DE102008003568A1 - Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil - Google Patents

Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil Download PDF

Info

Publication number
DE102008003568A1
DE102008003568A1 DE200810003568 DE102008003568A DE102008003568A1 DE 102008003568 A1 DE102008003568 A1 DE 102008003568A1 DE 200810003568 DE200810003568 DE 200810003568 DE 102008003568 A DE102008003568 A DE 102008003568A DE 102008003568 A1 DE102008003568 A1 DE 102008003568A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
arg
glu
asp
gly
insulin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE200810003568
Other languages
English (en)
Inventor
Paul Dr. Habermann
Gerhard Dr. Seipke
Roland Dr. Kurrle
Günter Dr. Müller
Mark Dr. Sommerfeld
Norbert Dr. Tennagels
Georg Dr. Tschank
Ulrich Dr. Werner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis Deutschland GmbH filed Critical Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority to DE200810003568 priority Critical patent/DE102008003568A1/de
Priority to MYPI20102683 priority patent/MY152979A/en
Priority to JP2010541743A priority patent/JP5694779B2/ja
Priority to EP09701358.5A priority patent/EP2229407B1/de
Priority to CN200980101962.3A priority patent/CN102007143B/zh
Priority to CA2711749A priority patent/CA2711749A1/en
Priority to BRPI0907371A priority patent/BRPI0907371A2/pt
Priority to HUE09701358A priority patent/HUE030537T2/en
Priority to PL09701358T priority patent/PL2229407T3/pl
Priority to NZ586590A priority patent/NZ586590A/en
Priority to ES09701358.5T priority patent/ES2613152T3/es
Priority to PCT/EP2009/000017 priority patent/WO2009087081A2/de
Priority to AU2009203809A priority patent/AU2009203809B2/en
Priority to KR1020107014961A priority patent/KR20100111682A/ko
Priority to UAA201009821A priority patent/UA103015C2/ru
Priority to DK09701358.5T priority patent/DK2229407T3/en
Priority to RU2010133231/10A priority patent/RU2524423C2/ru
Priority to PA20098811601A priority patent/PA8811601A1/es
Priority to UY031596A priority patent/UY31596A1/es
Priority to CL2009000017A priority patent/CL2009000017A1/es
Priority to TW098100281A priority patent/TW200942256A/zh
Priority to ARP090100035A priority patent/AR070118A1/es
Priority to PE2009000009A priority patent/PE20091377A1/es
Publication of DE102008003568A1 publication Critical patent/DE102008003568A1/de
Priority to ZA2010/03926A priority patent/ZA201003926B/en
Priority to CR11511A priority patent/CR11511A/es
Priority to US12/820,722 priority patent/US9644017B2/en
Priority to TN2010000298A priority patent/TN2010000298A1/fr
Priority to NI201000114A priority patent/NI201000114A/es
Priority to CO10079133A priority patent/CO6311108A2/es
Priority to DO2010000209A priority patent/DOP2010000209A/es
Priority to MA32985A priority patent/MA31998B1/fr
Priority to IL206844A priority patent/IL206844A/en
Priority to EC2010010333A priority patent/ECSP10010333A/es
Priority to GT201000199A priority patent/GT201000199A/es
Priority to HK11104060.4A priority patent/HK1149772A1/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Insulinanaloga mit basalem Zeit-/Wirkungsprofil, die durch die Merkmale charakterisiert sind, dass . das B-Kettenende aus einem amidierten basischen Aminosäurerest wie Lysin bzw. Argininamid besteht, . zudem der N-terminale Aminosäurerest der Insulin A-Kette ein Lysin- oder Argininrest ist, . die Aminosäureposition A8 durch einen Histidinrest besetzt wird, . die Aminosäureposition A21 durch einen Glycinrest besetzt wird und . eine oder mehrere Substitutionen und/oder Additionen negativ geladener Aminosäurereste in den Positionen A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 und B4 erfolgt ist.

Description

  • Die Erfindung betrifft neue Insulinanaloga mit basalem Zeit-/Wirkungsprofil, ihre Herstellung und Verwendung.
  • Über die letzten Jahre hat die Zahl der Erkrankungen an Diabetes in einem geradezu epidemischen Ausmaß zugenommen. Aufgrund der Erkrankung kann es zu einer gravierenden Verkürzung der Lebenserwartung kommen. Menschen mit Diabetes müssen ihrem Körper oft Insulin von außen zuführen. Es ist sinnvoll, die Behandlung mit Insulin zu optimieren. Mittlerweile gibt es unterschiedliche Insuline mit spezifischen pharmakologischen Eigenschaften zur Behandlung.
  • Praktischerweise werden die unterschiedlichen Insuline nach ihrer Wirkdauer unterschieden in kurzwirksame Insuline, schnellwirkende Insuline, langwirksame Insuline und Mischinsuline. Synonym verwendete Bezeichnungen für langwirksame Insuline sind Verzögerungsinsulin, Depotinsulin oder auch Basalinsulin. Die Wirkstoffe vieler dieser Insulinpräparate sind sogenannte Insulinanaloga, die vom humanen Insulin abgeleitet worden sind durch Substitution, Deletion und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren. Die Begriffe „Insulinanaloga" und „Insuline" werden hier synonym verwendet.
  • Das Konzept der intensivierten Insulintherapie versucht das Gesundheitsrisiko abzumindern, indem eine stabile Kontrolle des Blutzuckerspiegels durch frühe Gabe von Basalinsulinen angestrebt wird. Ein Beispiel für ein gängiges Basalinsulin ist das Medikament Lantus® (Wirkstoff: Insulin Glargin = Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) Humaninsulin). Generell gilt es, bei der Entwicklung neuer, verbesserter Basalinsuline die Zahl hypoglykämischer Ereignisse zu minimieren. Ein ideales Basalinsulin wirkt dabei sicher in jedem Patienten mindestens 24 h Stunden. Idealerweise setzt die Insulinwirkung verzögert und mit einem möglichst flachen Zeit-/Wirkungsprofil ein, so dass die Gefahr einer kurzfristigen Unterzuckerung deutlich minimiert ist und die Applikation sogar ohne vorherige Einnahme von Nahrungsmitteln erfolgen kann. Eine gute Versorgung mit Basalinsulin ist dann gegeben, wenn die Insulinwirkung möglichst lange gleichbleibend anhält, d. h. der Körper mit einer konstanten Menge Insulin versorgt wird. Damit ist die Gefahr hypoglykämischer Ereignisse gering und eine Patienten- und tagesspezifische Variabilität minimiert. Das pharmakokinetische Profil eines idealen Basalinsulins sollte also durch einen verzögerten Wirkeintritt und durch eine verzögerte, d. h. lang anhaltende und gleichmäßige Wirkung gekennzeichnet sein.
  • Jedoch zeigt – trotz der bereits erreichten therapeutischen Vorteile – keines der bisher beschriebenen Verzögerungsinsuline die pharmakokinetischen Eigenschaften eines idealen Basalinsulins. Wünschenswert sind Insuline, die ein solch flaches und lang andauerndes Zeit-/Wirkungsprofil haben, dass die Gefahr hypoglykämischer Ereignisse und der tagesabhängigen Varianz im Patienten weiter minimiert ist und die Wirkdauer weiter verzögert ist, so dass unter Umständen nicht mehr täglich Insulin verabreicht werden muss. Dies würde eine vereinfachte Behandlung von Diabetikern ermöglichen, insbesondere von älteren und pflegebedürftigen Diabetikern, die sich Insulin nicht mehr selber injizieren können und wäre somit auch von großem volkswirtschaftlichem Nutzen. In der frühen Phase des Diabetes Typ 2 wären solche Basalinsuline zudem nützlich. Kliniker berichten, dass die bei vielen Menschen vorhandene Phobie vor Spritzen sie davor zurückschrecken lässt, rechtzeitig mit der Insulintherapie zu beginnen. Als Konsequenz ergibt sich eine schlechte Blutzuckereinstellung, die diabetische Spätfolgen nach sich zieht. Ein Basalinsulin, das die Anzahl der durch Spritzen erfolgten Insulingaben vermindert, könnte bewirken, dass Patienten leichter die Insulintherapie annehmen.
  • Kohn et al. (Peptides 28 (2007) 935–948) beschreiben, dass man die Optimierung der Pharmakodynamik von Insulin dadurch erreichen kann, dass man Insulinanaloga herstellt, deren isoelektrischer Punkt (pI) durch Addition von Lysin oder Arginin an das B-Kettenende oder den N-Terminus der A und B-Kette in Richtung des alkalischen Bereichs verschoben ist, verglichen mit dem isoelektrischen Punkt von Humaninsulin (pI = 5,6), so dass die Löslichkeit unter physiologischen Bedingungen verringert ist und sich ein verlängertes Zeit-/Wirkungsprofil ergibt. Verbindung 18 aus Kohn et al. (Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) Humaninsulin (pI experimentell bestimmt = 7,3; pI berechnet = 7,58) wird dabei als beste Verbindung im Sinne des Konzeptes dargestellt. Das hauptsächliche Ziel bei der Gestaltung neuer Insulinanaloga sehen Kohn et al. daher in der Addition von positiv geladenen Aminosäuren zur Aminosäuresequenz von Humaninsulin zwecks Erhöhung des isoelektrischen Punktes von pI = 5,6 in den neutralen Bereich.
  • Diesem Ziel bei der Gestaltung neuer Insulinanaloga entgegengerichtet ist die Substitution neutraler Aminosäuren in humanem Insulin durch saure Aminosäuren und/oder die Addition von sauren Aminosäuren, da solch eine Substitution und/oder Additionen den Effekt der Einführung positiv geladener Aminosäuren zumindest teilweise aufhebt. Es wurde nun aber überraschend gefunden, dass solche Insulinanaloga zu dem beschriebenen wünschenswerten basalen Zeit-/Wirkungsprofil führen, die durch die Merkmale charakterisiert sind, dass
    • • das B-Kettenende aus einem amidierten basischen Aminosäurerest wie Lysin bzw. Argininamid besteht, und
    • • der N-terminale Aminosäurerest der Insulin A-Kette ein Lysin- oder Argininrest ist, und
    • • die Aminosäureposition A8 durch einen Histidinrest besetzt wird, und
    • • die Aminosäureposition A21 durch einen Glycinrest besetzt wird, und
    • • zwei Substitutionen neutraler Aminosäuren durch saure Aminosäuren, zwei Additionen negativ geladener Aminosäurereste oder je eine solche Substitution und eine solche Addition jeweils in den Positionen A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 und B4 erfolgt sind.
  • Während die ersten drei genannten Merkmale durch Einführen positiver Ladungen bzw. der Ausschaltung negativer Ladungen tendenziell Beiträge zu einer Erhöhung des pI-Wertes eines entsprechenden Insulinanalogs liefern, haben die letztgenannten Substitutionen und/oder Additionen negativ geladener Aminosäurereste den gegenteiligen Effekt und liefern Beiträge zu einer Erniedrigung des pI-Werts. Überraschenderweise haben gerade die beschriebenen Insulinanaloga die gewünschten vorteilhaften Zeit-/Wirkungsprofile. Die pI-Werte dieser Verbindungen sind niedriger als die der Verbindung 18 aus Kohn et al. (Arg (A0), Gly (A21), Arg (B319, Arg (B32) – Humaninsulin), weisen aber nichtsdestotrotz dabei einen verzögerten Wirkeintritt und eine längere Wirkdauer, d. h. einen extrem flachen und lang andauernden, gleichmäßigen Wirkungsverlauf auf. Damit wird die Gefahr von hypoglykämischen Ereignissen deutlich minimiert. Die Verzögerung ist so deutlich, dass sich der Effekt überraschend sogar in Modellversuchen an Ratten nachweisen lässt, obwohl im Gegensatz dazu die verzögerte Wirkung von Insulin Glargin in der Ratte nicht eindeutig beobachtbar ist. In 1 ist die hypoglykämische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung YKL205 verglichen mit der von Insulin Glargin dargestellt. Ähnliche Ergebnisse werden im Hund erhalten (siehe 2). Damit sind neue Basalinsuline bereitgestellt worden, die deutlich weniger häufig appliziert werden müssen. Neben diesen beschriebenen pharmakokinetischen Vorteilen weisen die erfindungsgemäßen Analoga gegenüber Insulin Glargin deutlich bessere Eigenschaften in pharmakologischer Hinsicht wie z. B. Rezeptorspezifität und in vitro Mitogenität auf. Ferner zeigen die beanspruchten Insuline auch in physikalisch – chemischer Hinsicht Vorteile.
  • Gegenstand der Erfindung ist somit ein Insulinanalogon der Formel I
    Figure 00040001
    wobei
    • A0
    Lys oder Arg;
    A5
    Asp, Gln oder Glu;
    A15
    Asp, Glu oder Gln;
    A18
    Asp, Glu oder Asn;
    B-1
    Asp, Glu oder eine Aminogruppe;
    B0
    Asp, Glu oder eine chemische Bindung;
    B1
    Asp, Glu oder Phe;
    B2
    Asp, Glu oder Val;
    B3
    Asp, Glu oder Asn;
    B4
    Asp, Glu oder Gln;
    B29
    Lys oder einer chemischen Bindung;
    B30
    Thr oder einer chemischen Bindung;
    B31
    Arg, Lys oder einer chemischen Bindung;
    B32
    Arg-Amid, Lys-Amid oder einer Aminogruppe

    entspricht, wobei zwei Aminosäurereste der Gruppe enthaltend A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 und B4 gleichzeitig und unabhängig voneinander Asp oder Glu entsprechen.
  • Insbesondere sind Gegenstände der Erfindung Insulinanaloga wie oben ausgeführt, bei denen unabhängig voneinander A0 Arg entspricht, oder wobei A5 Glu entspricht, oder wobei A15 Glu entspricht, oder wobei A18 Asp entspricht, oder wobei B-1 einer Aminogruppe entspricht, oder wobei B0 Glu entspricht, oder wobei B1 Asp entspricht, oder wobei B2 Val entspricht, oder wobei B3 Asp entspricht, oder wobei B4 Glu entspricht, oder wobei B29 Lys entspricht, oder wobei B30 Thr entspricht, oder wobei B31 Arg oder Lys entspricht.
  • Besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Insulinanalogon ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30), Arg (B31) -NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30), Lys (B31) -NH2 Humaninsulin.
  • Durch die Angabe des Begriffs "Humaninsulin" in den Bezeichnungen der genannten Insulinanaloga wird Bezug auf die Aminosäuresequenzen der A- und B-Kette von Humaninsulin genommen und alle Abweichungen (Additionen, Substitutionen, Deletionen) davon sind in einer gegebenen Bezeichnung eines Insulinanalogons angegeben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Insulinanalogons wie oben genannt, insbesondere wobei ein Vorläufer des Insulinanalogs Humaninsulin rekombinant hergestellt wird, der Vorläufer enzymatisch zu zwei-kettigem Insulin prozessiert wird und eine Kupplung mit Argininamid in Gegenwart eines Enzyms mit Trypsinaktivität durchgeführt wird, und das Insulinanalogon isoliert wird.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Verwendung eines Insulinanalogons wie oben beschrieben zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes, insbesondere von Diabetes Typ I oder Typ II. Ebenfalls ist Gegenstand der Erfindung eine Verwendung eines Insulinanalogons wie oben beschrieben zur Herstellung eines Medikaments zur Unterstützung der beta-Zellregeneration Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend ein Insulinanalogon wie oben beschrieben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung des Insulinanalogons wie oben beschrieben, wobei die Formulierung in wässriger Form enthaltend das gelöste Insulinanalog vorliegt.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung des Insulinanalogons wie oben beschrieben, wobei die Formulierung in Form von Pulver vorliegt.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung wie oben beschrieben, wobei das Insulinanalogon wie oben beschrieben in kristalliner und/oder amorpher Form vorhanden ist.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung des Insulinanalogons wie oben beschrieben, wobei die Formulierung in Form einer Suspension vorliegt.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung des Insulinanalogons wie oben beschrieben, wobei die Formulierung zusätzlich ein chemisches Chaperon enthält.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA kodierend für einen Vorläufer eines Insulinanalogons wie oben beschrieben, oder für die A-Kette oder B-Kette eines Insulinanalogons wie oben beschrieben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor enthaltend eine DNA wie oben beschrieben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Wirtsorganismus enthaltend eine DNA wie oben beschrieben oder einen Vektor wie oben beschrieben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Präproinsulinanalogon, dadurch gekennzeichnet, dass das C-Peptid an seinem N-Terminus den Aminosäurerest Arginin und an seinem C-Terminus zwei Argininreste oder einen Argininrest und einen Lysinrest trägt, wobei in letzterem Falle der Lysinrest den eigentlichen C-Terminus bildet.
  • Dem Fachmann ist dabei klar, dass die erfindungsgemäßen Insuline Gegenstand einer pharmazeutischen Formulierung sein können, die nach Applikation vorteilhaft wirkt. Dabei geht man von wässrigen Lösungen aus. Entsprechend müssen weitere Komponenten mischbar sein. Die Gefahr viraler tierischer Kontamination wird dadurch minimiert, dass die Zubereitung keine Komponenten enthalten sollte, die aus tierischen Quellen stammen. Es ist weiterhin vorteilhaft, durch Zusatz von Konservierungsmitteln eine mikrobielle Verunreinigung zu verhindern. Durch den Zusatz isotoner Agentien kann eine mögliche negative Auswirkung der Formulierung auf die Physiologie der Gewebezellen an der Applikationsstelle kompensiert werden. Stabilisierend kann sich der Zusatz von Protamin auswirken, so dass man weitgehend salzfreien Insulinzubereitung gelangen kann, wenn man der Formulierung Protamin zufügt. Der Zusatz von einer phenolischen Komponente kann zu einer Stabilisierung der Struktur des verwendeten Insulinanalogons führen und so unter anderem den Verzögerungseffekt beim Wirkungseintritt zusätzlich bewirken. Der Formulierung zugesetzt können auch Substanzen sein, die die Raumstruktur der erfindungsgemäßen Verzögerungsinsuline stabilisieren und zu besserer thermischen Stabilität führen. Solche chemischen Chaperone können z. B. kurze synthetische Peptide, die auch Aminosäureanaloga enthalten können oder z. B. vom C-Peptid des Insulin abgeleitete Peptidsequenzen umfassen.
  • Zur Entwicklung von Depotformen können die erfindungsgemäßen Insuline in Nanopartikel eingebunden werden. Denkbar sind auch sogenannte „Slow release" Formuierungen, bei denen das erfindungsgemäße Verzögerungsinsulin reversibel an polymere Träger gebunden vorliegt.
  • Die erfindungsgemäßen Insuline können parallel zu schnellwirksamen Insulinen wie Apidra®, NovoRapid®, Humalog® oder sich in Entwicklung befindlichen Insulinderivaten oder Formulierungen mit entsprechendem Zeit-/Aktionsprofil oder inhalierbarem Insulin oder nasal oder oral applizierten Insulinen, die sich in Entwicklung befinden, verabreicht werden. Dabei ist es dem Fachmann klar, dass dazu auch entsprechend formulierte Mischungen aus schnellwirksamen und erfindungsgemäßem Verzögerungsinsulin verwendet werden können. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Insuinanaloga in pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden, die Peptide, die durch eine dem GLP-1 (Glucagon like Peptide-1) oder dem Exendin-4 bzw. Exendin-3 vergleichbare Aktivität beschrieben sind, enthalten. Beispiel für solche Peptide stellen GLP-1 (7–37), Exenatide (Byetta®) oder Peptide, deren Herstellung in den Patentanmeldungen WO 2006/058620 , WO 2001/04156 , WO 2004/005342 und WO 98/08871 beschrieben sind, dar. Besonders vorteilhaft sind dabei Formulierungen, die eine Depotformulierung dieser Peptide enthalten. Vorteilhaft besonders in der Anfangsphase der TypII Diabetes Erkrankung sind Therapieformen, die parallel zu Verabreichung der erfindungsgemäßen Pharmazeutika vorsehen, die die Insulinwirkung erhöhen, wie z. B. Metformin. Kombinationstherapien mit Dipeptidyl Peptidase-4 Inhibitoren, die den Spiegel an Inkretinen erhöhen, sind wie Kombinationen mit Sulfonylharnstoffen, die die Insulinausschüttung im Pankreas erhöhen, ebenfalls möglich. Besonders vorteilhaft können die erfindungsgemäßen Verzögerungsinsuline dann eingesetzt werden, wenn durch Applikation von Differenzierungsfaktoren, die Regeneration von pankreatischen Betazellen aus entsprechenden Stammzellen eingeleitet wird. All diese Anwendungen sind beispielhaft für die Therapie des Diabetes genannt und ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Insuline in Kombination mit anderen Wirkstoffen zur Behandlung von Diabetes, insbesondere Diabetes Typ I oder Typ II Diabetes.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel, das ein erfindungsgemäßes Insulinanalogon enthält, welches insbesondere eine wässrige Formulierung oder ein Pulver darstellt.
  • Das Arzneimittel ist eine pharmazeutische Zubereitung, die vorzugsweise eine Lösung oder Suspension zu Injektionszwecken ist; sie ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem erfindungsgemäßen Insulinanalog, und/oder mindestens einem von deren physiologisch verträglichen Salzen in gelöster, amorpher und/oder kristalliner – vorzugsweise in gelöster – Form.
  • Die Zubereitung weist vorzugsweise einen pH-Wert zwischen etwa 2,5 und 8,5, insbesondere zwischen etwa 4,0 und 8,5 auf, enthält vorzugsweise ein geeignetes Isotonisierungsmittel, ein geeignetes Konservierungsmittel und gegebenenfalls einen geeigneten Puffer, sowie vorzugsweise auch eine bestimmte Zinkionen-Konzentration, in steriler wässriger Lösung. Die Gesamtheit der Zubereitungsbestandteile außer dem Wirkstoff bildet den Zubereitungs-Träger. Geeignete Isotonisierungsmittel sind z. B. Glycerin, Glukose, Mannit, NaCl, Calcium- oder Magnesium-Verbindungen wie CaCl2 etc. Durch die Wahl des Isotonisierungsmittels und/oder Konservierungsstoffes beeinflusst man die Löslichkeit der erfindungsgemäßen Insuline bzw. deren physiologisch verträgliche Salze bei schwach sauren pH-Werten.
  • Geeignete Konservierungsmittel sind z. B. Phenol, m-Cresol, Benzylalkohol und/oder p-Hydroxybenzoesäureester.
  • Als Puffersubstanzen, insbesondere zur Einstellung eines pH-Wertes zwischen etwa 4,0 und 8,5 können z. B. Natriumacetat, Natriumcitrat, Natriumphosphat etc. verwendet werden. Ansonsten sind zur Einstellung des pH-Wertes auch physiologisch unbedenkliche verdünnte Säuren (typischerweise HCl) bzw. Laugen (typischerweise NaOH) geeignet.
  • Wenn die Zubereitung einen Zinkgehalt besitzt, ist ein solcher von 1 μg/ml bis 2 mg/ml, insbesondere von 5 μg bis 200 μg Zink/ml bevorzugt.
  • Zwecks Variation des Wirkstoffprofils der erfindungsgemäßen Zubereitung kann auch unmodifiziertes insulin, vorzugsweise Rinder-, Schweine- oder Human-Insulin, insbesondere Humaninsulin, oder Insulinanaloga und Derivate davon zugemischt werden. Ebenfalls können ein oder mehrere Exendin-4 Derivate oder Peptide, die durch eine dem GLP-1 (Glucagon like Peptide-1) vergleichbare Aktivität charakterisiert sind, zugemischt werden. Solche Arzneimittel (Zubereitungen) sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Bevorzugte Wirkstoffkonzentrationen sind solche entsprechend etwa 1–1500, weiter bevorzugt etwa 5–1000 und insbesondere etwa 40–400 internationale Einheiten/ml.
  • Die erfindungsgemäßen Insulinanaloga werden zunächst als Vorstufe, die noch nicht das Amid umfasst, biotechnologisch hergestellt. Dem Fachmann ist geläufig, das es eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Herstellung von Insulinen gibt. Als Wirtszellsysteme finden dabei Bakterien, Hefen und Pflanzen bzw. fermentativ zu kultivierende Pflanzenzellen Verwendung. Falls die Kostenbetrachtung es erlaubt sind auch Expressionssysteme, die tierische Zellen als Wirtssystem nutzen, denkbar. Voraussetzung dafür ist aber eine sichere Freiheit von tierischen Viren. Somit ist klar, dass die beispielhaft beschriebenen Expressionssysteme nur einen kleinen Ausschnitt der für die rekombinante Herstellung von Proteinen entwickelten Wirts/Vektorsysteme darstellen. In der Anmeldung werden z. B. biotechnologische Verfahren, die Hefe- oder Pflanzensysteme wie Moose, Algen oder höhere Pflanzen wie Tabak, Erbse, Distel, Gerste, Mais oder Raps zur Grundlage haben nicht beschrieben. Dennoch sind Wirts/Vektor Systeme sowie kodierende DNA-Sequenzen, die die Herstellung der Zielpeptide in entsprechenden biotechnologischen Expressionssystemen erlauben, ebenfalls Bestandteil der Erfindung. Wirtsorganismen können also insbesondere ausgewählt werden aus dem Pflanzenreich aus Organismen der ersten Abteilung Schizophyta enthaltend Schizomcetes, Bakterien oder Blaualgen, Organismen der 2. Abteilung Phycophyta V. Klasse Chlorophyceae, Organismen der 2. Abteilung Phycophyta VII. Klasse Rhodophyceae, Organismen der 3. Abteilung Mycophyta, Organismen der 5. Abteilung Bryophyta und Organismen der 7. Abteilung Spermatophyta.
  • In der Europäischen Patentanmeldung EP-A 1 222 207 ist ein Plasmid pINT358d beschrieben, das für ein Prä-Proinsulin codiert, welches ein verändertes C-Peptid umfasst. Mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist es nun möglich, gezielt die das Proinsulin kodierende Sequenz so zu verändern, dass Prä-Proinsuline exprimiert werden können, die als Vorstufen für die erfindungsgemäßen Insulin dienen können. Entsprechende Fusionsproteine müssen nicht notwendigerweise intrazellulär hergestellt werden. Es ist dem Fachmann klar, dass solche Proteine auch durch bakterielle Expression mit anschließender Sekretion in das Periplasma und/oder in den Kulturüberstand hergestellt werden können. Die Europäische Patentanmeldung EP-A 1 364 029 beschreibt dies beispielhaft. Die Proinsulinvorstufen, die zu den erfindungsgemäßen Analoga führen, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Die so hergestellten Proinsuline können prinzipiell zu einer Insulinanalogavorstufe umgewandelt werden, die in Position A0 Lysin oder Arginin umfasst und am C-terminalen Ende der B-Kette Lysin oder Arginin trägt.
  • Liegen die erfindungsgemäßen Proinsuline nach intrazellulärer Expression in Bakterien als Einschlusskörper oder löslich vor, müssen diese Vorstufen durch in vitro Faltung in die richtige Konformation gefaltet werden, bevor die Prozessierung und biochemische Modifikation vorgenommen werden kann. Dabei erlaubt das beschriebene Fusionsprotein eine direkte Faltung nach Denaturierung mittels Harnstoff oder Guanidinium Hydrochlorid, Faltungsintermediate sind dabei ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Zur Anreicherung der einzelnen Zwischenstufen finden biochemische Methoden insbesondere Trennverfahren Verwendung, deren zugrunde liegenden Prinzipien publiziert und sogar Gegenstand von Lehrbüchern sind. Dem Fachmann ist klar, dass solche Prinzipien in Folge kombiniert werden können und so zu Verfahren führen können, die in ihre Abfolge vorher nicht publiziert wurden. Verfahren, die zur Reinigung der erfindungsgemäßen Analoga führen sind somit ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Insulinanaloga, wobei ein Vorläufer des Insulinanalogons rekombinant hergestellt und enzymatisch zu einer 2-kettigen Insulinvorstufe umgewandelt wird, die N-terminal zu Aminosäure 1 der A-Kette Arginin bzw. Lysin trägt und am C-terminalen Ende der B-Kette einen Lysin oder Argininrest aufweist, der mit Argininamid oder Lysinamid in Gegenwart eines Enzyms mit Trypsinaktivität in das Amid und somit in das erfindungsgemäße Verzögerungsinsulin überführt und über ein biochemischer Reinigungsverfahren hochrein dargestellt wird.
  • Figurenlegende:
  • 1: Blutzuckersenkende Wirkung von neuen Insulinanaloga in Ratten
  • 2: Blutzuckersenkende Wirkung von neuen Insulinanaloga im Hund
  • 3: Blutzuckersenkende Wirkung von YKL205 im Hund
  • Die folgenden Beispiele sollen den Erfindungsgedanken illustrieren, ohne dabei beschränkend zu wirken.
  • Beispiel 1: Herstellung des Vektorderivates pINT3580, das für Gly (A21) – Insulin und ein modifiziertes C-Peptid, das an der C/A-Kettengrenze Arg Arg trägt, kodiert.
  • Die Europäische Patentanmeldung EP-A 1 222 207 beschreibt die Plasmide pINT358d, pINT91d und die Primer-Sequenz Tir. DNA dieser Produkte findet Verwendung in der Konstruktion des Plasmides pINT3580. Das Plasmid pINT358d ist dabei durch eine Gensequenz charakterisiert, die für ein modifiziertes C-Peptid mit besonderen Eigenschaften kodiert. Drei Primersequenzen werden synthetisiert:
    Figure 00150001
  • Dieser Primer dient nach Aufarbeitung dazu in Position 21 der A-Kette der von pINT358d kodierten Proinsulinsequenz Glycin (fett gedruckt, unterstrichen) anstelle von Asparagin einzuführen.
    Figure 00150002
  • Dieser Primer dient, wie der Primer arg_cjunc_rev, zur Einführung von Arginin anstelle von Lysin an der Insulin A-/B-Kettengrenze.
    Figure 00150003
  • Das Codon für das einzuführende Arginin ist in beiden Primern fett gedruckt. Mit DNA des Plasmides pINT358d als Matrize wird mit den Primerpaaren Tir/arg_cjunc_rev und arg_cjuncf/pint3580_glya21rev entsprechend der Europäischen Patentanmeldung EP-A 1 222 207 je eine PCR durchgeführt. Aliquots der Produkte beider Reaktionen werden kombiniert und zusammen mit dem Primerpaar Tir/pint3580_glya21rev in einer dritten PCR eingesetzt. Das Produkt dieser Reaktion wird nach gelektrophoretischer Auftrennung des Reaktionsgemisches gereinigt und mit den Restriktionsenzymen Sal1/Nco1 nach Angaben des Herstellers in ein und derselben Reaktion verdaut, das Reaktionsgemisch gelelektrophoretisch aufgetrennt und das die Proinsulinsequenz kodierende DNA-Fragment isoliert. Das Fragment wird anschließend über eine DNA-Ligasereaktion in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert.
  • Mit dem Ligationsgemisch werden kompetente E. coli Bakterienzellen transformiert. Das Transformationsgemisch wird auf Selektionsplatten, die 25 mg/l Ampicillin enthalten, ausplattiert. Plasmid DNA wird von Kolonien isoliert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3580.
  • Beispiel 2: Konstruktion des Plasmides pINT3581 kodierend für His (A8), Gly (A21) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben über 3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
    Figure 00160001
  • Das Codon, das für Histidin in Position 8 der A-Kette kodiert ist jeweils fett herausgestellt. Die Konstruktion wird wie ins Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Template für PCR1 und 2 ist DNA des Plasmides pINT3580. PCR1 wird mit dem Primerpaar Tir/pint3580_Ha8rev und PCR2 mit dem Primerpaar pint3580_Ha8f/ pint3580_glya21rev durchgeführt. In PCR3 wird mit dem Primer paar Tir/pint3580_glya21rev eingesetzt. Template ist dabei ein Gemisch der Reaktionsprodukte von PCR1 und PCR2. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3581.
  • Beispiel 3: Konstruktion des Plasmides pINT3582 kodierend für His (A8), Glu (A5), Gly (A21) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben über 3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
    Figure 00170001
  • Das Codon, das für Glutaminsäure in Position 5 der A-Kette kodiert, ist jeweils fett herausgestellt. Die Konstruktion wird wie ins Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Template ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3582.
  • Beispiel 4: Konstruktion des Plasmides pINT3583 kodierend für His (A8), Asp (A18), Gly (A21) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt abweichend von Beispiel 1 über nur eine Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt dieser Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet wird der Primer Tir. Ein weiterer Primer wird synthetisiert:
    Figure 00180001
  • Das Codon, das für Asparaginsäure in Position 18 der A- Kette kodiert, ist fett herausgestellt. Template ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3583.
  • Beispiel 5: Konstruktion des Plasmides pINT3584 kodierend für His (A8), Glu (A5) Asp (A18), Gly (A21) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt abweichend von Beispiel 1 über nur eine Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt dieser Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet wird der Primer Tir pint3580_Da18rev (Bsp. 4). Template ist DNA des Plasmides pINT3582. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3584. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-1, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaminsulin
  • Entsprechende Amidierung mit Lysinamid führt zur Verbindung YKL205-1b:
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 6: Konstruktion des Plasmides pINT3585 kodierend für His (A8), Glu (A15), Gly (A21) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt abweichend von Beispiel 1 über nur eine Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt dieser Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet wird der Primer Tir. Ein weiterer Primer wird synthetisiert:
    Figure 00190001
  • Das Codon, das für Glutaminsäure in Position 15 der A-Kette kodiert, ist fett herausgestellt. Template ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3585.
  • Beispiel 7: Konstruktion des Plasmides pINT3586 kodierend für His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt abweichend von Beispiel 1 über nur eine Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt dieser Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet wird der Primer Tir. Ein weiterer Primer wird synthetisiert:
    Figure 00190002
  • Das Codon, für Glutaminsäure in Position 15 der A-Kette und Asparaginsäure in Position A18 der A-Kette ist jeweils fett herausgestellt. Template ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3586. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 8: Konstruktion des Plasmides pINT3587 kodierend für Glu (A5), His (A8), Glu (A15), Gly (A21) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt abweichend von Beispiel 1 über nur eine Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt dieser Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet wird der Primer Tir und pint3580_Ea15rev gemäß Beispiel 6. Template ist DNA des Plasmides pINT3582. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3587. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-2, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-2b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 9: Konstruktion des Plasmides pINT3588 kodierend für His (A8), Gly (A21), Asp (B3) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben über 3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
    Figure 00210001
  • Das Codon, das für Asparaginsäure in Position 3 der insulin B-Kette kodiert ist jeweils fett herausgestellt. Die Konstruktion wird wie ins Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Template ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3588.
  • Beispiel 10: Konstruktion des Plasmides pINT3589 kodierend für Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Asp (B3) – Präproinsulin
  • Führt man die Reaktionen wie in Beispiel 9 beschrieben durch, verwendet aber in PCR1 und PCR2 DNA des Plasmides pINT3582 als Template, so gelangt man zu Plasmid pINT3589.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-3, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-3b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 11: Konstruktion des Plasmides pINT3590 kodierend für His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3) – Präproinsulin
  • Führt man die Reaktionen wie in Beispiel 9 beschrieben durch, verwendet aber in PCR1 und PCR2 DNA des Plasmides pINT3585 als Template, so gelangt man zu Plasmid pINT3590. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-4, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-4b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 12: Konstruktion des Plasmides pINT3591 kodierend für His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3) – Präproinsulin
  • Führt man die Reaktionen wie in Beispiel 9 beschrieben durch, verwendet aber in PCR1 und PCR2 DNA des Plasmides pINT3586 als Template, so gelangt man zu Plasmid pINT3591. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-5, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-5b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 13: Konstruktion des Plasmides pINT3592 kodierend für His (A8), Gly (A21), Asp (B3) – Glu (B4) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben über 3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
    Figure 00230001
    Figure 00240001
  • Das Codon, das für Asparaginsäure in Position 3 und Glutaminsäure in Position 4 der Insulin B-Kette kodiert, ist jeweils fett herausgestellt Die Konstruktion wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Template ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3592. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-6, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-6b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 14: Konstruktion des Plasmides pINT3593 kodierend für His (A8), Gly (A21), Glu (B4) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben über 3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
    Figure 00240002
    Figure 00250001
  • Das Codon, das für Glutaminsäure in Position 4 der Insulin B-Kette kodiert, ist fett herausgestellt. Die Konstruktion wird wie ins Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Template ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3593.
  • Beispiel 15: Konstruktion des Plasmides pINT3594 kodierend für Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B4) – Präproinsulin.
  • Führt man die Reaktionen wie in Beispiel 9 beschrieben durch, verwendet aber in PCR1 und PCR2 DNA des Plasmides pINT3582 als Template, so gelangt man zu Plasmid pINT3594.
  • Das Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-7, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin.
  • Das Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-7b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 16: Konstruktion des Plasmides pINT3595 kodierend für His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4) – Präproinsulin.
  • Führt man die Reaktionen wie in Beispiel 9 beschrieben durch, verwendet aber in PCR1 und PCR2. DNA des Plasmides pINT3585 als Template, so gelangt man zu Plasmid pINT3595. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-8, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-8b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 17: Konstruktion des Plasmides pINT3596 kodierend für His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4) – Präproinsulin
  • Führt man die Reaktionen wie in Beispiel 9 beschrieben durch, verwendet aber in PCR1 und PCR2 DNA des Plasmides pINT3586 als Template, so gelangt man zu Plasmid pINT3596. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-9, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-9b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 18: Konstruktion des Plasmides pINT3597 kodierend für His (A8), Gly (A21), Glu (B0) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt über 2 Polymerase Kettenreaktionen. Verwendet wird der Primer pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
    Figure 00270001
  • Dabei überlappen sich die beiden Primer partial. Pint3581_Eb0f2 enthält eine NcoI – Erkennungssequenz. Diese ist unterstrichen dargestellt. Das Codon, das für Glutaminsäure in Position 0 am Anfang B-Kette kodiert, ist jeweils fett herausgestellt. Template für PCR1 ist DNA des Plasmides pINT3581.
  • PCR1 wird mit dem Primerpaar pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev. Template für PCR2 ist das Produkt aus PCR1. PCR2 wird mit dem Primerpaar pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev durchgeführt. Das Produkt aus PCR2 übereckt die vollständige Präproinsulinsequenz. Das Produkt der zweiten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3597. Ersetzt man das Codon für Glutaminsäure in Position B0 durch das Codon von Asparaginsäure und folgt dem Beispiel, so gelangt man zu Plasmiden, die in Position B0 anstelle von Glutaminsäure Asparaginsäure tragen.
  • Beispiel 19: Konstruktion des Plasmides pINT3598 kodierend für Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B0) – Präproinsulin
  • Führt man die Reaktionen wie in Beispiel 18 beschrieben durch, verwendet aber in PCR1 DNA des Plasmides pINT3582 als Template, so gelangt man zu Plasmid pINT3598. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-10, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-10b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 20: Konstruktion des Plasmides pINT3599 kodierend für His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0) – Präproinsulin
  • Führt man die Reaktionen wie in Beispiel 18 beschrieben durch, verwendet aber in PCR1 DNA des Plasmides pINT3585 als Template, so gelangt man zu Plasmid pINT3599. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-11, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-11b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 21: Konstruktion des Plasmides pINT3600 kodierend für His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0) – Präproinsulin
  • Führt man die Reaktionen wie in Beispiel 18 beschrieben durch, verwendet aber in PCR1 DNA des Plasmides pINT3586 als Template, so gelangt man zu Plasmid pINT3600. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-12, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-12b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 22: Konstruktion des Plasmides pINT3601 kodierend für His (A8), Gly (A21), Asp (B1) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt über 2 Polymerase Kettenreaktionen. Verwendet wird der Primer pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
    Figure 00300001
  • Dabei überlappen sich die beiden Primer partial. Pint3581_Db-1f2 enthält eine NcoI – Erkennungssequenz. Diese ist unterstrichen dargestellt. Das Codon, das für Asparaginsäure in Position 1 der B-Kette kodiert, ist jeweils fett herausgestellt. Template für PCR1 ist DNA des Plasmides pINT3581. PCR1 wird mit dem Primerpaar pint3581_Db1f1/pint3580_glya21rev durchgeführt. Template für PCR2 ist das Produkt aus PCR1. PCR2 wird mit dem Primerpaar pint3581_Db1f2/pint3580_glya21rev durchgeführt. Das Produkt aus PCR2 überdeckt die vollständige Präproinsulinsequenz. Das Produkt der zweiten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3601.
  • Beispiel 23: Konstruktion des Plasmides pINT3602 kodierend für Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Asp (B1) – Präproinsulin
  • Führt man die Reaktionen wie in Beispiel 22 beschrieben durch, verwendet aber in PCR1 DNA des Plasmides pINT3582 als Template, so gelangt man zu Plasmid pINT3602. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-13, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-13b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 24: Konstruktion des Plasmides pINT3603 kodierend für His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1) – Präproinsulin
  • Führt man die Reaktionen wie in Beispiel 22 beschrieben durch, verwendet aber in PCR1 DNA des Plasmides pINT3585 als Template, so gelangt man zu Plasmid pINT3603. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-14, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-14b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 25: Konstruktion des Plasmides pINT3604 kodierend für His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1) – Präproinsulin
  • Führt man die Reaktionen wie in Beispiel 22 beschrieben durch, verwendet aber in PCR1 DNA des Plasmides pINT3586 als Template, so gelangt man zu Plasmid pINT3604. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-15, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-15b, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 26: Konstruktion des Plasmides pINT3605 kodierend für His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt über 2 Polymerase Kettenreaktionen. Verwendet wird der Primer pint3580_glya21rev und der in Beispiel 18 beschrieben Primer pint3581_Eb01f2. Synthetisiert wird der Primer pint3597_Db1f:
    Figure 00320001
  • Das Codon, das für Glutaminsäure in Position 0 und das für Asparaginsäure jeweils am Anfang der B-Kette kodiert, ist jeweils fett herausgestellt. Template für PCR1 ist DNA des Plasmides pINT3597. PCR1 wird mit dem Primerpaar pint3597_Db1f/pint3580_glya21rev. Template für PCR2 ist das Produkt aus PCR1. PCR2 wird mit dem Primerpaar pint3581_Eb1f2/pint3580_glya21rev durchgeführt. Das Produkt aus PCR2 überdeckt die vollständige Präproinsulinsequenz. Das Produkt der zweiten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3605. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-16, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-16a, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 27: Konstruktion des Plasmides pINT3606 kodierend für His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), des Thr (B30) – Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben über 3 Polymerase Kettenreaktionen. Verwendet werden die Primer Tir und pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
    Figure 00330001
  • Template für PCR1 und PCR2 ist DNA des Plasmides pINT3586. PCR1 wird mit dem Primerpaar des B30f/pint3580_glya21rev und PCR2 wird mit dem Primerpaar Tir/des B30rev Template durchgeführt. Als Template für PCR3 wird ein äquimolares Gemisch der Produkte aus PCR1 und PCR2 verwendet. Die Reaktion wird mit dem Primerpaar Tir/pint3580_glya21rev durchgeführt. Das Produkt aus PCR3 überdeckt die vollständige Präproinsulinsequenz. Das Produkt der dritten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-17, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B30), Arg (B31) -NH2 – Humaninsulin
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung YKL205-18, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht und die folgende Struktur beschreibt:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B30), Lys (B31) -NH2 – Humaninsulin
  • Beispiel 28: Expression der Proinsulinderivate
  • Die Expression wird entsprechend Beispiel 1 der Europäischen Patentanmeldung EP-A 1 222 207 durchgeführt.
  • Beispiel 29: Faltung der Proinsulinderivate
  • Die Faltung erfolgt prinzipiell nach der in EP-A 0 668 282 beschriebenen Methode
  • Beispiel 30:
  • Enzymatische Prozessierung der gefalteten Präproinsulin zu der 2-kettigen Arg (A0) – Insulinvorstufe, deren C-terminales B-Kettenende durch Lysin oder Arginin charakterisiert ist.
  • Die Enzymatische Prozessierung der gefalteten Präproinsulinvorstufe erfolgt wie z. B. in Beispiel 4 von WO 91/03550 beschrieben. Als besonders vorteilhaft erweist sich dabei der Einsatz der in WO 2007/031187 A1 beschriebenen Trypsinvariante.
  • Beispiel 31: Herstellung eines Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulins
  • Unabhängig von der Positionierung der zusätzlichen sauren Aminosäuren wird eine Standardreaktion wie folgt durchgeführt: 100 mg Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31) – Insulinanalog werden in 0.95 ml Argininamidlösung (446 g/L) gelöst, 0.13 ml M Na-Acetatpuffer (pH 5.8) und 2 ml DMF zugegeben. Die Reaktionsmischung wird auf 12°C gekühlt und durch Zugabe von 0.094 ml Trypsin (0.075 mg, Roche Diagnostics) gestartet. Nach 8 h wird die Reaktion durch Zugabe von TFA bis pH 2.5 gestoppt und per HPLC analysiert. Es bildet sich > 60%. Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 – Humaninsulin. Nach Zusatz von Trypsininhibitorlösung erfolgt die Reinigung des amidierten Analogs in Analogie zu US 5,656,722 .
  • Die Herstellung der entsprechenden Lysinamid – Verbindung erfolgt analog. Allerdings geht man von einer wässrigen Lysinamid Stammlösung aus, die 366 g/L Lysinamid gelöst enthält.
  • Beispiel 32: Formulierung der amidierten Indulinderivate
  • Um die erfindungsgemäßen Insulinderivate auf ihre biologisch, pharmakologischen und physikalisch chemischen Eigenschaften zu testen, wurde von den Verbindungen wie folgt eine Lösung hergestellt: Das erfindungsgemäße Insulinderivat wurde mit einer Zielkonzentration von 240 ± 5 μM in 1 mM Salzsäure mit 80 μg/mL Zink (als Zinkchlorid) aufgelöst. Hierzu wurde von dem gefriergetrockneten Material zunächst eine um etwa 30% höhere Menge als aufgrund des Molekulargewichts und der angestrebten Konzentration benötigt eingewogen. Danach wurde die vorliegende Konzentration mittels analytischer HPLC bestimmt und die Lösung anschließend auf das zur Erreichung der Zielkonzentration erforderliche Volumen 5 mM Salzsäure mit 80 μg/mL Zink aufgefüllt. Falls erforderlich, wurde dabei der pH-Wert auf 3,5 ± 0,1 nachjustiert. Nach der endgültigen Analyse durch HPLC zur Absicherung der Zielkonzentration von 240 ± 5 μM wurde die fertige Lösung mittels einer Spritze mit einem 0,2 μm Filtervorsatz in ein mit einem Septum und einer Bördelkappe verschlossenes steriles Fläschchen überführt. Für die kurzfristige, einmalige Testung der erfindungsgemäßen Insulinderivate wurde keine Optimierung der Formulierungen, z. B. hinsichtlich eines Zusatzes isotonischer Agentien, Konservierungsmittel oder Puffersubstanzen, vorgenommen.
  • Beispiel 33: Evaluierung der blutzuckersenkenden Wirkung von neuen Insulinanaloga in der Ratte
  • Die blutzuckersenkende Wirkung von ausgewählten neuen Insulinanaloga wird in männlichen, gesunden, normoglykämischen Wistarratten geprüft. Männlichen Ratten wird eine Dosis von 9 nmol/kg eines Insulinanalogons subkutan injiziert. Unmittelbar vor der Injektion des Insulinanalogons und in regelmäßigen Abständen bis zu acht Stunden nach der Injektion werden den Tieren Blutproben entnommen und darin der Blutzuckergehalt bestimmt. Das Experiment zeigt deutlich (vgl. 1), dass das eingesetzte erfindungsgemäße Insulinanalogon zu einem deutlich verzögerten Wirkeintritt und einer längeren, gleichmäßigen Wirkdauer führt.
  • Beispiel 34: Evaluierung der blutzuckersenkenden Wirkung von neuen Insulinanaloga im Hund
  • Die blutzuckersenkende Wirkung von ausgewählten neuen Insulinanaloga wird in männlichen, gesunden, normoglykämischen Beaglehunden geprüft. Männlichen Tieren wird eine Dosis von 6 nmol/kg eines Insulinanalogons subkutan injiziert. Unmittelbar vor der Injektion des Insulinanalogons und in regelmäßigen Abständen bis zu achtundvierzig Stunden nach der Injektion werden den Tieren Blutproben entnommen und darin der Blutzuckergehalt bestimmt. Das Experiment zeigt deutlich (vgl. 2), dass das eingesetzte erfindungsgemäße Insulinanalogon zu einem deutlich verzögerten Wirkeintritt und einer längeren, gleichmäßigen Wirkdauer führt.
  • Beispiel 35: Evaluierung der blutzuckersenkenden Wirkung am Hund bei zweifach erhöhter Dosis
  • Die blutzuckersenkende Wirkung von ausgewählten neuen Insulinanaloga wird in männlichen, gesunden, normoglykämischen Beaglehunden geprüft. Männlichen Tieren wird eine Dosis von 6 nmol/kg und 12 nmol/kg eines Insulinanalogons subkutan injiziert. Unmittelbar vor der Injektion des Insulinanalogons und in regelmäßigen Abständen bis zu achtundvierzig Stunden nach der Injektion werden den Tieren Blutproben entnommen und darin der Blutzuckergehalt bestimmt. Das Experiment zeigt deutlich (vgl. 3), dass das eingesetzte erfindungsgemäße Insulinanalogon dosisabhängig wirkt, dass aber trotz zweifach erhöhter Dosis der Wirkungsverlauf flach verläuft, d. h. kein ausgeprägter Tiefpunkt (Nadir) beobachtet wird. Daraus lässt sich ableiten, dass die erfindungsgemäßen Insuline im Vergleich zu bekannten Verzögerungsinsulinen zu deutlich weniger hypoglykämischen Ereignissen führen.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • - WO 2006/058620 [0026]
    • - WO 2001/04156 [0026]
    • - WO 2004/005342 [0026]
    • - WO 98/08871 [0026]
    • - EP 1222207 A [0036, 0046, 0049, 0110]
    • - EP 1364029 A [0036]
    • - EP 0668282 A [0111]
    • - WO 91/03550 [0113]
    • - WO 2007/031187 A1 [0113]
    • - US 5656722 [0114]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Kohn et al. (Peptides 28 (2007) 935–948) [0006]
    • - Kohn et al [0006]

Claims (32)

  1. Insulinanalogon der Formel I
    Figure 00380001
    wobei A0 Lys oder Arg; A5 Asp, Gln oder Glu; A15 Asp, Glu oder Gln; A18 Asp, Glu oder Asn; B-1 Asp, Glu oder eine Aminogruppe; B0 Asp, Glu oder eine chemische Bindung; B1 Asp, Glu oder Phe; B2 Asp, Glu oder Val; B3 Asp, Glu oder Asn; B4 Asp, Glu oder Gln; B29 Lys oder einer chemischen Bindung; B30 Thr oder einer chemischen Bindung; B31 Arg, Lys oder einer chemischen Bindung; B32 Arg-Amid, Lys-Amid oder einer Aminogruppe entspricht, wobei zwei Aminosäurereste der Gruppe enthaltend A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 und B4 gleichzeitig und unabhängig voneinander Asp oder Glu entsprechen.
  2. Insulinanalogon gemäß Anspruch 1, wobei A0 Arg entspricht.
  3. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei A5 Glu entspricht.
  4. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei A15 Glu entspricht.
  5. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei A18 Asp entspricht.
  6. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B-1 einer Aminogruppe entspricht.
  7. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B0 Glu entspricht.
  8. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B1 Asp entspricht.
  9. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B2 Val entspricht.
  10. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B3 Asp entspricht.
  11. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B4 Glu entspricht.
  12. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B29 Lys entspricht.
  13. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B30 Thr entspricht.
  14. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B31 Arg oder Lys entspricht.
  15. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B32 Arg -NH2 oder Lys -NH2 entspricht.
  16. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend: Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30), Arg (B31) -NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30), Lys (B31) -NH2 Humaninsulin.
  17. Verfahren zur Herstellung eines Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei ein Vorläufer des Insulinanalogons Humaninsulin rekombinant hergestellt wird, der Vorläufer enzmatisch zu zwei- kettigem Insulin prozessiert wird und eine Kupplung mit Argininamid in Gegenwart eines Enzyms mit Trypsinaktivität durchgeführt wird, und das Insulinanalogon isoliert wird.
  19. Verwendung eines Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes Mellitus.
  20. Verwendung gemäß Anspruch 19 in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes Mellitus Typ I oder Typ II oder zur therapeutischen Unterstützung der beta-Zellregeneration.
  21. Arzneimittel enthaltend ein Insulinanalog gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.
  22. Formulierung des Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Formulierung in wässriger Form enthaltend das gelöste Insulinanalogon vorliegt.
  23. Formulierung des Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Formulierung in Form von Pulver vorliegt.
  24. Formulierung gemäß Anspruch 23, wobei das Insulinanalogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 in kristalliner und/oder amorpher Form vorhanden ist.
  25. Formulierung des Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Formulierung in Form einer Suspension vorliegt.
  26. Formulierung des Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Formulierung zusätzlich ein chemisches Chaperon enthält.
  27. DNA kodierend für einen Vorläufer eines Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.
  28. DNA kodierend für die A-Kette eines Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.
  29. DNA kodierend für die B-Kette eines Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.
  30. Vektor enthaltend eine DNA nach einem oder mehreren der Ansprüche 27 bis 29.
  31. Wirtsorganismus enthaltend eine DNA nach einem oder mehreren der Ansprüche 27 bis 29 oder einen Vektor gemäß Anspruch 30.
  32. Präproinsulinanalogon, dadurch gekennzeichnet, dass das C-Peptid an seinem N-Terminus den Aminosäurerest Arginin und an seinem C-Terminus zwei Argininreste oder einen Argininrest und einen Lysinrest trägt, wobei in letzterem Falle der Lysinrest den eigentlichen C-Terminus bildet.
DE200810003568 2008-01-09 2008-01-09 Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil Withdrawn DE102008003568A1 (de)

Priority Applications (35)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200810003568 DE102008003568A1 (de) 2008-01-09 2008-01-09 Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil
MYPI20102683 MY152979A (en) 2008-01-09 2009-01-06 Novel insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile
JP2010541743A JP5694779B2 (ja) 2008-01-09 2009-01-06 極度に遅延した時間作用プロファイルを有する新規なインスリン誘導体
EP09701358.5A EP2229407B1 (de) 2008-01-09 2009-01-06 Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit- / wirkungsprofil
CN200980101962.3A CN102007143B (zh) 2008-01-09 2009-01-06 具有超延迟时效特征的新型胰岛素衍生物
CA2711749A CA2711749A1 (en) 2008-01-09 2009-01-06 Novel insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile
BRPI0907371A BRPI0907371A2 (pt) 2008-01-09 2009-01-06 derivados de insulina com um perfil de tempo-ação muito retardado
HUE09701358A HUE030537T2 (en) 2008-01-09 2009-01-06 New insulin analogues with a particularly prolonged effect profile
PL09701358T PL2229407T3 (pl) 2008-01-09 2009-01-06 Nowe pochodne insuliny o ekstremalnie spowolnionym profilu czasu działania
NZ586590A NZ586590A (en) 2008-01-09 2009-01-06 Insulin analogues or derivatives having an extremely delayed time-action profile
ES09701358.5T ES2613152T3 (es) 2008-01-09 2009-01-06 Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/acción extremadamente retardado
PCT/EP2009/000017 WO2009087081A2 (de) 2008-01-09 2009-01-06 Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit-/wirkungsprofil
AU2009203809A AU2009203809B2 (en) 2008-01-09 2009-01-06 Novel insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile
KR1020107014961A KR20100111682A (ko) 2008-01-09 2009-01-06 극히 지연된 시간-작용 프로필을 갖는 신규 인슐린 유도체
UAA201009821A UA103015C2 (ru) 2008-01-09 2009-01-06 Новые производные инсулина с чрезвычайно замедленным профилем время/действие
DK09701358.5T DK2229407T3 (en) 2008-01-09 2009-01-06 NEW INSULIN DERIVATIVES WITH EXTREMELY DELAYED TIME / EFFECTS PROFILE
RU2010133231/10A RU2524423C2 (ru) 2008-01-09 2009-01-06 Новые производные инсулина с чрезвычайно замедленным профилем время/действие
PA20098811601A PA8811601A1 (es) 2008-01-09 2009-01-07 Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/accion extremadamente retardado
PE2009000009A PE20091377A1 (es) 2008-01-09 2009-01-07 Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/accion extremadamente retardado
UY031596A UY31596A1 (es) 2008-01-09 2009-01-07 Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/accion extremadamente retardado
CL2009000017A CL2009000017A1 (es) 2008-01-09 2009-01-07 Analogo de insulina con tiempo de accion plano y prolongado; procedimiento de preparación; uso para tratar diabetes mellitus; producto farmaceutico y formulacion que lo comprende; secuencia nucleotidica que lo codifica; vector; y célula hospedera.
TW098100281A TW200942256A (en) 2008-01-09 2009-01-07 Novel insulin derivatives with extremely delayed time/action profile
ARP090100035A AR070118A1 (es) 2008-01-09 2009-01-07 Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/ accion extremadamente retardado
ZA2010/03926A ZA201003926B (en) 2008-01-09 2010-06-02 Novel insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile
CR11511A CR11511A (es) 2008-01-09 2010-06-17 Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/accion extremadamente retardado
US12/820,722 US9644017B2 (en) 2008-01-09 2010-06-22 Insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile
TN2010000298A TN2010000298A1 (en) 2008-01-09 2010-06-25 Novel insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile
NI201000114A NI201000114A (es) 2008-01-09 2010-06-28 Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/acción extremadamente retardado.
CO10079133A CO6311108A2 (es) 2008-01-09 2010-06-30 Analogos de insulina en los cuales el extremo de la cadena b consiste en un residuo aminoácido, el residuo de aminoácido n-terminal de la cadena a de la insulina es un residuo lisina o arginina, la posición a8 del aminoácido está ocupada por un resid
DO2010000209A DOP2010000209A (es) 2008-01-09 2010-07-02 Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/accion extremadamente retardado
MA32985A MA31998B1 (fr) 2008-01-09 2010-07-05 Nouveaux derives d'insuline ayant un profil temps-action extremement retarde
IL206844A IL206844A (en) 2008-01-09 2010-07-06 Insulin derivatives with a highly delayed action profile
EC2010010333A ECSP10010333A (es) 2008-01-09 2010-07-08 Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/acción extremadamente retardado
GT201000199A GT201000199A (es) 2008-01-09 2010-07-08 Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/accion extremadamente retardado
HK11104060.4A HK1149772A1 (zh) 2008-01-09 2011-04-21 具有超延遲時效特徵的新型胰島素衍生物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200810003568 DE102008003568A1 (de) 2008-01-09 2008-01-09 Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102008003568A1 true DE102008003568A1 (de) 2009-07-16

Family

ID=40758369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE200810003568 Withdrawn DE102008003568A1 (de) 2008-01-09 2008-01-09 Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil

Country Status (3)

Country Link
CR (1) CR11511A (de)
DE (1) DE102008003568A1 (de)
UA (1) UA103015C2 (de)

Cited By (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008051834A1 (de) 2008-10-17 2010-04-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
DE102008053048A1 (de) 2008-10-24 2010-04-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
DE102009038210A1 (de) 2009-08-20 2011-03-03 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
WO2012035139A1 (en) 2010-09-17 2012-03-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Prodrugs comprising an exendin linker conjugate
WO2012098462A1 (en) 2011-01-20 2012-07-26 Zealand Pharma A/S Combination of acylated glucagon analogues with insulin analogues
US8642541B2 (en) 2008-12-15 2014-02-04 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US8642540B2 (en) 2008-12-15 2014-02-04 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US8680049B2 (en) 2008-12-15 2014-03-25 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US8685919B2 (en) 2008-12-15 2014-04-01 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US9138462B2 (en) 2009-07-31 2015-09-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Prodrugs comprising an insulin linker conjugate
US9156901B2 (en) 2009-07-13 2015-10-13 Ditte Riber Acylated glucagon analogues
US9169310B2 (en) 2010-06-24 2015-10-27 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US9180169B2 (en) 2012-09-17 2015-11-10 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US9265723B2 (en) 2009-07-31 2016-02-23 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Long acting insulin composition
US9364519B2 (en) 2011-09-01 2016-06-14 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
US9403894B2 (en) 2010-06-23 2016-08-02 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US9408893B2 (en) 2011-08-29 2016-08-09 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for use in glycemic control in diabetes type 2 patients
US9526764B2 (en) 2008-10-17 2016-12-27 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Combination of an insulin and a GLP-1-agonist
US9616015B2 (en) 2012-05-25 2017-04-11 Diamedica Inc. Formulations of human tissue kallikrein-1 for parenteral delivery and related methods
US9707176B2 (en) 2009-11-13 2017-07-18 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist and methionine
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
US9839678B2 (en) 2012-06-04 2017-12-12 Diamedica Inc. Human tissue kallikrein 1 glycosylation isoforms
US9896495B2 (en) 2013-10-17 2018-02-20 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogues
US9950039B2 (en) 2014-12-12 2018-04-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation
US9981013B2 (en) 2010-08-30 2018-05-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Use of AVE0010 for the treatment of diabetes mellitus type 2
US9988429B2 (en) 2013-10-17 2018-06-05 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US10017557B2 (en) 2015-08-28 2018-07-10 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analogs and use thereof
US10029011B2 (en) 2009-11-13 2018-07-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist, an insulin and methionine
US10093713B2 (en) 2013-11-06 2018-10-09 Zealand Pharma A/S GIP-GLP-1 dual agonist compounds and methods
US10100097B2 (en) 2012-05-03 2018-10-16 Zealand Pharma A/S GIP-GLP-1 dual agonist compounds and methods
US10131702B2 (en) 2013-11-06 2018-11-20 Zealand Pharma A/S Glucagon-GLP-1-GIP triple agonist compounds
US10159713B2 (en) 2015-03-18 2018-12-25 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Treatment of type 2 diabetes mellitus patients
US10159715B2 (en) 2014-05-29 2018-12-25 Hanmi Pharm. Co., Ltd Method for treating diabetes comprising long-acting insulin analogue conjugate and long-acting insulinotropic peptide conjugate
US10188703B2 (en) 2014-05-30 2019-01-29 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for treating diabetes mellitus by a composition comprising insulin and a GLP-1/glucagon dual agonist
US10253078B2 (en) 2014-10-29 2019-04-09 Zealand Pharma A/S GIP agonist compounds and methods
US10253082B2 (en) 2014-01-20 2019-04-09 Hanmi Pharm. Co., Ltd Long-acting insulin and use thereof
US10336802B2 (en) 2015-04-16 2019-07-02 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogue
US10434147B2 (en) 2015-03-13 2019-10-08 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Treatment type 2 diabetes mellitus patients
US10442847B2 (en) 2012-07-23 2019-10-15 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US11396534B2 (en) 2016-09-23 2022-07-26 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof
US11752216B2 (en) 2017-03-23 2023-09-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof
US11857608B2 (en) 2017-03-09 2024-01-02 Diamedica Inc. Dosage forms of tissue kallikrein 1

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991003550A1 (en) 1989-08-29 1991-03-21 Hoechst Aktiengesellschaft Fusion proteins, their preparation and use
EP0668282A1 (de) 1994-02-19 1995-08-23 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung von Polyalkyl-1-oxadiazaspirodecan-Verbindungen
US5656722A (en) 1988-11-08 1997-08-12 Hoechst Aktiengesellschaft A21 -, B30 - modified insulin derivatives having an altered action profile
WO1998008871A1 (en) 1996-08-30 1998-03-05 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives
WO2001004156A1 (en) 1999-07-12 2001-01-18 Zealand Pharmaceuticals A/S Peptides that lower blood glucose levels
EP1222207A1 (de) 1999-10-02 2002-07-17 Aventis Pharma Deutschland GmbH C-peptid zur verbesserten herstellung von insulin und insulinanaloga
EP1364029A1 (de) 2001-02-20 2003-11-26 Aventis Pharma Deutschland GmbH Fusionsproteine für die sekretion eines proteins von interesse in den überstand einer bakterienkultur
WO2004005342A1 (en) 2002-07-04 2004-01-15 Zealand Pharma A/S Glp-1 and methods for treating diabetes
WO2006058620A2 (de) 2004-12-01 2006-06-08 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verfahren zur herstellung von carboxy-terminal amidierten peptiden
WO2007031187A1 (en) 2005-09-14 2007-03-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5656722A (en) 1988-11-08 1997-08-12 Hoechst Aktiengesellschaft A21 -, B30 - modified insulin derivatives having an altered action profile
WO1991003550A1 (en) 1989-08-29 1991-03-21 Hoechst Aktiengesellschaft Fusion proteins, their preparation and use
EP0668282A1 (de) 1994-02-19 1995-08-23 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung von Polyalkyl-1-oxadiazaspirodecan-Verbindungen
WO1998008871A1 (en) 1996-08-30 1998-03-05 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives
WO2001004156A1 (en) 1999-07-12 2001-01-18 Zealand Pharmaceuticals A/S Peptides that lower blood glucose levels
EP1222207A1 (de) 1999-10-02 2002-07-17 Aventis Pharma Deutschland GmbH C-peptid zur verbesserten herstellung von insulin und insulinanaloga
EP1364029A1 (de) 2001-02-20 2003-11-26 Aventis Pharma Deutschland GmbH Fusionsproteine für die sekretion eines proteins von interesse in den überstand einer bakterienkultur
WO2004005342A1 (en) 2002-07-04 2004-01-15 Zealand Pharma A/S Glp-1 and methods for treating diabetes
WO2006058620A2 (de) 2004-12-01 2006-06-08 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verfahren zur herstellung von carboxy-terminal amidierten peptiden
WO2007031187A1 (en) 2005-09-14 2007-03-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kohn et al. (Peptides 28 (2007) 935-948)
PEPTIDES, 2007, 28, S. 935-948 *

Cited By (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3677275A1 (de) 2008-10-17 2020-07-08 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Kombination von einem insulin und einem glp-1-agonisten
DE102008051834A1 (de) 2008-10-17 2010-04-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
EP3228320A1 (de) 2008-10-17 2017-10-11 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Kombination von einem insulin und einem glp-1-agonisten
US9526764B2 (en) 2008-10-17 2016-12-27 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Combination of an insulin and a GLP-1-agonist
US10117909B2 (en) 2008-10-17 2018-11-06 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Combination of an insulin and a GLP-1 agonist
DE102008053048A1 (de) 2008-10-24 2010-04-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
US8642541B2 (en) 2008-12-15 2014-02-04 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US8642540B2 (en) 2008-12-15 2014-02-04 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US8680049B2 (en) 2008-12-15 2014-03-25 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US8685919B2 (en) 2008-12-15 2014-04-01 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US10004786B2 (en) 2009-07-13 2018-06-26 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogues
US9156901B2 (en) 2009-07-13 2015-10-13 Ditte Riber Acylated glucagon analogues
US9457066B2 (en) 2009-07-31 2016-10-04 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Prodrugs comprising an insulin linker conjugate
US9265723B2 (en) 2009-07-31 2016-02-23 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Long acting insulin composition
US9138462B2 (en) 2009-07-31 2015-09-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Prodrugs comprising an insulin linker conjugate
DE102009038210A1 (de) 2009-08-20 2011-03-03 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
US10028910B2 (en) 2009-11-13 2018-07-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition comprising a GLP-1-agonist and methionine
US10029011B2 (en) 2009-11-13 2018-07-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist, an insulin and methionine
US9707176B2 (en) 2009-11-13 2017-07-18 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist and methionine
US9403894B2 (en) 2010-06-23 2016-08-02 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US9169310B2 (en) 2010-06-24 2015-10-27 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US9981013B2 (en) 2010-08-30 2018-05-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Use of AVE0010 for the treatment of diabetes mellitus type 2
US9133276B2 (en) 2010-09-17 2015-09-15 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Prodrugs comprising an exendin linker conjugate
WO2012035139A1 (en) 2010-09-17 2012-03-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Prodrugs comprising an exendin linker conjugate
WO2012098462A1 (en) 2011-01-20 2012-07-26 Zealand Pharma A/S Combination of acylated glucagon analogues with insulin analogues
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
US9408893B2 (en) 2011-08-29 2016-08-09 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for use in glycemic control in diabetes type 2 patients
US9987332B2 (en) 2011-09-01 2018-06-05 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
US9364519B2 (en) 2011-09-01 2016-06-14 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
US10100097B2 (en) 2012-05-03 2018-10-16 Zealand Pharma A/S GIP-GLP-1 dual agonist compounds and methods
US9616015B2 (en) 2012-05-25 2017-04-11 Diamedica Inc. Formulations of human tissue kallikrein-1 for parenteral delivery and related methods
US9839678B2 (en) 2012-06-04 2017-12-12 Diamedica Inc. Human tissue kallikrein 1 glycosylation isoforms
US11795204B2 (en) 2012-07-23 2023-10-24 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US10442847B2 (en) 2012-07-23 2019-10-15 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US10253081B2 (en) 2012-09-17 2019-04-09 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US9975939B2 (en) 2012-09-17 2018-05-22 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US9180169B2 (en) 2012-09-17 2015-11-10 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US11091528B2 (en) 2013-10-17 2021-08-17 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogues
US10457714B2 (en) 2013-10-17 2019-10-29 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogues
US11034747B2 (en) 2013-10-17 2021-06-15 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues and methods of use
US9896495B2 (en) 2013-10-17 2018-02-20 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogues
US11884713B2 (en) 2013-10-17 2024-01-30 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogues
US9988429B2 (en) 2013-10-17 2018-06-05 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US10131702B2 (en) 2013-11-06 2018-11-20 Zealand Pharma A/S Glucagon-GLP-1-GIP triple agonist compounds
US11111285B2 (en) 2013-11-06 2021-09-07 Zealand Pharma A/S Glucagon-GLP-1-GIP triple agonist compounds
US10093713B2 (en) 2013-11-06 2018-10-09 Zealand Pharma A/S GIP-GLP-1 dual agonist compounds and methods
US11008375B2 (en) 2013-11-06 2021-05-18 Zealand Pharma A/S GIP-GLP-1 dual agonist compounds and methods
US10253082B2 (en) 2014-01-20 2019-04-09 Hanmi Pharm. Co., Ltd Long-acting insulin and use thereof
US10159715B2 (en) 2014-05-29 2018-12-25 Hanmi Pharm. Co., Ltd Method for treating diabetes comprising long-acting insulin analogue conjugate and long-acting insulinotropic peptide conjugate
US10188703B2 (en) 2014-05-30 2019-01-29 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for treating diabetes mellitus by a composition comprising insulin and a GLP-1/glucagon dual agonist
US11001619B2 (en) 2014-10-29 2021-05-11 Zealand Pharma A/S GIP agonist compounds and methods
US11814417B2 (en) 2014-10-29 2023-11-14 Zealand Pharma A/S GIP agonist compounds and methods
US10253078B2 (en) 2014-10-29 2019-04-09 Zealand Pharma A/S GIP agonist compounds and methods
US9950039B2 (en) 2014-12-12 2018-04-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation
US10434147B2 (en) 2015-03-13 2019-10-08 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Treatment type 2 diabetes mellitus patients
US10159713B2 (en) 2015-03-18 2018-12-25 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Treatment of type 2 diabetes mellitus patients
US11274136B2 (en) 2015-04-16 2022-03-15 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogue
US10336802B2 (en) 2015-04-16 2019-07-02 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogue
US10647753B2 (en) 2015-08-28 2020-05-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analogs and use thereof
US10017557B2 (en) 2015-08-28 2018-07-10 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analogs and use thereof
US11396534B2 (en) 2016-09-23 2022-07-26 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof
US11857608B2 (en) 2017-03-09 2024-01-02 Diamedica Inc. Dosage forms of tissue kallikrein 1
US11752216B2 (en) 2017-03-23 2023-09-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
UA103015C2 (ru) 2013-09-10
CR11511A (es) 2010-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2229407B1 (de) Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit- / wirkungsprofil
EP2229406B1 (de) Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit- / wirkungsprofil
DE102008003568A1 (de) Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil
DE102008003566A1 (de) Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil
EP0885961B1 (de) Neue Insulinderivate mit schnellem Wirkungseintritt
EP2041169B1 (de) Amidiertes insulin glargin
EP2451437B1 (de) Wässrige insulinzubereitungen enthaltend methionin
DE69722397T2 (de) Insulin-derivate und ihre verwendung
DE69629210T2 (de) Insulinabkömmlinge
EP2451471A1 (de) Langsamwirkende insulinzubereitungen
DE69928006T2 (de) Lagerstabile flüssige zusammensetzungen von glucagon-ähnlichem peptid-1
EP2451472A1 (de) Hitze- und schüttelstabile insulinzubereitungen
DD268976A5 (de) Verfahren zur Herstellung von Humaninsulinanaloga
DE3326473A1 (de) Pharmazeutisches mittel zur behandlung des diabetes mellitus
DE102008025008A1 (de) Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil
EP1084248B1 (de) Neue insulinanaloga mit erhöhter zinkbindung
DE102008025007A1 (de) Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil
EP1558641B1 (de) Kristalle von insulinanaloga und verfahren zu ihrer herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
R120 Application withdrawn or ip right abandoned

Effective date: 20130304