일부 구현예에서, i), iii), 및 안정화제 폴리펩타이드는 단일 벡터 상에서 암호화된다. 일부 구현예에서, 벡터들 중 하나 이상은 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 벡터는 하나 이상의 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터 또는 단순헤르페스바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터들 중 하나 이상은 비바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 본 시스템 또는 조성물은 비바이러스성이며, 이는 바이러스 성분을 함유하고 있지 않다는 의미이다.
일부 구현예에서, 다음 성분들: RNA 조절 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, RNA 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 안정화제를 포함하는 폴리펩타이드, RNA 조절 도메인을 인코딩하는 핵산, RNA 결합 도메인을 인코딩하는 핵산, 안정화제를 인코딩하는 핵산, RNA 표적화 영역 및 적어도 하나의 헤어핀 구조를 포함하는 RNA 표적화 분자를 암호화하는 핵산; 본 개시 내용의 접합체; 본 개시 내용의 벡터, 본 개시 내용의 융합 단백질, 재조합 숙주 세포, 발현 작제물, 조작된 바이러스 벡터, 또는 조작된 감쇠 바이러스 중 하나 이상을 포함하는 시스템 또는 키트가 있다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 폴리펩타이드는 이종 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 구현예에서 사용되는 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드 기능이 그 단백질 또는 폴리펩타이드 기능을 암호화하는 코딩하는 핵산에 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다. 또한, 임의의 및 모든 폴리펩타이드, 단백질, 핵산 분자가 세포 또는 바이러스(예: 파지)와 같은 다른 생명체 내에 함유될 수 있다.
키트는 멸균된 비반응성 용기와 같은 적절한 용기 수단 내에 분리되어 있거나 함께 있는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 작제물을 함유하는 세포 또는 바이러스가 제공된다. “프로모터”라는 용어는 분자 생물학 분야의 사람들에게 일반적인 의미로 사용되며; 이는 일반적으로 중합효소가 전사를 개시하기 위해 결합할 수 있는 핵산 상의 부위를 지칭한다. 구체적인 구현예에서, 프로모터는 T7 RNA 중합효소에 의해 인식된다.
본 개시 내용의 조성물, 벡터, 시스템, 방법, 및 단백질은 다양한 임상 및 연구-관련 응용에 유용하다. 본 개시 내용의 구현예는 암 또는 자가면역과 같은 질병 또는 병태의 치료에 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법 및 조성물은 질병 또는 병태의 급성 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 방법 및 조성물은 RNA의 일시적인 조절에 유용하다. 일부 구현예에서는 유전자 활성의 영구적 변형은 배제한다. 일부 구현예에서, 본 방법 및 조성물은 RNA의 급성 조절 및/또는 생체 내 시스템의 발현을 제어하는 능력으로 인해 더 안전하다.
본 명세서에 사용될 때, 단수 형태(“a” 또는 “an”)는 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구범위(들)에서 본 명세서에 사용된 바와 같이, “포함하는”이라는 단어와 함께 사용될 때, 단수 형태(“a” 또는 “an”) 표현은 하나 또는 하나보다 많은 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 “또는” 및 “및/또는”은 서로 조합되거나 배제하는 다수의 구성요소(성분)를 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, “x, y 및/또는 z”는 “x” 단독, “y” 단독, “z” 단독, “x, y 및 z”, “(x 및 y) 또는 z”, “x 또는 (y 및 z)”, 또는 “x 또는 y 또는 z”를 지칭할 수 있다. x, y 또는 z는 구현예에서 구체적으로 제외될 수 있음이 구체적으로 고려된다.
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 “약”은 세포 생물학 분야에서 그 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함하는 값을 나타내기 위해 평범하고 일반적인 의미에 따라 사용된다.
“포함하는(including)”, “함유하는(containing)” 또는 “에 의해 특성화되는(characterized by)”과 동의어인 “포함하는(comprising)”이라는 용어는 포괄적이거나 개방형이며 추가의 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. “구성되는 또는 이루어진(consisting of)”이라는 문구는 지정되지 않은 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. “필수적으로 포함하여 구성되는(consisting essentially of)”이라는 문구는 기술된 주제의 범위를 지정된 물질 또는 단계 및 기본적이고 새로운 특성에 물질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. “포함하는(comprising)”이라는 용어의 맥락에서 설명된 구현예는 또한 “구성되는 또는 이루어진(consisting of)” 또는 “필수적으로 포함하여 구성되는(consisting essentially of)”이라는 용어의 맥락에서 구현될 수 있는 것으로 고려된다.
본 발명의 일 구현예와 관련하여 논의된 임의의 제한이 본 발명의 임의의 다른 구현예에 적용될 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다. 또한, 본 발명의 임의의 조성물은 본 발명의 임의의 방법에 사용될 수 있고, 본 발명의 임의의 방법은 본 발명의 임의의 조성물을 생산하거나 사용하기 위해 사용될 수 있다. 실시예들에 제시된 구현예의 측면들은 또한 다른 실시예의 다른 곳 또는 “발명의 내용”, “발명을 실시하기 위한 구체적인 내용”, “청구범위”, 및 “도면의 간단한 설명”과 같은 출원의 다른 곳에서 논의 되는 구현예의 맥락에서 구현될 수 있는 구현예이다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내의 다양한 변경 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이므로, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내면서 단지 예시로서 제공되는 것임을 이해해야 한다.
다음 도면들은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 측면들을 추가로 예시하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 구체적인 구현예들의 상세한 설명과 함께 도면의 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a-d. CRISPR/Cas-영감 RNA 표적화 시스템(CIRTS)의 설계. (A) 설계 전략의 개략도. CIRTS는 ssRNA 결합 단백질, RNA 헤어핀 결합 단백질, 효과기 단백질 및 가이드 RNA로 구성된다. (B) 본 연구에 사용된 모듈형 CIRTS 작제물의 목록. (C) TBP6.7에 대한 가이드 RNA의 설계. HIV TAR 헤어핀을 뉴클레오타이드 링커(L) 및 가이드 서열에 융합시켰다. (D) SLBP의 RRM에 대한 가이드 RNA의 설계. 인간 히스톤 mRNA 헤어핀을 가요성 5-뉴클레오타이드 링커 및 가이드 서열에 융합시켰다.
도 2a-c. CIRTS-1 시험관 내 결합 및 RNA 절단 분석. (A) 표지된 RNA 기질(R1)에 대한 MBP-CIRTS-1:표적내 gRNA(R3) 복합체의 결합 친화도를 평가하는 전기영동 이동성 분석(EMSA). EDTA를 반응 완충제에 보충하여 임의의 절단을 피하였다. (B) 2차 결합 방정식에 기질에 결합된 TBP6.7:gRNA의 분획을 피팅하여 결합 친화도의 계산. (C) 2시간의 인큐베이션 후에 변성 겔 상에서 수행된 절단 분석. 표지된 RNA 기질(R2)은 gRNA-의존적 방식으로 절단된다.
도 3a-g. CIRTS 포유류 세포 리포터 분석. (A) 이중 루시퍼라아제 분석의 일반적인 개요. 반딧불이 루시퍼라아제 및 레닐라 루시퍼라아제 둘 다를 함유하는 리포터 작제물을 모든 분석에 사용하였다. 본 발명자들은 형질주입 대조군으로서 사용하기 위해 레닐라 루시퍼라아제를 일정하게 유지하면서, 반딧불이 루시퍼라아제 전사물에 CIRTS를 표적화하였다. 모든 후속 분석을 위해, HEK293T 세포를 리포터 벡터, CIRTS 벡터, 및 gRNA 벡터로 형질주입시켰다. (B) 촉매 불활성 CIRTS-0을 대조군으로 사용하였다. 48시간의 인큐베이션 후, 본 발명자들은 단백질 판독치의 감소가 없음을 관찰하였다. (C) CIRTS-1과 Cas13b 뉴클레아제의 비교. CIRTS-1 또는 Cas13으로 형질주입된 세포 및 상응하는 gRNA 표적화는 인큐베이션 후 감소된 단백질 수준을 나타낸다. (D) CIRTS-2로 형질주입된 HEK293T 세포는 48시간 후 단백질 수준의 증가를 나타내지만, (E) CIRTS-3으로 형질주입된 세포는 단백질 수준의 예상된 감소를 나타낸다. (F) 헤어핀-결합 단백질을 SLBP로 전환시키는 것은 48시간 후에도 여전히 단백질 수준 감소를 초래한다. (G) 반딧불이 루시퍼라아제에 대한 완전 인간화 CIRTS(CIRTS-5 및 CIRTS-6) 시스템 및 표적내 gRNA로 형질주입된 세포는 다시 감소된 단백질 수준을 초래한다.
도 4a-c. CIRTS를 이용한 내인성 전사물의 표적화. (A) qPCR을 사용하여 분석된 바와 같이 CIRTS-1로 세포의 형질주입 시 5개의 내인성 전사물의 뉴클레아제-매개 녹다운. CIRTS-1은 gRNA를 상응하는 표적내 가이드 서열로 동시-형질주입시킴으로써 관심 내인성 전사물을 표적화하는데 사용될 수 있다. (B) CIRTS-3을 사용한 내인성 전사물의 비뉴클레아제 매개 녹다운의 qPCR 분석. CIRTS-3으로 형질주입된 세포는 시험된 5개의 전사물 모두에 대해 RNA 수준에서 gRNA-의존적 감소를 나타낸다. (C) 웨스턴 블롯을 이용한 CIRTS-2 또는 CIRTS-3에 의한 형질주입 후 단백질 수준의 분석. CIRTS-2는 단백질 수준의 증가를 유도할 수 있는 반면, CIRTS-3은 대조군으로서 단백질 수준의 예상된 감소를 나타낸다.
도 5a-b. CIRTS를 이용한 다차원 표적화. (A) 다중화 표적화에 사용되는 벡터의 개략도. CIRTS-6은 PPIB를 표적화하는 이의 gRNA 작제물로 동시-형질주입된 반면, CIRTS-7은 SMARCA4를 표적화하는 상응하는 gRNA 작제물로 동시-형질주입되었다. (B) 다중화 표적화의 녹다운을 보여주는 히트 맵. CIRTS-6 및 CIRTS-7 둘 모두 세포 내에 존재하는 경우, 표적내 또는 표적외 대조군 gRNA의 동시-형질주입은 CIRTS가 내인성 전사물을 감소시키도록 유도할 수 있다. 두 CIRTS가 PPIB 또는 SMARCA4에 대한 표적내 gRNA가 존재하는 경우, 두 전사물은 동일한 샘플에서 녹다운될 수 있다.
도 6. CIRTS를 다른 DNA 및 RNA-표적화 CRISPR/Cas 시스템과 비교하는 것. 현재 사용되는 Cas9, Cas13, 및 융합 단백질 시스템의 개략적 크기 비교. Cas9 및 Cas13-기반 전달 시스템은 조작된 CIRTS 시스템보다 실질적으로 더 크다.
도 7a-c. 대조군 EMSA 및 절단 분석. (A) 임의의 gRNA의 부재 하에 MBP-CIRTS-1에 의존적인 결합 이동을 평가하는 EMSA. (B) 단지 표지만된 기질(R1) 및 표적내 gRNA(R3)의 존재 하에 결합 이동을 분석하는 EMSA. (C) 도 2c의 본문에 나타낸 완전한 절단 겔.
도 8a-d. CIRTS 링커 및 gRNA 최적화. (A) 헤어핀-결합 단백질과 효과기 단백질 사이의 상이한 링커를 사용하는 CIRTS 뉴클레아제 시스템을 이용한 루시퍼라아제 분석. (B) 헤어핀-결합 단백질과 효과기 단백질 사이의 상이한 링커를 사용하는 CIRTS-YTHDF2-매개 붕괴를 이용한 루시퍼라아제 분석. (C) 도 1c에 도시된 설계에 기초한 TBP6.7에 대한 상이한 조작된 gRNA. 20개 및 40개 뉴클레오타이드의 2개의 상이한 표적화 길이가 헤어핀과 가이드 서열 사이의 상이한 수의 연결 뉴클레오타이드(L)와 조합되어 사용되었다. 뉴클레아제-매개된 붕괴를 평가하기 위해 이중 루시퍼라아제 분석을 사용하였다. (D) 도 8c에서와 동일한 조작된 gRNA를 CIRTS-3과 함께 사용하여 후성전사체-유도된 RNA 붕괴를 유도하였다. n = 3개 생물학적 복제물
도 9a-h. 대조군 루시퍼라아제 분석 및 RT-qPCR. (A) ‘데드(dead)’ Pin 뉴클레아제 도메인 CIRTS(CIRTS-0)를 이용한 RNA 수준의 RT-qPCR 분석. (B) (CIRTS-8) 없는 TBP6.7-Pin 뉴클레아제 도메인의 뉴클레아제-매개된 붕괴를 (CIRTS-9) 있는 추가의 ssRNA 결합 단백질 ORF5와 비교하는 루시퍼라아제 분석. (C) CIRTS 뉴클레아제는 RNA의 감소를 매개할 수 있고, 이에 따라 핵 및 세포질 둘 다에서 단백질 수준 감소를 매개할 수 있다(n=6). (D) 세포를 CIRTS-1 및 활성 Cas13b 뉴클레아제로 형질주입시켰을 때의 RNA 수준의 비교. CIRTS-1-Pin 매개 RNA 절단은 Cas13b 시스템에 비해 실질적으로 더 적은 RNA 분해를 나타냈다. (E-H) 발명자들이 이중 루시퍼라아제 분석에서 시험한, 모든 조작된 CIRTS 시스템은 또한 RNA 수준의 변화를 평가하기 위해 RT-qPCR 분석을 거쳤다. 번역 활성화를 유도하는 YTHDF1 효과기 도메인을 함유하는 CIRTS-2는 RNA 수준에서 유의미한 변화를 나타내지 않은 반면, 모든 YTHDF2-함유 CIRTS는 RNA 수준의 예상된 감소를 나타낸다(S3F 및 S3H: n = 2 또는 3). 달리 나타내지 않는 한, n = 3개 생물학적 복제물. 스튜던트 t-검정: *P < 0.05, **P <0.01, ***P <0.001.
도 10a-c. 면역침강, 대조군 qPCR 웨스턴 블롯, Y2 절단. (A) 세포를 CIRTS-0-3xFLAG 및 PPIB, B4GALTN1 또는 NT에 대한 gRNA로 형질주입시켰다. 가교 및 FLAG IP 후, 풀다운된(pulled down) RNA를 RT-qPCR을 사용하여 정량화하였다. 어느 한 전사물에 대한 표적내 gRNA를 함유하는 반응은 이들 전사물에 대해 3.5 내지 5배 농축을 나타내었고, 이는 가이드된 RNA 표적화를 나타낸다(n = 2 또는 3). (B) 세포가 CIRTS-2로 형질주입되었을 때 RNA 수준의 RT-qPCR 분석. 예상한 바와 같이, YTHDF1-함유 단백질을 사용한 경우 RNA 수준의 유의한 변화가 관찰되지 않았다. (C) YTHDF2의 상이한 절단들을 분석하여 어느 것이 더 효율적인지를 결정하였다. 본 발명자들은 루시퍼라아제 데이터(좌측)를 qPCR 데이터(우측)와 비교하였고, 루시퍼라아제 분석을 위해 Y2(100-200) 작제물을 사용하고 내인성 표적화를 위해 Y2(1-200) 작제물을 사용하여 도구의 최상의 가능한 정량화를 가능하게 하는 것으로 결론지었다. 달리 나타내지 않는 한, n = 3개 생물학적 복제물. 스튜던트 t-검정: *P < 0.05, **P <0.01.
도 11a-c. CIRTS를 이용한 내인성 표적화. (A) PPIB에 대한 CIRTS5-7만의 형질주입 후에 평가한 RNA 수준의 변화. (B) 도 11a와 유사하게, 세포를 CIRTS5-7로 형질주입한 경우에 SMARCA4 수준을 분석하였다. (C) gRNA는 CIRTS-3을 사용하여 SMARCA4를 따라 스크리닝하여 gRNA-의존성 RNA 붕괴를 유도한다. 본 발명자들은 전사물이 표적화되는 곳(n = 2 또는 3)에 따라 유도 붕괴량의 유의한 변화를 관찰하였다. 달리 나타내지 않는 한, n = 3개 생물학적 복제물. 스튜던트 t-검정: *P < 0.05, **P <0.01, ***P <0.001.
도 12a-d. CRISPR/Cas-영감 RNA 표적화 시스템(CIRTS)의 설계. (A) 설계 전략의 개략도. CIRTS는 ssRNA 결합 단백질, RNA 헤어핀 결합 단백질, 효과기 단백질 및 가이드 RNA로 구성된다. (B) 본 연구에 사용된 핵심 CIRTS의 목록. (C) TBP6.7에 대한 가이드 RNA의 설계. HIV TAR 헤어핀을 뉴클레오타이드 링커(L) 및 가이드 서열에 융합시켰다. 뉴클레오타이드 링커는 최적화 동안 (지원 정보에 기재된 바와 같이) 변경되었지만, 이후 모든 작업을 위해 L = UUAUU를 사용하였다. (D) SLBP의 RNA 인식 모티프(RRM)에 대한 가이드 RNA의 설계. 인간 히스톤 mRNA 헤어핀을 가요성 5-뉴클레오타이드 링커 및 가이드 서열에 융합시켰다.
도 13a-b. CIRTS-1 시험관 내 결합 및 RNA 절단 분석. (A) 표지된 RNA 기질에 대한 표적내 gRNA 및 비-표적화 RNA 복합체와 MBP-CIRTS-1의 결합 친화도를 평가하는 필터 결합 분석. 2차 결합 방정식에 데이터를 맞추면 표적내:단백질 복합체에 대해 22 ± 7nM의 겉보기 KD 및 표적외:단백질 상호작용에 대해 약 500nM의 겉보기 KD를 나타냈다. (B) 0.5mM MnCl2의 존재 하에 10% 변성 우레아 PAGE 겔 상에서 절단 분석을 수행하였다. IR800-표지된 RNA 기질은 gRNA-의존적 방식으로 절단된다.
도 14a-g. CIRTS 포유류 세포 리포터 분석. (A) 이중 루시퍼라아제 분석의 일반적인 개요. 반딧불이 루시퍼라아제 및 레닐라 루시퍼라아제 둘 다를 함유하는 리포터 작제물을 모든 분석에 사용하였다. 본 발명자들은 레닐라 루시퍼라아제를 내부 대조군으로 사용하면서, 반딧불이 루시퍼라아제 전사물에 CIRTS를 표적화하였다. 모든 후속 분석을 위해, HEK293T 세포를 리포터 벡터, CIRTS 벡터, 및 gRNA 벡터로 형질주입시켰다. (B) 촉매 불활성 CIRTS-0을 대조군으로 사용하였다. 48시간의 인큐베이션 후, 본 발명자들은 단백질 판독치의 감소가 없음을 관찰하였다. 값은 n = 3개 생물학적 복제물인 상태에서 평균 ± SEM으로 나타냈다. (C) CIRTS-1과 Cas13b 뉴클레아제의 비교. CIRTS-1 또는 Cas13으로 형질주입된 세포 및 상응하는 gRNA 표적화 Fluc는 인큐베이션 후 감소된 단백질 수준을 나타낸다. 값은 n = 3개 생물학적 복제물인 상태에서 평균 ± SEM으로 나타냈다. 스튜던트 t-검정: *P < 0.05, **P < 0.01. (D) CIRTS-2로 형질주입된 HEK293T 세포는 48시간 후에 단백질 수준의 증가를 나타낸다. 값은 n = 3개 생물학적 복제물인 상태에서 평균 ± SEM으로 나타냈다. 스튜던트 t-검정: **P < 0.01. (E) CIRTS-3으로 형질주입된 HEK293T 세포는 단백질 수준의 예상된 감소를 나타낸다. 값은 n = 3개 생물학적 복제물인 상태에서 평균 ± SEM으로 나타냈다. 스튜던트 t-검정: *P < 0.05. (F) 헤어핀-결합 단백질을 SLBP로 전환하면 48시간 후에도 여전히 단백질 수준의 감소를 초래한다. 값은 n = 3개 생물학적 복제물인 상태에서 평균 ± SEM으로 나타냈다. 스튜던트 t-검정: *P < 0.05. (G) 반딧불이 루시퍼라아제에 대한 완전 인간화 CIRTS(CIRTS-5 및 CIRTS-6) 시스템 및 표적내 gRNA로 형질주입된 세포는 다시 감소된 단백질 수준을 초래한다. 값은 n = 3개 생물학적 복제물인 상태에서 평균 ± SEM으로 나타냈다. 스튜던트 t-검정: *P < 0.05.
도 15a-b. RNA 편집을 위한 CIRTS. (A) 사용된 RNA 편집 리포터 분석의 개략도. 단일 G-to-A 돌연변이를 반딧불이 루시퍼라아제의 코딩 서열에 도입하여 W417X(X = STOP) 코돈 스위치를 낳았고 측정가능한 반딧불이 루시퍼라아제 신호를 나타내지 않았다(도 22j). (B) 표적내 gRNA를 이용한 CIRTS-7(hADAR2 wt) 및 CIRTS-8(hADAR E488Q)의 전달은 측정가능한 반딧불이 루시퍼라아제 신호를 초래하는 유의한 RNA 편집을 나타낸다. 과활성 hADAR2 돌연변이체인 CIRTS-8의 백그라운드 및 편집 효율 둘 다는 야생형에 비해 더 높은 것으로 밝혀졌다. 값은 n = 3개 생물학적 복제물인 상태에서 평균 ± SEM으로 나타냈다. 스튜던트 t-검정: ***P < 0.001.
도 16a-c. CIRTS를 이용한 내인성 전사물의 표적화. (A) qPCR을 사용하여 분석된 바와 같이 CIRTS-1로 세포의 형질주입 시 5개의 내인성 전사물의 뉴클레아제-매개 녹다운. CIRTS-1은 gRNA를 상응하는 표적내 가이드 서열로 동시-형질주입시킴으로써 관심 내인성 전사물을 표적화하는데 사용될 수 있다. 값은 n = 3개 생물학적 복제물인 상태에서 평균 ± SEM으로 나타냈다. 스튜던트 t-검정: *P < 0.05, **P <0.01, ***P <0.001. (B) CIRTS-3을 사용한 내인성 전사물의 YTHDF2 매개 녹다운의 qPCR 분석. CIRTS-3으로 형질주입된 세포는 시험된 5개의 전사물 모두에 대해 RNA 수준에서 gRNA-의존적 감소를 나타낸다. 값은 n = 3개 생물학적 복제물인 상태에서 평균 ± SEM으로 나타냈다. 스튜던트 t-검정: *P < 0.05. (C) 웨스턴 블롯에 의한 CIRTS-2 또는 CIRTS-3을 이용한 형질주입 후 단백질 수준의 분석. CIRTS-2는 단백질 수준의 증가를 유도하는 반면, CIRTS-3은 모두 gRNA-의존적 방식으로 단백질 수준의 예상된 감소를 나타낸다.
도 17. 표적화 접근성은 CIRTS의 녹다운 효율을 결정한다. gRNA는 CIRTS-3을 사용하여 SMARCA4를 따라 스크리닝하여 gRNA-의존성 RNA 붕괴를 유도한다. 본 발명자들은 전사물이 표적화되는 곳에 따라 유도 붕괴량의 유의한 변화를 관찰하였다(n = 2 또는 3).
도 18a-d. CIRTS를 이용한 다차원 표적화. CIRTS-6 및 3개의 gRNA의 전달의 개략도. (B) CIRTS-6은 PPIB, SMARCA4, 및 NRAS에 대한 3개의 별개의 gRNA와 함께 전달될 수 있고 동시에 세 모든 전사물의 녹다운을 야기할 수 있다. n = 5개 생물학적 복제물. 스튜던트 t-검정: **P <0.05, ***P <0.001. (C) 상이한 효과기 단백질들과의 동시 CIRTS 전달의 개략도. (D) 세포를 Fluc 및 PPIB에 대해 각각 CIRTS-9(YTHDF1) 및 CIRTS-10(YTHDF2)과 gRNA들로 형질주입시켰을 때 루시퍼라아제 단백질 수준 및 PPIB 전사물 수준의 변화. 직교 CIRTS 둘 모두는 그들의 개별 기능을 유지하고 세포에서 동시에 작용한다. n = 5개 생물학적 복제물. 스튜던트 t-검정: *P < 0.1, **P <0.05.
도 19a-c. CIRTS의 AAV 전달. (A) CIRTS-6(YTHDF2) 뿐만 아니라 시스템의 gRNA 성분 둘 다를 함유하는 AAV 전달을 위한 전달 플라스미드. 2개의 역 말단 반복(ITR) 사이의 전체 삽입 크기는 2.7kb였다. (B) AAV-패키징된 CIRTS-6 및 루시퍼라아제를 표적화하는 gRNA를 HEK293T 세포로 전달하여 이중 루시퍼라아제 리포터 분석에서 반딧불이 루시퍼라아제를 녹다운시켰다. (C) AAV-패키징된 CIRTS-6 및 SMARCA4를 표적화하는 gRNA를 HEK293T 세포로 전달하여 내인성 유전자를 녹다운시켰고, 이는 일시적 형질주입에 의해 달성된 것에 필적하는 효율을 나타냈다. 값은 n = 3개 생물학적 복제물인 상태에서 평균 ± SEM으로 나타냈다. 스튜던트 t-검정: *P < 0.05.
도 20. CIRTS를 다른 DNA 및 RNA-표적화 CRISPR/Cas 시스템과 비교하는 것. 일반적으로 사용되는 Cas9, Cas12, Cas13, 및 융합 단백질 시스템의 개략적 크기 비교.
도 21. 도 12b로부터 계속된 CIRTS 목록. 본 연구에 사용된 모든 나머지 CIRTS의 참조 목록.
도 22a-j. 대조군 루시퍼라아제 분석 및 RT-qPCR. (A) (CIRTS-11) 없는 TBP6.7-Pin 뉴클레아제 도메인의 뉴클레아제-매개된 붕괴를 (CIRTS-12) 있는 추가의 ssRNA 결합 단백질 ORF5와 비교하는 루시퍼라아제 분석. (B) CIRTS 뉴클레아제는 RNA의 감소를 매개할 수 있고, 이에 따라 핵 및 세포질 둘 다에서 단백질 수준 감소를 매개할 수 있다(n=6). (C) ‘데드(dead)’ Pin 뉴클레아제 도메인 CIRTS(CIRTS-0)를 이용한 RNA 수준의 RT-qPCR 분석. (D) 세포를 CIRTS-1 및 활성 Cas13b 뉴클레아제로 형질주입시켰을 때의 RNA 수준의 비교. CIRTS-1-Pin 매개 RNA 절단은 Cas13b 시스템에 비해 실질적으로 더 적은 RNA 분해를 나타냈다. (E-H) 이중 루시퍼라아제 분석에서 시험한, 모든 조작된 CIRTS 시스템은 또한 RNA 수준의 변화를 평가하기 위해 RT-qPCR 분석을 거쳤다. 번역 활성화를 유도하는 YTHDF1 효과기 도메인을 함유하는 CIRTS-2는 RNA 수준에서 유의미한 변화를 나타내지 않은 반면, 모든 YTHDF2-함유 CIRTS는 RNA 수준의 예상된 감소를 나타낸다. (I) 헤어핀 결합 단백질로서 PP7 이량체를 함유하는 조작된 CIRTS-18. qPCR에 의해 측정된 바와 같이 CIRTS-18로 형질주입 후 PPIB의 녹다운. (J) 리포터 단독 및 리포터와 비-표적화 또는 표적화 gRNA를 갖는 CIRTS-7(hADAR wt)의 비교(S3F 및 S3H: n = 2 또는 3). 달리 나타내지 않는 한, n = 3개 생물학적 복제물. 스튜던트 t-검정: *P < 0.05, **P <0.01, ***P <0.001.
도 23a-d. CIRTS 링커 및 gRNA 최적화. (A) 헤어핀-결합 단백질과 효과기 단백질 사이의 상이한 링커를 사용하는 CIRTS 뉴클레아제 시스템을 이용한 루시퍼라아제 분석. 이전에 공개된 L8 = SGSETPGTSESATPES(서열 번호: 133)(문헌 [Guilinger et al., 2014]), 10nm 나선형 링커 = EEEEKKKQQEEEAERLRRIQEEMEKERKRREEDEKRRRKEEEERRMKLEMEAKRKQEEEERKKREDDEKRKKK(서열 번호: 134). (B) 헤어핀-결합 단백질과 효과기 단백질 사이의 상이한 링커를 사용하는 CIRTS-YTHDF2-매개 붕괴를 이용한 루시퍼라아제 분석. (C) 도 1c에 도시된 설계에 기초한 TBP6.7에 대한 상이한 조작된 gRNA. 20개 및 40개 뉴클레오타이드의 2개의 상이한 표적화 길이가 헤어핀과 가이드 서열 사이의 상이한 수의 연결 뉴클레오타이드(L)와 조합되어 사용되었다. 뉴클레아제-매개된 붕괴를 평가하기 위해 이중 루시퍼라아제 분석을 사용하였다. NT = 상이한 링커 뉴클레아제를 함유하는 비표적화, Fluc gRNA(도 1), L2 = UU, L3 = UUU, L5 = UUAUU. (D) 도 S3c에서와 동일한 조작된 gRNA를 CIRTS-3과 함께 사용하여 후성전사체-유도된 RNA 붕괴를 유도하였다. NT = 상이한 링커 뉴클레아제를 함유하는 비표적화, Fluc gRNA(도 1), L2 = UU, L3 = UUU, L5 = UUAUU. n = 3개 생물학적 복제물.
도 24a-d. 대조군 qPCR, 웨스턴 블롯, YTHDF2 절단. (A) CIRTS-1은 mRNA 이외의 RNA 종으로 전달될 수 있다. 원리의 증명으로서, 본 발명자들은 세포를 CIRTS-1(Pin 뉴클레아제) 및 lncRNA MALAT1에 대한 2개의 상이한 gRNA로 형질주입시키고, RNA 수준을 RT-qPCR에 의해 평가하였다. (B) 세포가 CIRTS-2로 형질주입되었을 때 RNA 수준의 RT-qPCR 분석. 예상한 바와 같이, YTHDF1-함유 단백질을 사용한 경우 RNA 수준의 유의한 변화가 관찰되지 않았다. (C) 세포를 CIRTS-2 또는 CIRTS-3으로 형질주입시키고 PPIB로 표적화했을 때 웨스턴 블롯에 의해 측정된 단백질 수준의 정량화(n=3). (D) YTHDF2의 상이한 절단들을 분석하여 어느 것이 더 효율적인지를 결정하였다. 본 발명자들은 루시퍼라아제 데이터(좌측)를 qPCR 데이터(우측)와 비교하였고, 루시퍼라아제 분석을 위해 Y2(100-200) 작제물을 사용하고 내인성 표적화를 위해 Y2(1-200) 작제물을 사용하여 도구의 최상의 가능한 정량화를 가능하게 하는 것으로 결론지었다. 달리 나타내지 않는 한, n = 3개 생물학적 복제물. 스튜던트 t-검정: *P < 0.05, **P <0.01.
도 25a-h. CIRTS의 표적화 특이성. (A) KRAS4b-루시퍼라아제 미스매치 리포터 분석의 개략도. 본 발명자들은 설계된 20nt 길이 gRNA에 대해 증가하는 수의 미스매치를 갖는 4개의 KRAS4b 변이체를 선택하였고, 이를 이중 루시퍼라아제 리포터에 N-말단에 융합시켰다. (B) 도 S5a에 기재된 바와 같이 gRNA와 표적 RNA 사이에 상이한 수의 미스매치를 갖는 KRAS4b-Fluc의 CIRTS-매개된 녹다운. CIRTS는 그의 가이드 서열의 중간에서 미스매치에 가장 민감한 것으로 밝혀졌다. (C) 상기 기재된 바와 동일한 KRAS4b-Fluc 리포터 분석에서의 Cas13b-매개 녹다운. Cas13b는 더 높은 녹다운 효율을 나타내지만 또한 도입된 미스매치에 덜 민감하다. CIRTS와 유사하게, Cas13b는 가이드 표적 이중체 영역의 중심에서의 미스매치에 의해 가장 영향을 받는 녹다운이다. (D) 40nt gRNA 길이를 사용할 때 KRAS4b-루시퍼라아제 미스매치 리포터에 대한 CIRTS의 녹다운 효율. gRNA에서 더 긴 안내 서열은 녹다운 효율의 손실의 일부를 구조할 수 있다. (E-F) CIRTS Pin 뉴클레아제(E) 또는 CIRTS YTHDF2(F)가 세포에서 SMARCA4에 전개될 때 log2(백만 당 전사물(TPM) +1) 단위의 전사체의 평균 발현 수준(n=3). (G) RNA 서열분석에 의해 결정된 SMARCA4의 녹다운 수준. (H) 세포를 CIRTS-0-3xFLAG 및 PPIB, B4GALNT1 또는 NT에 대한 gRNA로 형질주입시켰다. 가교 및 FLAG IP 후, 풀다운된(pulled down) RNA를 RT-qPCR을 사용하여 정량화하였다. 어느 한 전사물에 대한 표적내 gRNA를 함유하는 반응은 이들 전사물에 대해 3.5 내지 5배 농축을 나타내었고, 이는 가이드된 RNA 표적화를 나타낸다(n = 2 또는 3).
도 26a-c. CIRTS를 이용한 내인성 표적화.(A) PPIB에 대한 CIRTS5-7만의 형질주입 후에 RT-qPCR에 의해 평가한 RNA 수준의 변화. (B) 도 S6a와 유사하게, 세포를 CIRTS5-7로 형질주입한 경우에 SMARCA4 수준을 분석하였다. C) PPIB에 대한 활성 Cas13b 뉴클레아제 또는 조작된 dCas13b-YTHDF2(1-200) 작제물의 전달 후 PPIB의 녹다운 수준의 비교(n=2 또는 3). 달리 나타내지 않는 한, n = 3개 생물학적 복제물. 스튜던트 t-검정: *P < 0.01, **P <0.05, ***P <0.01, ****P < 0.001.
도 27a-c. CIRTS를 이용한 다중화 표적화. (A) 다중화 표적화에 사용되는 벡터의 개략도. 세포를 CIRTS-6에 대한 발현 벡터, 및 CIRTS-10에 대한 발현 벡터, PPIB를 표적화하는 CIRTS-6 gRNA 작제물 또는 비-표적화 대조군에 대한 발현 벡터, 및 SMARCA4를 표적화하는 CIRTS-9 gRNA 또는 비-표적화 대조군에 대한 발현 벡터로 형질주입시켰다. (B) (A)에 기재된 다중화 표적화의 녹다운을 보여주는 히트 맵. 두 CIRTS가 PPIB 또는 SMARCA4에 대한 표적내 gRNA가 존재하는 경우, 두 전사물은 동일한 샘플에서 녹다운될 수 있다. 값은 GAPDH에 대한 각각의 표적 전사물의 평균 발현 수준으로서 제시되며, n = 8개 생물학적 복제물이다. (C) 면역원성의 컴퓨터 예측. 본 발명자들은 먼저 IEDB 데이터베이스를 사용하여 MHC I 결합제인 9량체 펩타이드를 예측하고, IEDB 면역원성 예측인자를 사용하여 결합제의 상위 1백분위수를 면역원성 예측에 적용하였다.
도 28. ADAR을 이용한 gRNA 스크리닝. 다수의 헤어핀을 특징으로 하는 가이드 RNA 설계가 CIRTS의 효능을 증가시키는지에 대한 시험. 좌측 패널은 gRNA 설계가 기원 설계, 또는 가이드의 어느 한 단부 상에 하나의 TAR 헤어핀을 갖는, 또는 한 단부 상에 2개의 헤어핀을 갖는, 가이드를 특징으로 함을 보여준다. 추가의 헤어핀 가이드는 세포의 ADAR 활성 분석에서 CIRTS의 효능을 증가시킨다. 우측 패널은 제2 헤어핀이 TAR 헤어핀일 필요가 있는지, 또는 단지 “안정화 헤어핀”이 기능할 수 있는지 여부를 시험하며 - 이는 CIRTS 단백질과 직접 상호작용하지 않지만 분해를 지연시키는 헤어핀을 의미한다. 데이터에서 볼 수 있는 바와 같이, 제2 헤어핀은 1개의 헤어핀 gRNA 설계와 비교하여 효능을 증가시킨다.
도 29a-b. C-to-U 편집기: A의 데이터는 C-to-U 염기 편집기에 기초한 CIRTS가 또한 포유동물 세포 리포터 분석을 사용하여 기능적이라는 것을 입증한다. (B) ssRNA 결합 단백질. B의 데이터는 다른 ssRNA 결합 단백질이 본 개시 내용의 시스템 및 방법에서 RNA 결합 단백질로서 기능할 수 있음을 입증한다.
도 30a-c. (A): 번역을 활성화하고, 리포터 RNA 상의 다양한 위치에 gRNA들을 배열하고 각각의 번역 활성화를 측정할 수 있는, RNA 조절 도메인-함유 단백질. (B-C) RNA를 잠재적으로 분해하거나 불안정화하고, 리포터 RNA 상의 다양한 위치에 gRNA들을 배열하고 각각의 RNA 분해를 측정할 수 있는, RNA 조절 도메인-함유 단백질.
도 31a-b. (A) 본 개시 내용의 시스템의 요소의 상이한 배향을 입증하는 구현예들. (B) 상이한 배향으로(A에 나타낸 바와 같이) 그리고 2개의 RNA 표적:루시퍼라아제 리포터(좌측) 및 내인성 RNA(우측) 상에서 CNOT7을 사용한 데이터. 여러 상이한 배향의 단백질들이 여전히 기능하고, 이는 단백질들이 효과기의 필요에 따라 상이한 순서로 조작될 수 있음을 나타낸다.
도 32a-d. 유도성 RNA 표적화를 위한 CIRTS 바이오센서. (A) 아브시스산(ABA) CIRTS 바이오센서 설계의 개략도. CIRTS의 gRNA 매개 표적화 성분은 ABA 이종이량체화 도메인들(ABI) 중 하나에 융합되는 반면 CIRTS의 효과기 성분은 그의 결합 파트너(PYL)에 융합된다. 저분자 ABA의 첨가 시, 2개의 CIRTS 성분이 이량체화되고 효과기를 표적화된 전사물에 근접하게 한다. (B) 형질주입 48시간 후 적색-형광 단백질(RFP) 리포터 전사물의 ABA-유도성 RNA 분해는 Pin 뉴클레아제 도메인 또는 YTHDF2에 의해 매개될 수 있다. (C) 형질주입 48시간 후 ABA-유도된 CIRTS-YTHDF1에 의한 RFP의 번역 활성화. (D) 돌연변이-불활성화된 루시퍼라아제 리포터로 형질주입된 세포(A-to-I 편집의 경우 FlucW417X, 또는 C-to-U 편집의 경우 GlucC82R)로 ABA의 존재 하에 표적내 gRNA를 이용한 CIRTS-hADAR의 전달은 ABA-의존성 RNA 편집을 유도한다.
후성전사체 조절은 센트럴 도그마를 통해 정보 흐름을 제어하고 RNA 수준에서 세포 상태를 조작하기 위한 독특한 기회를 제공한다. 그러나, 기초적인 기계론적 연구 및 잠재적 번역 적용 둘 모두 효과기 단백질을 사용하여 특이적 RNA를 표적화하는 효과적인 방법의 결여로 인해 방해를 받는다. 여기서, 본 발명자들은 프로그램 가능한 RNA 조절 시스템을 구축하기 위한 새로운 단백질 조작 전략인 CRISPR/Cas-영감 RNA 표적화 시스템(CIRTS)의 설계 및 검증을 제시한다. 본 발명자들은 CIRTS가 뉴클레아제, 분해 기구, 및 번역 활성제를 포함하는 다양한 효과기 단백질을 표적 전사물에 전달하기 위한 단순하고 일반화 가능한 접근 방식임을 보여준다. CIRTS는 자연 발생 CRISPR/Cas 프로그램 가능한 RNA 결합 시스템보다 작을 뿐만 아니라, 전적으로 인간 단백질 부분으로부터 구축될 수 있다. CIRTS의 작은 크기 및 인간-유래 성질은 기초적인 RNA 조절 연구를 위한 덜 교란적인 방법뿐만 아니라 후성전사체-조절 요법에 적용할 때 면역 문제를 피하기 위한 잠재적인 전략을 제공한다.
I. RNA 조절 도메인
임의의 RNA 조절 도메인이 본 개시 내용의 방법 및 시스템에서 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 하기 활성들: 메틸화(methylation), 5’-3’ 구아닐화(5’-3’ guanylylation), 포스포리보실화(phosphoribosylation), 탈아미노화(deamination), 카르바모일화(carbamoylation), 이소펜테닐화(isopentenylation), 아그마티닐화(agmatinylation), 아세틸화(acetylation), 리실화(lysylation), O/S 교환, 갈락토실화(galactosylation), 글루타밀화(glutamylation), 만노실화(mannosylation), 수소화(hydrogenation), 유사우리딘(pseudouridine) 형성, 카르복시메틸아미노메틸화(carboxymethylaminomethylation), 아미노메틸화(aminomethylation), 탈카르복시메틸화(decarboxymethylation), 탈수소화(dehydrogenation), 카르복시메틸화(carboxymethylation), 히드록실화(hydroxylation), 메틸티올화(methylthiolation), 3-아미노-3-카르복시프로필화(3-amino-3-carboxypropylation), 탈메틸화(demethylation), 5’-5’ 구아닐화(5’-5’ guanylylation), 및 탈인산화(dephosphorylation) 중 하나 이상을 갖는 RNA 조절 도메인이 사용될 수 있다.
예시적인 RNA 조절 도메인은 표 1의 하기 단백질들로부터의 도메인들 (또는 이의 기능적 단편들)을 포함한다:
표 1
Figure pct00001
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추가의 RNA 조절 도메인은 표 2의 하기 인간 단백질들로부터의 기능적 도메인들을 포함한다:
표 2
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RNA 조절 도메인은 표 1 또는 표 2로부터 선택된 단백질 또는 표 1 또는 2의 단백질 목록으로부터 선택된 단백질로부터의 기능성 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 표 1 또는 2의 단백질 목록으로부터 선택된 단백질로부터의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 표 1 또는 2의 단백질 또는 표 1 또는 2로부터의 단백질의 단편에 대해 적어도, 최대, 또는 정확히 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61 또는 60%(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 표 1 또는 표 2로부터의 단백질의 적어도, 최대, 또는 정확히 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 또는 2000개의 인접 아미노산(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 표 1 또는 2로부터의 단백질의 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 하기 활성들: 메틸화, 5’-3’ 구아닐화, 포스포리보실화, 탈아미노화, 카르바모일화, O/S 교환, 갈락토실화, 글루타밀화, 만노실화, 수소화, 유사우리딘 형성, 카르복시메틸아미노메틸화, 아미노메틸화, 탈카르복시메틸화, 탈수소화, 카르복시메틸화, 히드록실화, 메틸티올화, 3-아미노-3-카르복시프로필화, 탈메틸화, 5’-5’ 구아닐화, 탈인산화, 뉴클레아제, 편집, RNA 수송, 번역 활성화, 번역 억제, 단일 가닥 RNA 절단 활성, 이중 가닥 RNA 절단 활성, 및 RNA 결합 활성 중 하나 이상을 갖는다.
일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 RNA 헤어핀 결합 단백질의 카르복시-말단에 또는 그 근처에 있다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 RNA 헤어핀 결합 단백질의 아미노-말단에 또는 그 근처에 있다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 펩타이드 결합에 의해 RNA 헤어핀 결합 단백질에 융합된다. 일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 링커 모이어티에 의해 RNA 헤어핀 결합 단백질에 연결된다.
II. RNA 헤어핀 결합 도메인 및 헤어핀 구조
다른 RNA 헤어핀 결합 도메인 및 이들이 결합하는 헤어핀 구조는 당업계에 공지되어 있고, 본 개시 내용의 시스템, 조성물, 융합 단백질, 키트, 벡터 및 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 구현예들은 하기 표(표 3)에 따른 RNA 헤어핀 결합 도메인 및 헤어핀 구조를 포함하고, 이 표는 RNA 헤어틴 결합 도메인, 및 이들이 특이적으로 결합하는 헤어핀 구조를 포함하는 단백질을 열거한다:
표 3: RNA 헤어핀 결합 도메인
RNA 헤어핀 결합 도메인 헤어핀 구조
MS2 외피 단백질(MCP) (박테리오파지) AAACAUGAGGAUUACCCAUGU(서열번호: 107)AAACAUGAGGAUCACCCAUGU(서열번호: 108)
λ N (박테리오파지) GCCCUGAAGAAGGGC(서열번호: 109);GCCCUGAAAAAGGGC(서열번호: 110)
PP7 (슈도모나스 에루지노사) UAAGGAGUUUAUAUGGAAACCCUUA(서열번호: 111)
철 반응 단백질(IRP) CAGWGH, 여기서 W는 A 또는 U이고 H는 A, C, 또는 U이고;NNNNNUGCNNNNNCAGUGNNNNNNCNNNNN, 여기서 n은 임의의 뉴클레오타이드이다
Qβ AAACAUGAGGAUUACCCAUGU(서열번호: 107);AAACAUGAGGAUCACCCAUGU(서열번호: 108);
AUGCAUGUCUAAGACAGCAU(서열번호: 114)
GA AAACAUGAGGAUUACCCAUGU(서열번호: 107);AAACAUGAGGAUCACCCAUGU(서열번호: 108);
AAAACAUAAGGAAAACCUAUGUU(서열번호: 115)
소 면역결핍 바이러스(BIV) 전사의 전이활성인자 (tat) GGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCC(서열번호: 112)
U1A (인간) AUUGCAC;GGAAUCCAUUGCACUCCGGAUUUCACTAG(서열번호: 113);
GGCCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGGCC(서열번호: 1)
SLBP (인간) CCAAAGGCUCUUCUCAGAGCCACCCA(서열번호: 2)
KU70 (인간) GGCGUCCCUCCCGAAGCUGCGCGCUCGGUCGAACAGGACGACC(서열번호: 83)
뉴클레오린 (인간) UCCCGA(서열번호: 84);GGCCGAAAUCCCGAAUGAGGCC(서열번호: 85);
GGAUGCCUCCCGAGUGCAUCC(서열 번호: 86).
다수의 RNA 헤어핀 결합 도메인 및/또는 RNA 조절 도메인이 상이한 헤어핀 구조에 결합하여 동일한 세포에서 다수의 상이한 RNA를 표적화하는 RNA 헤어틴 결합 도메인을 사용함으로써 다중화 방식으로 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 상이한 RNA들은 동일한 방식으로 또는 상이한 방식으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 하나의 RNA는 번역 활성화를 이용하여 조절될 수 있는 반면, 제2 RNA는 동일한 세포에서 번역 억제를 이용하여 조절될 수 있다. 따라서, 본 개시 내용의 시스템은 하나의 세포, 조직 또는 유기체에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 RNA의 조절을 위해 다중화된 방식으로 사용될 수 있다.
III. 핵산
특정 구현예에서, 본원에 기재된 단백질, 폴리펩타이드, 조절 도메인, 또는 RNA 표적화 분자를 암호화하는 재조합 핵산이 존재한다.
본 출원에서 사용되는 용어 “폴리뉴클레오타이드”는 재조합되었거나 또는 전체 유전체 핵산이 없는 단리된 핵산 분자를 지칭한다. 용어 “폴리뉴클레오타이드”에는 올리고뉴클레오타이드(핵산 100개 이하의 잔기 길이), 예를 들어 플라스미드, 코스미드(cosmid), 파지(phage), 바이러스 등을 포함한 재조합 벡터가 포함된다. 폴리뉴클레오타이드는, 특정 측면에서, 그의 자연 발생 유전자 또는 단백질 암호화 서열로부터 실질적으로 멀리 단리된 조절 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, RNA, DNA(유전체, cDNA 또는 합성), 이들의 유사체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
이와 관련하여, 용어 “유전자”, “폴리뉴클레오타이드” 또는 “핵산”은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드(적절한 전사, 번역 후 변형 또는 국소화에 필요한 임의의 서열 포함)를 암호화하는 핵산을 지칭하는데 사용된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 이 용어는 단백질, 폴리펩타이드, 도메인, 펩타이드, 융합 단백질, 및 돌연변이체를 발현하거나 또는 발현하도록 적응될 수 있는 유전체 서열, 발현 카세트, cDNA 서열, 및 보다 작은 조작된 핵산 단편을 포괄한다. 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산은 이러한 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 암호화하는 인접 핵산 서열을 함유할 수 있다. 또한, 특정 폴리펩타이드는 약간 상이한 핵산 서열을 갖는 변이를 함유하는 핵산에 의해 암호화될 수 있지만, 그럼에도 불구하고 동일하거나 실질적으로 유사한 단백질을 암호화할 수 있는 것으로 고려된다(상기 참조).
특정 구현예에서, 상호작용 성분이 상호작용할 때 중합효소 도메인으로부터의 중합효소 활성에 의존적인 유전자 전사를 구동하는 폴리펩타이드(예를 들어, 중합효소, RNA 중합효소, 폴리펩타이드인 하나 이상의 절단된 중합효소 도메인 또는 상호작용 성분)를 암호화하는 핵산 서열이 혼입된 단리된 핵산 단편 및 재조합 벡터가 존재한다. 용어 “재조합”은 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드의 이름과 함께 사용될 수 있고, 이는 일반적으로 시험관 내에서 조작된 또는 이러한 분자의 복제 생성물인 핵산 분자로부터 생성된 폴리펩타이드를 지칭한다.
핵산 단편은, 코딩 서열 자체의 길이에 관계없이, 다른 핵산 서열, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 추가의 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 분절 등과 조합되어, 그의 전체 길이가 상당히 달라질 수 있다. 따라서, 거의 임의의 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있고, 총 길이는 바람직하게는 의도된 재조합 핵산 계획에서의 제조 및 사용의 용이성에 의해 제한되는 것으로 고려된다. 일부 경우에, 핵산 서열은, 예를 들어 폴리펩타이드의 정제, 수송, 분비, 번역후 변형을 가능하게 하기 위해, 또는 표적화 또는 효능과 같은 치료 이익을 위해 추가의 이종 코딩 서열을 갖는 폴리펩타이드 서열을 암호화할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 꼬리표 또는 다른 이종 폴리펩타이드가 변형된 폴리펩타이드-암호화 서열에 첨가될 수 있고, 여기서 “이종(heterologous)”은 변형된 폴리펩타이드와 동일하지 않은 폴리펩타이드를 지칭한다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 서열에 대해 실질적인 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 변이체들이 존재하며; 이들은 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 표준 매개변수들을 사용한 BLAST 분석)을 사용하여 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여, 하기 수치 사이의 모든 값 및 범위를 포함하여, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함한다. 특정 측면에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 서열의 전체 길이에 걸쳐 본원에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 것이다.
A. 벡터
폴리펩타이드는 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다. 핵산 분자는 핵산 벡터의 형태일 수 있다. 용어 “벡터”는 이종 핵산 서열이 복제되고 발현될 수 있는 세포 내로의 도입을 위해 삽입될 수 있는 운반체 핵산 분자를 지칭하는 데 사용된다. 핵산 서열은 “이종성”일 수 있고, 이는 벡터가 도입되는 세포 또는 도입되는 핵산에 대해 외래인 맥락에 있음을 의미하며, 이는 세포 또는 핵산 내의 서열에 상동성이지만 숙주 세포 또는 핵산의 내에서 통상적으로 발견되지 않는 위치에 있는 서열을 포함한다. 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 염색체(예를 들어, YAC)를 포함한다. 당업자는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하기 위한 준비를 잘 갖출 수 있을 것이다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996], 둘 다 본원에 참조로 포함됨). 벡터는 중합효소, RNA 중합효소, 하나 이상의 절단된 중합효소 도메인 또는 하나 이상의 절단된 RNA 중합효소 도메인에 융합, 부착 또는 연결되는 상호작용 성분을 생성하기 위해 숙주 세포에서 사용될 수 있다.
용어 “발현 벡터”는 전사될 수 있는 유전자 생성물의 적어도 일부에 대한 핵산 서열 코딩을 함유하는 벡터를 지칭한다. 일부 경우에, RNA 분자는 이어서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터는 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 지칭하는 다양한 “제어 서열(control sequence)”을 함유할 수 있다. 전사 및 번역을 제어하는 제어 서열에 더하여, 벡터 및 발현 벡터는 또한 다른 기능을 하고 본원에 기재된 핵산 서열을 함유할 수 있다.
B. 세포
본 개시 내용은 구체적으로 원핵 세포, 진핵 세포, 조직, 기관 또는 유기체, 보다 구체적으로 포유동물 세포, 조직, 기관 또는 유기체에서 관심 표적 RNA를 변형시키는 방법을 제공한다. 표적 RNA는 세포 내의 핵산 분자에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 포유동물 세포 또는 식물 세포와 같은 진핵 세포에 있다. 포유동물 세포는 인간, 비인간 영장류, 소과, 돼지과, 설치류 또는 마우스 세포일 수 있다. 세포는 가금류, 어류 또는 새우와 같은 비포유류 진핵 세포일 수 있다. 식물 세포는 카사바, 옥수수, 수수, 밀 또는 벼와 같은 작물 식물의 것일 수 있다. 식물 세포는 또한 조류(algae), 나무 또는 채소의 것일 수 있다. 본 개시 내용의 방법, 시스템, 및 조성물에 의해 세포에서 유도된 RNA의 조절은 세포 및 세포의 자손이 항체, 녹말, 알코올 또는 기타 원하는 세포 산물과 같은 생물학적 생성물의 개선된 생산을 위해 변경되도록 될 수 있다. 세포에서 유도된 RNA의 조절은 세포 및 세포의 자손이 생산된 생물학적 생성물을 변화시키는 변경을 포함하도록 될 수 있다.
포유동물 세포는 인간 또는 비인간 포유동물, 예를 들어 영장류, 소과, 양과, 돼지과, 개과, 설치류, 토끼과, 예컨대 원숭이, 암소, 양, 돼지, 개, 토끼, 쥐 또는 마우스 세포일 수 있다. 세포는 가금류 조류(예: 닭), 척추동물 어류(예: 연어) 또는 조개류(예: 굴, 조개, 랍스터, 새우) 세포와 같은 비포유류 진핵 세포일 수 있다. 세포는 또한 식물 세포일 수 있다. 식물 세포는 단자엽 또는 쌍자엽 식물 또는 카사바, 옥수수, 수수, 대두, 밀, 귀리 또는 벼와 같은 작물 또는 곡물 식물의 것일 수 있다. 식물 세포는 또한 조류(algae), 나무 또는 생산 식물, 과일 또는 채소(예를 들어, 감귤류 나무, 예를 들어 오렌지, 그레이프프루트 또는 레몬 나무와 같은 나무; 복숭아 또는 천도 복숭아 나무; 사과 또는 배 나무; 아몬드, 호두 또는 피스타치오 나무와 같은 견과 나무; 가지속 식물; 배추속 식물; 상추속 식물; 시금치속 식물; 고추속 식물; 목화, 담배, 아스파라거스, 당근, 양배추, 브로콜리, 콜리플라워, 토마토, 가지, 후추, 상추, 시금치, 딸기, 블루베리, 라즈베리, 블랙베리, 포도, 커피, 코코아 등)의 것일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 “세포”, “세포주” 및 “세포 배양물”은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이 모든 용어에는 모든 후속 세대인 자손도 포함된다. 모든 자손은 의도적이거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해 동일하지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 이종 핵산 서열을 발현하는 맥락에서, “숙주 세포”는 원핵 또는 진핵 세포를 지칭하며, 벡터를 복제하거나 벡터에 의해 암호화되는 이종 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질전환 가능 유기체를 포함한다. 숙주 세포는 벡터나 바이러스의 수용자(recipient)로 사용될 수 있고 사용되어 왔다. 숙주 세포는 재조합 단백질-암호화 서열과 같은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭하는 “형질주입” 또는 “형질전환”될 수 있다. 형질전환된 세포는 1차 대상체 세포 및 그의 자손을 포함한다.
일부 벡터는 원핵 및 진핵 세포 모두에서 복제 및/또는 발현되도록 하는 제어 서열을 사용할 수 있다. 당업자는 상기 기재된 모든 숙주 세포를 인큐베이션하여 이들을 유지하고 벡터의 복제를 허용하는 조건을 추가로 이해할 것이다. 또한, 벡터 및 이들의 동족 폴리펩타이드, 단백질, 또는 펩타이드에 의해 암호화된 핵산의 생성 뿐만 아니라 벡터의 대규모 생성을 가능하게 하는 기술 및 조건은 공지되어 있으며 당업자가 이해 가능하다.
C. 발현 시스템
상기 논의된 조성물의 적어도 일부 또는 전부를 포함하는 수많은 발현 시스템이 존재한다. 원핵생물 및/또는 진핵생물 기반 시스템은 핵산 서열, 또는 그의 동족 폴리펩타이드, 단백질 및 펩타이드를 생성하기 위한 구현예와 함께 사용하기 위해 채용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시 내용의 벡터, 융합 단백질, RNA 헤어핀 결합 단백질, RNA 표적화 분자, RNA 조절 도메인, 및 부속 단백질은 유도성 또는 구성적 발현 시스템과 같은 발현 시스템을 이용할 수 있다. 상기와 같은 많은 시스템이 상업적으로 널리 이용 가능하다.
곤충 세포/배큘로바이러스(baculovirus) 시스템은 미국 특허 제5,871,986호, 제4,879,236호에 기술된 것과 같은 이종 핵산 단편의 높은 수준의 단백질 발현을 생성할 수 있으며, 두 특허 모두 본원에 참고로 포함되며, 예를 들어 INVITROGEN®의 MAXBAC® 2.0 및 CLONTECH®의 BACPACK™ BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM이라는 이름으로 구입할 수 있다.
개시된 발현 시스템에 더하여, 발현 시스템의 다른 예는 합성 엑디손-유도성 수용체를 포함하는 STRATAGENE®의 COMPLETE CONTROL 유도성 포유동물 발현 시스템, 또는 대장균 발현 시스템인 동사의 pET 발현 시스템을 포함한다. 유도성 발현 시스템의 또 다른 예는 전장(full-length) CMV 프로모터를 사용하는 유도성 포유동물 발현 시스템인 T-REX™(테트라사이클린 조절 발현) 시스템을 보유하는 INVITROGEN®에서 구입할 수 있다. INVITROGEN®은 또한 메틸올 자화 효모 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica)에서 재조합 단백질의 높은 수준의 생산을 위해 설계된 피치아 메탄올리카 발현 시스템이라고 하는 효모 발현 시스템을 제공한다. 당업자는 핵산 서열 또는 그의 동족 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드를 생성하기 위해 발현 작제물과 같은 벡터를 발현하는 방법을 알고 있을 것이다.
D. 핵산과 폴리펩타이드의 접합
본 개시 내용의 구현예는 핵산을 폴리펩타이드에 접합하는 것에 관한 것이다. 폴리펩타이드에 핵산을 접합하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 하기에 기술된 것을 포함한다. 본 개시 내용의 구현예는 핵산-폴리펩타이드 분자 및 핵산이 본원에 기재된 방법에 의해 폴리펩타이드에 접합된 분자 자체의 제조 방법에 관한 것이다. 상기와 같은 예에는 클릭 화학(click chemistry)이 포함된다. “클릭 화학”이라고도 알려진 “클릭 반응(click reaction)”은 1,2,3-트리아졸을 생성하기 위한 아지드 및 알킨의 휘스겐(Huisgen) 1,3-쌍극자 고리화 첨가의 단계적 변이체를 설명하는 데 자주 사용되는 이름이다. 이 반응은 대기 조건에서 또는 약한 마이크로파 조사 하에, 일반적으로 Cu(I) 촉매의 존재 하에, Cu(I) 염의 촉매량에 의해 매개될 때 1,4-2기치환된 트리아졸에 대한 배타적 위치 선택성을 갖고 수행된다[V. Rostovtsev, L. G. Green, V. V. Fokin, K. B. Sharpless, Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596; H. C. Kolb, M. Finn, K. B. Sharpless, Angew Chem., Int. Ed. 2001, 40, 2004].
다른 접합 방법에서, 돌연변이체 형태의 인간 DNA 복구 단백질 O6-알킬구아닌-DNA 알킬전달효소는 O6-벤질구아닌(BG), 및 벤질기에 연결된 큰 모이어티를 운반하는 유도체와 빠르게 특이적으로 반응한다. 구아닌을 이탈기(leaving group)로 사용하면 벤질 모이어티가 효소의 활성 부위에 있는 시스테인에 공유 결합된다. 효소는 또한 유사한 방식으로 O6-벤질시토신(BC)에 특이적이 되도록 돌연변이되었다. 이러한 효소 도메인들(약 20kDa)은 각각 SNAP 및 CLIP 태그로 상업적으로 이용 가능하다.
추가 접합 방법은 Halo 태그를 사용한다. Halo 태그는 진핵생물에 직교하는 화학 반응, 즉 할로알칸 리간드의 탈할로겐화를 이용하며, 따라서 태그의 고도로 특이적인 공유결합 라벨링으로 이어지고, 따라서 살아있는 세포 및 고정된 세포 모두에서 단백질로 이어진다.
E. 핵산 변형
본원에 기재된 RNA 표적화 분자 및 기타 핵산과 같은 본 개시 내용의 올리고뉴클레오타이드는 핵산의 안정성을 증가시키는 변형을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 표적화 분자는 올리고뉴클레오타이드 유사체이다. 용어 “올리고뉴클레오타이드 유사체”는 올리고뉴클레오타이드와 유사하게 기능하지만 비천연 발생 부분을 갖는 화합물을 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드 유사체는 변경된 당(sugar) 모이어티, 변경된 염기 모이어티 또는 변경된 당간(inter-sugar) 연결을 가질 수 있다. 용어 “올리고머”는 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 유사체 또는 올리고뉴클레오사이드(oligonucleoside)를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, “올리고머”에 대해 언급할 때 천연 인산디에스테르 결합 또는 4개의 원자 링커를 포함하는 다른 연결을 통해 연결된 일련의 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 참조한다. 연결이 일반적으로 한 뉴클레오사이드의 3’ 탄소에서 두 번째 뉴클레오사이드의 5’ 탄소로 연결되지만, 용어 “올리고머”는 2’-5’ 연결과 같은 다른 연결도 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 유사체는 또한 다른 변형, 구체적으로 뉴클레아제 내성을 증가시키고, 결합 친화도를 향상하고, 및/또는 결합 특이성을 향상하는 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드의 당 부분이 탄소고리 모이어티로 대체되면 이는 더 이상 당이 아니다. 더욱이, 당간 인산디에스테르 결합에 대한 상기 치환과 같은 다른 치환이 이루어질 때, 생성된 물질은 더 이상 진정한 핵산 종이 아니다. 이러한 모든 화합물은 유사체로 간주된다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 핵산 종의 당 부분에 대한 언급은 진정한 당 또는 야생형 핵산의 당의 구조적 위치를 차지하는 종을 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 당간 연결에 대한 언급은 야생형 핵산의 방식으로 당 또는 당 유사체 부분을 연결하는 역할을 하는 모이어티를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본 개시 내용은 변형된 올리고뉴클레오타이드, 즉, 올리고뉴클레오타이드 유사체 또는 올리고뉴클레오사이드, 및 상기 변형을 수행하는 방법에 관한 것이다. 이러한 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 유사체는 자연 발생 대응물에 비해 증가된 화학적 및/또는 효소적 안정성을 나타낼 수 있다. 세포외 및 세포내 뉴클레아제는 일반적으로 백본 변형된 화합물을 인식하지 못하므로 그에 결합하지 않는다. 양성화된 산 형태로 존재할 때 음전하를 띤 백본이 결여되면 세포 침투가 촉진될 수 있다.
변형된 뉴클레오사이드 연결은 천연 발생 인산디에스테르-5’-메틸렌 연결을 4개의 원자 연결기로 대체하여 생성된 화합물에 뉴클레아제 내성 및 향상된 세포 흡수력을 부여하기 위한 것이다. 바람직한 연결 구조는 CH2 --RA --NR1 CH2, CH2 --NR1 --RA --CH2, RA --NR1 --CH2 --CH2, CH2 --CH2 --NR1 --RA, CH2 --CH2 --RA --NR1, 또는 NR1 --RA --CH2 --CH2이고, 여기서 RA는 O 또는 NR2이다.
변형은 DNA 합성기 분야의 숙련가에게 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 DNA 합성기와 함께 사용하거나 수동으로 조작할 수 있는 고체 지지체를 사용하여 달성할 수 있다. 일반적으로, 절차는 선택된 서열에서 서로 인접할 2개의 뉴클레오사이드의 당 모이어티를 기능화하는 것을 포함한다. 5’에서 3’으로의 의미에서, “상류부위(upstream)” 신톤은 말단 3’ 부위에서 변형되고, “하류부위(downstream)” 신톤은 말단 5’ 부위에서 변형된다.
히드라진, 히드록실아르닌(hydroxylarnine) 및 기타 연결기에 의해 연결된 올리고뉴클레오사이드는 5’-히드록실에서 디메톡시트리틸기에 의해 보호될 수 있고 3’-히드록실에서 시아노에틸디이소프로필-아인산염 모이어티와 결합하기 위해 활성화될 수 있다. 이러한 화합물은 표준, 고체상, 자동화된 DNA 합성 기술에 의해 원하는 서열에 삽입할 수 있다. 가장 널리 사용되는 공정 중 하나는 포스포라미디트 기술이다. 균일한 백본 연결을 함유하는 올리고뉴클레오타이드는 Applied Biosystems Inc. 380B 및 394 및 Milligen/Biosearch 7500 및 8800s와 같은 표준 핵산 합성 기계 및 CPG-고체 지지체를 사용하여 합성할 수 있다. 초기 뉴클레오타이드(3’-말단의 1번)는 조절된 공극 유리와 같은 고체 지지체에 부착된다. 서열 특이적 순서로, 각각의 새로운 뉴클레오타이드는 수동 조작에 의해 또는 자동화된 합성기 시스템에 의해 부착된다.
유리 아미노기는 예를 들어 아세트산에서 아세톤 및 나트륨 시아노보로 수소화물(sodium cyanoboro hydride)로 알킬화될 수 있다. 알킬화 단계는 거대분자에 다른 유용한 기능 분자를 도입하는 데 사용할 수 있다. 이러한 유용한 기능적 분자는 리포터 분자, RNA 절단기(cleaving group), 올리고뉴클레오타이드의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기(group), 및 올리고뉴클레오타이드의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기(group)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 분자는 백본 연결에서 질소 원자에 대한 부착을 통해 거대분자에 부착되거나 접합될 수 있다. 대안적으로, 이러한 분자는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 당 모이어티의 히드록실기로부터 연장되는 펜던트기에 부착될 수 있다. 이러한 다른 유용한 작용기의 예는 WO1993007883(본원에 참고로 포함됨) 및 상기 언급된 다른 특허 출원에 제공된다.
고체 지지체에는 조절된 공극 유리(CPG), 옥살릴 조절된 공극 유리[53], TentaGel Support―아미노폴리에틸렌글리콜 유도된 지지체[54] 또는 Poros―폴리스티렌/디비닐벤젠의 공중합체를 포함하여 폴리뉴클레오타이드 합성에 대해 당업계에 알려진 모든 것이 포함될 수 있다. 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드의 부착 및 절단은 표준 절차를 통해 수행할 수 있다[55]. 본원에 사용된 바와 같이, 고체 지지체라는 용어는 성장하는 올리고뉴클레오사이드를 CPG와 같은 정지상(stationary phase)에 결합하는 데 사용되는 임의의 링커(예를 들어, 장쇄 알킬 아민 및 숙시닐 잔기)를 더 포함한다.
1. 고정된 뉴클레오타이드(Locked Nucleotide)
일부 구현예에서, RNA 표적화 분자와 같은 본 개시 내용의 핵산은 고정된 핵산(locked nucleic acid)을 포함한다. 접근 불가능한 RNA라고도 하는 고정된 핵산(LNA 또는 Ln)은 변형된 RNA 뉴클레오타이드이다. LNA 뉴클레오타이드의 리보스 모이어티는 2’ 산소와 4’ 탄소를 연결하는 여분의 가교로 변형된다. 가교(bridge)는 A형 이중체(duplex)에서 종종 발견되는 3’-엔도(북쪽) 형태로 리보스를 “고정(lock)”한다. LNA 뉴클레오타이드는 원하는 경우 언제든지 올리고뉴클레오타이드의 DNA 또는 RNA 잔기와 혼합될 수 있으며 Watson-Crick 염기쌍 규칙에 따라 DNA 또는 RNA와 혼성화될 수 있다. 이러한 올리고머는 화학적으로 합성되며 상업적으로 이용 가능하다. 고정된 리보스 형태는 염기 중첩(base stacking) 및 백본 사전 구성을 향상시킨다. 이것은 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 특성(용융 온도)을 상당히 증가시킨다.
2. 에틸렌 가교된 뉴클레오타이드
일부 구현예에서, RNA 표적화 분자와 같은 본 개시 내용의 핵산은 하나 이상의 에틸렌 가교된 뉴클레오타이드(ethylene bridged nucleotide)를 포함한다. 에틸렌-가교된 핵산(ENA 또는 En)은 2’-O, 4’C 에틸렌 연결이 있는 변형된 뉴클레오타이드이다. 고정된 뉴클레오타이드와 마찬가지로 이 뉴클레오타이드는 당질 퍼커링(sugar puckering)을 RNA의 N 형태로 제한한다.
3. 펩타이드 핵산
일부 구현예에서, RNA 표적화 분자와 같은 본 개시 내용의 핵산은 하나 이상의 펩타이드 핵산을 포함한다. 펩타이드 핵산(PNA 또는 Pn)은 DNA의 거동을 모방하고 상보성 핵산 가닥에 결합한다. 본원에서 사용되는 용어 “펩타이드”는 또한 펩타이드 핵산을 지칭할 수 있다. PNA는 DNA 또는 RNA와 유사한 인공적으로 합성된 중합체이다. DNA와 RNA는 각각 디옥시리보스와 리보스 당 백본을 가지고 있는 반면, PNA의 백본은 펩타이드 결합으로 연결된 반복되는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성된다. 다양한 퓨린 및 피리미딘 염기는 메틸렌 가교(-CH2-) 및 카르보닐기(-(C=O)-)에 의해 백본에 연결된다. PNA는 첫 번째(왼쪽) 위치에 N-말단이 있고 마지막(오른쪽) 위치에 C-말단이 있는 펩타이드처럼 묘사된다.
PNA의 백본에는 전하를 띤 인산기가 없기 때문에 PNA/DNA 가닥 사이의 결합은 정전기적 반발력의 결여로 인해 DNA/DNA 가닥 사이보다 더 강력하다. PNA는 뉴클레아제나 프로테아제에 의해 쉽게 인식되지 않아 효소에 의한 분해에 저항성이 있다. PNA는 또한 넓은 pH 범위에서 안정적이다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 PNA는 다른 PNA에 비해 개선된 세포액 전달력을 갖는다.
4. 5’(E)-비닐-포스포네이트(VP) 변형
일부 구현예에서, RNA 표적화 분자와 같은 본 개시 내용의 핵산은 하나 이상의 5’(E)-비닐-포스포네이트(VP) 변형을 포함한다. 5’(E)-비닐-포스포네이트 변형(대사적으로 안정된 인산염 모방체)은 올리고뉴클레오타이드의 대사 안정성과 효능을 향상시키는 것으로 보고되었다.
5. 모르폴리노(Morpholino)
일부 구현예에서, RNA 표적화 분자와 같은 본 개시 내용의 핵산은 모르폴리노(morpholino)를 포함한다. 모르폴리노는 천연 핵산 구조를 재설계한 생성물인 합성 분자이다. 일반적으로 길이가 25개 염기인 이들은 표준 핵산 염기쌍에 의해 RNA 또는 단일 가닥 DNA의 상보성 서열에 결합한다. 구조면에서 모르폴리노와 DNA의 차이점은 모르폴리노에는 표준 핵산 염기가 있지만 이러한 염기는 인산염 대신 포스포로디아미데이트 기를 통해 연결된 메틸렌모르폴린 고리에 결합되어 있다는 것이다. 그림은 거기에 묘사된 두 가닥의 구조를 비교하는데, 하나는 RNA이고 다른 하나는 모르폴리노이다. 음이온성 인산염을 전하를 띠지 않는 포스포로디아미데이트 기로 대체하면 일반적인 생리학적 pH 범위에서 이온화가 제거되므로 유기체나 세포의 모르폴리노는 전하를 띠지 않는 분자이다. 모르폴리노의 전체 백본은 이러한 변형된 서브유닛들로 만들어진다.
IV. 전달 매개체
본 개시 내용은 대략 균일한 분포를 제공하고 제어가능한 방출 속도를 갖는 핵산과 양립가능한 여러 전달 시스템을 고려한다. 핵산 전달 시스템을 만드는 데 유용한 다양한 상이한 매질이 아래에서 설명된다. 임의의 하나의 매질 또는 운반체가 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 모든 매질 또는 운반체는 다른 매질 또는 운반체와 결합될 수 있는데; 예를 들어, 일 구현예에서 화합물에 부착된 중합체 미세입자 운반체는 겔 매질과 결합될 수 있다.
본 개시 내용에 의해 고려되는 운반체 또는 매질은 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스 에스테르, 덱스트란 황산, 펜토산 폴리설페이트, 키틴, 당류, 알부민, 피브린 실란트, 합성 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드, 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리프로필렌 옥사이드의 블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴레이트(2-히드록시에틸 메타크릴레이트를 포함하나 이에 제한되지 않음), 폴리(오르토 에스테르), 시아노아크릴레이트, 젤라틴-레조르시놀-알데히드 유형 생체접착물질, 폴리아크릴산 및 공중합체 및 이들의 블록 공중합체를 포함하는 군(group)으로부터 선택된 물질을 포함한다.
A. 미세입자
본 개시 내용의 일부 구현예는 미세입자를 포함하는 전달 시스템을 고려한다. 바람직하게는, 미세입자는 리포솜, 나노입자, 마이크로스피어, 나노스피어, 마이크로캡슐, 및 나노캡슐을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 의해 고려되는 일부 미세입자는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리-글리콜산 및 폴리-락트산을 포함하나 이에 제한되지 않는 지방족 폴리에스테르, 히알루론산, 변형 다당류, 키토산, 셀룰로스, 덱스트란, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 슈도-폴리(아미노산), 폴리하이드록시부티레이트 관련 공중합체, 폴리무수물, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 옥사이드), 레시틴 및 인지질을 포함한다.
B. 리포솜
본 개시 내용의 일 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 접합체, 폴리펩타이드 및 융합 단백질을 부착 및 방출할 수 있는 리포솜을 고려한다. 리포솜은 인지질과 같은 양쪽 친매성 분자로 만들어진 수성 코어를 둘러싼 미세한 구형 지질 이중층이다. 예를 들어, 리포솜은 인지질 미셀의 소수성 꼬리 사이에 핵산을 포획할 수 있다. 수용성 제제는 코어에 포획될 수 있고 지용성 제제는 쉘-유사 이중층에 용해될 수 있다. 리포솜은 계면활성제나 다른 유화제를 사용하지 않고 매질에서 수용성 및 수불용성 화학물질을 함께 사용할 수 있다는 점에서 특별한 특징이 있다. 리포솜은 수성 매질에서 인지질을 강제로 혼합하여 자발적으로 형성할 수 있다. 수용성 화합물은 인지질을 수화시킬 수 있는 수용액에 용해된다. 따라서, 리포솜이 형성되면 이러한 화합물은 수성 리포솜 중심 내에 포획된다. 인지질 막인 리포솜 벽은 오일과 같은 지용성 물질을 보유한다. 리포솜은 통합된 화합물의 제어 방출을 제공한다. 또한, 리포솜은 약동학적 반감기를 증가시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체로 코팅될 수 있다. 본 발명의 일 구현예는 리포솜 생산을 정제하여 특별히 설계된 구조적 특징을 갖는 안정한 단일박막(단일층) 리포솜을 생성하기 위한 초고전단 기술을 고려한다. 리포솜의 이러한 독특한 특성으로 인해 일반적으로 섞이지 않는 화합물의 동시 저장과 제어 방출 기능이 가능하다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 양이온성 및 음이온성 리포솜 뿐만 아니라 중성 지질을 갖는 리포솜을 고려한다. 바람직하게는, 양이온성 리포솜은 물질과 지방산 리포솜 성분을 혼합하고 이들이 전하-회합하도록 함으로써 음으로 하전된 물질을 포함한다. 분명히, 양이온성 또는 음이온성 리포솜의 선택은 최종 리포솜 혼합물의 원하는 pH에 따라 달라진다. 양이온성 리포솜의 예에는 리포펙틴(lipofectin), 리포펙타민(lipofectamine) 및 리포펙타스(lipofectace)가 포함된다.
본 개시 내용의 일 구현예는 본원에 기재된 적어도 하나의 분자의 제어 방출을 제공하는 리포솜을 포함하는 전달 시스템을 고려한다. 바람직하게는, 제어 방출이 가능한 리포솜은: i) 생분해성이며 독성이 없고; ii) 수용성 및 지용성 화합물을 모두 운반하고; iii) 다루기 힘든 화합물을 가용화하고; iv) 화합물 산화를 방지하고; v) 단백질 안정화를 촉진하고; vi) 수화를 제어하고; vii) 지방산 사슬 길이, 지방산 지질 조성물, 포화 및 불포화 지방산의 상대적인 양, 물리적 배열과 같은 그러나 이에 제한되지 않는 이중층 조성물의 변화에 의해 화합물 방출을 제어하고; viii) 용매 의존성을 갖고; ix) pH 의존성을 갖고 x) 온도 의존성을 갖는다.
리포솜의 조성은 크게 두 가지로 분류된다. 기존의 리포솜은 일반적으로 당지질을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 합성 동일쇄 인지질을 포함할 수 있는 안정화된 천연 레시틴(PC)의 혼합물이다. 특수 리포솜은: i) 양극성 지방산; ii) 조직 표적화 요법을 위한 항체 부착 능력; iii) 지단백질 및 탄수화물과 같은(그러나 이에 한정되지 않는) 물질로 코팅됨; iv) 다중 캡슐화 및 v) 에멀션 호환성을 포함할 수 있다.
리포솜은 초음파 처리 및 진동과 같은(그러나 이에 한정되지 않는) 방법으로 실험실에서 쉽게 만들 수 있다. 대안적으로, 화합물 전달 리포솜은 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, Collaborative Laboratories, Inc.는 특정 전달 요구 사항을 위해 맞춤 설계된 리포솜을 제조하는 것으로 알려져 있다.
C. 마이크로스피어, 미세입자 및 마이크로캡슐
마이크로스피어 및 마이크로캡슐은 일반적으로 균일한 분포를 유지하고 안정하게 제어된 화합물 방출을 제공하고 생산 및 분배하기에 경제적인 능력으로 인해 유용하다. 바람직하게는, 관련된 전달 겔 또는 화합물이 함침된(compound-impregnated) 겔은 투명하거나, 대안적으로 상기 겔은 의료진이 쉽게 볼 수 있도록 착색되어 있다.
마이크로스피어는 상업적으로 입수가능하다(Prolease™, Alkerme’s: Cambridge, Mass.). 예를 들어, 적어도 하나의 치료제를 포함하는 동결 건조 매질을 적합한 용매에서 균질화하고 분무하여 20 내지 90㎛ 범위의 마이크로스피어를 제조한다. 이어서 정제, 캡슐화 및 저장 단계 동안 지속 방출 무결성을 유지하는 기술을 따른다. 문헌[Scott et al., Improving Protein Therapeutics With Sustained Release Formulations, Nature Biotechnology, Volume 16:153-157 (1998)]을 참조한다. 생분해성 중합체의 사용에 의한 마이크로스피어 조성물의 변형은 핵산 방출 속도를 제어하는 능력을 제공할 수 있다. 문헌[Miller et al., Degradation Rates of Oral Resorbable Implants {Polylactates and Polyglycolates: Rate Modification and Changes in PLA/PGA Copolymer Ratios, J. Biomed. Mater. Res., Vol. 11:711-719 (1977)]을 참조한다.
대안적으로, 생분해성 중합체 금속염의 유기 용매 용액이 먼저 제조되는 수중 건조 방법을 사용하여 지속 또는 제어 방출 마이크로스피어 제조용 물질을 제조한다. 이어서, 상기 생분해성 중합체 금속염 용액에 용해 또는 분산된 핵산 매질을 첨가한다. 핵산 대 생분해성 중합체 금속염의 중량비는 예를 들어 약 1:100000 내지 약 1:1, 바람직하게는 약 1:20000 내지 약 1:500, 보다 바람직하게는 약 1:10000 내지 약 1:500일 수 있다. 다음으로, 생분해성 중합체 금속염과 핵산을 함유하는 유기용매 용액을 수상에 부어 유/수(oil/water) 에멀션을 제조한다. 그런 다음 오일상의 용매를 증발시켜 마이크로스피어를 제공한다. 마지막으로 이러한 마이크로스피어를 회수하고 세척하고 동결 건조한다. 그 후, 마이크로스피어를 감압 하에 가열하여 잔류 물 및 유기 용매를 제거할 수 있다.
생분해성 중합체 금속염 및 핵산 혼합물과 호환되는 마이크로스피어를 생산하는 데 유용한 다른 방법은: i) 코아세르베이트제의 점진적인 첨가 동안 상 분리; ii) 입자 덩어리 응집을 방지하기 위해 항응집제를 첨가하는 수중 건조 방법 또는 상 분리 방법 및 iii) 분무 건조 방법에 의한 것이 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 대략 1일 내지 6개월의 기간 동안 핵산의 제어 방출을 전달할 수 있는 마이크로스피어 또는 마이크로캡슐을 포함하는 배지를 고려한다. 일 구현예에서, 마이크로스피어 또는 미세입자는 의사가 매질이 분배될 때 매질을 명확하게 볼 수 있도록 착색될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 마이크로스피어 또는 마이크로캡슐은 투명할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 마이크로스피어 또는 미세입자는 방사선 불투과성 형광 염료로 함침된다.
제어 방출 마이크로캡슐은 원심 압출, 팬 코팅 및 에어 서스펜션과 같은 공지된 캡슐화 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 이러한 마이크로스피어 및/또는 마이크로캡슐은 원하는 방출 속도를 달성하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Oliosphere™(Macromed)는 제어 방출 마이크로스피어 시스템이다. 이러한 특정 마이크로스피어는 5-500μm 범위의 균일한 크기로 제공되며 생체 적합성 및 생분해성 중합체로 구성된다. 마이크로스피어의 특이적인 중합체 조성물은 버스트 효과(burst effect)의 효과적인 관리를 포함하여 맞춤형으로 설계된 마이크로스피어가 가능하도록 핵산 방출 속도를 제어할 수 있다. ProMaxx™(Epic Therapeutics, Inc.)는 단백질-매트릭스(protein-matrix) 전달 시스템이다. 이 시스템은 본질적으로 수성이며 표준 제약 전달 모델에 적용할 수 있다. 특히, ProMaxx™는 소형 및 거대 분자 약물을 모두 전달하는 생체침식성 단백질(bioerodible protein) 마이크로스피어이며, 마이크로스피어 크기와 원하는 방출 특성 모두에 대해 맞춤화할 수 있다.
일 구현예에서, 마이크로스피어 또는 미세입자는 내부 장간막의 pH보다 낮은 pH에서 안정한 pH 민감성 캡슐화 물질을 포함한다. 내부 장간막의 일반적인 범위는 pH 7.6에서 pH 7.2이다. 따라서 마이크로캡슐은 pH 7 미만으로 유지되어야 한다. 그러나 pH 가변성이 예상되는 경우 마이크로캡슐의 용해에 필요한 다양한 pH 기준에 따라 pH 민감성 물질을 선택할 수 있다. 따라서 캡슐화된 핵산은 용해가 필요한 pH 환경에 대해 선택되고 안정성을 유지하기 위해 미리 선택된 pH에 저장된다. 캡슐화제로서 유용한 pH 민감성 물질의 예는 Eudragit™ L-100 또는 S-100(Rohm GMBH), 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 및 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트가 있다. 일 구현예에서, 지질은 마이크로캡슐의 내부 코팅을 포함한다. 이들 조성에서, 이러한 지질은 지방산 및 헥시티올 무수물의 부분 에스테르, 및 트리글리세리드와 같은 식용 지방일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 문헌[Lew C. W., Controlled-Release pH Sensitive Capsule And Adhesive System And Method. 미국 특허 번호 제5,364,634호]을 참조한다(본원에 참조로 포함됨).
일 구현예에서, 본 발명은 젤라틴, 또는 젤라틴과 유사한 전하 밀도를 갖는 다른 중합체성 양이온(즉, 폴리-L-리신)을 포함하는 미세입자를 고려하고, 이는 1차 미세입자를 형성하기 위한 복합체로서 사용된다. 1차 미세입자는 다음 조성: i) 젤라틴(60 블룸, 돼지 피부의 A형), ii) 콘드로이틴 4-설페이트(0.005%-0.1%), iii) 글루타르알데히드(25%, 등급 1), 및 iv) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염(EDC 염산염), 및 초순수 수크로스(ultra-pure sucrose)의 홉합물로 생성된다(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). 젤라틴의 출처는 중요하지 않으며, 소, 돼지, 인간 또는 기타 동물 출처에서 유래할 수 있다. 일반적으로 중합 양이온은 19,000-30,000 돌턴 사이이다. 그런 다음 황산 콘드로이틴을 황산나트륨 또는 코아세르베이션제로서 에탄올과 함께 복합체에 첨가한다.
미세입자의 형성 후, 핵산은 미세입자의 표면에 직접 결합되거나 “가교” 또는 “스페이서”를 사용하여 간접적으로 부착된다. 젤라틴 리신 기의 아미노 기는 화합물의 직접적인 결합 부위를 제공하기 위해 쉽게 유도된다. 대안적으로, 아비딘-비오틴과 같은 스페이서(즉, 표적 리간드 상의 연결 분자 및 유도체화 모이어티)는 표적 리간드를 미세입자에 간접적으로 결합하는 데에도 유용하다. 미세입자의 안정성은 EDC 염산염에 의해 유도된 글루타르알데히드-스페이서 가교의 양에 의해 제어된다. 제어 방출 매질은 또한 글루타르알데히드-스페이서 가교의 최종 밀도에 의해 경험적으로 결정된다.
일 구현예에서, 본 발명은 피브리노겐 또는 트롬빈을 포함하는 조성물을 핵산으로 분무 건조함으로써 형성된 미세입자를 고려한다. 바람직하게는, 이들 미세입자는 가용성이고 선택된 단백질(즉, 피브리노겐 또는 트롬빈)은 미세입자의 벽을 생성한다. 결과적으로, 핵산은 미세입자의 단백질 벽 내부와 그 사이에 통합된다. 문헌[Heath et al., Microparticles And Their Use In Wound Therapy. 미국 특허 번호 제6,113,948호]을 참조한다(본원에 참조로 포함됨). 살아있는 조직에 미세입자를 적용한 후, 피브리노겐과 트롬빈 사이의 후속 반응은 조직 밀봉재(tissue sealant)를 생성하여 통합된 화합물을 바로 주변 영역으로 방출한다.
당업자는 마이크로스피어의 형태가 정확히 구형일 필요는 없음을 이해할 것이며; 수술 부위(즉, 개방 또는 폐쇄된) 안으로 또는 수술 부위 상에 분무되거나 퍼질 수 있는 매우 작은 입자로서만 가능하다. 일 구현예에서, 미세입자는 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드 및 락타이드/글리콜라이드의 공중합체(PLGA), 히알루론산, 변형된 다당류 및 기타 잘 알려진 물질로 구성된 군에서 선택되는 생체적합성 및/또는 생분해성 물질로 구성된다.
V. 단백질 조성물
CIRT 융합 단백질, 안정화제 폴리펩타이드, 링커, RNA 헤어핀 결합 도메인, NES, RNA 조절 도메인, 태그, NLS, RNA 표적화 분자, RNA 표적화 분자의 헤어핀 영역, 나선 영역, 또는 RNA 표적화 분자의 표적화 영역과 같은, 본 개시 내용의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 변이체 아미노산 또는 핵산 치환을 포함할 수 있거나 또는 서열번호: 1 내지 132의 적어도, 또는 최대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1000개 이상의 인접 아미노산 또는 핵산, 또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위와 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 유사하거나, 동일하거나 또는 상동성일 수 있다.
CIRT 융합 단백질, 안정화제 폴리펩타이드, 링커, RNA 헤어핀 결합 도메인, NES, RNA 조절 도메인, 태그, NLS, RNA 표적화 분자, RNA 표적화 분자의 헤어핀 영역, 나선 영역, 또는 RNA 표적화 분자의 표적화 영역과 같은, 본 개시 내용의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 1 내지 132의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1000개 이상의 인접 아미노산 또는 핵산, 또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호: 87 내지 106 또는 128 내지 132의 아미노산 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 또는 615개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호: 87 내지 106 또는 128 내지 132의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 또는 615개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위) 인접 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호: 87 내지 106 또는 128 내지 132 중 하나와 적어도, 최대, 또는 정확히 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 유사한, 동일한, 또는 상동성인, 서열번호: 87 내지 106 또는 128 내지 132의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 또는 615개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위) 인접 아미노산을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드는 서열번호: 5, 19, 또는 20의 아미노산 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 또는 90개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드는 서열번호: 5, 19, 또는 20의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 또는 90개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위) 인접 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 안정화제 폴리펩타이드는 서열번호: 5, 19, 또는 20 중 하나와 적어도, 최대, 또는 정확히 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 유사한, 동일한, 또는 상동성인, 서열번호: 5, 19, 또는 20의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 또는 90개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위) 인접 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인은 서열번호: 7 또는 18의 아미노산 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 또는 102개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인은 서열번호: 7 또는 18의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 또는 102개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위) 인접 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 헤어핀 결합 도메인은 서열번호: 7 또는 18 중 하나와 적어도, 최대, 또는 정확히 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 유사한, 동일한, 또는 상동성인, 서열번호: 7 또는 18의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 또는 102개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위) 인접 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 서열번호: 9, 11, 15 내지 17, 또는 123 내지 125의 아미노산 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 또는 364개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 서열번호: 9, 11, 15 내지 17, 또는 123 내지 125의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 또는 364개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위) 인접 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 서열번호: 1 내지 132 중 어느 하나의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 또는 615에서 시작하고 서열번호: 1 내지 132 중 어느 하나의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 또는 615개 인접 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하는 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 있다.
일부 구현예에서, RNA 조절 도메인은 서열번호: 9, 11, 15 내지 17, 또는 123 내지 125 중 하나와 적어도, 최대, 또는 정확히 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 유사한, 동일한, 또는 상동성인, 서열번호: 9, 11, 15 내지 17, 또는 123 내지 125의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 또는 364개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위) 인접 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 표적화 분자의 헤어핀 구조, 예컨대 줄기, 루프 또는 줄기 및 루프 둘 모두는 서열번호: 1, 2, 26, 28, 또는 83 내지 86의 핵산 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 또는 43개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 표적화 분자의 헤어핀 구조, 예컨대 줄기, 루프 또는 줄기 및 루프 둘 모두는 서열번호: 1, 2, 26, 28, 또는 83 내지 86의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 또는 43개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위) 인접 핵산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 표적화 분자의 헤어핀 구조, 예컨대 줄기, 루프 또는 줄기 및 루프 둘 모두는 서열번호: 1, 2, 26, 28, 또는 83 내지 86 중 하나와 적어도, 최대, 또는 정확히 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 유사한, 동일한, 또는 상동성인, 서열번호: 1, 2, 26, 28, 또는 83 내지 86의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 또는 43개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위) 인접 핵산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 표적화 영역 또는 RNA 표적화 분자는 서열번호: 30 내지 62의 핵산 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 표적화 영역 또는 RNA 표적화 분자는 서열번호: 30 내지 62의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위) 인접 핵산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 표적화 영역 또는 RNA 표적화 분자는 서열번호: 30 내지 62 중 하나와 적어도, 최대, 또는 정확히 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 유사한, 동일한, 또는 상동성인, 서열번호: 30 내지 62의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개(또는 여기에 속하는 임의의 추론가능한 범위) 인접 핵산을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 안정화제 폴리펩타이드는 내인성 단백질에 대한 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 하나 이상의 치환을 가질 수 있다. 일부 측면에서, 안정화제 폴리펩타이드는 내인성 단백질에 대한 활성을 감소시키거나 또는 제거하는 하나 이상의 치환을 가질 수 있다.
본 개시 내용의 폴리펩타이드 및 핵산, 예컨대 CIRT 융합 단백질, 안정화제 폴리펩타이드, 링커, RNA 헤어핀 결합 도메인, NES, RNA 조절 도메인, 태그, NLS, RNA 표적화 분자, RNA 표적화 분자의 헤어핀 영역, 나선 영역 , 또는 RNA 표적화 분자의 표적화 영역은 적어도, 최대, 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 또는 615개 치환을 포함할 수 있다.
상기 치환은 서열번호: 1 내지 132 중 하나의 아미노산 위치 또는 핵산 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 또는 615에 있을 수 있다.
치환 변이체는 일반적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 하나의 아미노산을 다른 것으로 교환하는 것을 포함하고, 다른 기능 또는 특성의 손실이 있거나 또는 없는 상태로, 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적일 수 있는데, 즉, 하나의 아미노산이 유사한 모양과 전하를 갖는 아미노산으로 대체된다. 보존적 치환은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 리신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파르테이트로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 리신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 교체를 포함한다. 대안적으로, 치환은 폴리펩타이드의 기능 또는 활성이 영향을 받도록 비보존적일 수 있다. 비보존적 교체는 일반적으로 극성 또는 전하를 띤 아미노산을 비극성 또는 전하를 띠지 않는 아미노산으로 또는 그 반대로와 같이 화학적으로 유사하지 않은 것으로 잔기를 치환하는 것을 포함한다.
단백질은 재조합되거나 시험관 내에서 합성될 수 있다. 대안적으로, 비재조합 또는 재조합 단백질은 박테리아로부터 단리될 수 있다. 이러한 변이체를 함유하는 박테리아가 조성물 및 방법에서 구현될 수 있음이 또한 고려된다. 따라서 단백질을 단리할 필요가 없다.
용어 “기능적으로 등가인 코돈”은 아르기닌 또는 세린에 대한 6개의 코돈과 같이 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈을 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 또한 생물학적으로 등가인 아미노산을 암호화하는 코돈을 지칭한다.
또한 아미노산 및 핵산 서열은 각각 추가 N- 또는 C-말단 아미노산, 또는 5’ 또는 3’ 서열과 같은 추가 잔기를 포함할 수 있고, 상기 서열이 단백질 발현이 관련된 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함하여 상기 제시된 기준을 충족하는 한, 여전히 본질적으로 본원에 개시된 서열 중 하나에 제시된 바와 같을 수 있음이 이해될 것이다. 말단 서열의 추가는 특히, 예를 들어 코딩 영역의 5’ 또는 3’ 부분 중 하나에 인접하는 다양한 비-코딩 서열을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용된다.
다음은 등가이거나 개선된 2세대 분자를 생성하기 위해 단백질의 아미노산을 교체하는 것에 기반한 논의이다. 예를 들어, 특정 아미노산은 상호작용 결합 능력의 상당한 손실 없이 단백질 구조의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 효소 촉매 도메인 또는 상호작용 성분과 같은 구조는 이러한 기능을 유지하기 위해 치환된 아미노산을 가질 수 있다. 단백질의 생물학적 기능적 활성을 정의하는 것은 단백질의 상호작용 능력과 성질이기 때문에, 단백질 서열과 그 기본 DNA 코딩 서열에서 특정 아미노산 치환이 이루어질 수 있지만 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 가진 단백질을 생성할 수 있다. 따라서 본 발명자들은 생물학적 유용성 또는 활성의 상당한 손실 없이 유전자의 DNA 서열에 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 고려한다.
다른 구현예에서, 폴리펩타이드의 기능의 변경은 하나 이상의 치환을 도입함으로써 의도된다. 예를 들어, 특정 아미노산은 상호작용 성분의 상호작용 결합 능력을 변경하기 위한 의도로 단백질 구조의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 단백질 상호작용 도메인, 핵산 상호작용 도메인, 및 촉매 부위와 같은 구조는 이러한 기능을 변경하기 위해 치환된 아미노산을 가질 수 있다. 단백질의 생물학적 기능적 활성을 정의하는 것은 단백질의 상호작용 능력과 성질이기 때문에, 단백질 서열과 그 기본 DNA 코딩 서열에서 특정 아미노산 치환이 이루어질 수 있지만 그럼에도 불구하고 상이한 특성을 가진 단백질을 생성할 수 있다. 따라서 본 발명자들은 생물학적 유용성 또는 활성의 상당한 변경이 있도록 유전자의 DNA 서열에 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 고려한다.
이러한 변경을 수행할 때 아미노산의 소수성 지표를 고려할 수 있다. 단백질에 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 지표의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다(Kyte and Doolittle, 1982). 아미노산의 상대적인 소수성 특성은 생성된 단백질의 2차 구조에 기여하고, 이는 결국 단백질과 다른 분자, 예를 들어 효소, 기질(substrate), 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호작용을 정의한다는 것이 인정된다.
유사 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있음이 또한 당업계에서 이해된다. 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제4,554,101호는 인접 아미노산의 친수성에 의해 좌우되는 단백질의 최대 로컬 평균 친수성이 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다고 기술하고 있다. 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 생물학적으로 등가이고 면역학적으로 등가인 단백질을 생성할 수 있는 것으로 이해된다.
위에서 약술한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기반으로 한다. 전술한 다양한 특성을 고려한 예시적인 치환은 잘 알려져 있으며 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 단백질의 전부 또는 일부는 또한 통상적인 기술에 따라 용액 내 또는 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 다양한 자동 합성기가 시판되고 있으며 공지된 프로토콜에 따라 사용할 수 있다. 예를 들어 각각 본원에 참조로 포함된 문헌[Stewart and Young, (1984); Tam et al., (1983); Merrifield, (1986); 및 Barany and Merrifield (1979)]을 참조 한다. 대안적으로, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 발현 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 세포로 형질전환되거나 형질주입되고, 발현에 적합한 조건 하에 배양되는 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다.
한 구현예는 단백질의 생산 및/또는 제시를 위한 미생물을 비롯한 세포로의 유전자 전달의 사용을 포함한다. 관심 단백질에 대한 유전자는 적절한 숙주 세포로 전달된 후 적절한 조건 하에서 세포 배양이 이루어질 수 있다. 사실상 모든 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 사용될 수 있다. 재조합 발현 벡터의 생성, 및 이에 포함된 요소들이 본원에서 논의된다. 대안적으로, 생산될 단백질은 단백질 생산에 사용되는 세포에 의해 정상적으로 합성되는 내인성 단백질일 수 있다.
VI. 서열
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GGS6 GGSGGSGGSGGSGGSGGS (서열번호: 6)
hADAR (299-701) E488Q LHLDQTPSRQPIPSEGLQLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGQGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTP (서열번호: 124)
NLS KRPAATKKAGQAKKKK (서열번호: 13)
GS
플래그 태그 DYKDDDDK (서열번호: 14)
CIRTS-9X b-디펜신 3 MGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK (서열번호: 20)
GGS6 GGSGGSGGSGGSGGSGGS (서열번호: 6)
TBP6.7 MAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFV (서열번호: 7)
NES GSLQLPPLERLTL (서열번호: 124)
GGS6 GGSGGSGGSGGSGGSGGS (서열번호: 6)
NYTHDF1 MSATSVDTQRTKGQDNKVQNGSLHQKDTVHDNDFEPYLTGQSNQSNSYPSMSDPYLSSYYPPSIGFPYSLNEAPWSTAGDPPIPYLTTYGQLSNGDHHFMHDAVFGQPGGLGNNIYQHRFNFFPENPAFSAWGTSGSQGQQTQSSAYGSSYTYPPSSLGGTVVDGQPGFHSDTLSKAPGMNSLEQGMVGLKIGDVSSSAVKTVGSVVSSVALTGVLSGNGGTNVNMPVSKPTSWAAIASKPAKPQPKMKTKSGPVMGGGLPPPPIKHNMDIGTWDNKGPVPKAPVPQQAPSPQAAPQPQQVAQPLPAQPPALAQPQYQSPQQPPQTRWVAPRNRNAAFGQSGGAGSDSNSPGNVQPNSAPSVES (서열번호: 15)
GS
플래그 태그 DYKDDDDK (서열번호: 14)
CIRTS-10X b-디펜신 3 MGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK (서열번호: 20)
GGS6 GGSGGSGGSGGSGGSGGS (서열번호: 6)
SLBP ADFETDESVLMRRQKQINYGKNTIAYDRYIKEVPRHLRQPGIHPKTPNKFKKYSRRSWDQQIKLWKVALHFWD (서열번호: 18)
NES LQLPPLERLTL (서열번호: 8)
GGS6 GGSGGSGGSGGSGGSGGS (서열번호: 6)
YTHDF2(101-200) MSASSLLEQRPKGQGNKVQNGSVHQKDGLNDDDFEPYLSPQARPNNAYTAMSDSYLPSYYSPSIGFSYSLGEAAWSTGGDTAMPYLTSYGQLSNGEPHFLPDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAA (서열번호: 17)
GS
플래그 태그 DYKDDDDK (서열번호: 14)
CIRTS-18X ORF5 MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEE (서열번호: 5)
GGS6 GGSGGSGGSGGSGGSGGS (서열번호: 6)
PP7 MAKTIVLAVGEATRTLTEIQSTADRQIFEEKVGPLVGRLRLTASLRQNGAKTAYRVNLKLDQADVVDASTSVAGELPKVRYTQVWSHDVTIVANSTEASRKSLYDLTKSLVATSQVEDLVVNLVPLGRSLEGGSGGMAKTIVLAVGEATRTLTEIQSTADRQIFEEKVGPLVGRLRLTASLRQNGAKTAYRVNLKLDQADVVDASTSVAGELPKVRYTQVWSHDVTIVANSTEASRKSLYDLTKSLVATSQVEDLVVNLVPLGRSLE (서열번호: 125)
NES LQLPPLERLTL (서열번호: 8)
GGS6 GGSGGSGGSGGSGGSGGS (서열번호: 6)
Y2(100-200) DAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAA (서열번호: 16)
GS
플래그 태그 DYKDDDDK (서열번호: 14)
본 연구에 사용된 gRNA 서열(모든 gRNA는 hU6 프로모터로부터 발현됨)
이름: 설명: DNA 서열
TBP-OT 26-51 TBP6.7 gRNA (TAR) GGCCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCC (서열번호: 26)
TTATT
표적외 l 파지 Tgacagcccacatggcattccacttatcactggcatcctt (서열번호: 27)
SLBP-OT 24-18 SLBP gRNA CCAAAGGCTCTTCTCAGAGCCACCCA (서열번호: 28)
TTATT
l 표적 GTGATAAGTGGAATGCCATG (서열번호: 29)
PP7-NT PP7 비-표적화 gRNA l 파지 TAAGGAGTTTATATGGAAACCCTTA (서열번호: 121)
TTATT
l 파지 GTGATAAGTGGAATGCCATG (서열번호: 122)
gRNA 가이드 서열분석; 모두 TBP-OT와 동일한 hU6 프로모터에 의해 발현됨
표적 이름: 가이드 서열: 도면:
플루시페라아제-40 18-20 caggtcgactctagactcgaggctagcgagctcgtttaaa (서열번호: 30) 3
PPIB 23-26 cttggtgctctccaccttccgcaccacctccatgccctct (서열번호: 31) 4
SMARCA4 23-25 ccgatgcggtgggctcggtcctgcgcttgcaggtcctggt (서열번호: 32) 4
NFKB1 22-67 gcctccaccagctctctgactgtacccccagagacctcat (서열번호: 33) 4
NRAS 25-30 aagcatcttcaacaccctgtctggtcttggctgaggtttc (서열번호: 34) 4
B4GALTN1 24-50 cttcgcaccgcagcgcagcgcggctcagctcccggctcgt (서열번호: 35) 4
플루시페라아제-20 CTAGACTCGAGGCTAGCGAG (서열번호: 36) 8
플루시페라아제-30 CGACTCTAGACTCGAGGCTAGCGAGCTCGT (서열번호: 37) 8
KRAS-2 22-45 cttgtggtagttggagctga (서열번호: 116) 25B
KRAS-3 22-53 agttggagctgatggcgtag (서열번호: 117) 25B
KRAS-4 22-54 gttggagctgatggcgtagg (서열번호: 118) 25B
KRAS-5 22-65 tggcgtaggcaagagtgcct (서열번호: 119) 25B
KRAS-6 22-66 ggcgtaggcaagagtgcctt (서열번호: 120) 25B
SMARCA4-1 27-67 ggccctggcccttcccctggagccatgctgggccctagcc (서열번호: 38) 11C
SMARCA4-2 27-71 gcccaaccccatttaaccagaaccagctgcaccagctcag (서열번호: 39) 11C
SMARCA4-3 27-74 cctcccaagccctggcctgaaggacccatggcgaatgctg (서열번호: 40) 11C
SMARCA4-4 27-75 cgtcccacccgccgcctcgcccgtgatgccaccgcagacc (서열번호: 41) 11C
SMARCA4-5 27-78 ggaggtggtggtgtgcatgcggagggacacagcgctggag (서열번호: 42) 11C
SMARCA4-6 27-80 Tcacaggcaaaatccagaagctgaccaaggcagtggccac (서열번호: 43) 11C
SMARCA4-7 27-81 catggctgaagatgaggaggggtaccgcaagctcatcgac (서열번호: 44) 11C
SMARCA4-8 28-02 ctctggacgagaccagccagatgagcgacctcccggtgaa (서열번호: 45) 11C
SMARCA4-9 28-04 cccaccctgcccgtggaggagaagaagaagattccagatc (서열번호: 46) 11C
SMARCA4-10 28-05 aatatggcgtgtcccaggcccttgcacgtggcctgcagtc (서열번호: 47) 11C
SMARCA4-11 28-07 ctcatcacgtacctcatggagcacaaacgcatcaatgggc (서열번호: 48) 11C
SMARCA4-12 28-08 tggtgaaggtgtcttacaagggatccccagcagcaagacg (서열번호: 49) 11C
SMARCA4-13 28-10 accccgccgcctgctgctgacgggcacaccgctgcagaac (서열번호: 50) 11C
SMARCA4-14 28-11 cagtggtttaacgcaccctttgccatgaccggggaaaagg (서열번호: 51) 11C
SMARCA4-15 28-12 acgactcaagaaggaagtcgaggcccagttgcccgaaaag (서열번호: 52) 11C
SMARCA4-16 28-13 gtgctgctgactgatggctccgagaaggacaagaagggca (서열번호: 53) 11C
SMARCA4-17 28-16 ggaaccacgaaggcggaggaccggggcatgctgctgaaaa (서열번호: 54) 11C
SMARCA4-18 28-17 tccagtcggcagacactgtgatcatttttgacagcgactg (서열번호: 55) 11C
SMARCA4-19 28-20 cgccagcgggcgtcaaccccgacttggaggagccacctct (서열번호: 56) 11C
SMARCA4-20 28-22 gcggaggtggagcggctgacctgtgaggaggaggaggaga (서열번호: 57) 11C
SMARCA4-21 28-26 tgatcaagtacaaggacagcagcagtggacgtcagctcag (서열번호: 58) 11C
SMARCA4-22 28-27 cttcaagaagataaaggagcgcattcgcaaccacaagtac (서열번호: 59) 11C
SMARCA4-23 28-30 agggtcccgagccaagccggtcgtgagtgacgatgacagt (서열번호: 60) 11C
SMARCA4-24 28-32 tatttatacagcagagaagctgtaggactgtttgtgactg (서열번호: 61) 11C
SMARCA4-25 28-33 ggggaacacacgatacctgtttttcttttccgttgctggc (서열번호: 62) 11C
시험관 내 특성화에 사용되는 RNA 올리고뉴클레오타이드:
유전자 이름: 올리고 이름: 순방향: 도면:
R1 EMSA에 대한 ssRNA 표적 ATAGGCCAGTGAATTCGAGCTCGAATATGGATTACTTGGTAGAACAGCAATCTACGCCGGAAGCATAAAG (서열번호: 63) 2A
R2 절단 분석에 대한 ssRNA 표적 GGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAAATATGGATTACTTGGTAGAACAGCAATCTACTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAG (서열번호: 64) 2C
R3 EMSA에 대한 gRNA GGCCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCCCagccaccacccacagagccgccaccaga (서열번호: 65) 2A
R4 절단 분석에 대한 gRNA GGCCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCCCTAGATTGCTGTTCTACCAAGTAATCCAT (서열번호: 66) 2C
qPCR 프라이머:
유전자 이름: 순방향: 서열 번호: 역방향: 서열 번호:
GAPDH GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 67 ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA 68
PPIB AACGCAGGCAAAGACACCAACG 69 TCTGTCTTGGTGCTCTCCACCT 70
플루시페라아제 AGGTTACAACCGCCAAGAAGC 71 ATGAGAATCTCGCGGATCTTG 72
PPIB AACGCAGGCAAAGACACCAACG 73 TCTGTCTTGGTGCTCTCCACCT 74
NFKB1 gcagcactacttcttgaccacc 75 tctgctcctgagcattgacgtc 76
NRAS gaaacctcagccaagaccagac 77 ggcaatcccatacaaccctgag 78
B4GALTN1 tgaggctgctttcactatccgc 79 gaggaaggtcttggtggcaatc 80
SMARCA4 caaagacaagcacatcctcgcc 81 gccacatagtgcgtgttgagca 82
MALAT1 gaagaaggaaggagcgctaa 126 cctgctaccttcatcaccaa 127
RNA 헤어핀 구조: GGCGUCCCUCCCGAAGCUGCGCGCUCGGUCGAACAGGACGACC(서열번호: 83)
뉴클레오린 인식 서열: UCCCGA (서열번호: 84).
RNA 헤어핀 구조: GGCCGAAAUCCCGAAUGAGGCC (서열번호: 85) 및 GGAUGCCUCCCGAGUGCAUCC (서열번호: 86).
이름: 설명: 폴리펩타이드 서열
CIRTS-0 ORF5-TBP6.7-GGS6-데드 Pin 도메인 MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSMELEIRPLFLVPDTNGFIDHLASLARLLESRKYILVVPLIVINELDGLAKGQETDHRAGGYARVVQEKARKSIEFLEQRFESRDSCLRALTSRGNELESIAFRSEDITGQLGNNADLILSCCLHYCKDKAKDFMPASKEEPIRLLREVVLLTDDRNLRVKALTRNVPVRDIPAFLTWAQVGGSDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK (서열번호: 87)
CIRTS-1 ORF5-TBP6.7-GGS6-Pin 도메인-NLS MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGGSGGSGGSGGSGGSGGSMELEIRPLFLVPDTNGFIDHLASLARLLESRKYILVVPLIVINELDGLAKGQETDHRAGGYARVVQEKARKSIEFLEQRFESRDSCLRALTSRGNELESIAFRSEDITGQLGNNDDLILSCCLHYCKDKAKDFMPASKEEPIRLLREVVLLTDDRNLRVKALTRNVPVRDIPAFLTWAQVGKRPAATKKAGQAKKKKGSDYKDDDDK (서열번호: 88)
CIRTS-2 ORF5-TBP6.7-GGS6-NYTHDF1 MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSMSATSVDTQRTKGQDNKVQNGSLHQKDTVHDNDFEPYLTGQSNQSNSYPSMSDPYLSSYYPPSIGFPYSLNEAPWSTAGDPPIPYLTTYGQLSNGDHHFMHDAVFGQPGGLGNNIYQHRFNFFPENPAFSAWGTSGSQGQQTQSSAYGSSYTYPPSSLGGTVVDGQPGFHSDTLSKAPGMNSLEQGMVGLKIGDVSSSAVKTVGSVVSSVALTGVLSGNGGTNVNMPVSKPTSWAAIASKPAKPQPKMKTKSGPVMGGGLPPPPIKHNMDIGTWDNKGPVPKAPVPQQAPSPQAAPQPQQVAQPLPAQPPALAQPQYQSPQQPPQTRWVAPRNRNAAFGQSGGAGSDSNSPGNVQPNSAPSVESGSDYKDDDDK (서열번호: 89)
CIRTS-3t ORF5-TBP6.7-GGS6-YTHDF2 (100-200) MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 90)
CIRTS-3 ORF5-TBP6.7-GGS6-YTHDF2 (1-200) MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSMSASSLLEQRPKGQGNKVQNGSVHQKDGLNDDDFEPYLSPQARPNNAYTAMSDSYLPSYYSPSIGFSYSLGEAAWSTGGDTAMPYLTSYGQLSNGEPHFLPDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 91)
CIRTS-4t ORF5-SLBP-GGS6-YTHDF2 (100-200) MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSADFETDESVLMRRQKQINYGKNTIAYDRYIKEVPRHLRQPGIHPKTPNKFKKYSRRSWDQQIKLWKVALHFWDLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 92)
CIRTS-4 ORF5-SLBP-GGS6-YTHDF2 (1-200) MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSADFETDESVLMRRQKQINYGKNTIAYDRYIKEVPRHLRQPGIHPKTPNKFKKYSRRSWDQQIKLWKVALHFWDLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSMSASSLLEQRPKGQGNKVQNGSVHQKDGLNDDDFEPYLSPQARPNNAYTAMSDSYLPSYYSPSIGFSYSLGEAAWSTGGDTAMPYLTSYGQLSNGEPHFLPDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 93)
CIRTS-5t HBEGF-TBP6.7-GGS6-YTHDF2 (100-200) MRVTLSSKPQALATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCHGLSGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 94)
CIRTS-5 HBEGF-TBP6.7-GGS6-YTHDF2 (1-200) MRVTLSSKPQALATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCHGLSGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSMSASSLLEQRPKGQGNKVQNGSVHQKDGLNDDDFEPYLSPQARPNNAYTAMSDSYLPSYYSPSIGFSYSLGEAAWSTGGDTAMPYLTSYGQLSNGEPHFLPDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 95)
CIRTS-6t b-디펜신-TBP6.7-GGS6-YTHDF2 (100-200) MGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKKGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 96)
CIRTS-6 b-디펜신-TBP6.7-GGS6-YTHDF2 (1-200) MGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKKGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSMSASSLLEQRPKGQGNKVQNGSVHQKDGLNDDDFEPYLSPQARPNNAYTAMSDSYLPSYYSPSIGFSYSLGEAAWSTGGDTAMPYLTSYGQLSNGEPHFLPDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 97)
CIRTS-7 b-디펜신-SLBP-GGS6-YTHDF2 (1-200) MGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKKGGSGGSGGSGGSGGSGGSADFETDESVLMRRQKQINYGKNTIAYDRYIKEVPRHLRQPGIHPKTPNKFKKYSRRSWDQQIKLWKVALHFWDLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSMSASSLLEQRPKGQGNKVQNGSVHQKDGLNDDDFEPYLSPQARPNNAYTAMSDSYLPSYYSPSIGFSYSLGEAAWSTGGDTAMPYLTSYGQLSNGEPHFLPDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 98)
CIRTS-8 TBP6.7-GGS6-Pin 도메인-NES MAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSMELEIRPLFLVPDTNGFIDHLASLARLLESRKYILVVPLIVINELDGLAKGQETDHRAGGYARVVQEKARKSIEFLEQRFESRDSCLRALTSRGNELESIAFRSEDITGQLGNNDDLILSCCLHYCKDKAKDFMPASKEEPIRLLREVVLLTDDRNLRVKALTRNVPVRDIPAFLTWAQVGGSDYKDDDDK (서열번호: 99)
CIRTS-9 ORF5-TBP6.7-GGS6-Pin 도메인-NES MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSMELEIRPLFLVPDTNGFIDHLASLARLLESRKYILVVPLIVINELDGLAKGQETDHRAGGYARVVQEKARKSIEFLEQRFESRDSCLRALTSRGNELESIAFRSEDITGQLGNNDDLILSCCLHYCKDKAKDFMPASKEEPIRLLREVVLLTDDRNLRVKALTRNVPVRDIPAFLTWAQVGGSDYKDDDDK (서열번호: 100)
CIRTS-10 ORF5-TBP6.7-GGS3-Pin 도메인 MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSMELEIRPLFLVPDTNGFIDHLASLARLLESRKYILVVPLIVINELDGLAKGQETDHRAGGYARVVQEKARKSIEFLEQRFESRDSCLRALTSRGNELESIAFRSEDITGQLGNNDDLILSCCLHYCKDKAKDFMPASKEEPIRLLREVVLLTDDRNLRVKALTRNVPVRDIPAFLTWAQVGGSDYKDDDDK (서열번호: 101)
CIRTS-11 ORF5-TBP6.7-L8-Pin 도메인 MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLSGSETPGTSESATPESMELEIRPLFLVPDTNGFIDHLASLARLLESRKYILVVPLIVINELDGLAKGQETDHRAGGYARVVQEKARKSIEFLEQRFESRDSCLRALTSRGNELESIAFRSEDITGQLGNNDDLILSCCLHYCKDKAKDFMPASKEEPIRLLREVVLLTDDRNLRVKALTRNVPVRDIPAFLTWAQVGGSDYKDDDDK (서열번호: 102)
CIRTS-12 ORF5-TBP6.7-나선-Pin 도메인-NES MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGEEEEKKKQQEEEAERLRRIQEEMEKERKRREEDEQRRRKEEEERRMKLEMEAKRKQEEEERKKREDDEKRKKKGSGGSMELEIRPLFLVPDTNGFIDHLASLARLLESRKYILVVPLIVINELDGLAKGQETDHRAGGYARVVQEKARKSIEFLEQRFESRDSCLRALTSRGNELESIAFRSEDITGQLGNNDDLILSCCLHYCKDKAKDFMPASKEEPIRLLREVVLLTDDRNLRVKALTRNVPVRDIPAFLTWAQVGGSDYKDDDDK (서열번호: 103)
CIRTS-13 ORF5-TBP6.7-L8-Y2(100-200) MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLSGSETPGTSESATPESDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 104)
CIRTS-14 ORF5-TBP6.7-나선-Y2(100-200) MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGEEEEKKKQQEEEAERLRRIQEEMEKERKRREEDEQRRRKEEEERRMKLEMEAKRKQEEEERKKREDDEKRKKKGSGGSDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 105)
MBP-CIRTS-1 MBP-ORF5-TBP6.7-GGS6-데드 Pin 도메인 MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSMELEIRPLFLVPDTNGFIDHLASLARLLESRKYILVVPLIVINELDGLAKGQETDHRAGGYARVVQEKARKSIEFLEQRFESRDSCLRALTSRGNELESIAFRSEDITGQLGNNDDLILSCCLHYCKDKAKDFMPASKEEPIRLLREVVLLTDDRNLRVKALTRNVPVRDIPAFLTWAQVGSSGHHHHHH (서열번호: 106)
CIRTS-7X b-디펜신 3-TBP6.7-GGS6-hADAR(299-701) MGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKKGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGGSGGSGGSGGSGGSGGSLHLDQTPSRQPIPSEGLQLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTPKRPAATKKAGQAKKKKGSDYKDDDDK (서열번호: 128)
CIRTS-8X b-디펜신 3-TBP6.7-GGS6-hADAR (299-701) E488Q MGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKKGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGGSGGSGGSGGSGGSGGSLHLDQTPSRQPIPSEGLQLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGQGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTPKRPAATKKAGQAKKKKGSDYKDDDDK (서열번호: 129)
CIRTS-9X b-디펜신 3-SLBP-GGS6-NYTHDF1 MGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKKGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAVPETRPNHTIYINNLNSKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVPRQRTPRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDKRIPAKMKGTFVGSLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSMSATSVDTQRTKGQDNKVQNGSLHQKDTVHDNDFEPYLTGQSNQSNSYPSMSDPYLSSYYPPSIGFPYSLNEAPWSTAGDPPIPYLTTYGQLSNGDHHFMHDAVFGQPGGLGNNIYQHRFNFFPENPAFSAWGTSGSQGQQTQSSAYGSSYTYPPSSLGGTVVDGQPGFHSDTLSKAPGMNSLEQGMVGLKIGDVSSSAVKTVGSVVSSVALTGVLSGNGGTNVNMPVSKPTSWAAIASKPAKPQPKMKTKSGPVMGGGLPPPPIKHNMDIGTWDNKGPVPKAPVPQQAPSPQAAPQPQQVAQPLPAQPPALAQPQYQSPQQPPQTRWVAPRNRNAAFGQSGGAGSDSNSPGNVQPNSAPSVESGSDYKDDDDK (서열번호: 130)
CIRTS-10X b-디펜신 3-SLBP-GGS6-YTHDF2 (1-200) MGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKKGGSGGSGGSGGSGGSGGSADFETDESVLMRRQKQINYGKNTIAYDRYIKEVPRHLRQPGIHPKTPNKFKKYSRRSWDQQIKLWKVALHFWDLQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSMSASSLLEQRPKGQGNKVQNGSVHQKDGLNDDDFEPYLSPQARPNNAYTAMSDSYLPSYYSPSIGFSYSLGEAAWSTGGDTAMPYLTSYGQLSNGEPHFLPDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 131)
CIRTS-18X ORF5-PP7-Y2(100-200) MDDPSFLTGRSTYAKRRRARRMNVCKCGAILHNNKDCRSSTISGHKLDRLRFVKEGRVALEGETPVYRTWVKWVETEYHINILETSDDEEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMAKTIVLAVGEATRTLTEIQSTADRQIFEEKVGPLVGRLRLTASLRQNGAKTAYRVNLKLDQADVVDASTSVAGELPKVRYTQVWSHDVTIVANSTEASRKSLYDLTKSLVATSQVEDLVVNLVPLGRSLEGGSGGMAKTIVLAVGEATRTLTEIQSTADRQIFEEKVGPLVGRLRLTASLRQNGAKTAYRVNLKLDQADVVDASTSVAGELPKVRYTQVWSHDVTIVANSTEASRKSLYDLTKSLVATSQVEDLVVNLVPLGRSLELQLPPLERLTLGGSGGSGGSGGSGGSGGSDAMFGQPGALGSTPFLGQHGFNFFPSGIDFSAWGNNSSQGQSTQSSGYSSNYAYAPSSLGGAMIDGQSAFANETLNKAPGMNTIDQGMAAGSDYKDDDDK (서열번호: 132)
VII. 실시예들
하기 실시예들은 본 개시 내용의 바람직한 구현예를 설명하기 위해 포함된다. 하기 실시예들에 개시된 기술은 본 개시 내용의 실시에서 잘 기능하는 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시 내용에 비추어, 개시되는 특정 구현예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고 개시 내용의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 여전히 유사하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다.
실시예 1 - 인간 부분으로부터 구축된 프로그램 가능한 RNA-가이드 RNA 효과기 단백질
A. 도입
현재 RNA 표적화 시스템의 큰 크기와 미생물 유래 성질을 극복하기 위해, 본 발명자들은 프로그램 가능한 RNA 효과기 단백질을 조작하기 위한 일반적인 방법인 CRISPR/Cas-영감 RNA 표적화 시스템(CIRTS)을 제시한다. 본 발명자들은 CIRTS가 기능적 부분에 대한 인간 단백질체(proteome)를 채굴하여 프로그램 가능한 RNA 조절 단백질을 구축할 수 있음을 보여준다. CIRTS는 왓슨-크릭-프랭클린(Watson-Crick-Franklin) 염기쌍 상호작용을 사용하여 전사체에서 단백질 카고(protein cargo) 부위를 선택적으로 전달하는 리보핵산단백질 복합체이다. 본 발명자들은 분해를 위한 뉴클레아제, 분해를 위한 탈아데닐화 조절 기구, 또는 강화된 단백질 생산을 위한 번역 활성화 기구를 포함하는 전사체에 일정 범위 또는 조절 단백질을 전달하는 CIRTS를 쉽게 조작할 수 있음을 보여준다. 그러나 CIRTS는 현재 가장 작은 CRISPR/Cas 시스템보다 최대 5배 작으며 전적으로 인간 부분으로부터 조작될 수 있다.
본 발명자들은 최소 프로그램 가능한 RNA-표적화 시스템은 다음 성분들: 즉, (1) 시스템의 코어 역할을 하고 조작된 gRNA에 디스플레이되는 특정 RNA 구조에 대한 선택적 고친화성 결합제인 RNA 헤어핀 결합 단백질, (2) 조작된 헤어핀 결합 단백질과 상호작용하는 구조 및 관심 표적 RNA에 상보성을 갖는 서열 모두를 특징으로 하는 gRNA, 및 (3) 근접 의존적 방식으로 표적화된 RNA에 작용하는 뉴클레아제 또는 후성전사체 조절인자와 같은 효과기 단백질,을 필요로 할 것이라고 추론했다. 일부 구현예에서, 디스플레이된 gRNA 서열에 비특이적으로 결합하는 하전된 단백질은 표적 결합 전에 가이드 RNA를 안정화 및 보호하기 위해 사용된다. (도 1a). CIRTS는 조작된 시스템에서 이러한 기능을 수행하는 여러 단백질 도메인을 결합한다.
여기에서 본 발명자들은 CIRTS의 설계 및 검증을 제시한다. 먼저, 본 발명자들은 시험관 내 및 포유동물 세포 리포터 분석 최적화 및 검증 모두에 사용되는 프로그램 가능한 CIRTS 리보뉴클레아제를 조작했다. 그런 다음 본 발명자들은 gRNA, 헤어핀 결합 단백질, ssRNA 결합 단백질 및 CIRTS-1의 효과기 도메인을 포함하는 4가지 구성 부분 모두가 다른 부분으로 대체될 수 있으며 5개의 추가 CIRTS가 발생될 수 있음을 보임으로써 CIRTS의 다목적성을 보여준다(도 1b). 본 발명자들은 프로그램 가능한 m6A 판독기 단백질로서 조작된 CIRTS를 사용하여 분해 기구 및 번역 활성화를 포함하는 내인성 후성전사체 조절 경로를 표적화할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 CIRTS를 사용하여 근접-의존성 뉴클레아제-매개 붕괴, 비-뉴클레아제-매개 붕괴 또는 번역 활성화를 위해 내인성 전사물을 표적화할 수 있음을 보여준다. 마지막으로, 본 발명자들은 직교 CIRTS를 사용하여 여러 유전자를 동시에 표적화할 수 있음을 보여준다. 종합하면, 이 작업은 CIRTS 전략이 작고 인간 부분에서 결집된 RNA 효과기 단백질을 조작하기 위한 실행 가능한 새로운 접근 방식으로 검증한다.
B. 결과
1. CIRTS-1의 개발 및 시험관 내 검증
본 발명자의 1세대 시스템인 CIRTS-1의 경우, 본 발명자들은 HIV TAR 헤어핀에 결합하도록 이전에 조작되었고 내인성 인간 RNA 헤어핀 표적을 갖지 않는, 인간 헤어핀-결합 단백질 U1A 단백질(TBP6.7)의 진화된 버전을 사용했다(Blakeley and McNaughton, 2014; Crawford et al., 2016)(도 1b). 본 발명자들은 TAR 헤어핀 구조, 뉴클레오타이드 링커 서열(L) 및 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 설계했다(도 1c). 시스템을 개발하고 검증하기 위해, 본 발명자들은 먼저 TBP6.7을 이전에 비특이적 근접 의존적 RNA 엔도뉴클레아제로 사용된, 인간 SMG6의 Pin 뉴클레아제 도메인에 융합하여 프로그램 가능한 뉴클레아제를 조작했다(Batra et al., 2017; Choudhury et al., 2012). 이 가장 단순한 설계가 이미 세포 기반 분석에서 gRNA 매개 전사물 분해를 디스플레이했지만(도 9b, 왼쪽), 성능은 상당히 안 좋았고, 본 발명자들은 이를 디스플레이된 표적화 서열의 잠재적인 분해의 결과로 보았다. Cas13 시스템의 단백질 표면과 헤어핀 채널은 높게 하전되는 경향이 있어, 가이드 RNA 서열에 비특이적으로 결합하고 이를 안정화할 가능성이 있다(Liu et al., 2017). 이 RNA 보호 기능을 본 발명자의 시스템에 조작하기 위해, 본 발명자들은 단일 가닥 RNA에 대해 비특이적이고 낮은 친화성을 갖는 RNA 결합 단백질을 추가하는 것을 목표로 하였다. 그러나 인간 단백질 툴박스는 주해가 달린 작고 비특이적인 단일 가닥 RNA 결합 단백질을 쉽게 포함하지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 작은 바이러스 ssRNA 결합 단백질인 ORF5를 사용하여 CIRTS-1을 개발했다(Zhou et al., 2006). 전체적으로, CIRTS-1은 상응하는 gRNA와 함께 ORF5-TBP6.7-Pin 뉴클레아제 도메인의 단백질 융합 복합체로 구성된다(도 1a).
본 발명자들은 먼저 모델 RNA 표적 기질에 대한 시험관 내 CIRTS-1의 프로그램 가능한 RNA 결합 및 RNA 뉴클레아제 활성을 특성화하였다. 상기 뉴클레아제를 비활성화하기 위해 EDTA의 존재 하에 실행되는 전기영동 이동성 변화 분석(EMSA)에서 정제된 MBP-CIRTS-1 단백질 및 gRNA를 사용하여, 본 발명자들은 MBP-CIRTS-1이 105nM의 겉보기 KD로 gRNA-의존적 방식으로 표적 RNA에 결합함을 발견하였다(도 2a 및 2b). gRNA(도 7a) 또는 CIRTS-1 단백질(도 7b) 중 하나가 분석에서 제외되면, 측정 가능한 결합이 검출되지 않아, 시스템에서 설계된 바와 같이 gRNA-의존적 결합 모드가 확인된다. 또한, 절단 분석에서, 본 발명자들은 CIRTS-1이 gRNA- 및 Mn2+-의존적 방식으로 RNA 기질을 분해한다는 것을 발견하였다(도 2c). 종합적으로, 이러한 시험관 내 결과는 CIRTS-1 이면의 설계 원리를 검증하고 발명자들이 살아있는 세포에서 사용하기 위해 시스템을 최적화하려고 시도하도록 동기를 부여했다.
2. 살아있는 세포에서 CIRTS-1의 최적화
살아있는 포유동물 세포에서 CIRTS-1의 표적 뉴클레아제 활성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 표적 RNA 상의 gRNA-의존성 전사 변화에 대해 보고하는 이중 루시퍼라아제 리포터 분석을 확립했다(도 3a). 이 시스템을 사용하여, 본 발명자들은 상이한 단백질 링커 유형(도 8a), gRNA 구조(도 8c) 및 CIRTS-1 세포 국소화(도 9c)를 분석함으로써 CIRTS-1의 배치를 최적화하였다. 최적화 후, 본 발명자들은 표적 리포터 RNA를 분해하는 최적화된 CIRTS-1 시스템의 능력을 현재의 최첨단 Cas13 시스템과 비교하였다. 본 발명자들은 CIRTS-1 및 Cas13b 모두에 대한 이중 루시퍼라아제 리포터 분석에서 반딧불이 루시퍼라아제 mRNA를 표적으로 하는 gRNA는 물론, 각각의 프로그램 가능한 뉴클레아제에 대한 대조군, 표적외 gRNA를 설계했다. 전사물에 결합하는 것만으로도 전사물 수준이 변경되는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 CIRTS-1의 뉴클레아제 도메인에 이전에 보고된 ‘죽은(dead)’ 돌연변이를 함유하는(Eberle et al., 2009), CIRTS-0을 음성 대조군 역할을 하도록 조작했다. 본 발명자들은 CIRTS-0이 표적 전사물에 유의한 영향을 미치지 않는다는 것을 발견하였고(도 3b 및 도 9a), 이는 CIRTS 리보핵산단백질 표적 RNA 복합체가 관심 RNA에 대해 최소한으로 교란적이라는 것을 나타낸다. 다음으로, 본 발명자들은 활성 뉴클레아제를 갖는 CIRTS-1이 표적의 분해를 매개할 수 있는지 여부를 시험하였다. 실제로, 본 발명자들은 루시퍼라아제 활성에 의해 모니터링되는 단백질 수준(도 3c) 및 RT-qPCR에 의해 모니터링되는 mRNA 수준(도 9d) 모두에서 측정된 표적 유전자의 gRNA-의존성 분해를 발견하였다. 고무적으로, 본 발명자들은 CIRTS-1이 Cas13b에 의한 표적화된 뉴클레아제 분해와 비교하여 루시퍼라아제 리포터 유전자를 표적화하는데 있어서 약간 덜 효율적이라는 것을 발견하였고, 이는 CIRTS 전략이 살아있는 세포에서 실행 가능한 방법임을 나타낸다. CIRTS-1의 성능에 고무된 본 발명가들은 다음으로 다양한 시스템 성분을 다른 부분으로 교체하고 CIRTS 기능을 유지할 수 있는지 여부를 시험하여 설계의 다목적성을 평가하려고 했다.
3. CIRTS의 모듈성
CIRTS 설계의 다목적성을 탐구하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 CIRTS 단백질 전달 시스템의 각 성분에 대해 상이한 단백질 도메인을 시험했다. 먼저, 본 발명자들은 CIRTS가 이전에 dCas13b 시스템을 사용하여 전달했던 RNA 후성전사체 조절 “판독자(reader)” 단백질을 전달할 수 있는지 여부를 분석했다.(Rauch et al., 2018). 본 발명자들은 CIRTS-1의 Pin 뉴클레아제 효과기 단백질을 번역 기구를 동원하는 세포질 N 6 -메틸아데노신(m6A) 판독자 단백질인 YTHDF1의 N-말단 도메인으로 교체하여, CIRTS-2를 생성하였다. CIRTS-2가 CIRTS-1 실험과 동일한 표적 서열에 전달되는 경우, RNA 수준은 상대적으로 변하지 않지만(도 9e), RNA로부터 단백질 수준의 상당한 증가가 발생한다(도 3d). 그런 다음, 본 발명자들은 YTHDF1 단편을 RNA 탈아데닐화 기구를 동원하고 RNA 분해를 유도하는 m6A 판독자 단백질인 YTHDF2의 단편으로 교체하여, CIRTS-3을 생성하였다. 리포터 mRNA로 CIRTS-3을 전달하면 RNA(도 9f) 및 단백질 수준(도 3e) 모두에 의해 측정된 바와 같이 표적 전사물의 분해를 유도한다. CIRTS-1 내지 -3은 다양한 효과기 단백질 카고(effector protein cargo)를 살아있는 세포의 표적 RNA에 전달하는 설계 전략의 다목적성을 보여준다.
효과기 도메인의 모듈성을 입증한 후, 본 발명자들은 다른 인간 부분이 RNA 헤어핀 결합 도메인 및 비특이적 ssRNA 결합 단백질에도 사용될 수 있는지 평가에 착수했다. 본 발명자들은 CIRTS-3의 TBP6.7을 인간 히스톤 줄기 루프 결합 단백질(SLBP)의 RNA 헤어핀 결합 도메인으로 대체하여 CIRTS-4를 생성하였다. 또한, 본 발명자들은 히스톤 mRNA 줄기 루프 구조를 기반으로 gRNA를 설계하였다(도 1d). 리포터 분석(도 3f)에서 그리고 RNA 수준을 평가하기 위한 RT-qPCR(도 9g)에 의한 CIRTS-4 분석은 CIRTS-3과 유사한 성능이 나타났다. 마지막으로, 본 발명자들은 CIRTS 시스템의 완전히 인간화된 버전을 조작하려고 하였다. 앞서 언급한 바와 같이, 본 발명자들은 바이러스 비특이적 단일 가닥 RNA 결합 단백질 ORF5를 기반으로 하는 첫 번째 개념 증명 시스템(proof-of-concept system)을 설계했다. 주해가 달린 인간 단일 가닥, 비특이적 RNA 결합 단백질은 없지만, 본 발명자들은 높게 하전된 양이온성 인간 단백질이 CIRTS 시스템에서 ORF5의 역할을 수행할 수 있다고 추론했다(Cronican et al., 2011). 따라서, 본 발명자들은 CIRTS-3에서 ORF5 대신에 2개의 양이온성 인간 단백질인 HBEGF 및β-디펜신 3을 조작하여 CIRTS-5 및 CIRTS-6을 각각 생성하였다. 다시, 루시퍼라아제 리포터 분석에 이들 프로그램 가능한 효과기들을 배치하면 표적 유전자의 gRNA-의존성 분해가 나타났다(도 3g). 본 발명자들은 또한 qPCR에 의한 RNA 수준의 변화를 분석하고 CIRTS-5 및 CIRTS-6 모두에 대한 감소를 발견하였다(도 9h). 종합하면, 리포터 분석에서 CIRTS-1부터 CIRTS-6까지의 성능은 헤어핀 결합 도메인과 해당 gRNA, 단일 가닥 RNA 결합 단백질 및 효과기 단백질을 포함한 모든 차원에서 CIRTS 설계의 모듈성을 보여준다. 다음으로, 본 발명자들은 CIRTS가 내인성 전사물을 표적화하는 데에도 사용될 수 있는지 여부를 시험하고자 했다.
4. CIRTS로 내인성 mRNA 표적화
내인성 전사물을 선택적으로 표적화하기 위한 첫 번째 단계로서, 본 발명자들은 RNA 면역침강 후 RT-qPCR에 의한 분석에 의해 CIRTS-0이 표적 내인성 전사물에 결합할 수 있음을 확인하였다. 본 발명자들은 이전에 Cas13 시스템, PPIB 및 SMARCA4에 의해 표적화된 두 개의 내인성 전사물을 표적화하는 gRNA들을 설계했다(Cox et al., 2017; Konermann et al., 2018). 본 발명자들은 3x FLAG-태그에 융합된 CIRTS-0과 함께 각 gRNA를 개별적으로 전달하였다. 이어서, 본 발명자들은 항-Flag 항체로 면역침강된 전체 RNA를 단리하고, 단백질에 결합된 각각의 표적 RNA의 상대적인 양을 정량화하였다. 실제로, 내인성 전사물 둘 모두는 gRNA-의존적 방식으로 2.5배 내지 5배 농축되었고(도 10a), 이는 CIRTS가 내인성 전사물에서 프로그램 가능한 RNA-가이드 RNA 결합 단백질로서 기능할 수 있음을 입증한다.
다음으로 본 발명자들은 CIRTS-1 프로그램 가능한 뉴클레아제 및 CIRTS-3 프로그램 가능한 YTHDF2-매개 붕괴 시스템을 예시로 사용하여 CIRTS 시스템이 표적 내인성 전사물에 효과기 단백질을 전달할 수 있는지 여부를 평가하고자 했다. 본 발명자들은 이전에 Cas13 표적으로 검증된 5개의 RNA 전사물을 선택하고, 이것들이 프로그램 가능한 RNA-결합 시스템에 의한 RNA 표적화에 접근 가능하다고 추론했다. 그런 다음 본 발명자들은 이전에 Cas13 실험에 사용된 표적상의 동일한 결합 부위를 사용하여 각 표적에 대한 gRNA를 설계했으며, 이러한 부위는 CIRTS 표적화에도 접근 가능할 수 있을 것이라고 상정했다(Konermann et al., 2018). 본 발명자들은 RT-qPCR에 의해 각 표적의 RNA 수준에 대한 CIRT 시스템의 효과를 분석하였다. 세포가 특정 gRNA 발현 벡터와 함께 CIRTS-1 또는 CIRTS-3으로 형질주입되었을 때, 본 발명자들은 5가지 내인성 전사물: PPIB, NFKB1, NRAS, B4GALTN1, 및 SMARCA4의 각각에 대해 RT-qPCR에 의한 RNA 수준의 상당한 감소를 보았다(도 4a 및 4b). 상대적 녹다운 효율은 각 유전자에 따라 달랐으며, 이는 다른 RNA 표적화 시스템에서도 관찰되며 각 유전자에 특이적인 접근성 또는 기타 조절 경로에 의해 잠재적으로 매개된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 결과는 CIRTS가 표적에 대한 활성 뉴클레아제 활성을 통해 또는 내인성 후성전사체 조절 경로를 촉발함으로써 내인성 전사물을 표적화하고 붕괴를 매개할 수 있음을 확인해준다.
다음으로, 본 발명자들은 CIRTS-2가 YTHDF1-매개된 후성전사체 경로를 통해 내인성 전사물의 단백질 생산을 촉발할 수 있는지 여부를 평가하고자 했다. 본 발명자들은 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의한 단백질 생산 분석을 위해 보고되고 신뢰할 수 있는 항체가 있는 풍부한 전사물(CypB, PPIB의 단백질 생성물)를 선택했다. 실제로, CIRTS-2로 형질주입된 세포 및 표적내 gRNA는 RNA 수준(도 10b)의 변화 없이 단백질 수준(도 4c)의 증가를 나타내었고, 이는 전사물에 대한 YTHDF1 효과를 확인시켜주었다. 대조군으로서, YTHDF2를 전달하는 CIRTS-3으로 수행된 동일한 실험은 단백질 수준 감소로 나타났고, 이는 mRNA 수준의 감소와 상관관계가 있다(도 3b). 종합하면, 이러한 실험은 CIRTS 플랫폼이 gRNA 의존적 방식으로 내인성 전사물에서 기능적이며, 표적 전사물을 능동적으로 분해하거나, 분해 기구가 표적 전사물에 작용하도록 촉발하거나 또는 표적 전사물로부터 번역을 활성화하고 단백질 생산을 증가시킬 수 있음을 보여준다. CIRTS의 다목적성은 발명가들이 한 전사물 이상을 표적화하도록 그들을 동시에 배포하도록 영감을 주었다.
5. CIRTS를 사용한 다중 내인성 RNA의 다중 표적화
마지막으로, 본 발명자들은 상이한 헤어핀 결합 도메인으로 조작된 CIRTS가 상이한 전사물을 선택적으로 표적화하기 위해 살아있는 세포에서 직교하게 기능할 수 있는지 여부를 평가하는 것을 목표로 하였다. 원칙적으로, 각각 별도로 조작된 gRNA(도 1c 및 1d)를 사용하는, TBP 헤어핀 결합 도메인으로부터 구축된 CIRTS와 SLBP 헤어핀 결합 도메인으로부터 구축된 CIRTS는 서로 직교해야 한다. 다중 표적화 CIRTS의 이러한 직교성 시험을 위해, 본 발명자들은 각각 상이한 헤어핀 구조에 결합하고 서로 간에 최소 혼선을 가져야 하는 YTHDF2, CIRTS-6 및 CIRTS-7을 각각 전달하는 2개의 완전히 인간화된 CIRTS를 배치했다. 본 발명자들은 PPIB를 표적화하기 위해 CIRTS-6을 사용하고 SMARCA4를 표적화하기 위해 CIRTS-7을 사용하는 것을 목표로 하였다(도 5a). 본 발명자들은 대조군, 비표적화 gRNA 서열, 또는 각각의 내인성 유전자를 표적화하는 gRNA 서열을 표시하는 각 CIRTS를 위한 gRNA에 대한 발현 벡터와 함께 두 CIRTS 단백질에 대한 발현 벡터로 세포를 동시-형질주입시켰다. 이어서, 본 발명자들은 RT-qPCR에 의해 2개의 표적 유전자의 상대적인 RNA 수준의 변화를 평가하였다. 실제로, 각각의 CIRTS 시스템은 두 시스템 사이에 어떠한 혼선도 없이 표적 전사물을 표적내 gRNA 의존적 방식으로 분해하였다(도 5b). 결정적으로, 본 발명자들은 두 CIRTS 단백질의 존재 하에 하나의 전사물 또는 다른 전사물을 선택적으로 분해할 수 있었고 또한 동시에 두 전사물을 분해할 수 있었다.
CIRTS-6의 RNA 분해는 CIRTS-6만이 세포에 전달될 때(도 11a)와 유사한 수준을 나타냈지만, CIRTS-7을 사용한 표적화는 개별 형질주입과 비교하여 RNA 분해를 약간 감소시켰다(도 11b). 다중 표적화 실험을 위해, 본 발명자들은 이틀 연속으로 매일 CIRTS 및 gRNA 벡터로 세포를 순차적으로 형질주입시켰다. 본 발명자들은 이러한 감소된 활성이 CIRTS-7로 형질주입된 지 2일째에 형질주입 효율이 감소한 결과로 본다. 또한 TBP6.7 기반 CIRTS에는 내인성 포유동물 세포 기구에 직교하는 RNA 헤어핀이 있지만, SLBP 기반 작제물은 이론적으로 여전히 세포 히스톤 mRNA에 결합할 수 있으며, 이는 전체 활성 감소로 이어질 수 있다. 흥미롭게도, 두 CIRTS 모두 표적내 gRNA와 함께 전달되었을 때 이 분석에서 최상의 성능을 보였다. 이 시점에서, 본 발명자들은 2개의 직교 CIRTS 시스템이 각각 서로 직교할 수 있고 각각 gRNA 의존적 방식으로 내인성 전사물을 동시에 표적화할 수 있다고 결론내린다. 본 발명자들은 현재, 더 이상 내인성 결합 파트너가 없고 잠재적으로 세포 이벤트 교란 없이 작용할 수 있는 조작 직교 CIRTS에 대해 연구하고 있다.
C. 논의
요약하면, 여기에서 본 발명자들은 프로그램 가능한 RNA 효과기 단백질을 조작하기 위한 새로운 전략인 CIRTS를 제시했다. CIRTS는 작고, 완전히 인간화될 수 있으며, 살아있는 세포의 내인성 RNA를 표적화 할 수 있으며, 다차원 제어를 위해 직교적 및 상승적으로 함께 작동할 수 있다. 연구 도구로서 CIRTS는 크기가 더 작기 때문에 이전 방법에 이점을 제공해야 한다. 예를 들어, CIRTS-2 및 CIRTS-3은 각각 65 및 36 kDa인 반면, 비교 가능한 Cas13b 기반 프로그램 가능한 YTHDF1 및 YTHDF2 시스템은 각각 155 및 126 kDa이다(도 6). CIRTS-1은 현재까지 발견된 가장 작은 DNA 표적화 Cas 단백질인 Cas14a보다 훨씬 작다(Harrington et al., 2018). 전달 시스템의 더 작은 크기는 살아있는 세포에서 RNA 조절 단백질의 역할을 밝혀낼 기회를 제시하는 연구 중인 내인성 전사물에 덜 교란적이어야 한다.
번역의 관점에서, CIRTS는 몇 가지 주요 이점과 기회를 제공해야 한다. CIRTS의 인간화된 특성은 면역 반응을 회피하는 경로를 제공하여 지속-전달 치료법의 가능성을 열어줄 것이다. 인간β-디펜신 3과 같은 부속 단백질을 사용하는 것과 관련하여, 이 단백질은 광범위하게 연구되었으며 그 기능에 대한 구조적 기반이 해명되었다(Dhople et al., 2006; Kluver et al., 2005). 이러한 지식을 통해 당업자는 하전된 성질을 유지하지만 내인성 기능을 제거하는 β-디펜신 3 펩타이드를 조작할 수 있을 것이다. 현재, CIRTS의 작은 크기는 예를 들어 분해를 위해 하나의 전사물을 그리고 번역 활성화를 위해 다른 전사물을 표적화하기 위해 바이러스 전달 시스템에서 여러 조절 단백질을 동시에 전달이 가능하게 할 것이다. CIRTS의 다중화 능력은 전달될 수 있는 효과기 단백질의 작은 크기 및 다양성과 결합하여 다중 차원에서 한 번에 다중 유전자를 표적화함으로써 세포 재프로그램의 가능성을 열어준다.
더 넓은 관점에서, CIRTS 플랫폼은 인간 단백질 툴박스에 포함된 부분을 결합하여 새로운 특성을 가진 단백질을 조작할 수 있는 가능성을 보여준다. CIRTS 시스템은 RNA 조절을 연구하고 활용하기 위한 새로운 접근 방식을 제공하며 질병 치료를 위한 세포 조절에 개입할 수 있는 많은 미래의 기회를 열어줄 것이다.
실시예 2 - 인간 부분으로부터 구축된 프로그램 가능한 RNA-가이드 RNA 효과기 단백질
A. 결과
1. CIRTS의 설계
DNA 표적화 Cas9 기반 시스템은 DNA를 풀고 표적 서열에 어닐링하기(anneal) 위해 복잡한 생물물리학적 메커니즘을 사용하지만(Rutkauskas et al., 2015; Sternberg et al., 2014; Szczelkun et al., 2014), Cas13의 기계론적 연구는 RNA 표적화는 gRNA의 중심 시드(seed) 영역에 의해 시작됨을 보여주었다(Liu et al., 2017). 또한, Cas13 시스템은 개별 전사물에 대한 서열 맥락 표적화 가능성에서 상당한 가변성을 나타낸다(Abudayyeh et al., 2017; Cox et al., 2017; Konermann et al., 2018). 동시에 이러한 발견은 gRNA와 표적화된 전사물 사이의 서열 상보성과, 주어진 부위의 접근성이 RNA 표적화의 핵심 요건임을 시사한다. 본 발명자들은 과발현된 리포터 작제물을 사용한 이전의 RNA 테더링 분석과 유사하게, 표적 RNA에 단백질 카고를 전달하기 위해 gRNA 서열을 표시하는 정의된 단백질-RNA 상호작용을 사용하는 Cas13-영감 시스템을 조작하려고 했다(Coller and Wickens, 2007). 실제로, 헤어핀 결합 단백질과 공유 RNA 융합이 RNA 편집 기구를 전사물에 전달하는 데 사용되었다(Montiel-Gonzalez et al., 2016; Sinnamon et al., 2017; Vogel et al., 2018).
현재 Cas13의 특성화(Abudayyeh et al., 2017; Cox et al., 2017; Gootenberg et al., 2018; Konermann et al., 2018; Liu et al., 2017)를 기반으로, 본 발명자들은 최소한의 프로그램 가능한 RNA 표적화 시스템은 다음의 4가지 성분: (1) 시스템의 코어 역할을 하고 조작된 gRNA에 표시된 특이적 RNA 구조에 대한 선택적 고친화성 결합제인 RNA 헤어핀-결합 단백질; (2) 조작된 헤어핀-결합 단백질과 상호작용하는 구조 및 관심 표적 RNA에 상보성을 갖는 서열 모두를 특징으로 하는 gRNA; (3) 표적 결합 전에 가이드 RNA를 안정화 및 보호하기 위해, 표시된 gRNA 서열에 비특이적으로 결합할 수 있는 하전된 단백질; 및 (4) 근접 의존 방식으로 표적화된 RNA에 작용하는 리보뉴클레아제 또는 후성전사체 조절인자와 같은 효과기 단백질(도 12a)을 가지는 것으로 추론하였다. Cas13은 단일 단백질 도메인에 이러한 모든 기능적 성분을 담고 있지만(Liu et al., 2017; Tambe et al., 2018), 본 발명자들은 CRISPR/Cas-영감 RNA 표적화 시스템(CIRTS)이라고 명명한, 각각이 이들 기능 중 하나를 수행하는 다중 단백질 도메인을 결합하는 시스템을 조작하는 것을 구상했다. CIRTS는 모듈 조성이 다양하며 도 12a 및 도 21에 나열된 바와 같이 고유하게 번호가 지정된다.
2. CIRTS-1의 개발 및 시험관 내 검증
1세대 시스템인 CIRTS-1의 경우, 본 발명자들은 HIV 전이-활성화 반응(TAR) 헤어핀에 결합하도록 이전에 조작되었고 내인성 인간 RNA 헤어핀 표적을 갖지 않는, 인간 헤어핀-결합 단백질 U1A 단백질(TBP6.7)의 진화된 버전을 사용했다(Blakeley and McNaughton, 2014; Crawford et al., 2016)(도 12b). 본 발명자들은 TAR 헤어핀, 뉴클레오타이드 링커 서열(L) 및 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 설계했다(도 12c). 시스템을 개발하고 검증하기 위해, 본 발명자들은 먼저 TBP6.7을 이전에 비특이적 근접 의존적 RNA 엔도뉴클레아제로 사용된, 인간 넌센스-매개 mRNA 붕괴 인자 SMG6의 Pin 뉴클레아제 도메인에 융합하여 프로그램 가능한 리보뉴클레아제를 조작했다(Batra et al., 2017; Choudhury et al., 2012). 이 가장 단순한 설계가 이미 세포 기반 루시퍼라아제 분석에서 유망한 gRNA 매개 전사물 분해를 디스플레이했지만(도 22a, 왼쪽), 성능은 상당히 안 좋았고, 본 발명자들은 이를 디스플레이된 가이드 서열의 분해의 결과로 보았다. Cas13 시스템의 단백질 표면과 헤어핀 채널은 높게 하전되는 경향이 있어, 가이드 RNA 서열에 비특이적으로 결합하고 이를 안정화할 가능성이 있다(Liu et al., 2017). 이 RNA 보호 기능을 상기 시스템에 조작하기 위해, 본 발명자들은 비특이적인 낮은 친화성 단일 가닥 RNA 결합 단백질(ssRNA 결합 단백질)을 추가하는 것을 목표로 하였다. 그러나, 인간 단백질체는 본 발명자들이 알고 있는 최선에서 주해가 달린 작은 비특이적 단일 가닥 RNA 결합 단백질을 쉽게 포함하지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 작은 바이러스 ssRNA 결합 단백질인 ORF5를 사용하여 CIRTS-1을 개발했다(Zhou et al., 2006). 전체적으로, CIRTS-1은 상응하는 gRNA와 함께 ORF5-TBP6.7-Pin 뉴클레아제 도메인의 단백질 융합 복합체로 구성된다.
본 발명자들은 먼저 모델 RNA 표적 기질에 대한 시험관 내 CIRTS-1의 프로그램 가능한 RNA 결합 및 RNA 뉴클레아제 활성을 특성화하였다. Pin 뉴클레아제 도메인은 이전에 Mn2+의 존재 하에서 활성인 것으로 나타났으며 활성은 EDTA의 첨가에 의해 소멸될 수 있었다(Choudhury et al., 2012). CIRTS-1을 직접 과발현하면 세포 펠릿에서 불용성 단백질이 생성되며, 이는 본 발명자들이 N-말단 MBP 태그를 CIRTS-1에 융합(MBP-CIRTS-1)하여 해결했다. 필터 결합 분석에서 정제된 MBP-CIRTS-1 단백질 및 gRNA를 사용하여, 본 발명자들은 MBP-CIRTS-1이 22nM의 겉보기 결합 해리 상수(KD)로 gRNA-의존적 방식으로 표적 RNA에 결합함을 발견하였다(도 13a). 결정적으로, 본 발명자들이 시스템에 비-표적화 gRNA를 제공한다면, 본 발명자들은 약 50배 더 약한 결합을 본다. 더욱이, 절단 분석에서, 본 발명자들은 MBP-CIRTS-1이 gRNA- 및 Mn2+-의존적 방식으로 RNA 기질을 분해한다는 것을 발견하였으며, 이는 융합 맥락에서 Pin 리보뉴클레아제 도메인의 활성을 확인해준다(도 13b). 종합적으로, 이러한 시험관 내 결과는 CIRTS-1 이면의 설계 원리를 검증하고 발명자들이 살아있는 세포에서 사용하기 위해 시스템을 최적화하도록 동기를 부여했다.
3. 살아있는 세포에서 CIRTS-1의 최적화
살아있는 포유동물 세포에서 CIRTS-1의 표적 뉴클레아제 활성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 표적 반딧불이 루시퍼라아제(Fluc) RNA 상의 gRNA-의존성 전사 변화에 대해 보고하는 이중 루시퍼라아제 리포터 분석을 확립했다(도 14a). 이 시스템을 사용하여, 본 발명자들은 상이한 단백질 링커 유형(도 23a), gRNA 구조 및 길이(도 23c), 및 CIRTS 뉴클레아제 세포 국소화(도 22b)를 분석함으로써 Pin 뉴클레아제 CIRTS의 배치를 최적화하였다. 본 발명자들은 헤어핀-결합 단백질과 40개 뉴클레오타이드 길이의 gRNA 사이의 긴 가요성 링커가 최상의 녹다운 효율을 초래한다는 것을 발견하였다. 최적화 후, 본 발명자들은 표적 리포터 RNA를 분해하는 최적화된 CIRTS-1(Pin 뉴클레아제) 시스템의 능력을 Cas13b 시스템과 비교하였다(Cox et al., 2017). 본 발명자들은 CIRTS-1 및 Cas13b 모두에 대한 이중 루시퍼라아제 리포터 분석에서 반딧불이 루시퍼라아제 mRNA를 표적으로 하는 gRNA는 물론, 각각의 프로그램 가능한 뉴클레아제에 대한 대조군, 비표적화 gRNA(람다 파지 서열을 표적화)를 설계했다. 전사물에 결합하면 단백질 수준이 변경되는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 CIRTS-1의 Pin 뉴클레아제 도메인에 이전에 보고된 ‘죽은(dead)’ 돌연변이를 함유하는(Eberle et al., 2009), CIRTS-0을 음성 대조군 역할을 하도록 조작했다. 본 발명자들은 CIRTS-0이 표적 전사물의 발현 수준에 유의한 영향을 미치지 않는다는 것을 발견하였고(도 14b 및 도 22c), 이는 표적 RNA에 대한 CIRTS 리보핵산단백질의 결합이 표적화된 전사물에 최소한으로 교란적이라는 것을 나타낸다. 다음으로, 본 발명자들은 활성 뉴클레아제를 함유하는 CIRTS-1이 표적의 분해를 매개할 수 있는지 여부를 시험하였다. 실제로, 본 발명자들은 루시퍼라아제 활성에 의해 모니터링되는 단백질 수준(도 14c) 및 RT-qPCR에 의해 모니터링되는 mRNA 수준(도 22d) 모두에서 측정된 표적 Fluc mRNA의 gRNA-의존성 분해를 발견하였다. 두 결과 모두 CIRTS 전략이 살아있는 세포에서 실행 가능한 방법임을 시사한다. CIRTS-1은 Cas13b에 비해 리포터 유전자를 표적화하는 데 덜 효율적이지만, 특히 Cas13b 시스템이 이 녹다운 기능을 수행하도록 진화했다는 점을 고려할 때 성능은 크게 다르지 않았다. CIRTS-1(Pin 뉴클레아제)의 성능에 고무된 본 발명자들은 다음으로 gRNA, 헤어핀 결합 도메인, 비특이적 RNA 결합 도메인 및 효과기 단백질을 포함하여 시스템의 각 성분이 다양한 기능을 갖는 CIRTS를 달성하기 위해 다른 부분으로 교체될 수 있는지 여부를 시험하여 설계의 다목적성을 평가하려고 했다.
4. 리포터 전사물에 대한 CIRTS의 모듈성
CIRTS 설계의 다목적성을 탐구하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 CIRT 단백질 전달 시스템의 각 성분에 대해 상이한 단백질 도메인을 시험했다. 먼저, 본 발명자들은 CIRTS가 발명자들이 이전에 dCas13b 시스템을 사용하여 전달했던 RNA 후성전사체 조절 “판독자(reader)” 단백질을 전달할 수 있는지 여부를 분석했다(Rauch et al., 2018). 연구를 위해 본 발명자들은 가장 널리 퍼진 mRNA 변형인 N6-메틸아데노신의 조절 단백질에 집중하기로 했다. 평균적으로 각 전사물은 3’UTR에서 검출된 m6A 존재비가 높은 3개의 변형 부위를 함유하며, m6A는 스플라이싱(Xiao et al., 2016), 번역(Meyer et al., 2015; Wang et al., 2015) 및 안정성(Du et al., 2016; Wang et al., 2013)에서 조절 역할을 하는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 CIRTS-1의 Pin 뉴클레아제 효과기 단백질을 번역 기구(Wang et al., 2015)를 동원하는 세포질 m6A 판독자 단백질인 YT521-B 상동성 도메인 패밀리 단백질 1(YTHDF1)의 N-말단 도메인으로 교체하여, CIRTS-2를 생성했다. 본 발명자들의 현재 설계는 m6A 독립적인 방식으로 판독자 단백질의 연구를 단순화하고 CIRTS를 검증할 때 세포 mRNA의 다양한 m6A 수준으로 인한 혼란을 피하기 위해 m6A를 인식하는 YTHDF1의 C-말단 YTH 도메인을 포함하지 않는다는 것에 유의한다. CIRTS-2(YTHDF1)가 CIRTS-1 실험과 동일한 표적 서열에 전달될 때, RNA 수준은 상대적으로 변하지 않지만(도 22e), YTHDF1의 알려진 번역-활성화 역할에 기초하여 예상되는 바와 같이(Wang et al., 2015), RNA로부터 단백질 수준의 상당한 증가가 일어난다(도 14d). 그런 다음, 본 발명자들은 YTHDF1 단편을 RNA 탈아데닐화 기구를 동원하고 RNA 분해를 유도하는(Du et al., 2016; Wang et al., 2013) 상이한 m6A 판독자 단백질인 YTHDF2의 단편으로 교체하여, CIRTS-3을 생성하였다. 리포터 mRNA로 CIRTS-3(YTHDF2)을 전달하면 RNA(도 22f) 및 단백질 수준(도 14e) 모두에 의해 측정된 바와 같이 표적 전사물의 분해를 유도한다. CIRTS-1 내지 -3은 다양한 효과기 단백질 카고(effector protein cargo)를 살아있는 세포의 표적 RNA에 전달하는 설계 전략의 다목적성을 보여준다.
효과기 도메인의 모듈성을 입증한 후, 본 발명자들은 다른 인간 부분이 RNA 헤어핀 결합 도메인 및 비특이적 ssRNA 결합 단백질에도 사용될 수 있는지 평가에 착수했다. 본 발명자들은 CIRTS-3(YTHDF2)의 TBP6.7을 인간 히스톤 줄기 루프 결합 단백질(SLBP)의 RNA 헤어핀 결합 도메인으로 대체하여 CIRTS-4(YTHDF2)를 생성하였다. 동시에, 본 발명자들은 히스톤 mRNA 줄기 루프 구조를 기반으로 gRNA를 설계하였다(도 12d). 리포터 분석(도 14f)에서 그리고 RNA 수준을 평가하기 위한 RT-qPCR(도 22g)에 의한 CIRTS-4(YTHDF2) 분석은 CIRTS-3과 유사한 성능을 나타냈고, 이는 다른 헤어핀 결합 도메인이 CIRTS의 코어로 사용될 수 있음을 확인해준다.
다음으로, 본 발명자들은 CIRTS 시스템의 완전히 인간화된 버전을 조작하려고 하였다. 앞서 언급한 바와 같이, 본 발명자들은 바이러스 비특이적 단일 가닥 RNA 결합 단백질 ORF5를 기반으로 하는 첫 개념 증명 시스템(proof-of-concept system)을 설계했다. 주해가 달린 인간 단일 가닥, 비특이적 RNA 결합 단백질은 없지만, 본 발명자들은 높게 하전된 양이온성 인간 단백질이 CIRTS 시스템에서 ORF5의 역할을 수행할 수 있다고 추론했다(Cronican et al., 2011). 따라서, 본 발명자들은 CIRTS-3에서 ORF5 대신에 2개의 양이온성 인간 단백질인 HBEGF 및 β-디펜신 3을 조작하여 CIRTS-5 및 CIRTS-6을 각각 생성하였다. 다시, 루시퍼라아제 리포터 분석에 이들 프로그램 가능한 효과기들을 배치하면 YTHDF2 후성전사체 조절에 의해 매개된 표적 유전자의 gRNA-의존성 분해(도 14g 및 S2H)가 나타났다.
마지막으로, 본 발명자들은 추가 효과기 단백질과 함께 기능 범위에서 CIRTS의 다목적성을 확인하기 위해 CIRTS를 사용하여 인간 ADAR2(hADAR2)의 촉매 도메인을 RNA 전사물에 전달하였다. 본 발명자들은 반딧불이 루시퍼라아제 코딩 영역에 G-to-A 돌연변이를 포함하는 이중 루시퍼라아제 리포터를 설계하여 번역이 조기에 중단되고 측정 가능한 반딧불이 루시퍼라아제 활성이 나타나지 않았다(도 15a 및 22j). 그런 다음 본 발명자들은 CIRTS를 배치하여 hADAR2의 알려진 과활성 돌연변이체(Kuttan and Bass, 2012)인 wt ADAR2(CIRTS-7) 또는 hADAR 2 E488Q(CIRTS-8)를 돌연변이된 위치에 전달했고, 그 결과 두 경우 모두 루시퍼라아제 활성의 gRNA-의존성 구조(rescue)가 나타났다(도 15b). 과활성 hADAR2 돌연변이체는 루시퍼라아제 분석을 기반으로 표적내 gRNA가 없을 때 더 높은 편집 효율과 더 높은 백그라운드를 보였다. 그러나 과잉 활성 돌연변이체를 사용하면 완화된 서열 제약을 갖기 때문에 더 넓은 기질 범위를 표적화하는 데 이롭다(Kuttan and Bass, 2012). 종합하면, 리포터 분석에서 이러한 다양한 CIRTS의 성능은 헤어핀 결합 도메인과 해당 gRNA, 단일 가닥 RNA 결합 단백질 및 효과기 단백질을 포함한 CIRTS 설계의 모듈성을 보여준다.
5. CIRTS로 내인성 mRNA 표적화
다음으로 본 발명자들은 CIRTS-1 프로그램 가능한 뉴클레아제 및 CIRTS-3 프로그램 가능한 YTHDF2-매개 붕괴 시스템을 예시로 사용하여 CIRTS 시스템이 표적 내인성 전사물에 효과기 단백질을 전달할 수 있는지 여부를 평가하고자 했다. 본 발명자들은 이전에 Cas13 표적으로 검증된 5개의 RNA 전사물을 선택하고, 이것들이 프로그램 가능한 RNA-결합 시스템에 의한 RNA 표적화에 접근 가능하다고 추론했다. 그런 다음 본 발명자들은 이전에 Cas13 실험에 사용된 표적상의 동일한 결합 부위를 사용하여 각 표적에 대한 gRNA를 설계했다(Abudayyeh et al., 2017; Konermann et al., 2018). 본 발명자들은 RT-qPCR에 의해 각 표적의 RNA 수준에 대한 CIRT 시스템의 효과를 분석하였다. 세포가 특정 gRNA 발현 벡터와 함께 CIRTS-1 또는 CIRTS-3으로 형질주입되었을 때, 본 발명자들은 5가지 내인성 mRNA 전사물: PPIB, NFKB1, NRAS, B4GALNT1, 및 SMARCA4의 각각에 대해 RT-qPCR에 의한 RNA 수준의 상당한 감소를 관찰했다(도 16a 및 16b). mRNA를 표적화하는 것 외에도, 본 발명자들은 또한 본 발명자들이 CIRTS-1(Pin 뉴클레아제)을 MALAT1에 표적화함으로써 lncRNA와 같은 다른 RNA 종을 표적화할 수 있음을 확인하였다(도 24a). 상대적 녹다운 효율은 각 유전자에 따라 달랐으며, 이는 다른 RNA 표적화 시스템에서도 관찰되며 각 유전자에 특이적인 접근성 또는 기타 조절 경로에 의해 잠재적으로 매개된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 결과는 CIRTS가 표적에 대한 활성 뉴클레아제 활성을 통해 또는 내인성 후성전사체 조절 경로를 촉발함으로써 내인성 전사물을 표적화하고 붕괴를 매개할 수 있음을 확인해준다.
다음으로, 본 발명자들은 CIRTS-2가 YTHDF1-매개된 후성전사체 경로를 통해 내인성 전사물의 단백질 생산을 촉발할 수 있는지 여부의 평가에 착수했다. 본 발명자들은 웨스턴 블로팅에 의한 CypB(PPIB의 단백질 생성물) 단백질 생산의 분석을 위해 보고되고 신뢰할 수 있는 항체가 있는 풍부한 전사물 PPIB를 선택했다. 실제로, CIRTS-2로 형질주입된 세포 및 표적내 gRNA는 RNA 수준(도 24b)의 변화 없이 단백질 수준(도 16c 및 도 24c)의 증가를 나타내었고, 이는 전사물에 대한 이전에 보고된 YTHDF1 효과와 일치한다(Wang et al., 2015). 대조군으로서, YTHDF2를 전달하는 CIRTS-3으로 수행된 동일한 실험은 약간의 단백질 수준 감소로 나타났고, 이는 mRNA 수준의 감소와 상관관계가 있다(도 16b 및 24c).
마지막으로, 전사물 위치 특이적 효과의 첫 번째 시험으로서, 본 발명자들은 SMARCA4 mRNA를 따라 gRNA를 타일링하고 CIRTS-3에 의한 YTHDF2 매개 붕괴를 시험했다. 본 발명자들은 gRNA가 표적화된 mRNA에 도달하는 위치에 따라 시스템의 극적으로 다른 성능을 발견했으며(도 17), 이는 CIRTS 결합 접근성 및 조절 단백질 서열 요건 모두의 결과일 가능성이 높다. 종합하면, 이러한 실험은 CIRTS 플랫폼이 gRNA 의존적 방식으로 내인성 전사물에서 기능적이며, 표적 전사물을 능동적으로 분해하거나, 분해 기구가 표적 전사물에 작용하도록 촉발하거나 또는 표적 전사물로부터 번역을 활성화하고 단백질 생산을 증가시킬 수 있음을 보여준다.
6. CIRTS의 표적화 특이성
특정 CIRTS가 RNA 기질을 표적화하는 방법에 대한 통찰력을 얻기 위해, 본 발명자들은 미스매치, 전사체 전반의 표적외 및 내인성 기질 표적화에 대한 gRNA의 민감도를 다루는 일련의 실험을 설계했다. 미스매치 내성(mismatch tolerance)을 평가하기 위해, 본 발명자들은 gRNA와 표적 RNA 사이에 형성된 이중체(duplex)에 1, 2 또는 3개의 미스매치를 도입할 때 본 발명자들이 표적화 효과를 분석할 수 있도록 하는 루시퍼라아제 기반 미스매치 실험을 설계했다. 본 발명자들은 질병 관련 KRAS4b 전사물을 루시퍼라아제 리포터에 융합하기로 결정하고 조작된 시스템이 암 관련 G12D(표적 1), 야생형(표적 2), G12C(표적 3) 및 G12W(표적 4) KRAS4b 변이체들을 구별할 수 있는지 질문했다(도 25a). 본 발명자들은 CIRTS가 G12D 및 야생형 변이체의 비슷한 녹다운을 산출한다는 것을 발견했는데, 이는 하나의 미스매치가 표적화 특이성에 큰 변화를 일으키지 않는다는 것을 나타낸다(도 25b). 그러나, 본 발명자들이 각각 2개 및 3개의 미스매치를 포함하는 G12C 및 G12W 리포터에 시스템을 표적화했을 때 CIRTS 녹다운 효율이 감소했다.
다음으로, 본 발명자들은 분석에서 녹다운 효율에 가장 큰 영향을 보인 gRNA와 표적 RNA 사이에 형성된 이중체의 중앙 영역에 있는 미스매치들에 초점을 맞추어, gRNA 길이의 증가가 CIRTS의 미스매치 내성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 평가하였다. 더 짧은 20nt gRNA에서 관찰된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명자들이 미스매치가 없거나 하나인 리포터를 표적화할 때 녹다운 효율에 차이가 없음을 확인했다. 그러나, 더 긴 40nt gRNA는 2개-미스매치 변이체가 표적화되었을 때 일부 효과를 구조할 수 있으며, 이는 gRNA 길이가 시스템의 특이성에 기여함을 나타낸다(도 25d). 기존 기술과의 비교로서, 본 발명자들은 Cas13b에 동일한 미스매치 분석을 실시했으며, 이는 Cas13b가 일반적으로 불일치에 덜 민감함을 나타냈다. 1개 및 2개의 미스매치가 있는 리포터에 Cas13b를 표적화하면 녹다운 효율의 변화를 거의 나타내지 않은 반면, 3개의 미스매치는 녹다운 효율의 상당한 감소를 초래하였다(도 25c). Cas13b와 CIRTS는 모두 gRNA와 표적 RNA 사이에 형성된 이중체의 중심에서 미스매치된 염기쌍에 가장 민감하며, 이는 Cas13b에 대한 이전 연구와 잘 일치하는 연구결과이다(Abudayyeh et al., 2017).
전사체 전반의 표적외를 평가하기 위해, 본 발명자들은 시스템을 RNA 서열분석에 적용하였다. 본 발명자들은 내인성 전사물 SMARCA4를 표적화하는 CIRTS Pin 뉴클레아제 및 CIRTS YTHDF2의 효과를 분석하였다(도 25e 및 25f). 두 경우 모두, 본 발명자들은 통계적으로 유의미한 표적외를 찾지 못했다. 그러나, 본 발명자들은 표적 전사물만을 볼 때((pval <0.1) 표적화된 전사물의 녹다운 및 CIRTS-3(YTHDF2)에 의한 심지어 통계적으로 유의한 녹다운을 보지만, 전사체 전반의 방식으로 평가했을 때 녹다운 수준은 통계적으로 유의한 영역으로 떨어지지 않는다(qval < 0.1). 이 시점에서 본 발명자들은, 시스템의 과발현이 전사체에 큰 교란을 유발하지 않는다는 결론을 내리며, 본 발명자들의 미스매치 연구와 함께 취한 결과는 표적화 특이성 및 그에 따른 녹다운 효율이 향후 연구에서 추가 최적화에 의해 추가로 최적화될 수 있음을 나타낸다.
CIRTS가 관심 전사물에 결합하는지 확인하기 위해, 본 발명자들은 또한 RNA 면역침강 후 RT-qPCR을 수행하였다. 본 발명자들은 이전에 Cas13 시스템, PPIB 및 B4GALNT1에 의해 표적화된 두 개의 내인성 전사물을 표적화하는 gRNA들을 설계했다(Cox et al., 2017; Konermann et al., 2018). 본 발명자들은 3x FLAG-태그에 융합된 CIRTS-0(죽은 뉴클레아제 CIRTS)과 함께 각 gRNA를 개별적으로 전달하였다. 이어서, 본 발명자들은 용해물에 항-Flag 항체로 면역침강을 수행하고, 단백질에 결합된 각각의 표적 RNA의 상대적인 양을 정량화하였다. 실제로, 내인성 전사물 둘 모두는 gRNA-의존적 방식으로 2.5배 내지 5배 농축되었고(도 25h), 이는 CIRTS가 내인성 전사물에서 프로그램 가능한 RNA-가이드 RNA 결합 단백질로서 기능함을 확인해준다.
7. CIRTS를 사용한 다중 내인성 RNA의 다중 표적화
CIRTS의 표적화 특이성과 모듈성은 함께 발명자들이 다중 표적화 방식으로 CIRTS의 적용을 확장하도록 영감을 주었다. 한 번에 단일 효과기 단백질을 전달하고 단일 전사물을 표적화하는 대신, 본 발명자들은 CIRTS가 하나 초과의 전사물을 표적화할 수 있는지 또는 동일한 샘플에서 하나 초과의 효과기 단백질을 전달할 수 있는지 시험에 착수했다. 원칙적으로, 각각 별도로 조작된 gRNA(도 12c 및 12d)를 사용하는, TBP 헤어핀 결합 도메인으로부터 구축된 CIRTS와 SLBP 헤어핀 결합 도메인으로부터 구축된 CIRTS는 서로 직교해야 하며, 이는 동일한 또는 심지어 상이한 CIRTS로 다수 전사물의 선택적 표적화를 가능하게 한다.
먼저, 본 발명자들은 단일 CIRTS를 사용하여 다수 전사물을 동시에 표적화할 수 있는지 여부를 시험했다. 본 발명자들은 PPIB, SMARCA4 및 NRAS를 표적화하는 3개의 gRNA와 함께 CIRTS-6으로 세포를 동시-형질주입시키고 RT-qPCR에 의해 RNA 수준의 변화를 평가하였다. 예상대로, 본 발명자들은 3개의 표적화된 전사물 모두에 대한 RNA 수준의 감소를 관찰하였다(도 18a 및 18b). 그러나, 본 발명자들은 동일한 세포에 여러 gRNA 또는 CIRTS를 배치할 때 효율이 약간 감소하는 것을 관찰하였다. 본 발명자들은 이러한 감소를 4개의 플라스미드를 이용한 세포의 동시 형질주입의 결과로 본다. 단일 CIRTS/gRNA 실험의 성능을 회복하려면 단백질 및 gRNA 수준 및 벡터의 추가 최적화가 필요할 수 있다.
다음으로, 두 가지 상이한 유형의 효과기가 동시에 사용될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 반딧불이 루시퍼라아제를 표적화하기 위해 완전히 인간화된 버전의 YTHDF1 작제물인 CIRTS-9를 배치하고 SMARCA4를 표적화하기 위해 CIRTS-10(YTHDF2)을 배치했다(도 18c 및 18d). 본 발명자들은 두 단백질 모두 활성이고 루시퍼라아제 단백질의 예상된 증가 및 RNA 수준의 감소를 각각 유도한다는 것을 발견하였다. 더욱이, 다중-표적화 CIRTS의 직교성을 추가로 확증하기 위해, 본 발명자들은 2개의 CIRTS, 즉 CIRTS-6(TBP6.7) 및 CIRTS-10(SLBP)(도 26a 및 26b)을 배치했지만, YTHDF2를 2개의 상이한 내인성 표적 mRNA에 전달하기 위해 상이한 헤어핀-결합 모듈을 사용하였다(도 27a). 각각의 CIRT 시스템은 두 시스템 사이에 최소한의 혼선으로 표적 전사물을 표적내 gRNA 의존적 방식으로 분해하였다(도 27b).
이 시점에서, 본 발명자들은 TBP6.7 및 SLBP-기반 CIRTS가 각각 gRNA-의존적 방식으로 내인성 전사물을 동시에 표적화할 수 있다고 결론내렸다. 본 발명자들은 현재 TBP6.7에서 수행된 것처럼 인간 단백질을 새로운 특이성을 향해 진화시킴으로써 내인성 결합 파트너가 없는 직교 CIRTS를 조작하는 연구를 하고 있다. 인간 유래는 아니지만, 본 발명자들은 PP7과 같은 다른 헤어핀-결합 시스템이 CIRTS를 생성하는 데에도 사용될 수 있다는 것을 발견했으며, 이는 다양한 선택적 및 직교 시스템을 생성하는 것이 가능함을 시사한다(도 22i). CIRTS는 여러 조절 단백질이 동시에 전달될 수 있도록 하여, 예를 들어 분해를 위한 하나의 전사물과 번역 활성화를 위한 다른 전사물을 표적화하며, 이는 여러 차원에서 한 번에 여러 유전자를 표적화함으로써 세포 재프로그램의 가능성을 열어준다(Bao et al., 2017; Gao et al., 2016).
8. AAV에 의한 CIRTS의 바이러스 전달
CIRTS의 인간 유래 특성을 제외하고 또 다른 핵심 이점은 CIRTS의 크기가 작아 보다 효율적인 바이러스 패키징 및 전달이 가능하다는 것이다. 아데노바이러스 연관 바이러스(AAV)는 광범위한 이용 가능 혈청형(Gao et al., 2005), 낮은 면역 반응 자극(Vasileva and Jessberger, 2005), 및 낮은 유전체 삽입 위험(Gao et al., 2005; Naso et al., 2017)으로 인해 상이한 세포 유형에 전이 유전자 및 유전자 요법을 전달하는 다목적 전달 매개체이다. 그러나 약 4.7kb의 제한된 패키징 용량으로 인해 많은 Cas13 단백질을 패키징하고 전달하는 것이 어려웠었다(Wu et al., 2010). AAV에 의해 CIRTS가 전달될 가능성을 보여주기 위해, 본 발명자들은 이중 CIRTS-6/gRNA 전달 플라스미드를 설계하고 그것을 AAV 전달 매개체에 패키징했다. CIRTS 단백질 및 gRNA를 포함하는 전체 삽입물은 단지 2.7kb이다(도 19a). 본 발명자들은 생성된 바이러스를 사용한 HEK293T 세포의 형질도입이 루시퍼라아제 리포터 및 내인성 표적 둘 모두에서 CIRTS-6의 녹다운 효율을 반복한다는 것을 발견하였고(도 19b 및 19c), 이는 바이러스-전달된 CIRTS가 여전히 기능함을 확인해주고 임상 배치를 향한 경로를 제공한다. 미래의 응용 분야에서는 이전에 일시적 형질주입에 의해 나타난 바와 같이, 상향 조절을 위한 하나의 전사물과 분해를 위한 하나의 전사물을 동시에 표적화하기 위해 하나 초과의 CIRT 시스템을 AAV 전달 매개체에 패킹하는 것을 생각할 수 있다.
B. 논의
요약하면, 여기에서 본 발명자들은 프로그램 가능한 RNA 효과기 단백질을 조작하기 위한 다목적 전략인 CIRTS를 제시했다. CIRTS는 작고, 완전히 인간화될 수 있으며, 살아있는 세포의 내인성 RNA를 표적화 할 수 있으며, 다차원 전사체 제어에 작동할 수 있다. 연구 도구로서 CIRTS는 크기가 더 작기 때문에 이전 방법에 이점을 제공해야 한다. 예를 들어, CIRTS-2 및 CIRTS-3은 각각 65 및 36 kDa인 반면, 비교 가능한 Cas13b 기반 프로그램 가능한 YTHDF1 및 YTHDF2 시스템은 각각 155 및 126 kDa이다(도 20). CIRTS-1은 현재까지 발견된 가장 작은 DNA 표적화 Cas 단백질인 Cas14a 및 가장 작은 Cas12g RNA 표적화 단백질보다 훨씬 작다(Harrington et al., 2018; Yan et al., 2019).
번역의 관점에서, CIRTS는 몇 가지 주요 이점과 기회를 제공해야 한다. CIRTS의 인간화된 특성은 면역 반응을 회피하는 경로를 제공하여 지속-전달 치료법의 가능성을 열어줄 것이다. CIRTS에서 인간 단백질 간의 융합은 면역계가 반응할 수 있는 설계에 잠재적인 한계를 나타내지만(Glaesner et al., 2010), 이는 원칙적으로 조작하여 해결될 수 있는 문제이다. 본 발명자들이 본 발명자들의 조작된 작제물에서 가장 가능성이 높은 MHC I 결합 펩타이드의 면역원성을 컴퓨터로 예측했을 때, 본 발명자들은 완전히 인간화된 CIRTS가 면역 반응을 일으키는 더 낮은 경향을 나타내지만(도 27c), 설계의 한계가 나타나는 위치를 발견하기 위해 추가 실험적 시험이 필요하다는 것을 발견했다.
현재 CIRT 시스템에는 몇 가지 알려진 도전 과제가 남아 있다. 첫째, 현재 형태의 대체 헤어핀 결합 단백질 SLBP에는 내인성 RNA 헤어핀 결합 파트너가 있어 줄기 루프 RNA 트래픽킹에 영향을 미칠 수도 있다. 본 발명자들의 융합 작제물의 내인성 효과를 최소화하기 위해, 본 발명자들은 시스템에 헤어핀 인식에 필요한 최소 RNA 인식 모티프(RRM)만을 포함하고 다른 단백질 또는 핵산과의 잠재적인 상호작용 영역을 제외하였다. 마찬가지로, 본 발명자들은 잠재적인 내인성 상호작용을 피하기 위해 요구되는 RNA 헤어핀을 가능한 한 작게 유지하려고 노력했다. 줄기 루프 헤어핀은 이미 매우 짧아서 더 이상 자를 수 없었지만 본 발명자들은 TAR 헤어핀에 대한 TBP6.7 결합에 필요한 최소한으로 요구되는 영역만을 사용하도록 선택하여, 원래 헤어핀 길이의 절반 미만인 gRNA를 생성하였다. 둘째, 현재 형태의 양이온성 펩타이드인 β-디펜신 3은 이론적으로 여전히 세포내 결합 파트너와 상호작용하고 원치 않는 생물학적 반응을 끌어낼 수 있다. 그러나, 인간 β-디펜신 3은 광범위하게 연구되었으며 그 기능에 대한 구조적 기반이 해명되었다(Dhople et al., 2006; Kluver et al., 2005). 본 발명자들은 인간 부분 기반, 직교 RNA 표적화 시스템을 조작하기 위해 CIRTS에 필요한 높게 하전된 특성을 유지하지만 내인성 기능을 폐기하는 β-디펜신 3 돌연변이체를 조작하기 위한 기초로서 이러한 지식을 활용할 수 있다.
더 넓은 관점에서, CIRTS 플랫폼은 인간 단백질 툴박스에 포함된 부분을 결합하여 새로운 특성을 가진 단백질을 조작할 수 있는 가능성을 보여준다. 제시된 CIRTS는 최소한의 단백질 조작 및 최적화 노력을 통해 만들어졌지만 자연적으로 진화한 CRISPR/Cas 시스템과 거의 같은 기능을 한다. 특히, 본 발명자들이 내인성 뉴클레아제에 의한 Cas13b 기반 녹다운과 YTHDF2(도 26c)를 CIRTS-매개된 녹다운에 전달함으로써 Cas13b 기반 녹다운을 비교했을 때, 본 발명자들은 Cas13b 뉴클레아제가 CIRTS 뉴클레아제보다 실질적으로 더 나은 성능을 나타내지만, 본 발명자들은 YTHDF2에 의해 매개되는 녹다운에 차이가 없음을 발견했으며, 이는 현재 상태의 CIRTS-3(YTHDF2)이 후성전사체를 효과적으로 연구하는 데 이미 사용될 수 있음을 시사한다. 유도 진화를 사용하여 CIRTS를 최적화하는 추가 작업은 포유류 시스템에서 향상된 성능을 가진 변이체를 산출할 가능성이 높다(Hu et al., 2018). 표적 부위 설계 및 효과기 단백질 맥락적 요건을 이해하면 CIRTS 시스템 성능도 향상될 것이며, 이용되고 있는 후성전사체 경로에 대한 더 나은 이해는 본 발명자들이 더 나은 시스템을 설계할 수 있게 해줄 것이다. 또한 고유한 RNA 제어 특성을 보유할 가능성이 있는 인간 단백질체 내에 함유된 다양한 다른 조절 단백질이 있으며(Dominguez et al., 2018), 이는 CIRTS와 결합하여 기능적 특성화 및 잠재적 번역 적용 모두에 대해 각 단백질의 프로그램 가능한 버전을 생성할 수 있다. CIRTS 시스템은 RNA 조절을 연구하고 활용하기 위한 새로운 접근 방식을 제공하며 질병 치료를 위한 세포 조절에 개입할 수 있는 미래의 기회를 열어줄 것이다.
* * *
본원에 개시되고 청구되는 모든 방법은 본 개시 내용에 비추어 과도한 실험 없이 만들어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예의 관점에서 설명되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기술된 방법의 방법 및 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 본원에 기재된 제제를 대체할 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 그러한 모든 유사한 대체물 및 수정물은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참고문헌
예시적인 절차 또는 본원에 기술된 것에 보충적인 기타 세부사항을 제공하는 범위에서, 다음 참고문헌은 본원에 참고로 구체적으로 포함된다.
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Ala Leu Gly Ser Thr Pro Phe Leu 1 5 10 15 Gly Gln His Gly Phe Asn Phe Phe Pro Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ala 20 25 30 Trp Gly Asn Asn Ser Ser Gln Gly Gln Ser Thr Gln Ser Ser Gly Tyr 35 40 45 Ser Ser Asn Tyr Ala Tyr Ala Pro Ser Ser Leu Gly Gly Ala Met Ile 50 55 60 Asp Gly Gln Ser Ala Phe Ala Asn Glu Thr Leu Asn Lys Ala Pro Gly 65 70 75 80 Met Asn Thr Ile Asp Gln Gly Met Ala Ala 85 90 <210> 17 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Met Ser Ala Ser Ser Leu Leu Glu Gln Arg Pro Lys Gly Gln Gly Asn 1 5 10 15 Lys Val Gln Asn Gly Ser Val His Gln Lys Asp Gly Leu Asn Asp Asp 20 25 30 Asp Phe Glu Pro Tyr Leu Ser Pro Gln Ala Arg Pro Asn Asn Ala Tyr 35 40 45 Thr Ala Met Ser Asp Ser Tyr Leu Pro Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Ile 50 55 60 Gly Phe Ser Tyr Ser Leu Gly Glu Ala Ala Trp Ser Thr Gly Gly Asp 65 70 75 80 Thr Ala Met Pro Tyr Leu Thr Ser Tyr Gly Gln Leu Ser Asn Gly Glu 85 90 95 Pro His Phe Leu Pro Asp Ala Met Phe Gly Gln Pro Gly Ala Leu Gly 100 105 110 Ser Thr Pro Phe Leu Gly Gln His Gly Phe Asn Phe Phe Pro Ser Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Ser Ala Trp Gly Asn Asn Ser Ser Gln Gly Gln Ser Thr 130 135 140 Gln Ser Ser Gly Tyr Ser Ser Asn Tyr Ala Tyr Ala Pro Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gly Gly Ala Met Ile Asp Gly Gln Ser Ala Phe Ala Asn Glu Thr Leu 165 170 175 Asn Lys Ala Pro Gly Met Asn Thr Ile Asp Gln Gly Met Ala Ala 180 185 190 <210> 18 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Ala Asp Phe Glu Thr Asp Glu Ser Val Leu Met Arg Arg Gln Lys Gln 1 5 10 15 Ile Asn Tyr Gly Lys Asn Thr Ile Ala Tyr Asp Arg Tyr Ile Lys Glu 20 25 30 Val Pro Arg His Leu Arg Gln Pro Gly Ile His Pro Lys Thr Pro Asn 35 40 45 Lys Phe Lys Lys Tyr Ser Arg Arg Ser Trp Asp Gln Gln Ile Lys Leu 50 55 60 Trp Lys Val Ala Leu His Phe Trp Asp 65 70 <210> 19 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Met Arg Val Thr Leu Ser Ser Lys Pro Gln Ala Leu Ala Thr Pro Asn 1 5 10 15 Lys Glu Glu His Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr Lys Asp Phe Cys Ile His Gly 35 40 45 Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg Ala Pro Ser Cys Ile Cys His 50 55 60 Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His Gly Leu Ser 65 70 75 <210> 20 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 20 Met Gly Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gln Ile Gly 20 25 30 Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 35 40 45 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser 1 5 10 15 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 24 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Glu Glu Glu Glu Lys Lys Lys Gln Gln Glu Glu Glu Ala Glu Arg Leu 1 5 10 15 Arg Arg Ile Gln Glu Glu Met Glu Lys Glu Arg Lys Arg Arg Glu Glu 20 25 30 Asp Glu Gln Arg Arg Arg Lys Glu Glu Glu Glu Arg Arg Met Lys Leu 35 40 45 Glu Met Glu Ala Lys Arg Lys Gln Glu Glu Glu Glu Arg Lys Lys Arg 50 55 60 Glu Asp Asp Glu Lys Arg Lys Lys Lys 65 70 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 ggccagatct gagcctggga gctctctggc c 31 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 tgacagccca catggcattc cacttatcac tggcatcctt 40 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 ccaaaggctc ttctcagagc caccca 26 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 gtgataagtg gaatgccatg 20 <210> 30 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 caggtcgact ctagactcga ggctagcgag ctcgtttaaa 40 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 cttggtgctc tccaccttcc gcaccacctc catgccctct 40 <210> 32 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 ccgatgcggt gggctcggtc ctgcgcttgc aggtcctggt 40 <210> 33 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 gcctccacca gctctctgac tgtaccccca gagacctcat 40 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 aagcatcttc aacaccctgt ctggtcttgg ctgaggtttc 40 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 cttcgcaccg cagcgcagcg cggctcagct cccggctcgt 40 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 ctagactcga ggctagcgag 20 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 cgactctaga ctcgaggcta gcgagctcgt 30 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 ggccctggcc cttcccctgg agccatgctg ggccctagcc 40 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 gcccaacccc atttaaccag aaccagctgc accagctcag 40 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 cctcccaagc cctggcctga aggacccatg gcgaatgctg 40 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 cgtcccaccc gccgcctcgc ccgtgatgcc accgcagacc 40 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 ggaggtggtg gtgtgcatgc ggagggacac agcgctggag 40 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 tcacaggcaa aatccagaag ctgaccaagg cagtggccac 40 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 catggctgaa gatgaggagg ggtaccgcaa gctcatcgac 40 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 ctctggacga gaccagccag atgagcgacc tcccggtgaa 40 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 cccaccctgc ccgtggagga gaagaagaag attccagatc 40 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 aatatggcgt gtcccaggcc cttgcacgtg gcctgcagtc 40 <210> 48 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 ctcatcacgt acctcatgga 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 ggaaccacga aggcggagga ccggggcatg ctgctgaaaa 40 <210> 55 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 tccagtcggc agacactgtg atcatttttg acagcgactg 40 <210> 56 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 cgccagcggg cgtcaacccc gacttggagg agccacctct 40 <210> 57 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 57 gcggaggtgg agcggctgac ctgtgaggag gaggaggaga 40 <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 58 tgatcaagta caaggacagc agcagtggac gtcagctcag 40 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 59 cttcaagaag ataaaggagc gcattcgcaa ccacaagtac 40 <210> 60 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 agggtcccga gccaagccgg tcgtgagtga cgatgacagt 40 <210> 61 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 tatttataca gcagagaagc tgtaggactg tttgtgactg 40 <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 ggggaacaca cgatacctgt ttttcttttc cgttgctggc 40 <210> 63 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 ataggccagt gaattcgagc tcgaatatgg attacttggt agaacagcaa tctacgccgg 60 aagcataaag 70 <210> 64 <211> 173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 64 ggccagtgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga aatatggatt acttggtaga 60 acagcaatct actcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 120 cctgtgttta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aag 173 <210> 65 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 ggccagatct gagcctggga gctctctggc ccagccacca cccacagagc cgccaccaga 60 <210> 66 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 ggccagatct gagcctggga gctctctggc cctagattgc tgttctacca agtaatccat 60 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 gtctcctctg acttcaacag cg 22 <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 accaccctgt tgctgtagcc aa 22 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 aacgcaggca aagacaccaa cg 22 <210> 70 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 tctgtcttgg tgctctccac ct 22 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 71 aggttacaac cgccaagaag c 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 atgagaatct cgcggatctt g 21 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 73 aacgcaggca aagacaccaa cg 22 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 74 tctgtcttgg tgctctccac ct 22 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 75 gcagcactac ttcttgacca cc 22 <210> 76 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Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 gccacatagt gcgtgttgag ca 22 <210> 83 <211> 43 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 83 ggcgucccuc ccgaagcugc gcgcucgguc gaacaggacg acc 43 <210> 84 <211> 6 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 84 ucccga 6 <210> 85 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 85 ggccgaaauc ccgaaugagg cc 22 <210> 86 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 86 ggaugccucc cgagugcauc c 21 <210> 87 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 87 Met Asp Asp Pro Ser Phe Leu Thr Gly Arg Ser Thr Tyr Ala Lys Arg 1 5 10 15 Arg Arg Ala Arg Arg Met Asn Val Cys Lys Cys Gly Ala Ile Leu His 20 25 30 Asn Asn Lys Asp Cys Arg Ser Ser Thr Ile Ser Gly His Lys Leu Asp 35 40 45 Arg Leu Arg Phe Val Lys Glu Gly Arg Val Ala Leu Glu Gly Glu Thr 50 55 60 Pro Val Tyr Arg Thr Trp Val Lys Trp Val Glu Thr Glu Tyr His Ile 65 70 75 80 Asn Ile Leu Glu Thr Ser Asp Asp Glu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser 85 90 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hairpin binding domain <400> 109 gcccugaaga agggc 15 <210> 110 <211> 15 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: RNA hairpin binding domain <400> 110 gcccugaaaa agggc 15 <210> 111 <211> 25 <212> RNA <213> Pseudomonas aeroginosa <400> 111 uaaggaguuu auauggaaac ccuua 25 <210> 112 <211> 28 <212> RNA <213> Bovine immunodeficiency virus <400> 112 ggcucgugua gcucauuagc uccgagcc 28 <210> 113 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 113 ggaauccauu gcacuccgga uuucactag 29 <210> 114 <211> 20 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: RNA hairpin binding domain <400> 114 augcaugucu aagacagcau 20 <210> 115 <211> 23 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: RNA hairpin binding domain <400> 115 aaaacauaag gaaaaccuau guu 23 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 cttgtggtag ttggagctga 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 agttggagct gatggcgtag 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 gttggagctg atggcgtagg 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 tggcgtaggc aagagtgcct 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 ggcgtaggca agagtgcctt 20 <210> 121 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 taaggagttt atatggaaac cctta 25 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 gtgataagtg gaatgccatg 20 <210> 123 <211> 403 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 123 Leu His Leu Asp Gln Thr Pro Ser Arg Gln Pro Ile Pro Ser Glu Gly 1 5 10 15 Leu Gln Leu His Leu Pro Gln Val Leu Ala Asp Ala Val Ser Arg Leu 20 25 30 Val Leu Gly Lys Phe Gly Asp Leu Thr Asp Asn Phe Ser Ser Pro His 35 40 45 Ala Arg Arg Lys Val Leu Ala Gly Val Val Met Thr Thr Gly Thr Asp 50 55 60 Val Lys Asp Ala Lys Val Ile Ser Val Ser Thr Gly Thr Lys Cys Ile 65 70 75 80 Asn Gly Glu Tyr Met Ser Asp Arg Gly Leu Ala Leu Asn Asp Cys His 85 90 95 Ala Glu Ile Ile Ser Arg Arg Ser Leu Leu Arg Phe Leu Tyr Thr Gln 100 105 110 Leu Glu Leu Tyr Leu Asn Asn Lys Asp Asp Gln Lys Arg Ser Ile Phe 115 120 125 Gln Lys Ser Glu Arg Gly Gly Phe Arg Leu Lys Glu Asn Val Gln Phe 130 135 140 His Leu Tyr Ile Ser Thr Ser Pro Cys Gly Asp Ala Arg Ile Phe Ser 145 150 155 160 Pro His Glu Pro 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Synthetic primer <400> 127 cctgctacct tcatcaccaa 20 <210> 128 <211> 613 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 128 Met Gly Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gln Ile Gly 20 25 30 Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys Gly Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 50 55 60 Met Ala Val Pro Glu Thr Arg Pro Asn His Thr Ile Tyr Ile Asn Asn 65 70 75 80 Leu Asn Ser Lys Ile Lys Lys Asp Glu Leu Lys Lys Ser Leu Tyr Ala 85 90 95 Ile Phe Ser Gln Phe Gly Gln Ile Leu Asp Ile Leu Val Pro Arg Gln 100 105 110 Arg Thr Pro Arg Gly Gln Ala Phe Val Ile Phe Lys Glu Val Ser Ser 115 120 125 Ala Thr Asn Ala Leu Arg Ser Met Gln Gly Phe Pro Phe Tyr Asp Lys 130 135 140 Pro Met Arg Ile Gln Tyr Ala Lys Thr Asp Lys Arg Ile Pro Ala Lys 145 150 155 160 Met Lys Gly Thr Phe Val Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 132 Met Asp Asp Pro Ser Phe Leu Thr Gly Arg Ser Thr Tyr Ala Lys Arg 1 5 10 15 Arg Arg Ala Arg Arg Met Asn Val Cys Lys Cys Gly Ala Ile Leu His 20 25 30 Asn Asn Lys Asp Cys Arg Ser Ser Thr Ile Ser Gly His Lys Leu Asp 35 40 45 Arg Leu Arg Phe Val Lys Glu Gly Arg Val Ala Leu Glu Gly Glu Thr 50 55 60 Pro Val Tyr Arg Thr Trp Val Lys Trp Val Glu Thr Glu Tyr His Ile 65 70 75 80 Asn Ile Leu Glu Thr Ser Asp Asp Glu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser 85 90 95 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Ala Lys Thr 100 105 110 Ile Val Leu Ala Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu Thr Glu Ile Gln 115 120 125 Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val Gly Pro Leu Val 130 135 140 Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn Gly Ala Lys Thr 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp Val Val Asp Ala 165 170 175 Ser Thr Ser Val Ala Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg Tyr Thr Gln Val 180 185 190 Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser 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Gly Ala Leu Gly Ser 405 410 415 Thr Pro Phe Leu Gly Gln His Gly Phe Asn Phe Phe Pro Ser Gly Ile 420 425 430 Asp Phe Ser Ala Trp Gly Asn Asn Ser Ser Gln Gly Gln Ser Thr Gln 435 440 445 Ser Ser Gly Tyr Ser Ser Asn Tyr Ala Tyr Ala Pro Ser Ser Leu Gly 450 455 460 Gly Ala Met Ile Asp Gly Gln Ser Ala Phe Ala Asn Glu Thr Leu Asn 465 470 475 480 Lys Ala Pro Gly Met Asn Thr Ile Asp Gln Gly Met Ala Ala Gly Ser 485 490 495 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 500 <210> 133 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 133 Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser 1 5 10 15 <210> 134 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 134 Glu Glu Glu Glu Lys Lys Lys Gln Gln Glu Glu Glu Ala Glu Arg Leu 1 5 10 15 Arg Arg Ile Gln Glu Glu Met Glu Lys Glu Arg Lys Arg Arg Glu Glu 20 25 30 Asp Glu Lys Arg Arg Arg Lys Glu Glu Glu Glu Arg Arg Met Lys Leu 35 40 45 Glu Met Glu Ala Lys Arg Lys Gln Glu Glu Glu Glu Arg Lys Lys Arg 50 55 60 Glu Asp Asp Glu Lys Arg Lys Lys Lys 65 70 <210> 135 <211> 403 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 135 Leu His Leu Asp Gln Thr Pro Ser Arg Gln Pro Ile Pro Ser Glu Gly 1 5 10 15 Leu Gln Leu His Leu Pro Gln Val Leu Ala Asp Ala Val Ser Arg Leu 20 25 30 Val Leu Gly Lys Phe Gly Asp Leu Thr Asp Asn Phe Ser Ser Pro His 35 40 45 Ala Arg Arg Lys Val Leu Ala Gly Val Val Met Thr Thr Gly Thr Asp 50 55 60 Val Lys Asp Ala Lys Val Ile Ser Val Ser Thr Gly Thr Lys Cys Ile 65 70 75 80 Asn Gly Glu Tyr Met Ser Asp Arg Gly Leu Ala Leu Asn Asp Cys His 85 90 95 Ala Glu Ile Ile Ser Arg Arg Ser Leu Leu Arg Phe Leu Tyr Thr Gln 100 105 110 Leu Glu Leu Tyr Leu Asn Asn Lys Asp Asp Gln Lys Arg Ser Ile Phe 115 120 125 Gln Lys Ser Glu Arg Gly Gly Phe Arg Leu Lys Glu Asn Val Gln Phe 130 135 140 His Leu Tyr Ile Ser Thr Ser Pro Cys Gly Asp Ala Arg Ile Phe Ser 145 150 155 160 Pro His Glu Pro Ile Leu Glu Glu Pro Ala Asp Arg His Pro Asn Arg 165 170 175 Lys Ala Arg Gly Gln Leu Arg Thr Lys Ile Glu Ser Gly Gln Gly Thr 180 185 190 Ile Pro Val Arg Ser Asn Ala Ser Ile Gln Thr Trp Asp Gly Val Leu 195 200 205 Gln Gly Glu Arg Leu Leu Thr Met Ser Cys Ser Asp Lys Ile Ala Arg 210 215 220 Trp Asn Val Val Gly Ile Gln Gly Ser Leu Leu Ser Ile Phe Val Glu 225 230 235 240 Pro Ile Tyr Phe Ser Ser Ile Ile Leu Gly Ser Leu Tyr His Gly Asp 245 250 255 His Leu Ser Arg Ala Met Tyr Gln Arg Ile Ser Asn Ile Glu Asp Leu 260 265 270 Pro Pro Leu Tyr Thr Leu Asn Lys Pro Leu Leu Ser Gly Ile Ser Asn 275 280 285 Ala Glu Ala Arg Gln Pro Gly Lys Ala Pro Asn Phe Ser Val Asn Trp 290 295 300 Thr Val Gly Asp Ser Ala Ile Glu Val Ile Asn Ala Thr Thr Gly Lys 305 310 315 320 Asp Glu Leu Gly Arg Ala Ser Arg Leu Cys Lys His Ala Leu Tyr Cys 325 330 335 Arg Trp Met Arg Val His Gly Lys Val Pro Ser His Leu Leu Arg Ser 340 345 350 Lys Ile Thr Lys Pro Asn Val Tyr His Glu Ser Lys Leu Ala Ala Lys 355 360 365 Glu Tyr Gln Ala Ala Lys Ala Arg Leu Phe Thr Ala Phe Ile Lys Ala 370 375 380 Gly Leu Gly Ala Trp Val Glu Lys Pro Thr Glu Gln Asp Gln Phe Ser 385 390 395 400 Leu Thr Pro <210> 136 <211> 30 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: RNA hairpin binding domain <220> <221> modified_base <222> (1)..(5) <223> a, c, u, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (9)..(13) <223> a, c, u, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (19)..(24) <223> a, c, u, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (26)..(30) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 136 nnnnnugcnn nnncagugnn nnnncnnnnn 30 <210> 137 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Asp Glu Ala His 1 <210> 138 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Asp Glu Ala Asp 1 <210> 139 <211> 68 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (32)..(68) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 139 ggccagaucu gagccuggga gcucucuggc cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnn 68 <210> 140 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (32)..(63) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 140 ccaaaggcuc uucucagagc cacccattat tnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnn 63 <210> 141 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (32)..(63) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 141 ccaaaggcuc uucucagagc cacccauuau unnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnn 63 <210> 142 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (13)..(15) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 142 gtagttggag ctnnnggcgt aggcaag 27 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 tgaacaccat caacctcgac 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 gaacaccatc aacctcgact 20 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 tcaacctcga ctaccgcatc 20 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 caacctcgac taccgcatcc 20 <210> 147 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 accgcatccg ttctcacgga 20 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 ccgcatccgt tctcacggaa 20

Claims (94)

  1. RNA 조절 시스템으로서,
    i) RNA 헤어핀 결합 도메인;
    ii) RNA 표적화 영역 및 적어도 하나의 헤어핀 구조를 포함하는 RNA 표적화 분자 - 상기 RNA 표적화 분자의 상기 헤어핀 구조는 i)에 특이적으로 결합함 -; 및
    iii) RNA 조절 도메인;
    각각 중 적어도 하나를 포함하는, RNA 조절 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 RNA 헤어핀 결합 도메인 및 상기 RNA 조절 도메인은 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  3. 제1항에 있어서,
    i), ii), 및/또는 iii) 부분들은 인간의 것이거나 인간-유래인 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    i) 및 iii)은 펩타이드 결합을 통해 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    i) 및 iii)은 비공유 상호작용을 통해 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인은 제1 이량체화 도메인에 공유 결합되고 상기 RNA 헤어핀 결합 도메인은 제2 이량체화 도메인에 공유 결합되며, 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 이량체화하여 비공유 또는 공유 연결을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 이량체화는 유도성(inducible)인 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 이량체화는 리간드-유도된 이량체화를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제1 또는 제2 이량체화 도메인 중 하나는 PYR/PYR1-유사(PYL1)를 포함하고, 상기 제1 또는 제2 이량체화 도메인 중 다른 하나는 ABA 비민감성(insensitive) 1(ABI1)을 포함하고, 상기 리간드는 아브시스산(ABA) 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 FKBP12를 포함하고 상기 리간드는 FK1012 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 제1 또는 제2 이량체화 도메인 중 하나는 FK506 결합 단백질(FKBP)을 포함하고, 상기 제1 또는 제2 도메인 중 다른 하나는 포유동물 Rap mTOR의 표적의 FKBP-Rap 결합 도메인(Frb)을 포함하고, 상기 리간드는 라파마이신(Rap) 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    ii)는 적어도 두 개의 헤어핀 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    ii)는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시스템은 안정화제 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 안정화제 폴리펩타이드는 핵산에 비특이적으로 결합하는 양이온성 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 안정화제 폴리펩타이드는 인간 유래인 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시스템의 전체 크기는 150kDa 미만인 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    i)은 U1A, SLBP, 또는 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    ii)는 서열번호: 1의 TAR 헤어핀 지지체(scaffold)를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    ii)는 서열번호: 2의 SLBP 헤어핀 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    ii)는 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 링커는 적어도 5개 아미노산인 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 표적화 영역은 적어도 12개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    iii)은 뉴클레아제, 메틸라아제, 데메틸라아제(demethylase), 번역 활성제, 번역 억제인자, 단일 가닥 RNA 절단 활성, 이중 가닥 RNA 절단 활성, 또는 RNA 결합 활성을 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    iii)은 Pin 뉴클레아제 도메인 또는 m6A 판독자 단백질(reader protein) 또는 이의 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  25. 제24항에 있어서,
    iii)은 YTHDF1, YTHDF2, 또는 ADAR을 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  26. 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안정화제 단백질은 HBEGF, 베타-디펜신, 또는 이의 변이체 또는 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    ii)의 상기 RNA 표적화 영역은 원핵 또는 진핵 세포에서 표적 RNA에 혼성화(hybridize)되는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 및/또는 iii)은 하나 이상의 핵 국소화 신호(NLS)를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시스템은 각각의 i), ii), 및 iiii) 중에서 적어도 두 개를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인은 RNA를 절단하거나, RNA 번역을 촉진하거나, RNA 번역을 억제하거나, 또는 RNA의 염기 서열을 변형하는 것을 특징으로 하는, RNA 조절 시스템.
  31. 하나 이상의 핵산 벡터를 포함하는 벡터 시스템으로서,
    i) RNA 헤어핀 결합 도메인; ii) RNA 표적화 영역 및 적어도 하나의 헤어핀 구조를 포함하는 RNA 표적화 분자 - 상기 RNA 표적화 분자의 상기 헤어핀 구조는 i)에 특이적으로 결합함 -, 및 iii) RNA 조절 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는, 벡터 시스템.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 RNA 헤어핀 결합 도메인 및 상기 RNA 조절 도메인은 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.
  33. 제31항에 있어서,
    i), ii), 및/또는 iii)을 암호화하는 뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 더 포함하는, 벡터 시스템.
  34. 제31항 또는 제33항에 있어서,
    상기 하나 이상의 핵산 벡터는 진핵 세포 내 발현에 최적화되는 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현은 구성적(constitutive) 또는 조건적(conditional)인 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    i), ii), 및 iii)은 단일 벡터 상에 있는 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터 중 하나 이상은 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 벡터는 하나 이상의 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터 또는 단순 헤르페스 바이러스 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.
  39. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터 중 하나 이상은 비바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.
  40. RNA 표적화 분자에 작동 가능하게 연결된 RNA 조절 도메인을 포함하는 접합체로서, 상기 RNA표적화 분자는 RNA 표적화 영역 및 적어도 하나의 헤어핀 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인은 인간 유래인 것을 특징으로 하는, 접합체.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인 및 상기 RNA 표적화 분자는 펩타이드 결합을 통해 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 링커를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  44. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인 및 상기 RNA 표적화 분자는 비공유 상호작용을 통해 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인은 제1 이량체화 도메인에 공유 결합되고 상기 RNA 표적화 분자는 제2 이량체화 도메인에 공유 결합되며, 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 이량체화하여 비공유 또는 공유 연결을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 이량체화는 유도성(inducible)인 것을 특징으로 하는, 접합체.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 이량체화는 리간드-유도된 이량체화를 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 제1 또는 제2 이량체화 도메인 중 하나는 PYR/PYR1-유사(PYL1)를 포함하고, 상기 제1 또는 제2 이량체화 도메인 중 다른 하나는 ABA 비민감성(insensitive) 1(ABI1)을 포함하고, 상기 리간드는 아브시스산(ABA) 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  49. 제47항에 있어서,
    상기 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 FKBP12를 포함하고 상기 리간드는 FK1012 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  50. 제47항에 있어서,
    상기 제1 또는 제2 이량체화 도메인 중 하나는 FK506 결합 단백질(FKBP)을 포함하고, 상기 제1 또는 제2 도메인 중 다른 하나는 포유동물 Rap mTOR의 표적의 FKBP-Rap 결합 도메인(Frb)을 포함하고, 상기 리간드는 라파마이신(Rap) 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 표적화 분자는 적어도 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  52. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 표적화 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  53. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 표적화 분자는 서열번호: 1의 TAR 헤어핀 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  54. 제40항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 표적화 분자는 서열번호: 2의 SLBP 헤어핀 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  55. 제40항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 표적화 분자는 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  56. 제55항에 있어서,
    상기 링커는 적어도 5개 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  57. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 표적화 영역은 적어도 12개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  58. 제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인은 뉴클레아제, 메틸라아제, 데메틸라아제(demethylase), 번역 활성제, 번역 억제인자, 단일 가닥 RNA 절단 활성, 이중 가닥 RNA 절단 활성, 또는 RNA 결합 활성을 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  59. 제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인은 Pin 뉴클레아제 도메인 또는 m6A 판독자 단백질(reader protein) 또는 이의 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  60. 제40항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인은 YTHDF1, YTHDF2, 또는 ADAR을 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  61. 제40항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 표적화 분자의 상기 RNA 표적화 영역은 원핵 또는 진핵 세포에서 표적 RNA에 혼성화(hybridize)되는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  62. 제40항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 하나 이상의 핵 국소화 신호(NLS)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  63. 제40항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인은 RNA를 절단하거나, RNA 번역을 촉진하거나, RNA 번역을 억제하거나, 또는 RNA의 염기 서열을 변형하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  64. RNA 헤어핀 결합 도메인 및 RNA 조절 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
  65. RNA 조절 도메인 및 제1 이량체화 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
  66. RNA 헤어핀 결합 도메인 및 제2 이량체화 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서,
    상기 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인의 이량체화는 유도성(inducible)인 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  68. 제67항에 있어서,
    상기 이량체화는 리간드-유도된 이량체화를 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  69. 제68항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 PYL1 및 ABI1 중에서 선택되고, 상기 리간드는 ABA 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  70. 제68항에 있어서,
    상기 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 FKBP12를 포함하고 상기 리간드는 FK1012 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  71. 제68항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 FKBP 및 Frb 중에서 선택되고, 상기 리간드는 라파마이신 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  72. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 헤어핀 결합 도메인 및/또는 상기 RNA 조절 도메인은 인간 유래인 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  73. 제64항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 150kDa 미만인 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  74. 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 헤어핀 결합 도메인은 U1A, SLBP, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  75. 제64항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인은 뉴클레아제, 메틸라아제, 데메틸라아제(demethylase), 번역 활성제, 번역 억제인자, 단일 가닥 RNA 절단 활성, 이중 가닥 RNA 절단 활성, 또는 RNA 결합 활성을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  76. 제75항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인은 Pin 뉴클레아제 도메인 또는 m6A 판독자 단백질 또는 이의 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  77. 제76항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인은 YTHDF1 또는 YTHDF2를 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  78. 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 핵 국소화 신호(NLS)를 더 포함하는, 융합 단백질.
  79. 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 조절 도메인은 RNA를 절단하거나, RNA 번역을 촉진하거나, RNA 번역을 억제하거나, 또는 RNA의 염기 서열을 변형하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  80. 제64항 내지 제79항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는, 핵산.
  81. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 시스템, 제40항 내지 제63항 중 어느 한 항의 접합체, 또는 제64항 내지 제79항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는, 전달 매개체.
  82. 제81항에 있어서,
    상기 전달 매개체는 리포솜(들), 입자(들), 엑소좀(들), 미세소포(들), 유전자총 또는 하나 이상의 핵산 벡터(들)을 포함하는, 전달 매개체.
  83. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 시스템, 제40항 내지 제63항 중 어느 한 항의 접합체, 제64항 내지 제79항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 또는 제81항 내지 제82항 중 어느 한 항의 전달 매개체를 포함하는, 조성물.
  84. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 시스템, 제40항 내지 제63항 중 어느 한 항의 접합체, 제64항 내지 제79항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제81항 내지 제82항 중 어느 한 항의 전달 매개체, 또는 제83항의 조성물을 포함하는, 세포.
  85. 적어도 하나의 표적 RNA를 조절하는 방법으로서,
    상기 표적 RNA를 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 시스템, 제40항 내지 제63항 중 어느 한 항의 접합체, 제64항 내지 제79항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제81항 내지 제82항 중 어느 한 항의 전달 매개체, 또는 제83항의 조성물과 접속시키는 단계를 포함하는, 방법.
  86. 제85항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 RNA를 조절하는 것은 상기 RNA를 절단하는 단계, 탈메틸화하는 단계, 메틸화하는 단계, 번역 활성화하는 단계, 번역 억제하는 단계, 분해 촉진하는 단계, 및/또는 그에 결합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서,
    상기 표적 RNA는 원핵 또는 진핵 세포 내에 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  88. 제87항에 있어서,
    상기 표적 RNA는 인간 세포 내에 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서,
    상기 표적 RNA는 시험관 내(vitro) 또는 생체 내(in vivo)에 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  90. 조절된 표적 RNA를 포함하는 세포 또는 이의 자손으로서,
    상기 표적 RNA는 제85항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따라서 조절된 것을 특징으로 하는, 세포 또는 이의 자손.
  91. 제90항에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는, 다세포 생물.
  92. 제91항에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는, 식물 또는 동물.
  93. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 시스템, 제40항 내지 제63항 중 어느 한 항의 접합체, 제64항 내지 제79항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제81항 내지 제82항 중 어느 한 항의 전달 매개체, 또는 제83항의 조성물을 포함하는, 키트.
  94. 대상체에서 표적 RNA를 조절하는 방법으로서,
    상기 방법은 제40항 내지 제63항 중 어느 한 항의 접합체, 제64항 내지 제79항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제81항 내지 제82항 중 어느 한 항의 전달 매개체, 또는 제83항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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