DE102008027403A1 - Zellbildauswertung - Google Patents

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Abstract

Bei dem Verfahren zum automatischen Auswerten von Zellbildern werden aus einem Grauwertbild mit innerhalb eines Grauwertdiskriminierungsbereiches liegenden Grauwerten ausgewählt und aus diesen Bereichen Objektes ausgewählt, die mit wenigstens einem Morphologieparameter innerhalb wenigstens eines vorbestimmten Selektionsparameterbereiches liegen. Die selektierten Objekte werden anschließend bezüglich wenigstens eines vorbestimmten Messwertes ausgewertet. Dadurch lassen sich Zellbilder verschiedenster Art automatisch auswerten.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum automatischen Auswerten von Zellbildern.
  • Bislang ist es weit verbreitet, bei Untersuchungen von Zellbildern beispielsweise im Hinblick auf zeitabhängige Merkmale wie Zellwachstum oder Differenzierung von Zellmerkmalen der Zellbilder über Bildaufnahmemittel wie ein Mikroskop zu sichten und beispielsweise durch Auszählen oder durch einen optischen Gesamteindruck zu bewerten. Diese langwierige Vorgehensweise beinhaltet jedoch den für eine differenzierte Analyse schwerwiegenden Nachteil von subjektiven Komponenten und anthropogenen Fehlerraten.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum automatischen Auswerten von Zellbildern anzugeben, das beim Auswerten von Zellbildern schnell und automatisch ohne individuelle persönliche Beeinflussung durchführbar ist.
  • Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren zum automatischen Auswerten von Zellbildern mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst.
  • Dadurch, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch Bereiche mit bestimmten Grauwerten ausgewählt und aus diesen ausgewählten Bereichen Objekte selektiert werden, deren wenigstens ein Morphologieparameter innerhalb eines vorbestimmten Selektionsparameterbereiches liegt, um diese Objekte dann bezüglich wenigstens eines vorbestimmten Messwertes auszuwerten, ist bei diesem automatisierten Verfahren jegliche subjektive Komponente eliminiert. Dadurch lassen sich insbesondere auch bei sehr differenziert ausgewählten mehreren Selektionsparameterbereichen objektiv verläss lich und auch insbesondere bei unterschiedlichen Proben in verschiedenen Versuchsreihen gewonnene Messwerte untereinander mit hoher Verlässlichkeit vergleichen.
  • Weitere zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
  • Weitere zweckmäßige Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen mit Bezug auf die Figuren der Zeichnung. Es zeigen:
  • 1 in einer anschaulichen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines optischen Aufbaus zum Gewinnen von Zellbildern, die mit einem beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahren verarbeitet werden,
  • 2 bis 4 in einem Blockschaubild die einzelnen Schritte beim Durchführen des beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens,
  • 5 in einer anschaulichen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines weiteren optischen Aufbaus zum Gewinnen von Zellbildern, die mit einem weiteren beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahren verarbeitet werden, und
  • 6 bis 8 in einem Blockschaubild die einzelnen Schritte beim Durchführen des weiteren beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • 1 zeigt in einer anschaulichen Darstellung eine beispielhafte Vorrichtung zum automatischen Aufnehmen von Zellbildern, an denen ein weiter unten näher erläutertes beispielhaftes erfindungsgemäßes Verfahren durchgeführt wird. Die Vorrichtung gemäß 1 verfügt über ein Phasenkontrastdurchlichtmikroskop 1, mit dem ein eine Probe tragender Probenträger 2 mit Licht aus einer Lichtquelle 3 beleuchtbar ist, das vor Beaufschlagen des Probenträgers 2 eine der Lichtquelle 3 nachgeordnete erste Phasenplatte 4 und eine erste Sammeloptik 5 zum Bündeln des aus der Lichtquelle 3 stammenden und über die erste Phasenplatte 4 mit einer Phaseninformation behafteten Lichts auf den Probenträger 2 durchläuft.
  • Das durch die auf den Probenträger 2 aufgebrachte Probe durchgetretene Licht durchläuft eine dem Probenträger 2 nachgeordnete zweite Sammeloptik 6 und eine zweite Phasenplatte 7 zum Hervorrufen eines Zellbildes als Phasenkontrastbild auf einer CCD-Kamera 8 als Bildaufnahmemittel in an sich bekannter Art und Weise. Die CCD-Kamera 8 ist an einen Auswerterechner 9 angeschlossen, der zum Durchführen eines nachfolgend erläuterten beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet ist.
  • 2 bis 5 zeigt in einem Blockschaubild den Ablauf eines beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens zum Durchführen einer Proliferationsanalyse von Neurosphären. In einem Ausleseschritt 10 wird das in der CCD-Kamera 8 gespeicherte Bild ausgelesen und in einem nachfolgenden Kalibrierschritt 11 unter Berücksichtigung der Abbildungsverhältnisse des Phasenkontrastdurchlichtmikroskops 1 sowie der CCD-Kamera 8 auf ein absolutes Flächenmaß pro Pixel kalibriert. Anschließend wird das kalibrierte Zellbild in einem Graustufenkonvertierungsschritt 12 in ein Grauwertbild 13 konvertiert, bei dem eine Diskretisierung der Grauwerte in eine endliche Anzahl von beispielsweise 256 (28) Grauwertstufen erfolgt, wobei in 2 ff. zum Visualisieren von Objekten aus formalzeichnerischen Gründen lediglich an Objektgrenzen auftretende signifikante Kontrastsprünge in den Grauwerten als Linien dargestellt sind.
  • In einem dem Grauwertstufenkonvertierungsschritt 12 nachfolgenden Extraktionsschritt 14 werden aus dem Grauwertbild 13 bei diesem Ausführungsbeispiel einen relativ großen runden Bereich aufweisende Objekte in ein weiteres Grauwertbild 15 extrahiert, so dass in dem Grauwertstufenkonvertierungsschritt 12 noch enthaltene linienhafte Objekte ohne Bezug zu großen rundlichen Objekten verworfen werden. Sollten keine derartigen rundlichen Objekt gefunden werden, ist das Verfahren mit einem Abbruchschritt 16 beendet.
  • Dem Extraktionsschritt 14 nachfolgend wird ein Grauwertdiskriminierungsschritt 17 durchgeführt, bei dem bei einem 8-Bit-stufigen Grauwertbild 15 Objekte mit einem Grauwertbereich von beispielsweise einem Pixelwert von 60 bis 255 von anderen Bereichen diskriminiert werden. Diese Objekte sind in dem Grauwertbild 18 gemäß 2 kreuzschraffiert gekennzeichnet.
  • Dem Grauwertdiskriminierungsschritt 17 nachfolgend wird ein Messbereichsdefinitionsschritt 19 durchgeführt, um in dem Grauwertbild 18 einen in dem Grauwertbild 20 als gestrichelter Kreis umrandeten Messbereich festzulegen. In einem dem Messbereichsdefinitionsschritt 19 nachfolgenden Flächenselektionsschritt 21 als ein Unterschritt des Selektionsschrittes werden in dem Messbereich Objekte selektiert, die als ein Morphologieparameter eine Fläche aufweisen, die in einem vorbestimmten Flächenselektionsparameterbereich liegen und demnach eine Minimalfläche nicht unterschreiten sowie eine Maximalfläche nicht überschreiten. Diese nach Durchführen des Flächenselektionsschrittes 21 noch weiterhin als relevant auszuwertenden Objekte sind in dem Grauwertbild 22 weiterhin kreuzschraffiert gekennzeichnet. Falls innerhalb des Messbereiches keine Objekte mit einer innerhalb des Flächenselektionsparameterbereiches liegenden Fläche enthalten sind, bricht das Verfahren mit dem Abbruchschritt 16 ab.
  • Dem Flächenselektionsschritt 21 nachfolgend wird ansonsten ein Formselektionsschritt 23 als weiterer Unterschritt des Selektionsschrittes durchgeführt, bei dem die bereits in dem Flächenselektionsschritt 21 selektierten Objekte nochmals selektiert werden, die zusätzlich zu einer vorbestimmten, innerhalb des Flächenselektionsparameterbereiches liegenden Fläche eine durch einen Formparameterbereich parametrisierte Form als weiteren Morphologieparameter aufweisen. Beispielsweise ist der Formparameterbereich in dem Formselektionsschritt 23 durch einen Formfaktorbereich für Ellipsen in Gestalt eines ellipsoiden Formfaktors gegeben, der im Wesentlichen rundliche Objekte mit gewissen ellipsoiden Abweichungen von einer reinen Kreisform umfasst. In dem Grauwertbild 24 verbleibt nach Durchführen des Formselektionsschrittes 23 in dem Messbereich nunmehr nur noch lediglich ein einziges, weiterhin mit Kreuzschraffur gekennzeichnetes Objekt, das alle voranstehend erläuterten Selektionsbedingungen kumulativ erfüllt hat.
  • Dem Formselektionsschritt 23 nachfolgend wird bei der Proliferationsanalyse in einem Radiusbestimmungsschritt 25 als Messwert der mittlere Radius des in dem Grauwertbild 24 kreuzschraffiert gekennzeichneten Objektes bestimmt und über einen dem Radiusbestimmungsschritt 25 nachfolgenden Datenexportschritt 26 zur Verwendung in einem abschließenden Datenanalyseschritt 27 verarbeitet. In dem Datenanalyseschritt 27 werden bei einer Proliferationsanalyse die mittleren Radien von die vorgenannten Selektionskriterien erfüllenden Objekten, die zu verschiedenen Zeitpunkten bei einem wiederholten Durchführen des beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen worden sind, beispielsweise durch Abtragen der Zunahme der mittleren Radien ausgewertet.
  • Aus der vorangehenden Beschreibung des beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens zur Proliferationsanalyse ergibt sich, dass der mittlere Radius der mit kumulativen parametrisierten Selektionsschritten ausgewählten Objekte völlig frei von anthropogenen Faktoren gewonnen worden ist. Dadurch können eine Vielzahl von auch aus unterschiedlichen Proben gewonnene Zellbilder objektiv in einer äußerst kurzen Zeit ausgewertet werden.
  • 5 zeigt in einer anschaulichen Darstellung eine weitere beispielhafte Vorrichtung zum Durchführen eines beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens. Das Ausführungsbeispiel gemäß 5 verfügt über ein Fluoreszenzmikroskop 28, mit dem aus einem Anregungslaser 29 stammende Anregungsstrahlung über eine Strahlaufweitoptik 30, über ein erstes Sperrfilter 31, das im Wesentlichen nur für den Spektralbereich des Anregungslichtes durchlässig ist, und durch einen dichromatischen Einkoppelspiegel 32 abgelenkt durch ein in drei Raumrichtungen bewegliches Scanobjektiv 33 hindurch auf eine Probe 34 lenkbar ist, die auf einem Probenträger 35 angeordnet ist. Die auf dem Probenträger 35 aufgebrachte Probe 34 enthält Zellen, die mit hier zwei verschiedenen, durch den Anregungsstrahl aktivierbaren Fluoreszenzfarbstoffen, nämlich zum einen zum Färben von Zellkernen und zum anderen zum Färben von Antikörpern, markiert sind.
  • Das von der Probe 34 abgegebene Fluoreszenzlicht durchtritt das Scanobjektiv 33 sowie den für den Frequenzbereich der Fluoreszenzstrahlung transmittiven Einkoppelspiegel 32 und fällt nach Passieren eines für den Frequenzbereich der Fluoreszenzstrahlung transmittiven, für den Frequenzbereich der Anregungsstrahlung jedoch undurchlässigen, zwischen zwei an die Emissionsbereiche der Fluoreszenzfarbstoffe angepassten Frequenzbereichen schaltbaren zweiten Sperrfilter 36 nach teilweise Reflexion an einem Strahlteiler 37 eine Okulareinsicht 38 und nach Passieren des Strahlteilers 37 über eine Abbildungsoptik eine CCD-Kamera 40 von Aufnahmemitteln zum Aufnehmen von Zellbildern.
  • Die CCD-Kamera 40 ist an einen Steuerrechner 41 angeschlossen, der ebenfalls mit dem Fluoreszenzmikroskop 38 insbesondere zum Steuern des Scanobjektives 33, dem zweiten Sperrfilter zum Schalten desselben zwischen den beiden Frequenzbereichen sowie mit dem Anregungslaser 29 zum Steuern desselben verbunden ist. Der Steuerrechner 41 wiederum ist an einen Auswerterechner 42 angeschlossen, mit dem das nachfolgend erläuterte beispielhafte erfindungsgemäße Verfahren zum Durchführen einer Differenzierungsanalyse durchführbar ist.
  • 6 bis 8 zeigen in einem Blockschaubild die Schritte des im Zusammenhang mit 5 angesprochenen beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens zum Durchführen einer Differenzierungsanalyse. In einem Zellkernfärbungsbildausleseschritt 43 ist das von der CCD-Kamera 40 bei einer Transmissionsstellung des zweiten Sperrfilters 30 aufgenommene Zellbild auslesbar, das für fluoreszierende Bereiche charakteristisch ist, deren Fluoreszenzlicht durch den für das Markieren von Zellkernen verwendeten Farbstoff erzeugt worden ist. In einem bei dem Zellkernfärbungsbildausleseschritt 43 gewonnenes Zellkernfärbungsbild 44 wird in einem nachfolgenden Kalibrierschritt 45 unter Berücksichtigung der Abbildungsverhältnisse des Fluoreszenzmikroskops 28 sowie der CCD-Kamera 40 auf absolute Flächenmaße umgerechnet.
  • Bei einem dem Kalibrierschritt 40 nachfolgenden Messbereichsdefinitionsschritt 46 wird ein in einem weiteren Zellkernfärbungsbild 47 gestrichelt dargestellter Messbereich festgelegt, der einen für die Differenzanalyse ausreichenden Teil des Zellkernfärbungsbildes 47 umfasst. Die Größe des Messbereiches wird in Abhängigkeit der Auswertefragestellung festgelegt. Zur Analyse spezifischer Regionen wie bei einer Einwanderung von Zellen in einen zuvor zellfreien Bereich oder bei einem Zell-Zell-Kontakt zwischen definierten Zelltypen ist es zweckmäßig, einen relativ kleinen Messbereich innerhalb des Zellkernfärbungsbildes 47 festzulegen. Zur Analyse eines gesamten Zellverbandes erfasst der Messbereich beispielsweise auch das vollständige Zellkernfärbungsbild 47.
  • In einem dem Messbereichsdefinitionsschritt 46 nachfolgenden Grauwertdiskriminierungsschritt 48 wird in dem Zellkernfärbungsbild 47 innerhalb des Messbereiches die Intensität der Zellkernfluoreszenzstrahlung in eine endliche Anzahl von diskreten, beispielsweise 256 (28) Grauwertstufen umgewandelt, was zu einem Zellkerngrauwertbild 49 führt. Weiterhin werden in dem Grauwertdiskriminierungsschritt 48 Objekte eliminiert, deren Grauwerte nicht innerhalb eines vorbestimmten Grauwertstufenparameterbereiches liegen.
  • In einem dem Grauwertdiskriminierungsschritt 48 nachfolgenden Morphologieselektionsschritt 50 als Selektionsschritt werden die in dem Messbereich liegenden Objekte in dem Zellkerngrauwertbild 49 bezüglich einer innerhalb eines Flächenselektionsparameterbereiches liegenden Fläche als ein Morphologieparameter und innerhalb eines Formparameterbereiches liegenden Formparametern als weitere Morphologieparameter von anderen Objekten diskriminiert und zum weiteren Auswerten selektiert. Bei dem beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel werden in dem Morphologieselektionsschritt 50 Objekte mit einer zwischen einer Minimalfläche sowie einer Maximalfläche liegenden Fläche und mit innerhalb bestimmter ellipsoider Exzentrizitätsparametern liegenden ellipsoiden Formfaktoren selektiert, um zu kleine, zu große und zu stark von einer rundlichen Form abweichende Objekte für die weitere Auswertung zu verwerfen, wie dies in dem Zellkerngrauwertbild 51 durch Aufheben einer Flächenfüllung in einem kantigen Objekt und in einem kleinen runden Objekt anschaulich dargestellt ist.
  • Dem Morphologieselektionsschritt 50 folgt ein Messzonenerzeugungsschritt 52 nach, bei dem, wie in dem Zellkerngrauwertbild 53 anschaulich dargestellt, um jedes selektierte Objekt zum Beschleunigen der nachfolgenden Bearbeitung eine Messzone gelegt wird.
  • Nach dem Messzonenerzeugungsschritt 52 wird in einem Zellkernzahlbestimmungsschritt 54 die Anzahl der in den Messzonen enthaltenen Zellkerne dadurch bestimmt, dass ausgehend von einer vorbestimmten, für die zu zählenden Zellkerne typischen Zellkernstandardfläche Zellkernflächen, die größer als die Zellkernstandardfläche ist, multipliziert mit einem Überlagerungsfaktor zwischen etwa 1,5 bis 1,9 als für zwei Zellkerne charakteristisch bestimmt werden. Dies ist beispielsweise bei dem in dem Zellkerngrauwertbild 55 mit „G.” gekennzeichneten Objekt der Fall, während die mit „A.” bis „F.” gekennzeichneten Objekte trotz gewisser Größenabweichungen von einer nahe bei dem Objekt „A.” liegenden Standardzellkernfläche jeweils nur einem Zellkern zugeordnet ist.
  • Die in dem Zellkernzahlbestimmungsschritt 54 aus dem einer kumulativen Selektionsprozedur unterworfenen Zellkerngrauwertbild 55 bestimmte Anzahl von Zellkernen wird über einen Datenexportschritt 56 einem Datenanalyseschritt 57 zugeführt, mit dem beispielsweise die Anzahl von Zellkernen in einem flächenmäßig vorbestimmten Messbereich zu verschiedenen Zeitpunkten beim Durchführen des beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens ausgewertet werden.
  • Entsprechend dem Zellkernfärbungsbildausleseschritt 53 gemäß 6 und 7 erfolgt gemäß 8 weiterhin ein Antikörperfärbungsbildausleseschritt 58, bei dem aus dem von der CCD-Kamera 40 in der anderen Transmissionsstellung des zweiten Sperrfilters 36 aufgenommenen Zellbild die Signale aus einem für eine Antikörperfärbung charakteristischen Spektralbereich, der von dem Spektralbereich bei der Zellkernfärbung verschieden ist, ausgelesen werden und zu einem Zellkernfärbungsbild 59 führen. In einem Messbereichsimportschritt 60 wird der in dem Messbereichsdefinitionsschritt 46 bestimmte Messbereich importiert und, wie in dem Zellkernfärbungsbild 61 gemäß 8 durch eine gestrichelte Linie dargestellt, auf das Zellkernfärbungsbild 61 gelegt. In einem dem Messbereichsimportschritt 60 nachfolgenden Grauwertdiskriminierungsschritt 62 das Zellkernfärbungsbild 63 zum Gewinnen eines Antikörperexpressionsverhältnisses dahingehend ausgewertet, welcher Flächenanteil des Zellkernfärbungsbildes 63 in dem Messbereich oberhalb eines vorbestimmten Grauwertgrenzwertes und welcher Flächenanteil in dem Messbereich unterhalb dieses Grauwertgrenzwertes liegt.
  • In einem dem Grauwertdiskriminierungsschritt 62 nachfolgenden Datenexportschritt 64 wird dieses Verhältnis dem Datenanalyseschritt 57 zugeführt, so dass nunmehr wie in 7 und 8 jeweils mit den weiteren Zuweisungspfeilen anschaulich dargestellt, in dem Datenanalysenschritt 57 die Anzahl der Zellkerne mit dem Antikörperexpressionsverhältnis korreliert werden kann und somit ein Maß für die Differenzierung und/oder die Reifung von Zellen objektiv bestimmbar ist.

Claims (10)

  1. Verfahren zum automatischen Auswerten von Zellbildern, das die aufeinanderfolgenden Schritte aufweist – Aufnehmen eines Zellbildes als Grauwertbild (13, 44), – Auswählen von Bereichen des Grauwertbildes (13, 44) mit innerhalb eines vorbestimmten Diskriminierungsbereiches liegenden Grauwerten in einem Grauwertdiskriminierungsschritt (17, 48), – Selektieren von Objekten des grauwertdiskriminierten Grauwertbildes (18, 49), die mit wenigstens einem Morphologieparameter innerhalb wenigstens eines vorbestimmten Selektionsparameterbereiches liegen, in einem Selektionsschritt (21, 23; 50) und – Auswerten der selektierten Objekte des grauwertdiskriminierten Grauwertbildes (24, 55) bezüglich wenigstens eines vorbestimmten Messwertes.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Schritt des Aufnehmens eines Zellbildes als Grauwertbild (13, 44) ein Schritt (19, 46) des Festlegens eines Messbereiches durchgeführt wird, innerhalb dem die nachfolgenden Schritte ausgeführt werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Schritt des Aufnehmens eines Zellbildes als Grauwertbild (13, 44) ein Schritt (11, 45) des Kalibrierens eines Flächenbereiches des Grauwertbildes (13, 44) auf ein absolutes Flächenmaß durchgeführt wird.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Aufnehmens eines Zellbildes als Grauwertbild (13, 44) einen Schritt (12) des Umwandelns des Zellbildes in ein Grauwertbild (13) mit einer endlichen Anzahl von diskreten Grauwertstufen aufweist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Selektierens von Objekten des grauwertdiskriminierten Grauwertbildes (13, 47) einen Unterschritt (21) des Selektierens von Objekten aus einem Flächenselektionsparameterbereich und aus diesen Objekten einen Unterschritt (23) des Selektierens von Objekten aus einem Formparameterbereich aufweist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Formparameterbereich ein für Ellipsen charakteristischer Formfaktorbereich ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 und Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Schritt (62) des Bestimmens des Flächenverhältnisses von innerhalb eines vorbestimmten Grauwertstufenbereiches liegenden Flächen zu außerhalb des Grauwertstufenbereiches liegenden Flächen durchgeführt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Schritt des Auswertens die Objekte gezählt und zu dem Flächenverhältnis in Beziehung gesetzt werden.
  9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Schritt (27, 57) des Auswertens der mittlere Radius der Objekte bestimmt wird.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten an jeweils einer gleichen Probe durchgeführt wird und der Schritt des Auswertens das Aufzeichnen des oder jedes Messwertes über die Zeitpunkte aufweist.
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