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Die Erfindung betrifft einen Gelträger zur Durchführung des COMET-Assays mit Automatisierungsmöglichkeit im Roboter-gestützten Analysebetrieb zur Realisierung eines Hochdurchsatz-Verfahrens, umfassend eine Trägerplatte, deren Plattenoberseite mindestens eine Trägerfläche zum Aufbringen des Gels aufweist.
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Der COMET-Assay, auch als Einzelzellgelelektrophorese oder SCGE, nämlich Single Cell Gel Electrophoresis, bezeichnet, ist eine Technik, durch die es ermöglicht wird, DNA-Schädigungen in einzelnen Zellen festzustellen.
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Entwickelt wurde der Assay 1984 von Östling und Johanson zum Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen. Mit der Weiterentwicklung durch Singh im Jahre 1988 konnten durch die Verwendung von alkalischen Puffern zusätzlich auch DNA-Einzelstrangbrüche festgestellt werden.
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Das Prinzip des COMET-Assays beruht darauf, dass Zellen in Agarose-Gel eingebettet, lysiert und einem elektrischen Feld, der so genannten Elektrophorese, ausgesetzt werden. Während der Elektrophorese wandert die negativ geladene DNA zum Pluspol, wobei sich aufgrund des Agarose-Gels die Bruchstücke der Größe nach auftrennen, da die kleineren Bruchstücke in bestimmter Zeit eine weitere Strecke zurücklegen als die größeren. Chromosomale DNA ist jedoch zu groß um als Ganzes im elektrischen Feld zu wandern. Nur geschädigte, bruchstückhafte DNA ist hier in der Lage aus dem Zellkern herauszuwandern.
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Unter dem UV-Mikroskop erscheinen die beschädigten Zellen, welche vorher mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Ethidiumbromid behandelt worden sind, nun mit einem Schweif aus DNA-Bruchstücken, welcher ihnen das Aussehen eines Kometen gibt. Beim COMET-Assay können alle Zellen verwendet werden, welche einen Zellkern besitzen.
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Ausgewertet wird die Zahl der beschädigten und unbeschädigten DNA entweder von Hand oder durch spezielle Computerprogramme mit visueller Erfassung.
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Die Durchführung des gebräuchlichen COMET-Assays wird in der Beschreibungseinleitung der
DE 10 2004 046 364 A1 beschrieben. Hierbei werden üblicherweise Gelträger in Form von Objektträgern aus Glas der Größe 76 × 26 mm mit einer Dicke von etwa 1 mm verwendet. Die gesamte Objektträgeroberseite bildet hierbei die Trägerfläche zum Aufbringen des Gels, wobei das Gel dadurch, dass es die Ränder des Objektträgers umgreift, auf dem Objektträger haftet. Solche Objektträger sind ganz allgemein zur Aufbringung eines Gels geeignet. Das hierbei entstehende Gel/Glas-Konstrukt lässt sich unter Fluoreszenz-Bedingungen gut mikroskopieren. Der Objekträger selbst ist auch vorteilhaft mit dem oben genannten Standard-Verfahren in der Durchführung des COMET-Assays kompatibel. Nachteilig daran ist jedoch, dass immer nur ein Gel aufgebracht und mithin immer nur Probe analysiert werden kann.
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Die Erfindung geht von der
DE 10 2007 046 615 A1 als nächstliegendem Stand der Technik aus, welche ebenfalls auf die Erfinder der vorliegenden Anmeldung zurückgeht. Dort wird auch zur Überwindung des vorgenannten Nachteils ein Gelträger offenbart, der eine Trägerplatte umfasst, deren Plattenoberseite mindestens eine Trägerfläche zum Aufbringen des Gels aufweist, wobei die Trägerfläche einen Haftbereich umfasst, der derart ausgebildet ist, dass das auf der Trägerfläche aufgebrachte Gel in diesem Bereich an der Plattenoberseite haftet, und einen Analysenbereich umfasst, der derart ausgebildet ist, dass eine Analyse in diesem Bereich durchführbar ist.
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Die Offenbarung der
DE 10 2007 046 615 A1 wird hiermit, insbesondere im Hinblick auf die Ausbildung des Gelträgers sowie seiner diversen Ausführungsformen, durch ausdrückliche Bezugnahme vollinhaltlich in die vorliegende Patentanmeldung mit aufgenommen.
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Der in der
DE 10 2007 046 615 A1 offenbarte Gelträger eignet sich besonders gut zur Durchführung des COMET-Assays mit Automatisierungsmöglichkeit im Roboter-gestützten Analysebetrieb zur Realisierung eines Hochdurchsatz-Verfahrens. Letzteres ist auch möglich, weil auf dem Gelträger eine Vielzahl physikalisch voneinander getrennter Gele aufbringbar sind. Ein automatisiertes Handling ist hierbei aufgrund der erfindungsgemäßen stabilen Verbindbarkeit von Gel und Plattenoberseite des Gelträgers möglich. Ein solcher Gelträger ist vorteilhaft kostengünstig herstellbar und zweckmäßigerweise wiederverwendbar. Insbesondere ist es von Vorteil, dass das auf einem solchen Gelträger angeordnete Gel in getrockneter Form der mikroskopischen Analyse zuführbar ist, wodurch eine automatisierte Auswertung erheblich erleichtert und eine Archivierbarkeit der Präparate ermöglicht wird.
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Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen Gelträger der vorgenannten Art so weiterzuentwickeln, dass eine einheitliche Nachbehandlung der auf dem Gelträger angeordneten und voneinander physikalisch getrennten Gele insbesondere durch Reagenzien möglich ist.
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Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen Gelträger der vorgenannten Art so weiterzuentwickeln, dass eine unterschiedliche Nachbehandlung der auf dem Gelträger angeordneten und voneinander physikalisch getrennten Gele insbesondere durch Reagenzien möglich ist.
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Der Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, einen Gelträger der vorgenannten Art so weiterzuentwickeln, dass eine optische Erkennbarkeit bzw. Detektierbarkeit der auf dem Gelträger angeordnete und voneinander physikalisch getrennten Gele im Verfahrensablauf insbesondere unter reduzierter Beleuchtung bzw. in einer Dunkelkammer möglich ist.
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Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen Gelträger der vorgenannten Art so weiterzuentwickeln, dass die Haft- und Analysebereiche eine verbesserte Anpassung an die automatischen und händischen Bildauswertesysteme erfahren, um so eine verbesserte Anpassung und Ausnutzung des Bildfeldes zu erreichen.
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Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen Gelträger der vorgenannten Art so weiterzuentwickeln, dass der Auftrag des Gels bzw. der Probe auf den Träger vereinfacht bzw. optimiert wird.
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Wenigstens einzelne der vorliegend genannten Aufgaben, werden durch einen Gelträger gemäß Anspruch 1 gelöst. Weitere Erfindungen und vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den weiteren Ansprüchen.
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Der erfindungsgemäße Gelträger zur Durchführung des COMET-Assays mit Automatisierungsmöglichkeit im Roboter-gestützten Analysebetrieb zur Realisierung eines Hochdurchsatz-Verfahrens, umfasst eine Trägerplatte, deren Plattenoberseite mindestens eine Trägerfläche zum Aufbringen des Gels aufweist, wobei die Trägerfläche einen Haftbereich umfasst, der derart ausgebildet ist, dass das auf der Trägerfläche aufgebrachte Gel in diesem Bereich an der Plattenoberseite haftet, und einen vom Haftbereich verschiedenen Analysenbereich, der derart ausgebildet ist, dass eine Analyse in diesem Bereich durchführbar ist, wobei sich Haftbereich und Analysenbereich durch physikalische und/oder chemische Eigenschaften in bzw. auf der Plattenoberseite voneinander unterscheiden.
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Zweckmäßigerweise bzw. vorzugsweise ist der den Analysenbereich wenigstens teilweise umgebende Haftbereich wenigstens teilweise von einem hydrophoben Bereich umgeben, der vorzugsweise durch Beschichtung auf der Plattenoberseite aufgebracht ist.
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Der hydrophobe Bereich gewährleistet erfindungsgemäß, dass eine Vermischung von Proben ausgeschlossen ist. Gleichzeitig definiert der vorzugsweise geschlossene hydrophobe Bereich die geometrische Formung des aufgebrachten Flüssigkeits- bzw. Gel- bzw. Probentropfens exakt und definiert damit die Form des sich im späteren Verlauf der Aufarbeitung daraus bildenden Gels. Dies ist für die Reproduzierbarkeit und Auswertbarkeit der Proben von hoher Bedeutung. Weiterhin ermöglicht der hydrophobe Bereich auch eine Nachbehandlung einzelner oder verschiedener Proben auf dem Gelträger in unterschiedlicher Weise. Dies ist für die Durchführung des COMET-Assays in methodischen Variationen, zum Beispiel zur Analyse oxidativer DNA-Schäden oder von DNA-Quervernetzungen, notwendig.
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Es kann von Vorteil sein, wenn der hydrophobe Bereich durch physikalische und/oder chemische Verfahren auf der Plattenoberseite, vorzugsweise durch Sieb- oder Tampondruck, aufgebracht ist.
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Zweckmäßiger kann der Haftbereich aus einem oder mehreren Segmenten, vorzugsweise aus insbesondere drei Kreissegmenten oder insbesondere vier Quadratsegmenten bestehen.
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Ein solch segmentierter Haftbereich ermöglicht eine kostengünstigere und vereinfachte Herstellung des erfindungsgemäßen Gelträgers, ohne dass dabei die Funktionalität des Haftbereiches eingeschränkt wird.
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Für bestimmte Anwendungsfälle kann es vorteilhaft sein, wenn die nach außen weisende Seite des Segments bogenförmig und die nach innen weisende Seite des Segments gerade ausgebildet sind.
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Für die Durchführung einer Analyse kann es besonders zweckmäßig sein, wenn der Analysenbereich (10) rechteckig, vorzugsweise quadratisch, ausgebildet ist.
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Es kann vorteilhaft sein, wenn der Haftbereich quadratisch oder rechteckig ausgebildet ist.
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Eine solche spezielle Anpassung der geometrischen Formung des Auftragsbereiches optimiert die Flächenausnutzung bei Verwendung automatischer Auswertesysteme, da dort mit Kameras gearbeitet wird, die ein quadratisches oder rechteckiges Bildformat unterstützen. Dadurch wird eine höhere Anzahl von Proben auf einem Gelträger erreichbar.
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Es kann aber auch vorteilhaft sein, wenn der Haftbereich kreisförmig ausgebildet ist.
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Eine vorteilhafte Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass mehrere Trägerflächen vorgesehen sind, von denen wenigstens zwei voneinander verschieden dimensionierte und/oder geformte Haftbereiche aufweisen.
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Es kann vorteilhaft sein, wenn mehrere Trägerflächen mit jeweils umgebenden hydrophoben Bereichen vorgesehen sind.
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Vorzugsweise weist der den Haftbereich umgebende hydrophobe Bereich die gleiche Form wie der Haftbereich, aber eine andere Dimension als der Haftbereich auf.
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Zweckmäßig kann es sein, wenn der den Haftbereich nur außen umgebende hydrophobe Bereich die Plattenoberseite unter Aussparung des Haft- und Analysenbereichs ganz oder teilweise bedeckt.
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Es kann vorteilhaft sein, wenn der hydrophobe Bereich schwarz, weiß oder farbig ausgebildet ist.
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Der erfindungsgemäße Gelträger macht insbesondere die Herstellung einer hohen Anzahl physikalisch getrennter Gele auf einer gemeinsamen Oberfläche bei gleichzeitiger Einhaltung der festen Haftung jedes Gels auf der Oberfläche möglich. Ferner erlaubt der Gelträger die Durchführung eines Roboter-gestützten Hochdurchsatz-Verfahrens. Insbesondere wird dadurch ein Abarbeiten der COMET-Präparate nach dem folgenden Ablauf möglich:
- – Erzeugung der Zellen für die Durchführung des COMET-Assays
- – Automatisiertes Aufbringen einer hohen Anzahl von Spots(=COMET-Proben) auf einen einzigen Gelträger (z. B. 96 Proben auf der Fläche einer Mikrotiterplatte)
- – Überführung des Gels/Gelträgers in eine Elektrophorese-Einheit Lyse, Unwindung, Elektrophorese
- – Entnahme aus der Elektrophorese, ggf. Roboter-gestützte Spülschritte und Färbung
- – Trocknung der Gele
- – Überführung zur mikroskopischen Auswertung
- – Automatisierte Analyse der COMET-Spots
- – Entfernen des Gels vom Träger durch einfaches Quellen/Waschen in Wasser und Wiederverwendung oder Archivierung des Gels für langfristige Dokumentation
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Die Trägerplatte des Gelträgers besteht gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung aus Glas.
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Eine solche Trägerplatte ist, insbesondere vor dem Hintergrund eines Hochdurchsatz-Verfahrens, kostengünstig herstellbar. Zudem ist der Gelträger nach einem Reinigungsvorgangs wieder verwendbar.
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Es können standardmäßige Flachglasmaterialien zur Herstellung der Trägerplatte verwendet werden, wobei das Material im Analysenbereich eine ausreichende Transmission im benötigten Wellenlängenbereich von 450–600 nm erlauben muss, wenn der Gelträger für den COMET-Assay eingesetzt wird. Weiterhin kann es von Vorteil sein, wenn Flachglasmaterialien verwendet werden, die eine hohe Durchlässigkeit im UV-Bereich erlauben, beispielsweise so genanntes superweißes Glas. Dadurch ist es möglich, dass auch DNA-Fluoreszenzfarbstoffe, die eine Anregung in diesem Bereich erfordern, zur mikroskopischen Auswertung eingesetzt werden können. Als DNA-Fluoreszenzfarbstoff eignet sich insbesondere so genanntes DAPI (4',6-Diamidin-2'-phenylindol-dihydrochlorid), welches mit einer Wellenlänge von ca. 350 nm anregbar ist. Solche Flachglasmaterialien haben Vorteile gegenüber anderen Trägermaterialien, beispielsweise solchen aus Kunststoff, die durch eine hohe Eigenfluoreszenz in diesem Wellenlängenbereich eine Verwendung derartiger Farbstoffe grundsätzlich ausschließen.
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Der Analysenbereich wird vorzugsweise durch eine unbeschädigte Glasoberfläche mit freiem Lichtdurchgang zur mikroskopischen Auswertung des in diesem Bereich befindlichen Gels gebildet.
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Die Größe des Gelträgers wird in Abhängigkeit der Automatisierungsmöglichkeiten gewählt. Eine geeignete Größe entspricht beispielsweise dem Format einer Mikrotiterplatte mit einer Länge von etwa 128 mm und einer Breite von etwa 85 mm oder auch eines Standard-Objektträgers mit einer Länge von etwa 76 mm und einer Breite von etwa 26 mm. Eine geeignete Dicke beträgt vorzugsweise etwa 1 bis 2 mm.
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Eine Trägerplatte in der Größe eines Standard-Objektträgers, welcher nach dem Stand der Technik für nur ein einziges Gel und somit nur für eine einzige Probe zuverlässig nutzbar ist, kann erfindungsgemäß beispielsweise zwölf Trägerflächen aus jeweils einem Haft- und einem Analysebereich aufweisen. Damit wären zwölf so genannte Gel-Spots und mithin zwölf Proben untersuchbar.
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Bevorzugt ist die Ausbildung eines Gelträgers mit 96 Trägerflächen. Auch andere Größen sind problemlos herstellbar, bevorzugt solche mit 12, 24, 48 oder 192 Trägerflächen.
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Eine Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass die Plattenoberseite im Haftbereich jeder Trägerfläche aufgeraut ist. Dadurch wird eine erhöhte Haftung der Plattenoberseite zum Gel realisiert.
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Die vorgesehenen Haftbereiche können vorzugsweise durch Sandstrahlen oder andere geeignete Verfahren hergestellt werden. Vorteilhaft wird hierbei im Haftbereich Material von der Plattenoberseite abgetragen, ohne dass die benachbarte Oberfläche, insbesondere der Analysenbereich, beschädigt wird. Eine genaue Trennung zwischen Haftbereich und Analysenbereich, also in diesem Fall zwischen beschädigter und unbeschädigter Oberfläche, ist möglich.
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Der Abtrag der Oberfläche hat dabei so zu geschehen, dass im abgetragenen Bereich eine Fläche von ausreichender Tiefe und Rauheit entsteht. Dies kann beispielsweise durch die Wahl des Strahlmittels und die Dauer des Sandstrahlens definiert werden.
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Eine ausreichende Haftung im Haftbereich wird gemäß einer Weiterbildung der Erfindung durch Aufbringen von stark hydrophilen Beschichtungen, insbesondere Farbbeschichtungen, erreicht, die dann vorteilhaft nicht lichtdurchlässig sein müssen.
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Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die Plattenoberseite im Haftbereich mit Silanen chemisch vorbehandelt ist. Auch dadurch wird eine erhöhte Haftung die Plattenoberseite zum Gel realisiert.
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Es versteht sich, dass der erfindungsgemäße Gelträger zwar besonders vorteilhaft auf dem Gebiet des COMET-Assays eingesetzt werden kann, sich jedoch auch anderweitig verwenden lässt.
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Bei alledem werden die geschilderten Vorzüge mit einer sehr einfachen Maßnahme erzielt, da das Herstellen der Haftbereiche mit verhältnismäßig geringen Kosten verbunden ist.
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Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert, dass in der Zeichnung dargestellt ist. In dieser zeigen
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1 schematisch eine Draufsicht auf einen erfindungsgemäßen Gelträger,
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2 schematisch eine Seitenansicht auf den in 1 dargestellten Gelträger im Längsschnitt,
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3 schematisch eine Draufsicht auf einen Gelträger vor dem Herstellen des Haftbereichs und
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4 eine Maske zum Herstellen der Haftbereiche auf einem Gelträger nach 3.
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Der in 1 und 2 schematisch dargestellte Gelträger 10 ist insbesondere zur Durchführung des bekannten COMET-Assays, speziell für einen automatischen Roboter-gestützten Analysebetrieb zur Realisierung eines Hochdurchsatz-Verfahrens, geeignet.
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Der Gelträger 10 umfasst eine Trägerplatte 12, deren Plattenoberseite 14 zwölf Trägerflächen aufweist, auf denen jeweils ein Gel 16 und somit eine zu untersuchende Probe aufgebracht wird.
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Jede Trägerfläche umfasst erfindungsgemäß einen Haftbereich 18, der derart ausgebildet ist, dass das auf der Trägerfläche aufgebrachte Gel 16 in diesem Bereich 18 an der Plattenoberseite 14 haftet, und einen Analysenbereich 20, der derart ausgebildet ist, dass eine Analyse in diesem Bereich 20 durchführbar ist.
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Vorliegend ist der Haftbereich 18 ringförmig ausgebildet und umgibt somit den Analysenbereich 20. Der den Analysenbereich 20 umgebende Haftbereich 18 ist seinerseits von einem hydrophoben Bereich 22 umgeben, der vorzugsweise durch Beschichtung mittels Sieb- oder Tampondruck auf der Plattenoberseite 14 aufgebracht ist.
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Die Trägerplatte 12 besteht aus Glas. Die ringförmigen Haftbereiche 18 werden durch Sandstrahlen hergestellt, wobei Glasmaterial von der Plattenoberseite 14 abgetragen wird.
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Der vom Haftbereich 18 eingerahmte Analysenbereich 20 ist dagegen unbeschädigt und eignet sich für eine Analyse des Gels 16 mittels eines hier nicht dargestellten Mikroskops.
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Der erfindungsgemäße Gelträger 10 weist zwölf Trägerflächen mit jeweils einem so genannten Gel-Spot 16 auf, wobei jede Trägerfläche zwei Funktionsbereiche umfasst, nämlich einen Bereich 20 mit unbeschädigter Glasoberfläche zur mikroskopischen Analyse und einen Bereich 18, der vorzugsweise durch physikalische Vertiefungen in Kombination mit einer ausreichenden Rauheit der dortigen Oberfläche oder eine geeignete dauerhafte Beschichtung eine stabile Haftung des jeweiligen Gel-Spots 16 sichert.
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In 3 ist schematisch eine Draufsicht auf einen Gelträger 10 vor dem Herstellen des Haftbereichs 18 dargestellt. Der Gelträger 10 umfasst eine Trägerplatte 12, deren Plattenoberseite zur Bildung eines hydrophoben Bereichs 22 mit einer Epoxy-Beschichtung versehen ist, die zehn kreisförmige Aussparungen zur Bildung der Trägerflächen aufweist. Die Trägerflächen 24 sind derart beschaffen, dass eine Analyse in diesem Bereich möglich ist.
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Zum Herstellen des erfindungsgemäßen Gelträgers 10 bzw. der erfindungsgemäß vorgesehenen Haftbereiche 18 wird nun die im 4 gezeigte Maske 26 auf den Gelträger nach 3 gelegt. Anschließend wird der Gelträger 10 mit aufgelegter Maske 26 sandgestrahlt, wobei die in der Maske 26 gezeigten Aussparungen 28 die Haftbereiche 18 auf der Trägerfläche 24 abbilden. Es ist deutlich zu erkennen, dass der verbleibende Analysenbereich entsprechend quadratisch ausgebildet sein wird.
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Jede Trägerfläche 24 weist so vier Segmente auf, deren nach außen weisenden Seiten kreisförmig und deren nach innen weisenden Seiten geradlinig ausgebildet sind.
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Bezugszeichenliste
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- 10
- Gelträger
- 12
- Trägerplatte
- 14
- Plattenoberseite
- 16
- Gel
- 18
- Haftbereich
- 20
- Analysebereich
- 22
- hydrophober Bereich
- 24
- Trägerfläche
- 26
- Maske
- 28
- Aussparung
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102004046364 A1 [0007]
- DE 102007046615 A1 [0008, 0009, 0010]
