DE102008018155A1

DE102008018155A1 - Agglutinationstest und Kit zum Nachweis von Antikörpern in einer flüssigen Probe, insbesondere in einer Plasma- oder Serumprobe

Info

Publication number: DE102008018155A1
Application number: DE200810018155
Authority: DE
Original assignee: Olympus Life Science Research Europa GmbH
Current assignee: Beckman Coulter Biomedical Ltd
Priority date: 2008-04-08
Filing date: 2008-04-08
Publication date: 2009-10-15

Abstract

Agglutinationstest zum Nachweis von Antikörpern in einer Probenflüssigkeit, insbesondere in einer Plasma- oder Serumprobe, bei dem ein Testansatz enthaltend verdünnte Probenflüssigkeit in einer Konzentration zwischen 20% und 40% der Ausgangskonzentration, ein erythrozytenhaltiges Testreagenz, ein die Abstoßung zwischen Erythrozyten herabsetzendes Reagenz sowie eine Antikörper vernetzende Substanz in einem Reaktionsgefäß mit einen stufentrichterförmig zulaufenden Boden inkubiert wird, wobei vor und während der Inkubation kein Trennschritt vorgesehen ist, und nach Inkubation zur Auswertung optisch jeweils ein Sedimentationsbild in einem inneren und in einem den inneren Bereich umgebenden Bereich des Bodens des Reaktionsgefäßes erfasst wird und über einen Vergleich beider Bilder auf das Vorliegen oder nicht Vorliegen einer eventuellen Agglutination geschlossen wird.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen Agglutinationstest nach dem Oberbegriff des Anspruches 1 sowie auf einen Kit für einen derartigen Agglutinationstest.
Gattungsgemäße Tests werden insbesondere im Rahmen der Blutgruppenserologie zur Untersuchung von Spenderserum bzw. -plasma auf eventuell darin enthaltene erythrozytäre Antikörper durchgeführt.
Es handelt sich dabei um Flüssigkeitstests, bei denen eine Plasma- bzw. Serumprobe mit Erythrozyten bekannter Antigenizität und einer Substanz inkubiert wird, die in der Lage ist, eventuell in der Probe enthaltene, im Zuge der Inkubation an die Erythrozyten gebundene Antikörper, miteinander zu vernetzen. Die Erythrozyten sind so gewählt, dass sie für die gesuchten Antikörper spezifisch sind.
In der Regel sind die in der Probe enthaltenen interessierenden Antikörper vom IgG-Typ. Eine gängige zur Vernetzung eingesetzte Substanz, das sogenannte Coombs-Serum, enthält daher anti-IgG-Antikörper. Es ist aber auch bekannt, zur Vernetzung von IgG- aber auch eventueller IgM-Antikörper Protein A oder Lektine oder auch anti-IgM-Antikörper einzusetzen.
Nach Inkubation wird überprüft, ob in dem Testansatz eine auf eine Antigen-Antikörperbindung zurückzuführende Agglutination stattgefunden hat. In der Regel kommt es sowohl bei positiven als auch negativen Reaktionen zu einer Sedimentation in dem zur Inkubation verwendeten Reaktionsgefäß. Je nach Durchführung des Tests, bzw. Auswahl der verwendeten Reaktionsgefäße, ergeben sich für positive und negative Reaktionen unterschiedliche charakteristische Sedimentationsbilder, die im Rahmen einer optischen Untersuchung ausgewertet werden können.
Ein Problem bei vielen Tests ist, dass sie relativ störanfällig sind und deswegen, insbesondere auch im Hinblick auf die mit einer eventuellen Fehlinterpretation verbundenen Risiken, eine Automatisierung ohne Trennschritt nicht oder nur schwer möglich ist.
Zur Erhöhung der Eindeutigkeit wird daher in nicht gattungsgemäßen Verfahren ein Wasch- oder Zentrifugationsschritt vorgesehen, mit dem eventuell interferierende Substanzen, insbesondere nichterythrozytäre Antikörper vor der Zugabe z. B. des Coombs-Serums entfernt werden. Ein solcher Trennschritt stellt allerdings einen zusätzlichen Aufwand dar, wodurch der analytische Durchsatz des jeweiligen Systems stark herabgesetzt wird.
Ein gattungsgemäßes Verfahren, das keinen Wasch- bzw. Trennschritt vorsieht, ist z. B. aus der DE 198 56 703 bekannt.
Bei dem bekannten Verfahren wird die Probe zunächst verdünnt und dann zusammen mit Testerythrozyten bekannter Antigenizität, einer Substanz, die die Abstoßung zwischen den Erythrozyten herabsetzt und Coombs-Serum in einem Reaktionsgefäß inkubiert, in dem eine viskose Substanz, insbesondere z. B. ein Gel enthalten ist. Das in dem Reaktionsgefäß enthaltene Gel beeinflusst das Sedimentationsverhalten in der Probeflüssigkeit dergestalt, dass sich bei bereits schwacher Vernetzung ein deutliches, einer positiven Reaktion zuordenbares, Sedimentationsbild ergibt. Im Wesentlichen entspricht das bekannte Verfahren einer Art Gelfiltration. Nachteilig an dem Verfahren ist, dass die Anordnung jeweils eines Gels in den Probegefäßen relativ aufwändig ist und eine Wiederverwertung der Reaktionsgefäße aufgrund der schwierigen Reinigung kaum möglich ist.
Bei der Diskussion des Standes der Technik wird in der DE 198 56 703 auch die mögliche Verwendung von speziellen Mikrotiterplatten angesprochen in deren jeweiligen Reaktionsgefäßen (siehe 1) eine treppenförmige Struktur vorgesehen ist. Diese Platten, die ebenfalls die Ausbildung gut differenzierbarer Sedimentationsbilder ermöglichen, werden wegen ihres hohen Preises und ihrer begrenzten Wiederverwendbarkeit als nicht geeignet eingestuft.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, einen sicheren, automatisierbaren und kostengünstigen Agglutinationstest zu schaffen, bei dem wiederverwendbare Reaktionsgefäße zum Einsatz kommen können. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, einen besonders gut für einen automatisierten Test geeigneten Kit bereitzustellen.
Gelöst wird die Aufgabe mit einem Test, der die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1 aufweist, sowie einem Kit gemäss Anspruch 7.
Wie im Stand der Technik, so wird auch bei dem erfindungsgemäßen Agglutinationstest die Probe, insbesondere eine Plasma- oder Serumprobe, verdünnt mit einem erythrozytenhaltigen Testreagenz, einem Reagenz, das die Abstoßung zwischen den Erythrozyten herabsetzt, sowie einer eventuell in der Probe enthaltene Antikörper vernetzenden Substanz inkubiert. Nach Inkubation wird optisch insbesondere ein Aufsichtbild einer in dem verwendeten Reaktionsgefäß erfolgten Sedimentation erfasst und anhand des Sedimentationsbildes auf eine eventuelle Agglutination der Erythrozyten geschlossen.
Wie im Stand der Technik, so ist auch beim erfindungsgemäßen Agglutinationstest vor und während der Inkubation kein Trennschritt vorgesehen. Eine Automatisierung des Tests ist damit in gängigen, z. B. zur Blutgruppenserologie eingesetzten Einrichtungen möglich.
Erfindungsgemäß ist nun vorgesehen, dass die Inkubation des Testansatzes in einem Reaktionsgefäß mit stufentrichterförmig zulaufendem Boden erfolgt. Bei einem derartigen Reaktionsgefäß kann es sich z. B. um eine Vertiefung in speziellen Mikrotiterplatten handeln, wie sie in der DE 198 56 703 diskutiert wurden. Derartige Mikrotiterplatten sind dem Fachmann bekannt, z. B. aus der DE 30 22 940 , und unter der Bezeichnung ”terrassierte Mikrotiterplatte P3” von der Firma ”Olympus” im Markt erhältlich. Ein Beispiel für solches Reaktionsgefäß ist in 1 dargestellt.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass sich solche Probegefässe bzw. Mikrotiterplatten deren Vertiefungen entsprechend ausgebildet sind, unter den erfindungsgemäßen Bedingungen ohne weiteres so häufig wieder verwenden las sen, dass die mit dem Einsatz solcher Platten bzw. Gefässe verbundenen Kosten zu vernachlässigen sind. Dies mag u. a. auch darauf zurückzuführen sein, dass aufgrund der erfindungsgemäß vorgenommenen Verdünnung der Probe auf einen Wert zwischen 20% und 40%, bevorzugt auf einen Wert zwischen 25% und 35%, besonders bevorzugt auf einen Wert zwischen 28% und 32% der Ausgangskonzentration und der deswegen ebenfalls möglichen Verdünnung aller weiteren eingesetzten Reagenzien, bzw. Substanzen eine Reinigung der Platten vor ihrer erneuten Verwendung mit geringerem Reinigungsaufwand und damit geringerer Beanspruchung der Platte möglich ist als dies bei der oben erwähnten Würdigung in der DE 198 56 703 angenommen wurde.
Die erfindungsgemäß vorgesehene Verdünnung der Probenflüssigkeit stellt dabei weiterhin sicher, dass die im üblichen Rahmen liegenden Störungen durch eventuell in der Probeflüssigkeit enthaltene interferierende Substanzen (wie z. B. Cholesterin, Bilirubin etc.) ausgeschlossen werden.
Referenzmessungen der Anmelderin zeigten, dass es bei der Blutgruppenbestimmung ab einem Hämoglobingehalt von 250 mg/dl bzw. Lipidgehalten ab 500 mg/dl, Bilirubingehalten ab 30 mg/dl sowie Proteingehalten ab 15 g/dl zu Interferenzen in automatisierten Systemen kommen kann. Es ist davon auszugehen, dass ähnliche Verhältnisse auch für die hier abgedeckte automatisierte Antikörpersuche gelten. Mit der erfindungsgemäss vorgenommenen Verdünnung der Probenflüssigkeit in dem Testansatz auf Konzentrationswerte zwischen 20% und 40% stellt man sicher, dass auch bei extremen Ausgangssituationen eine quantitave Verdünnung der untersuchten Proben in einen Konzentrationsbereich erfolgt, in dem keine Interferenzen mehr zu erwarten sind. Kritische z. B. lipämische Probeflüssigkeiten können Lipidwerte über 1000 mg/dl aufweisen. Hier bestünde die Gefahr von Interferenzen, was aber durch die erfindungsgemäss vorgenommene Verdünnung der Probeflüssigkeit sicher ausgeschlossen wird. Ähnliches gilt für ikterische oder hämolytische Proben.
Durch die Verdünnung der Probeflüssigkeit erhöht sich also die Sicherheit des Tests insofern, dass mögliche Interferenzen ausgeschlossen werden. Allerdings werden dadurch auch eventuell in der Probe enthaltenen Antikörper verdünnt, wodurch zumindest prinzipiell eine mögliche Agglutinationsreaktion schwächer wird. Dieses Risiko wird zum einen über die Verwendung der speziellen Reaktionsgefäße mit gestuftem bzw. stufentrichterförmig zulaufendem Boden und zum anderen über die spezielle im Rahmen der Erfindung vorgesehene Auswertung des Sedimentationsbildes kompensiert.
Die Vorteile der erfindungsgemäß eingesetzten Reaktionsgefäße mit stufentrichterförmig zulaufendem Boden bei der Blutgruppenserologie, insbesondere bei der Erzeugung eindeutiger Sedimentationsbilder, sind hinreichend bekannt und sollen an dieser Stelle nicht diskutiert werden.
Kombiniert man die Vorteile solcher Reaktionsgefäßes mit der speziellen, gemäß der Erfindung vorgenommenen Auswertung, so ist eine besonders sichere Differenzierung auch schwach positiver Reaktionen von einer negativen Reaktion möglich.
Im Wesentlichen läuft die Auswertung darauf hinaus, dass zunächst ein zentraler z. B. in 3 mit C dargestellter Bereich des Bodens des Reaktionsgefäßes optisch erfasst wird. Dieser Bereich weist üblicherweise die stärkste Färbung auf. Es wird dann ein weiterer, den zentralen Bereich umgebender, in 3 mit P bezeichneter Bereich des Bodens des Probegefäßes erfasst und mit einem Faktor multipliziert. Dann wird geprüft, wie viele Werte des inneren Bereiches dunkler sind, als der mit dem Faktor multiplizierte Wert des äußeren Bereiches und in Abhängigkeit von der Anzahl entschieden, ob eine negative Reaktion stattgefunden hat (der zentrale Bereich ist deutlich dunkler als der umgebende Bereich) oder eine positive Reaktion (der Helligkeitsunterschied zwischen beiden Bereichen ist geringer).
Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angesprochen.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass als Probe eine Serum- oder Plasmaprobe untersucht wird.
Die Probe wird in einer vorteilhaften Ausgestaltung in einem ersten Verdünnungsschritt vor der Inkubation auf eine Konzentration zwischen 50% und 70% der Ausgangskonzentration, besonders bevorzugt auf einen Wert zwischen 55% und 65% verdünnt.
Die Verdünnung erfolgt bevorzugt in einem isotonischen Puffer. Es kann sich dabei z. B. um einen Phosphatpuffer handeln. Der Begriff Puffer ist weit zu interpretiern. Er soll auch reine Lösungsmittel wie z. B. 0,9% NaCl-Lösungen oder dergleichen abdecken.
In einem weiteren Schritt wird die verdünnte Probeflüssigkeit dann zur Inkubation mit den weiteren Reagenzien des Testansatzes vermischt, wobei sich die endgültige Verdünnung einstellt.
Durch die Verdünnung der Probe in einem ersten Schritt stellt man sicher, dass das für die weitere Verarbeitung erforderliche Pipettiervolumen so gewählt werden kann, dass eventuelle Pipettierungenauigkeiten, die insbesondere bei der Pipettierung besonders kleiner Volumina auftreten, ausgeschlossen werden. Würde man die Probeflüssigkeit unverdünnt in den Testansatz pipettieren, müsste eventuell aufgrund der in üblichen automatischen Testsystemen vorgegebenen Maximalvolumina, ein Pipettiervolumen gewählt werden, das zu gering für eine genaue Pipettierung ist.
Als die Abstoßung herabsetzende Substanz wird bevorzugt ein sogenanntes LISS-Medium (Low Ionic Strength Solution) oder ein analog wirkendes Medium eingesetzt. Der Begriff LISS-Medium ist ein gängiger dem Fachmann bekannter Begriff. Das bevorzugte LISS-Medium enthält Glycin in isotonischem Puffer. Denkbar sind aber auch analoge Medien (Supplementmedien) mit anderen Substanzen, wie z. B. Albumin. Üblicherweise sind die Substanzen in den Medien, wie erwähnt, in einem isotonischen Puffer aufgenommen enthalten.
Weiterhin bevorzugt ist, dass bei der Durchführung des Tests die zur Vernetzung der Erythrozyten bestimmten Substanzen z. B. in einem LISS-Medium aufgenommen werden.
Ein typisches LISS-Medien enthält folgende Inhaltstoffe (in 1 l Wasser):

KH₂PO₄ 0,236 g

Na₂HPO₄ 0,185 g

NaCl 1,75 g

Glycin 18 g
Der pH-Wert wird ggf. mit NaOH auf 6,7 eingestellt.
In Abwandlungen kann das Medium neben Glycin wie oben erwähnt auch zusätzlich Albumin enthalten.
Denkbar sind auch sogenannte Supplement-Medien, die anstelle von Glycin z. B. Albumin in einer Konzentration von 4,5 bis 6,0% (v/v), besonders bevorzugt in einer Konzentration von 5,4% (v/v), in isotonischem Puffer, z. B. der für das LISS-Medium angegebenen Pufferzusammensetzung enthalten.
LISS-Medien und auch die erwähnten Supplement-Medien sind dem Fachmann bekannt. Es soll an dieser Stelle nicht weiter darauf eingegangen werden.
Wie bereits oben angesprochen geht eine eventuelle Agglutinationsreaktion auf eine Vernetzung der im Ansatz enthaltenen Erythrozyten über IgG-Antikörper zurück. Voraussetzung ist, dass eventuell in der Probe enthaltene irreguläre Antikörper spezifisch an die Antigene der Erythrozyten binden. In der Regel sind IgG-Antikörper nicht in der Lage, über ihre weitere Bindungsstelle direkt mit einem weiteren Erythrozyten zu binden. Hierfür wird erfindungsgemäß, genauso wie in gattungsgemäßen Tests, eine die Antikörper vernetzende Substanz zugegeben. Üblicherweise ist dies ein anti-IgG-Antikörper, der an humane IgG-Antikörper binden kann.
Bevorzugt wird daher in dem erfindungsgemäßen Test so genanntes Coombs-Serum zugesetzt, das anti-IgG-Antikörper enthält. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Tests kann hochtitriges Coombs-Reagenz eingesetzt werden, wobei ein besonderer Vorteil der Erfindung ist, dass dieses Serum stark verdünnt zum Einsatz kommen kann. Die üblicherweise mögliche Anzahl von Tests, die durchgeführt werden kann, erhöht sich damit deutlich.
In dem erfindungsgemässen Agglutinationstest wird das Coombs-Serum so weit verdünnt, dass die Antikörperkonzentration (anti-Human IgG) im Testansatz bevorzugt zwischen 15 mg/l und 40 mg/l, besonders bevorzugt zwischen 18 mg/l und 36 mg/l liegt.
Üblicherweise erreicht man eine solche Verdünnung wie folgt: das als Ausgangsmaterial eingesetzte hochtitrige Coombs-Serum weist üblicherweise eine Antikörperkonzentration von 500–1000 mg/l auf. Das Ausgangsserum wird im Verhältnis 1:5 z. B. mit LISS-Medium verdünnt. Von dem mit LISS-Medium verdünnten Coombs-Serum werden 11 μl auf 50 μl Probenflüssigkeit und Erythrozytenhaltige Lösung gegeben, was zu der erwähnten Endverdünnung führt. Es handelt sich bei den angegebenen Mengen nur um Beispiele. Denkbar sind selbstverständlich auch andere Mischungsverhältnisse etc.
Natürlich können auch weitere Substanzen zum Einsatz kommen, wie z. B. Lectine oder Protein A. Einige der irregulären Antikörper sind weiterhin nicht vom IgG-Typ, sondern vom IgM-Typ. Denkbar ist daher auch, dass in speziellen Testkonstellation anti-IgM-Antikörper zur Vernetzung der Erythrozyten zugesetzt werden.
Im Rahmen der Erfindung soll auch ein Kit mit Fertigreagenzien abgedeckt werden, der besonders gut für die Durchführung des erfindungsgemässen Agglutinationstests in automatisierten Systemen geeignet ist.
Der betreffende Kit ist so konzipiert, dass z. B. 2 Fertigreagenzien enthalten sind, die nach Vermischung definierter Volumina der Fertigreagenzien miteinander und mit der ggf. vorverdünnten Probeflüssigkeit den fertigen Testansatz ergeben.
Erfindungsgemäss enthält ein Fertigreagenz zwischen 0,5% und 1,5% (v/v), bevorzugt 1,1% (v/v), Erythrozyten in isotonischem Puffer, und das andere anti-Human IgG in einer Konzentration von 100 mg/l bis 200 mg/l in LISS-Medium oder einem Supplement-Medium.
Die Menge der in dem Kit enthaltenen Fertigreagenzien ist so aufeinander abgestimmt sind, dass sich bei Einsatz vorgegebener Volumina der Fertigreagenzien in den Testansätzen automatisch die gewünschte Verdünnung der Probenflüssigkeit einstellt und unter gleichzeitigem Aufbrauchen beider Fertigreagenzien eine definierte Anzahl von Agglutinationstests durchführbar ist.
In einer Ausgestaltung enthält der Kit als weiteres Reagenz isotonischen Puffer zur Verdünnung der Probeflüssigkeit in einem ersten Schritt. Die verdünnte Probeflüssigkeit wird dann in einem weiteren Schritt mit den beiden weiteren Fertigreagenzien zum endgültigen Testansatz vermischt. Der Begriff Puffer schließt wie oben gesagt neben, pH-regulierende Systemen, auch reine Lösungsmittel, wie z. B. isotonische Kochsalzlösungen mit ein.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand eines Beispieles und mehrerer Figuren näher erläutert werden. Dabei zeigt:
1 im Schnitt ein erfindungsgemäß einsetzbares Reaktionsgefäß,
1a in einer schematischen Teilansicht das Sedimentationsverhalten von Partikeln in Reaktionsgefässen gemäß 1 im Falle einer positiven Reaktion,
1b in einer schematischen Teilansicht das Sedimentationsverhalten von Partikeln in Reaktionsgefässen gemäß 1 im Falle einer negativen Reaktion,
2 Aufsichtsbilder auf Reaktionsgefäße bei einer positiven und einer negativen Reaktion, und
3 eine schematische Darstellung des Bodens einer Reaktionsgefäßes zur Erläuterung des Auswerteverfahrens.
1 zeigt im Schnitt ein übliches Reaktionsgefäß 10, das insbesondere Bestandteil einer speziellen oben erwähnten nur angedeuteten Mikrotiterplatte 11 sein kann. Man erkennt, dass im Bodenbereich des Reaktionsgefäßes umlaufende Stufen 12 vorgesehen sind, die das Sedimentationsverhalten wie in den 1a und 1b dargestellt, beeinflussen.
1a zeigt das Sedimentationsverhalten von Partikeln 13 bei einer positiven Reaktion (Agglutination hat stattgefunden). In diesem Fall werden die Partikel 13 aufgrund ihrer auf die Agglutination zurückzuführenden reduzierten Beweglichkeit in den Stufen 12 festgehalten. Es ergibt sich ein im Wesentlichen größerer, dunkel gefärbter Flächenbereich in Aufsicht. Ein typisches Aufsichtbild einer positiven Reaktion ist in 2 mit 15 bezeichnet wiedergegeben.
Für den Fall, dass keine Agglutination stattgefunden hat, sedimentieren die Partikel 13 aufgrund ihrer größeren Beweglichkeit nach unten in einen zentralen Bodenbereich 14 des Reaktionsgefässes 10. Dies ist in 1b schematisch dargestellt, Im Ergebnis ergibt sich ein in 2 wiedergegebenes Sedimentationsbild 16, mit zentralem, dunkel gefärbtem Bereich, der von einem helleren peripheren Bereich umgeben ist.
Anhand von 3 soll eine bevorzugte Ausführungsform der in dem erfindungsgemäßen Test eingesetzten Auswertung erläutert werden. Es handelt sich dabei um die Bestimmung des sogenannten LIA-Wertes.
3 zeigt in Aufsicht schematisch einen zentralen Bereich C des Bodens eines erfindungsgemäß eingesetzten Reaktionsgefäßes, der von einem peripheren Bereich P umgeben ist. Die Stufen wurden in dieser Darstellung weggelassen.
Der LIA Wert ist ein Wert, der auf Basis von Messungen einzelner Werte im Bereich C ermittelt wird. Zunächst wird die mittlere Färbung im Bereich P bestimmt. Betrachtet wird hierbei der Bereich außerhalb des C-Bereichs bis zu einem Durchmesser von 4,5 mm. Weiterhin werden die einzelnen Messwerte im Bereich C bestimmt.
Der für den Bereich P ermittelte Wert wird mit einem frei wählbaren Faktor zwischen 0,1 und 1,0 multipliziert und das Ergebnis dieses Produktes mit den C-Werten verglichen. Die Anzahl der Messwerte im C-Bereich (in der Regel ca. 4500 Messwerte) die unter dem Produktergebnis liegen (was bedeutet, dass sie dunkler sind) werden nun addiert und ergeben den LIA Wert.
Der Faktor ist dabei so gewählt, dass man bei einer negativen Reaktion auf einen LIA Wert zwischen 500 und 600 kommt. Geeignete Faktoren liegen in einem Berich zwischen 0,3 und 0,8.
In der Regel werden einer „negativen Reaktion” LIA Werte oberhalb von 350 zugeordnet. Eine positive Reaktion hat idealerweise einen LIA Wert von 0, wobei Werte unter 100 noch akzeptabel sind.
Werte knapp über 100 können auf eine besonders schwache Reaktion hindeuten. In der Regel sollte in diesem Fall die Probe noch einmal untersucht werden.
Mittels der Bestimmung des LIA-Wertes lassen sich in einfacher Weise die Ergebnisse insbesondere schwacher Reaktionen interpretieren.
BEISPIEL:
Untersuchung von Proben mit bekannten Antikörpern
Im Folgenden soll der erfindungsgemäße Agglutinationstest anhand eines Ausführungsbeispieles näher erläutert werden.
Bei den zu untersuchenden Proben handelte es sich um Plasmaproben mit bekanntem Antikörperprofil. Die Proben enthalten die in der Tabelle 1 angegebenen Antikörper.
Die Plasmaprobe wurde mit 0,9%iger NaCl-Lösung 1,7fach verdünnt.
25 μl der verdünnten Plasmaprobe wurden in einem Reaktionsgefäß gemäß 1 mit 25 μl einer 1,2%igen Zellsuspension (gelöst in 0,9% NaCl-Lösung) vermischt. Die Zellsuspension enthielt Erythrozytenzellen mit speziellen Antigenen gegen die untersuchten irregulären Antikörper.
Weiterhin wurde dem Testansatz 11 μl einer mit 0,9%iger NaCl-Lösung im Verhältnis 1–5 verdünnter Albuminlösung sowie AHG (anti-Human-Globulin) im Verhältnis 1:5 verdünnt zugesetzt. Der Testansatz wurde 60 Minuten bei 37°C inkubiert.
Nach der Inkubationszeit wurde optisch in Aufsicht das sich einstellende Sedimentationsbild in den Reaktionsgefäßen erfasst.

Die Ergebnisse des Agglutinationstestes sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Antikörper	LIA-Wert	Resultat
anti-Jk a (Kidd)	0	Positiv
anti-Le a (Lewis)	0	Positiv
anti-Kell (Kell)	0	Positiv
anti-D (Rhesus)	0	Positiv
anti-D (Rhesus)	0	Positiv
anti-Fy a (Duffy)	0	Positiv
anti-Kell (Kell)	0	Positiv
Diagast Kontrolle Hoch(anti-D)	0	Positiv
Diagast Kontrolle niedrig(ant-Fy a)	0	Positiv
Diagast Negative Kontrolle	300	Negativ

Tab.1

Im untersuchten Fall sind die in den Zeilen 1–9 analysierten Proben positiv, was sich an einer flächigen Dunkelfärbung (siehe 2, Sedimentationsbild 15) erkennen lässt. Die in Zeile 10 dargestellte Probe ist negativ. Man erkennt dies an dem dunklen Hof (siehe 2, Sedimentationsbild 16), der von einem deutlich abgegrenzten helleren Bereich umgeben ist. Gemäß Tabelle 1 handelt es sich bei dieser Probe um die Negativ-Kontrolle.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- DE 19856703 [0008, 0010, 0015, 0016]
- DE 3022940 [0015]

Claims

Agglutinationstest zum Nachweis von Antikörpern in einer Probeflüssigkeit, insbesondere in einer Plasma- oder Serumprobe, bei dem ein Testansatz enthaltend: – Probenflüssigkeit, – ein erythrozytenhaltiges Testreagenz, – ein die Abstossung zwischen Erythrozyten herabsetzendes Reagenz – sowie eine Antikörper vernetzende Substanz in einem Reaktionsgefäss inkubiert wird, wobei vor und während der Inkubation kein Trennschritt vorgesehen ist, und nach Inkubation zur Auswertung optisch ein Aufsichtbild einer in dem Reaktionsgefäss erfolgten Sedimentation erfasst und anhand des Sedimentiationsbildes auf das Vorliegen oder nicht Vorliegen einer auf eine Antikörper-Antigen Reaktion zurückgehende Agglutination geschlossen wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation in einem Reaktionsgefäss mit einen stufentrichterförmig zulaufenden Boden erfolgt, die Probenflüssigkeit in mindestens einem Schritt soweit verdünnt wird, dass ihre Konzentration in dem Testansatz zwischen 20% und 40% der Ausgangskonzentration beträgt, und im Rahmen der Auswertung jeweils ein Sedimentationsbild in einem inneren und in einem den inneren Bereich umgehenden Bereich erfasst wird und über einen Vergleich beider Bilder auf das Vorliegen oder nicht Vorliegen einer eventuellen Agglutination geschlossen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenflüssigkeit in einem ersten Schritt durch Vermischen mit einem Lösunsgmittel auf eine Konzentration zwischen 50% und 70% verdünnt wird und in einem zweiten Schritt die Verdünnung auf den Wert zwischen 25% und 35% durch Vermischung mit den Reagenzien erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als die Abstossung zwischen Erythrozyten herabsetzendes Reagenz LISS-Medium oder ein analoges insbesondere Albumin enthaltenes Medium eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper vernetzende Substanz anti-IgG-Antikörper eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auswertung der LIA-Wert bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein LIA-Wert unterhalb von 100 einer positiven Reaktion zugeordnet wird.
Kit für einen Agglutinationstest gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6 zum Nachweis von Antikörpern in einer Probenflüssigkeit, insbesondere in einer Plasma- oder Serumprobe, mit mindestens 2 zur Durchführung des Agglutinationstest miteinander und mit der ggf. verdünnten Probeflüssigkeit zu vermischenden Fertigreagenzien, von denen das eine zwischen 0,5% und 1,5% (v/v) Erythrozyten in isotonischem Puffer, und das andere anti-Human IgG in einer Konzentration zwischen 100 mg/l und 200 mg/l in LISS-Medium oder einem Supplement-Medium dazu enthält, und wobei die Menge der in dem Kit enthaltenen Fertigreagenzien so aufeinander abgestimmt sind, dass sich bei Einsatz vorgegebener Volumina der Fertigreagenzien in den Testansätzen automatisch die gewünschte Verdünnung der Probenflüssigkeit einstellt.
Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass und unter gleichzeitiger Aufbrauchen beider Fertigreagenzien eine definierte Anzahl von Agglutinationstests durchführbar ist.