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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum automatischen Auswerten von
Zellbildern.
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Bislang
ist es weit verbreitet, bei Untersuchungen von Zellbildern beispielsweise
im Hinblick auf zeitabhängige
Merkmale wie Zellwachstum oder Differenzierung von Zellmerkmalen
der Zellbilder über
Bildaufnahmemittel wie ein Mikroskop zu sichten und beispielsweise
durch Auszählen
oder durch einen optischen Gesamteindruck zu bewerten. Diese langwierige
Vorgehensweise beinhaltet jedoch den für eine differenzierte Analyse
schwerwiegenden Nachteil von subjektiven Komponenten und anthropogenen
Fehlerraten.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum automatischen
Auswerten von Zellbildern anzugeben, das beim Auswerten von Zellbildern
schnell und automatisch ohne individuelle persönliche Beeinflussung durchführbar ist.
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Diese
Aufgabe wird bei einem Verfahren zum automatischen Auswerten von
Zellbildern mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst.
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Dadurch,
dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
auch Bereiche mit bestimmten Grauwerten ausgewählt und aus diesen ausgewählten Bereichen Objekte
selektiert werden, deren wenigstens ein Morphologieparameter innerhalb
eines vorbestimmten Selektionsparameterbereiches liegt, um diese
Objekte dann bezüglich
wenigstens eines vorbestimmten Messwertes auszuwerten, ist bei diesem
automatisierten Verfahren jegliche subjektive Komponente eliminiert.
Dadurch lassen sich insbesondere auch bei sehr differenziert ausgewählten mehreren
Selektionsparameterbereichen objektiv verläss lich und auch insbesondere
bei unterschiedlichen Proben in verschiedenen Versuchsreihen gewonnene
Messwerte untereinander mit hoher Verlässlichkeit vergleichen.
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Weitere
zweckmäßige Ausgestaltungen
der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
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Weitere
zweckmäßige Ausgestaltungen
und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung
von Ausführungsbeispielen mit
Bezug auf die Figuren der Zeichnung. Es zeigen:
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1 in
einer anschaulichen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines optischen
Aufbaus zum Gewinnen von Zellbildern, die mit einem beispielhaften
erfindungsgemäßen Verfahren
verarbeitet werden,
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2 bis 4 in
einem Blockschaubild die einzelnen Schritte beim Durchführen des
beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens,
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5 in
einer anschaulichen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines weiteren
optischen Aufbaus zum Gewinnen von Zellbildern, die mit einem weiteren
beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahren
verarbeitet werden, und
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6 bis 8 in
einem Blockschaubild die einzelnen Schritte beim Durchführen des
weiteren beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens.
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1 zeigt
in einer anschaulichen Darstellung eine beispielhafte Vorrichtung
zum automatischen Aufnehmen von Zellbildern, an denen ein weiter
unten näher
erläutertes
beispielhaftes erfindungsgemäßes Verfahren
durchgeführt
wird. Die Vorrichtung gemäß 1 verfügt über ein
Phasenkontrastdurchlichtmikroskop 1, mit dem ein eine Probe
tragender Probenträger 2 mit
Licht aus einer Lichtquelle 3 beleuchtbar ist, das vor
Beaufschlagen des Probenträgers 2 eine
der Lichtquelle 3 nachgeordnete erste Phasenplatte 4 und
eine erste Sammeloptik 5 zum Bündeln des aus der Lichtquelle 3 stammenden und über die
erste Phasenplatte 4 mit einer Phaseninformation behafteten
Lichts auf den Probenträger 2 durchläuft.
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Das
durch die auf den Probenträger 2 aufgebrachte
Probe durchgetretene Licht durchläuft eine dem Probenträger 2 nachgeordnete
zweite Sammeloptik 6 und eine zweite Phasenplatte 7 zum
Hervorrufen eines Zellbildes als Phasenkontrastbild auf einer CCD-Kamera 8 als
Bildaufnahmemittel in an sich bekannter Art und Weise. Die CCD-Kamera 8 ist
an einen Auswerterechner 9 angeschlossen, der zum Durchführen eines
nachfolgend erläuterten
beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens
eingerichtet ist.
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2 bis 5 zeigt
in einem Blockschaubild den Ablauf eines beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens
zum Durchführen
einer Proliferationsanalyse von Neurosphären. In einem Ausleseschritt 10 wird
das in der CCD-Kamera 8 gespeicherte Bild ausgelesen und
in einem nachfolgenden Kalibrierschritt 11 unter Berücksichtigung
der Abbildungsverhältnisse
des Phasenkontrastdurchlichtmikroskops 1 sowie der CCD-Kamera 8 auf
ein absolutes Flächenmaß pro Pixel
kalibriert. Anschließend wird
das kalibrierte Zellbild in einem Graustufenkonvertierungsschritt 12 in
ein Grauwertbild 13 konvertiert, bei dem eine Diskretisierung
der Grauwerte in eine endliche Anzahl von beispielsweise 256 (28) Grauwertstufen erfolgt, wobei in 2 ff.
zum Visualisieren von Objekten aus formalzeichnerischen Gründen lediglich
an Objektgrenzen auftretende signifikante Kontrastsprünge in den
Grauwerten als Linien dargestellt sind.
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In
einem dem Grauwertstufenkonvertierungsschritt 12 nachfolgenden
Extraktionsschritt 14 werden aus dem Grauwertbild 13 bei
diesem Ausführungsbeispiel
einen relativ großen
runden Bereich aufweisende Objekte in ein weiteres Grauwertbild 15 extrahiert,
so dass in dem Grauwertstufenkonvertierungsschritt 12 noch
enthaltene linienhafte Objekte ohne Bezug zu großen rundlichen Objekten verworfen
werden. Sollten keine derartigen rundlichen Objekt gefunden werden,
ist das Verfahren mit einem Abbruchschritt 16 beendet.
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Dem
Extraktionsschritt 14 nachfolgend wird ein Grauwertdiskriminierungsschritt 17 durchgeführt, bei
dem bei einem 8-Bit-stufigen Grauwertbild 15 Objekte mit
einem Grauwertbereich von beispielsweise einem Pixelwert von 60
bis 255 von anderen Bereichen diskriminiert werden. Diese Objekte
sind in dem Grauwertbild 18 gemäß 2 kreuzschraffiert
gekennzeichnet.
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Dem
Grauwertdiskriminierungsschritt 17 nachfolgend wird ein
Messbereichsdefinitionsschritt 19 durchgeführt, um
in dem Grauwertbild 18 einen in dem Grauwertbild 20 als
gestrichelter Kreis umrandeten Messbereich festzulegen. In einem
dem Messbereichsdefinitionsschritt 19 nachfolgenden Flächenselektionsschritt 21 als
ein Unterschritt des Selektionsschrittes werden in dem Messbereich
Objekte selektiert, die als ein Morphologieparameter eine Fläche aufweisen,
die in einem vorbestimmten Flächenselektionsparameterbereich
liegen und demnach eine Minimalfläche nicht unterschreiten sowie eine
Maximalfläche
nicht überschreiten.
Diese nach Durchführen
des Flächenselektionsschrittes 21 noch weiterhin
als relevant auszuwertenden Objekte sind in dem Grauwertbild 22 weiterhin
kreuzschraffiert gekennzeichnet. Falls innerhalb des Messbereiches keine
Objekte mit einer innerhalb des Flächenselektionsparameterbereiches liegenden
Fläche
enthalten sind, bricht das Verfahren mit dem Abbruchschritt 16 ab.
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Dem
Flächenselektionsschritt 21 nachfolgend
wird ansonsten ein Formselektionsschritt 23 als weiterer
Unterschritt des Selektionsschrittes durchgeführt, bei dem die bereits in
dem Flächenselektionsschritt 21 selektierten
Objekte nochmals selektiert werden, die zusätzlich zu einer vorbestimmten, innerhalb
des Flächenselektionsparameterbereiches liegenden
Fläche
eine durch einen Formparameterbereich parametrisierte Form als weiteren
Morphologieparameter aufweisen. Beispielsweise ist der Formparameterbereich
in dem Formselektionsschritt 23 durch einen Formfaktorbereich
für Ellipsen
in Gestalt eines ellipsoiden Formfaktors gegeben, der im Wesentlichen
rundliche Objekte mit gewissen ellipsoiden Abweichungen von einer
reinen Kreisform umfasst. In dem Grauwertbild 24 verbleibt
nach Durchführen
des Formselektionsschrittes 23 in dem Messbereich nunmehr
nur noch lediglich ein einziges, weiterhin mit Kreuzschraffur gekennzeichnetes
Objekt, das alle voranstehend erläuterten Selektionsbedingungen
kumulativ erfüllt
hat.
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Dem
Formselektionsschritt 23 nachfolgend wird bei der Proliferationsanalyse
in einem Radiusbestimmungsschritt 25 als Messwert der mittlere
Radius des in dem Grauwertbild 24 kreuzschraffiert gekennzeichneten
Objektes bestimmt und über
einen dem Radiusbestimmungsschritt 25 nachfolgenden Datenexportschritt 26 zur
Verwendung in einem abschließenden
Datenanalyseschritt 27 verarbeitet. In dem Datenanalyseschritt 27 werden
bei einer Proliferationsanalyse die mittleren Radien von die vorgenannten
Selektionskriterien erfüllenden
Objekten, die zu verschiedenen Zeitpunkten bei einem wiederholten Durchführen des
beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens
gewonnen worden sind, beispielsweise durch Abtragen der Zunahme
der mittleren Radien ausgewertet.
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Aus
der vorangehenden Beschreibung des beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Proliferationsanalyse ergibt sich, dass der mittlere Radius
der mit kumulativen parametrisierten Selektionsschritten ausgewählten Objekte
völlig
frei von anthropogenen Faktoren gewonnen worden ist. Dadurch können eine
Vielzahl von auch aus unterschiedlichen Proben gewonnene Zellbilder
objektiv in einer äußerst kurzen
Zeit ausgewertet werden.
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5 zeigt
in einer anschaulichen Darstellung eine weitere beispielhafte Vorrichtung
zum Durchführen
eines beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens. Das Ausführungsbeispiel
gemäß 5 verfügt über ein
Fluoreszenzmikroskop 28, mit dem aus einem Anregungslaser 29 stammende
Anregungsstrahlung über
eine Strahlaufweitoptik 30, über ein erstes Sperrfilter 31,
das im Wesentlichen nur für
den Spektralbereich des Anregungslichtes durchlässig ist, und durch einen dichromatischen Einkoppelspiegel 32 abgelenkt
durch ein in drei Raumrichtungen bewegliches Scanobjektiv 33 hindurch
auf eine Probe 34 lenkbar ist, die auf einem Probenträger 35 angeordnet
ist. Die auf dem Probenträger 35 aufgebrachte
Probe 34 enthält
Zellen, die mit hier zwei verschiedenen, durch den Anregungsstrahl
aktivierbaren Fluoreszenzfarbstoffen, nämlich zum einen zum Färben von
Zellkernen und zum anderen zum Färben
von Antikörpern,
markiert sind.
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Das
von der Probe 34 abgegebene Fluoreszenzlicht durchtritt
das Scanobjektiv 33 sowie den für den Frequenzbereich der Fluoreszenzstrahlung transmittiven
Einkoppelspiegel 32 und fällt nach Passieren eines für den Frequenzbereich
der Fluoreszenzstrahlung transmittiven, für den Frequenzbereich der Anregungsstrahlung
jedoch undurchlässigen,
zwischen zwei an die Emissionsbereiche der Fluoreszenzfarbstoffe
angepassten Frequenzbereichen schaltbaren zweiten Sperrfilter 36 nach
teilweise Reflexion an einem Strahlteiler 37 eine Okulareinsicht 38 und
nach Passieren des Strahlteilers 37 über eine Abbildungsoptik eine
CCD-Kamera 40 von Aufnahmemitteln zum Aufnehmen von Zellbildern.
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Die
CCD-Kamera 40 ist an einen Steuerrechner 41 angeschlossen,
der ebenfalls mit dem Fluoreszenzmikroskop 38 insbesondere
zum Steuern des Scanobjektives 33, dem zweiten Sperrfilter
zum Schalten desselben zwischen den beiden Frequenzbereichen sowie
mit dem Anregungslaser 29 zum Steuern desselben verbunden
ist. Der Steuerrechner 41 wiederum ist an einen Auswerterechner 42 angeschlossen,
mit dem das nachfolgend erläuterte
beispielhafte erfindungsgemäße Verfahren
zum Durchführen
einer Differenzierungsanalyse durchführbar ist.
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6 bis 8 zeigen
in einem Blockschaubild die Schritte des im Zusammenhang mit 5 angesprochenen
beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens
zum Durchführen
einer Differenzierungsanalyse. In einem Zellkernfärbungsbildausleseschritt 43 ist
das von der CCD-Kamera 40 bei einer Transmissionsstellung
des zweiten Sperrfilters 30 aufgenommene Zellbild auslesbar,
das für
fluoreszierende Bereiche charakteristisch ist, deren Fluoreszenzlicht durch
den für
das Markieren von Zellkernen verwendeten Farbstoff erzeugt worden
ist. In einem bei dem Zellkernfärbungsbildausleseschritt 43 gewonnenes Zellkernfärbungsbild 44 wird
in einem nachfolgenden Kalibrierschritt 45 unter Berücksichtigung
der Abbildungsverhältnisse
des Fluoreszenzmikroskops 28 sowie der CCD-Kamera 40 auf
absolute Flächenmaße umgerechnet.
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Bei
einem dem Kalibrierschritt 40 nachfolgenden Messbereichsdefinitionsschritt 46 wird
ein in einem weiteren Zellkernfärbungsbild 47 gestrichelt dargestellter
Messbereich festgelegt, der einen für die Differenzanalyse ausreichenden
Teil des Zellkernfärbungsbildes 47 umfasst.
Die Größe des Messbereiches
wird in Abhängigkeit
der Auswertefragestellung festgelegt. Zur Analyse spezifischer Regionen wie
bei einer Einwanderung von Zellen in einen zuvor zellfreien Bereich
oder bei einem Zell-Zell-Kontakt zwischen definierten Zelltypen
ist es zweckmäßig, einen
relativ kleinen Messbereich innerhalb des Zellkernfärbungsbildes 47 festzulegen. Zur
Analyse eines gesamten Zellverbandes erfasst der Messbereich beispielsweise
auch das vollständige
Zellkernfärbungsbild 47.
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In
einem dem Messbereichsdefinitionsschritt 46 nachfolgenden
Grauwertdiskriminierungsschritt 48 wird in dem Zellkernfärbungsbild 47 innerhalb
des Messbereiches die Intensität
der Zellkernfluoreszenzstrahlung in eine endliche Anzahl von diskreten, beispielsweise
256 (28) Grauwertstufen umgewandelt, was
zu einem Zellkerngrauwertbild 49 führt. Weiterhin werden in dem
Grauwertdiskriminierungsschritt 48 Objekte eliminiert,
deren Grauwerte nicht innerhalb eines vorbestimmten Grauwertstufenparameterbereiches
liegen.
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In
einem dem Grauwertdiskriminierungsschritt 48 nachfolgenden
Morphologieselektionsschritt 50 als Selektionsschritt werden
die in dem Messbereich liegenden Objekte in dem Zellkerngrauwertbild 49 bezüglich einer
innerhalb eines Flächenselektionsparameterbereiches
liegenden Fläche
als ein Morphologieparameter und innerhalb eines Formparameterbereiches
liegenden Formparametern als weitere Morphologieparameter von anderen Objekten
diskriminiert und zum weiteren Auswerten selektiert. Bei dem beispielhaften
erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel
werden in dem Morphologieselektionsschritt 50 Objekte mit
einer zwischen einer Minimalfläche
sowie einer Maximalfläche
liegenden Fläche
und mit innerhalb bestimmter ellipsoider Exzentrizitätsparametern
liegenden ellipsoiden Formfaktoren selektiert, um zu kleine, zu
große
und zu stark von einer rundlichen Form abweichende Objekte für die weitere
Auswertung zu verwerfen, wie dies in dem Zellkerngrauwertbild 51 durch
Aufheben einer Flächenfüllung in
einem kantigen Objekt und in einem kleinen runden Objekt anschaulich
dargestellt ist.
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Dem
Morphologieselektionsschritt 50 folgt ein Messzonenerzeugungsschritt 52 nach,
bei dem, wie in dem Zellkerngrauwertbild 53 anschaulich
dargestellt, um jedes selektierte Objekt zum Beschleunigen der nachfolgenden
Bearbeitung eine Messzone gelegt wird.
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Nach
dem Messzonenerzeugungsschritt 52 wird in einem Zellkernzahlbestimmungsschritt 54 die Anzahl
der in den Messzonen enthaltenen Zellkerne dadurch bestimmt, dass
ausgehend von einer vorbestimmten, für die zu zählenden Zellkerne typischen Zellkernstandardfläche Zellkernflächen, die
größer als
die Zellkernstandardfläche
ist, multipliziert mit einem Überlagerungsfaktor
zwischen etwa 1,5 bis 1,9 als für
zwei Zellkerne charakteristisch bestimmt werden. Dies ist beispielsweise
bei dem in dem Zellkerngrauwertbild 55 mit „G.” gekennzeichneten
Objekt der Fall, während
die mit „A.” bis „F.” gekennzeichneten
Objekte trotz gewisser Größenabweichungen
von einer nahe bei dem Objekt „A.” liegenden
Standardzellkernfläche
jeweils nur einem Zellkern zugeordnet ist.
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Die
in dem Zellkernzahlbestimmungsschritt 54 aus dem einer
kumulativen Selektionsprozedur unterworfenen Zellkerngrauwertbild 55 bestimmte Anzahl
von Zellkernen wird über
einen Datenexportschritt 56 einem Datenanalyseschritt 57 zugeführt, mit
dem beispielsweise die Anzahl von Zellkernen in einem flächenmäßig vorbestimmten
Messbereich zu verschiedenen Zeitpunkten beim Durchführen des beispielhaften
erfindungsgemäßen Verfahrens
ausgewertet werden.
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Entsprechend
dem Zellkernfärbungsbildausleseschritt 53 gemäß 6 und 7 erfolgt
gemäß 8 weiterhin
ein Antikörperfärbungsbildausleseschritt 58,
bei dem aus dem von der CCD-Kamera 40 in
der anderen Transmissionsstellung des zweiten Sperrfilters 36 aufgenommenen
Zellbild die Signale aus einem für
eine Antikörperfärbung charakteristischen
Spektralbereich, der von dem Spektralbereich bei der Zellkernfärbung verschieden
ist, ausgelesen werden und zu einem Zellkernfärbungsbild 59 führen. In
einem Messbereichsimportschritt 60 wird der in dem Messbereichsdefinitionsschritt 46 bestimmte Messbereich
importiert und, wie in dem Zellkernfärbungsbild 61 gemäß 8 durch
eine gestrichelte Linie dargestellt, auf das Zellkernfärbungsbild 61 gelegt.
In einem dem Messbereichsimportschritt 60 nachfolgenden
Grauwertdiskriminierungsschritt 62 das Zellkernfärbungsbild 63 zum
Gewinnen eines Antikörperexpressionsverhältnisses
dahingehend ausgewertet, welcher Flächenanteil des Zellkernfärbungsbildes 63 in
dem Messbereich oberhalb eines vorbestimmten Grauwertgrenzwertes
und welcher Flächenanteil
in dem Messbereich unterhalb dieses Grauwertgrenzwertes liegt.
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In
einem dem Grauwertdiskriminierungsschritt 62 nachfolgenden
Datenexportschritt 64 wird dieses Verhältnis dem Datenanalyseschritt 57 zugeführt, so
dass nunmehr wie in 7 und 8 jeweils
mit den weiteren Zuweisungspfeilen anschaulich dargestellt, in dem
Datenanalysenschritt 57 die Anzahl der Zellkerne mit dem
Antikörperexpressionsverhältnis korreliert
werden kann und somit ein Maß für die Differenzierung
und/oder die Reifung von Zellen objektiv bestimmbar ist.