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Um insbesondere in der biomedizinischen Wissenschaft eine möglichst große Zahl an Proben (z. B. Gewebeproben) auf möglichst kleinem Raum zu untersuchen, wurde u. a. die sogenannte Multigewebeblocktechnik (Tissue microarray-Technik) entwickelt, bei der zumeist paraffinierte Gewebeproben mittels einer Gewebestanze (Innendurchmesser 0,4–5 mm) einem sog. Donorblock (z. B. Paraffingewebeblock) entnommen und in die zahlreichen Aufnahmeöffnungen eines sog. Akzeptorblockes (Gewebemultiblock, Tissue microarray) übertragen werden. Diese Aufnahmeöffnungen im Akzeptorblock können gestanzt (
Kononen et al.;
WO 01/42796 A1 ), gebohrt (
Vogel UF, Bueltmann B. Simple, inexpensive, and precise paraffin tissue microarrays constructed with a conventional microcompound table and a drill grinder. Am. J. Clin. Pathol. 2006; 126: 342–348) oder mit Hilfe von Platzhaltern (z. B. Zylinderstiften) (Lilischkis R, von Wasielewski R, Mengel M. Method for production of material blocks with multiple test samples. PCT International Publication Number:
WO 01/51910 A1 . 2001. International Patent Number:
PCT/DE00/04647 ) gegossen werden. Bei den bisher bekannten Systemen zum Gießen dieser Akzeptorblöcke befinden sich die Platzhalter entweder fest integriert in der Bodenplatte der zweiteiligen muldenartigen Ausgießform (TMA Builder, Fa. Lab Vision, Freemont, CA, USA) oder werden durch Bohrungen in der Bodenplatte von unten in die Model gesteckt (Patent Lilischkis). Aufgrund dieser Anordnung der Platzhalter im Bereich der Bodenplatte können keine kommerziell erhältlichen, in vielen Labors bereits vorhandenen Ausgießmodeln verwendet werden. Ferner ist die Zahl und die Anordnung der Platzhalter und die Größe der Ausgießform festgelegt. Ferner besteht bei diesen zweiteiligen Ausgießformen die Gefahr, dass beim Gießen das Paraffin seitlich zwischen Bodenplatte und Seitenwänden (TMA Builder) oder durch die Löcher der Bodenplatte entweicht (System von Lilischkis).
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Um das System hinsichtlich der Größe der zu gießenden Paraffinblöcke, der Zahl und Anordnung der Löcher flexibler zu gestalten und die bereits in den meisten Labors vorhandenen, da routinemäßig verwendeten Ausgießförmchen aus Edelstahl (z. B. Tissue Tek, Fa. Sakura Finetek, Japan) benutzen zu können, wurde eine Gussform entwickelt, die aus diesen kommerziell erhältlichen wannenartigen Modeln besteht, in welche von oben eine Mehrzahl von Platzhaltern, vorzugsweise rund und aus Edelstahl, eingeführt werden. Diese Platzhalter sind oberhalb der Modeln lose durch die Öffnungen einer relativ dicken Materialplatte, vorzugsweise aus Edelstahl, gesteckt, welche die Platzhalter stabilisiert und die Anordnung der selben vorgibt. Je nach Größe der verwendeten, kommerziell erhältlichen Ausgußmodel kann nun die Anordnung und die Zahl der Platzhalter variiert werden, da diese nur lose in die Löcher der relativ dicken Materialplatte geschoben werden. Zwischen diese Metallplatte und der Model kann eine dünnere Metallplatte, ebenfalls vorzugsweise aus Edelstahl, mit der gleichen Lochanordnung eingebracht werden, um das Herausziehen der Platzhalter nach dem Gießen und Abkühlen/Erstarren des Akzeptorblockes zu erleichtern, indem mit Hilfe von Schrauben, vorzugsweise aus Kunststoff, die dickere Metallplatte von der dünneren, der Model zugewandten Metallplatte abgedrückt wird. Das eine Ende der Platzhalter, welches über die dickere Materialplatte leicht hervorragt, ist durch Pressen oder Aufbringen von zusätzlichem Material, vorzugsweise Kunststoff, dergestalt verändert, dass dieses Ende nicht durch die Löcher der dünneren und dickeren Materialplatte (Lochplatten) passt und die Platzhalter somit mitsamt der dickeren Materialplatte vom gegossenen Akzeptorblock abgehoben werden können. Eine weitere, dünne, jedoch lochfreie Metallplatte kann optional von oben auf die dickere Materialplatte aufgeschraubt werden, um das aufgrund einer Unachtsamkeit mögliche Herausfallen der lose gesteckten Platzhalter aus der dickeren Materialplatte z. B. nach dem Trennen von Akzeptorblock und Gießform zu verhindern. Zwischen der dünneren Lochplatte und der Model kann eine routinemäßig verwendete bodenfreie Kunststoffkassette (z. B. Tissue Tek Paraform Cassette System, Sakura Finetek, Japan) eingebracht werden, wodurch der Akzeptorblock nach dem Befüllen der Aufnahmelöcher mit Gewebeproben direkt am Mikrotour eingespannt werden kann.
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Um eine glatte Paraffinoberfläche des zu gießenden Akzeptorblockes auf der, der Bodenplatte der Model entgegengesetzten Deckfläche zu erreichen, sollte die dünnere Lochplatte auf der Model oder der Kunststoffkassette aufsitzen. Diese glatte Oberfäche ist von Vorteil, wenn Gewebeproben nicht von der Bodenfläche des Akzeptorblockes aus, sondern von der Deckfläche aus in den Akzeptorblock eingestellt werden sollen.
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Nach dem Füllen der Aufnahmelöcher des Akzeptorblockes mit z. B. Gewebeproben kann der Akzeptorblock je nach Wunsch geschmolzen (Vogel UF. Combining different techniques to construct paraffin tissue microarrays of superior quality. Histopathology, 2009; 54: 624–626) oder direkt am Mikrotom geschnitten werden.
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Die vom Akzeptorblock erstellten Schnitte können wie die mit den anderen, zur Verfügung stehenden Techniken zur Erstellung von Gewebemultiblöcken gewonnen Schnittpräparate für Routinefärbungen, histochemische Färbungen, immunhistochemische Färbungen, in situ Hybridisierungen oder auch zur Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet werden. Zusammengefaßt bietet die beschriebene Erfindung die Möglichkeit, die routinemäßig in vielen Labors verwendeten Ausgießmodeln auch für die Erstellung von Gewebemultiblöcken zu verwenden, damit ohne zusätzliche Kosten die Größe des zu gießenden Akzeptorblockes zu variieren und die Zahl und Anordnung der Aufnahmelöcher den entsprechenden Anforderungen der jeweiligen Forschungsaufgabe zu anzupassen.
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Im folgenden wird eine mögliche Ausführungsart der vorliegenden Erfindung für die Verwendung bei der Erstellung von Paraffingewebemultiblocks (paraffin tissue microarrays) unter Benutzung von kommerziell erhältlichen, routinemäßig benutzten Ausgießmodeln aus Stahl und entsprechenden Plastikkassetten anhand der Zeichnung (1) näher erläutert. Die Gussform besteht aus 6 Komponenten:
- 1. den Platzhaltern A, welche vorzugsweise als 20 oder 30 mm lange, 1,0 mm durchmessende Zylinderstifte aus Edelstahl gearbeitet sind. Besonderer Wert muß hierbei auf den geradlinigen Verlauf der Zylinderstifte gelegt werden, da ansonsten das Durchstecken der Zylinderstifte durch die Bohrungen einer Materialplatte C und insbesondere das Herausziehen der Zylinderstifte aus dem erstarrten Paraffin nach dem Gießen sehr erschwert bis unmöglich wird. Ferner ist größter Wert auch auf die Oberflächenbeschaffenheit, d. h. die Polierung der Zylinderstifte, zu legen. Die Zylinderstifte dürfen beim Kontakt mit dem Paraffin keine Metallpartikel abgeben. Die Platzhalter A haben an einem Ende eine leichte Verformung B, welche vorzugsweise z. B. durch Kaltumformung (z. B. Pressen) erzeugt wird. Ein Auftragen von Material an einem Ende der Platzhalter, vorzugsweise von flüssigem, aushärtenden Kunststoff (vgl. Stecknadeln), ist ebenfalls möglich; diese Kunststoffe sind jedoch zumeist nicht Xylol-resistent und erschweren dadurch die Reinigung der Platzhalter. Diese Verformung soll bewirken, dass die Platzhalter nicht durch die Bohrungen D der Materialplatte C fallen. Diese Verformung dient als Widerlager beim Herausziehen der Platzhalter aus dem erstarrten Paraffin nach dem Gießen des Akzeptorblockes. Das der Verformung gegenüberliegende Ende der Platzhalter soll als ebene Querschnittsfläche ausgeführt sein.
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Der Durchmesser der Platzhalter kann entsprechend der Anforderungen des Benutzers zwischen 0,4 und 5 mm variieren. Die Bohrungen in den weiteren Bestandteilen der Gussform, z. B. der Materialplatte C, müssen selbstverständlich dem Durchmesser der verwendeten Platzhalter angepasst sein.
- 2. der 60 × 29 × 5 mm großen Materialplatte C („Zylinderstiftplatte”), vorzugsweise aus Edelstahl, mit zentral angelegten Bohrungen D (Fläche der Bohrungen: 34 × 19 mm; Bohrlochdurchmesser: z. B. 1,01 mm; Abstand der Bohrlöcher: 0,3 mm; Zahl der Bohrungen: etwa 300).
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Die Dicke der Materialplatte C soll mindestens 5 mm betragen, um die Platzhalter so präzise wie möglich zu positionieren, dass diese möglichst senkrecht zur Materialplatte C, zur Materialplatte H und zum Boden der Ausgießstahlmodel K ausgerichtet sind.
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Die Breite der Materialplatte C ist so gewählt, dass diese zwischen die oberen seitlichen Begrenzungsflächen L der kommerziell erhältlichen Ausgießstahlmodeln K (z. B. Tissue Tek, Sakura Finetek, Japan) passt.
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Die Fläche, auf welcher die Bohrungen D auf der Materialplatte C gesetzt werden, entspricht nahezu der Bodenfläche M der größten kommerziell erhältlichen Ausgießstahlmodel K, welche in etwa der von der kommerziell erhältlichen Plastikkassette I umgrenzten Freifläche J gleicht.
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Die vier, nahe der für die Platzhalter vorgesehenen Bohrungen D angelegten Bohrungen G (Durchmesser 2 mm) dienen zum Durchstecken von Zylinderstiften, vorzugsweise aus Edelstahl, zum Positionieren und Adaptieren der Materialplatte C mit der Materialplatte H und der Materialplatte N.
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Die an den Ecken der Materialplatte C angebrachten Gewindebohrungen F dienen zur Befestigung von vorzugsweise aus Kunststoff hergestellten Schrauben, womit die Materialplatte N an die Materialplatte C fixiert wird.
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Die zwei Gewindebohrungen E dienen zur Aufnahme von vorzugsweise aus Kunststoff hergestellten Schrauben („Abdrückschrauben”), womit die Materialplatte C zusammen mit den Platzhaltern und der Materialplatte N von der Materialplatte H, der Plastikkassette I, der Ausgießstahlmodel K und dem gegossenen Akzeptorblock nach dem Erstarren des Paraffins abgedrückt wird.
- 3. der 60 × 29 × 3 mm großen Materialplatte H („Lochplatte, Abdrückplatte”), welche entsprechend der Materialplatte C dimensioniert ist und ebenfalls die Bohrungen D für die Platzhalter A aufweist, wobei die Zahl, die Anordnung und der Durchmesser der Bohrungen denen der Materialplatte C entsprechen.
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Die Materialplatte H dient als Widerlager zur Materialplatte C beim Herausziehen der Platzhalter aus dem Akzeptorblock nach dem Gießen, wobei die Materialplatte H die durch das Herausziehen der Platzhalter erzeugte Kraft auf die Plastikkassette I oder direkt auf die Ausgießstahlmodel K überträgt.
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Ferner finden sich auf der Materialplatte H die Bohrungen G für die der Positionierung/Adaptierung der Materialplatten dienenden Zylinderstifte.
- 4. der 60 × 29 × 3 mm großen, vorzugsweise aus Edelstahl gefertigten Materialplatte N („Deckelplatte”), welche durch Fixierung an der Materialplatte C ein Herausfallen der lose in den Bohrungen der Materialplatte C befindlichen Platzhalter verhindern soll.
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Diese Fixierung der Materialplatte N an der Materialplatte C erfolgt durch vorzugsweise aus Kunststoff hergestellte Schrauben („Befestigungsschrauben”), welche durch eine Bohrung P in der Materialplatte N gesteckt und in der Gewindebohrung F der Materialplatte C eingeschraubt werden. Der Durchmesser der Bohrung P soll kleiner sein als der Durchmesser des Kopfes dieser Befestigungsschrauben.
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In der Materialplatte N finden sich wie in der Materialplatte C und H die gleichen Bohrungen G zum Durchstecken von vorzugsweise aus Edelstahl hergestellten Zylinderstiften zur Positionierung/Adaptierung der Materialplatten.
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In der Materialplatte N finden sich ferner zwei Bohrungen O zum Durchstecken der Abdrückschrauben, welche für die Gewindebohrung E der Materialplatte C vorgesehen sind. Der Durchmesser der Bohrung O muß größer sein als der Durchmesser des Kopfes der Abdrückschraube.
- 5. der kommerziell erhältlichen Plastikkassetten I, vorzugsweise dem Tissue Tek Paraform Cassette System von Sakura Finetek, Japan, bei welchem die Plastikkassette keinen Boden, sondern nur eine stabile seitliche Begrenzung aufweist. Die Plastikkassette I dient zur Befestigung des Akzeptorblockes am Mikrotom, mit dem der gefüllte Akzeptorblock, also der Gewebemultiblock (Tissue microarray) in etwa 2–5 μm dicke Scheiben aufgeschnitten wird. Der Akzeptorblock lässt sich jedoch auch ohne Plastikkassette gießen. Die Plastikkassette I kann auch noch später nach dem Befüllen des Akzeptorblockes z. B. mit Gewebeproben mit diesem mittels flüssigem Paraffin verbunden werden.
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Falls nur Plastikkassetten mit Bodenplatte zur Verfügung stehen, lässt sich die Bodenplatte leicht mittels einer Schere oder eines Messers von den Seitenwänden der Plastikkassette abschneiden.
- 6. der kommerziell erhältlichen Ausgießstahlmodel K, vorzugsweise der Modellreihe Tissue Tek der Firma Sakura Finetek, Japan.
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Zusammenstellung der Abkürzungen:
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- A
- = Platzhalter, vorzugsweise Zylinderstifte aus Edelstahl (Durchmesser 1,0 mm; Länge 20 oder 30 mm)
- B
- = Verformung der Zylinderstifte an einem Ende
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- C
- = 60 × 29 × 5 mm große Materialplatte („Zylinderstiftplatte”), vorzugsweise aus Edelstahl
- D
- = Bohrungen in der Materialplatte C (Bohrlochdurchmesser: z. B. 1,01 mm; Abstand der Bohrlöcher: 0,3 mm; Zahl der Bohrungen: etwa 300).
- E
- = Gewindebohrung für die vorzugsweise aus Kunststoff hergestellten Schrauben (Durchmesser: 35 × 5 mm) („Abdrückschrauben”), mit denen die Materialplatte C zusammen mit den Platzhaltern A von der Materialplatte H und dem gegossenen Akzeptorblock abgedrückt wird.
- F
- = Gewindebohrung für die vorzugsweise aus Kunststoff hergestellten Schrauben zur Befestigung der Materialplatte N
- G
- = Bohrungen zum Durchstecken von vorzugsweise Zylinderstiften aus Edelstahl zur Adaptierung der Materialplatten C, H und N.
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- H
- = 60 × 29 × 3 mm große Materialplatte („Lochplatte”, „Abdrückplatte”), vorzugsweise aus Edelstahl
- D
- = Bohrungen in der Materialplatte H entsprechend zu den Bohrungen in der Materialplatte C zur Aufnahme der Platzhalter A
- G
- = Bohrungen in der Materialplatte H entprechend zu den Bohrungen in der Materialplatte C zur Aufnahme von Zylinderstiften zur Positionierung/Adaptierung der Materialplatten C, H und N
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- N
- = 60 × 29 × 3 mm große Materialplatte („Deckelplatte”), vorzugsweise aus Edelstahl
- G
- = Bohrungen in der Materialplatte N entsprechend zu den Bohrungen in den Materialplatten C und H zur Aufnahme von Zylinderstiften zur Positionierung/Adaptierung der Materialplatten C, H und N
- O
- = Bohrungen zum Durchstecken der Abdrückschrauben, welche in die Gewindebohrung E der Materialplatte C zum Abdrücken der Materialplatte C zusammen mit den Platzhaltern A von der Materialplatte H eingeschraubt werden. Der Durchmesser der Bohrung O muß größer sein als der Durchmesser des Kopfes der Abdrückschraube.
- P
- = Bohrung zum Durchstecken der vorzugsweise aus Kunststoff gefertigten Befestigungsschrauben, welche in die Gewindebohrung F der Materialplatte C passen und dazu dienen, die Materialplatte N an der Materialplatte C zu fixieren und dadurch ein Herausfallen der lose eingesteckten Platzhalter A aus der Materialplatte C zu vermeiden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 01/42796 A1 [0001]
- WO 01/51910 A1 [0001]
- DE 00/04647 [0001]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Kononen et al. [0001]
- Vogel UF, Bueltmann B. Simple, inexpensive, and precise paraffin tissue microarrays constructed with a conventional microcompound table and a drill grinder. Am. J. Clin. Pathol. 2006; 126: 342–348 [0001]
- Vogel UF. Combining different techniques to construct paraffin tissue microarrays of superior quality. Histopathology, 2009; 54: 624–626 [0004]
