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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur konfokalen optischen
Untersuchung von Proben basierend auf einem Parabolspiegel.
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In
den letzten fünfzehn Jahren haben konfokale Laser-Raster-Mikroskope
(CLSM) in der Biologie, Medizin oder Materialprüfung ein
weites Anwendungsfeld gefunden. Ihr wesentlicher Vorteil gegenüber
klassischen optischen Weitfeldmikroskopen liegt bei der beugungsbegrenzten
hohen optischen Ortsauflösung, beim sehr guten Kontrast
(Verhältnis von Signal zu Untergrund), der Möglichkeit
dreidimensionale Schnittbilder aufzunehmen (Tomographie), bei der
zerstörungsfreien Probeninspektion, der Möglichkeit
der lokalen Probenanalyse durch optische Spektroskopie, etc..
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Die
meisten CLSM benutzen zur Fokussierung des Lichts auf die Probe
und zum Einsammeln des optischen Signals von der Probe ein Mikroskopobjektiv
mit hoher numerischer Apertur.
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Zur
Aufnahme eines Bildes wird entweder die Probe oder der Fokus gerastert
und das optische Signal Punkt für Punkt aufgezeichnet und
von einem Computer schließlich als Bild dargestellt. Hinsichtlich minimaler
Fokusgröße (Ortsauflösung), chromatischer
Aberration und Reinheit der Polarisation des Lichts im Fokus stellt
ein Objektiv allerdings nur einen Kompromiss dar. Aus Sicht der
Optik stellt ein Parabolspiegel (eine parabolisch geformte, reflektierende Oberfläche)
ein ideales Element zur Fokussierung von Licht auf eine Probe dar.
Ein Parabolspiegel hat einen wohl definierten fokalen Punkt, er
kann einen radialpolarisierten Laserstrahl zum kleinsten möglichen
beugungsbegrenzten Fokus mit wohl definierter longitudinal orientierter
Polarisation bündeln [J. Stadler, C. Stanciu, C.
Stupperich and A. J. Meixner, Optics Letters, zur Begutachtung eingereicht
am 11. 12. 2007] und ist frei von chromatischen Aberationen. Zusätzlich
gestattet er, das im Fokus gestreute oder erzeugte Licht im gesamten
Halbraum über der Probe einzusammeln (Numerische Apertur:
NA = n·1,0, n = Brechungsindex des umgebenden Mediums). Aus
diesem Grund wurde der Einsatz eines Parabolspiegels als fokusierendes
und lichtsammelndes Element von verschiedenen Autoren beschrieben
[M. A. Lieb and A. J. Meixner, Optics Express 8 (2001) 458–474, P.
Varga and P. Török, J. Opt. Soc. Am. A17 (2000)
2081–2095, N. Davidson, N. Bokor, Optics Letters
29 (2004) 1318–1320].
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Lieb
et al. haben gezeigt, dass sehr hohe Anforderungen an die
Qualität des Eingangsstrahls (Orientierung der Strahlachse
parallel zur Parabolspiegelachse, Divergenz, Rotationssymmetrie
des Strahlprofils) erforderlich sind, um die Vorteile des Parabolspiegels
für die konfokale Mikroskopie zu nutzen. Aus diesem Grund
sind eine sehr gute Optik eine reproduzierbare Justierung der optischen
Elemente und ein sehr stabiler optischer Aufbau nötig, um
den Laserstrahl (Strahlprofil, Orientierung) so genau in den Parabolspiegel
zu justieren, dass seine Vorteile zum Tragen kommen.
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Die
wenigen aus dem Stand der Technik bekannten experimentellen Aufbauten
konnten das Ziel nicht erreichen und ihre Ortsauflösung
bleibt unter derjenigen eines klassischen konfokalen Mikroskops [M.
A. Lieb Diss. Universität Siegen, 2001, eDiss: www.ub.uni-siegen.de/epub/diss/lieb.htm, T.
Ruckstuhl, S. Seeger, Appl. Opt. 42 (2003) 3277–3283.]
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Da
der Parabolspiegel nur einen wohl definierten fokalen Punkt und
keine fokale Ebene wie das Objektiv hat, ergibt sich ein weiteres
grundlegendes Problem. Es ist nicht möglich, mit einem
Parabolspiegel Weitfeldbilder wie bei einem herkömmlichen
optischen Mikroskop aufzunehmen. Somit gestaltet es als äußerst
schwierig, die Probe in den Fokus zu bringen und einen interessanten
Probenbereich auszuwählen.
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Damit
eine vergleichbar hohe Auflösung wie bei den aus dem Stand
der Technik bekannten Mikroskopen zustande kommt, muss der Parabolspiegel den
gesamten optischen Halbraum über der Probe abdecken. Die
Probe muss einen Durchmesser haben, der wesentlich kleiner ist als
derjenige des Parabolspiegels und muss von unten her in den Fokus des
Parabolspiegels gebracht werden. Daraus folgt, dass die Probe nur
schwer zugänglich ist und dass der Austausch der Probe
sowie das Auffinden bestimmter Probenpositionen sehr schwierig sind.
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Aus
diesen Gründen wird der Parabolspiegel bis auf wenige Ausnahmen
bislang nicht zum Aufbau eines konfokalen Mikroskops verwendet.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Nachteile der
bekannten Vorrichtungen zu umgehen und ein CLSM Mikroskop basierend
auf einem Parabolspiegel bereit zu stellen, das die Vorteile des
Parabolspiegels gegen über einem herkömmlichen
Objektiv nutzbar macht und mit dem es möglich ist, die
Probe einfach und reproduzierbar in den Fokus zu bringen. Zusätzlich
soll es damit möglich sein, einen interessanten Probenbereich
auszuwählen und untersuchen zu können.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst,
dass die Position des Parabolspiegels im optischen Strahlengang
des Mikroskops genau festgelegt und beim Probenwechsel, bei der
Fokussierung und beim Rastern der Probe nicht verändert wird.
Dies hat den Vorteil, dass der Strahlengang nur einmal beim Aufbau
des Mikroskops optimal justiert wird und nicht nachjustiert werden
muss, wenn die Probe ausgetauscht wird. Bei der erfindungsgemäßen
Vorrichtung wird nur die Probe bewegt, die Position des Parabolspiegels
bleibt unverändert, so dass der Fokus immer an der gleichen
Stelle bleibt. Dadurch kann aus Sicht der Optik eine ideale Strahlführung
und die maximal mögliche Apertur gegeben durch den halben
Raumwinkel über der Probe gewählt werden.
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Die
gleiche Positionierung des Parabolspiegels wird erfindungsgemäß reproduzierbar
durch eine selbstjustierende Spiegelhalterung erreicht, über
die der Parabolspiegel mit dem optischen Aufbau verbunden wird (1).
Dies wird durch den Einsatz von mindestens drei Auflagepunkten ermöglicht,
welche den Ort des Fokus und die Orientierung der Rotationsachse
des Parabolspiegels genau fest legen, so dass sie exakt auf der
optischen Achse der restlichen Optik liegen. Idealerweise wird die
selbstjustierende Spiegelhalterung mittels einer Dreipunktlagerung
gehalten, wobei drei Auflagepunkte ein gleichseitiges Dreieck bilden,
dessen Schwerpunkt mit dem Fokus des Parabolspiegels übereinstimmt und
dreizählige Rotationsachse mit der Achse des Parabolspiegels
zusammen fällt (2).
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Die
Auflagepunkte sind bevorzugt aus sehr hartem Material (Saphir, Rubin,
Diamant) angefertigt, welches mit hoher Präzision bearbeitet
werden kann. Sie können z. B. aus einer Kugel, die in einem
Konus liegt, einer Kugel, die in einer Kerbe liegt und einer Kugel,
die auf einer glatten Oberfläche liegt, bestehen. Sind
die Mittelpunkte der Kugeln fest miteinander verbunden, so ist die
Lage des Schwerpunktes des Dreiecks, welches sie aufspannen, exakt
definiert. Da die Kugeln immer so tief wie möglich in den Konus
und in die Kerbe eindringen, ist die Halterung des Parabolspiegels
selbstjustierend, sie findet immer wieder an ihre Ursprungsposition
zurück.
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Durch
den Einsatz von selbstjustierenden Auflagepunkten kann der Parabolspiegel
zum Probenwechsel einfach aus dem Strahlengang entfernt und reproduzierbar
durch einen Handgriff wieder in die Lagerung eingesetzt und so mit
sehr großer Genauigkeit zurück in seine vorgesehene
Lage gebracht werden. Der Strahlengang muss nach diesem Vorgang
nicht nachjustiert werden. Einzig eine neu eingesetzte Probe muss
wieder in den Fokus gebracht werden.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführung hat der Parabolspiegel
in der Mitte eine Öffnung, die von oben Einblick auf die
Probenoberfläche gewährt. Dadurch wird ermöglicht,
dass ein interessanter Bereich auf der Probe ausgewählt
und in den Fokus positioniert werden kann. Durch eine Optik mit
geeigneter Brennweite (Linse, Objektiv) kann ein großer
Bereich der Probenoberfläche in Reflexion im Weitfeld beobachtet
werden. Die Auflösung liegt dabei im Bereich von wenigen
Mikrometern. Man sieht den durch den Parabolspiegel fokussierten
Lichtfleck auf der Probe, dadurch wird es sehr einfach, mit Hilfe
des elektromechanischen Stelltisches, der zum Rastern der Probe
dient, einen interessanten Probenbereich auszusuchen und in den
Fokus des Parabolspiegels zu fahren (1).
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Die Öffnung
in der Mitte des Parabolspiegels hat bevorzugt eine runde Form und
ihr Durchmesser beträgt typischerweise 10–20%
des Parabolspiegeldurchmessers. Durch die erfindungsgemäße Öffnung
in der Mitte des Parabolspiegels hervorgerufene Abbildungsfehler
oder Detektionsverluste dürften auch bei sehr hohen Anforderungen
aus folgenden zwei Gründen vernachlässigbar sein.
Erstens, wird der Parabolspiegel mit einem radial-polarisierten,
an die Apertur angepassten Laserstrahl beleuchtet. Das Profil dieses
Strahls ist ringförmig, es hat im Zentrum einen dunklen
Bereich, so dass die Abschattung durch die Probe oder Strahlverluste
durch die Öffnung des Parabolspiegels nicht zum Tragen
kommen. Zweitens, beträgt der durch die Öffnung
im Parabolspiegel nicht abgedeckte Halbraum nur ca. 1,5% des gesamten
Halbraums über dem Fokus. Folglich wäre der Verlust
des Signals einer im Fokus befindlichen isotrop ausstrahlenden Lichtquelle
nicht größer als 1,5%.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung hat gegenüber
den aus dem Stand der Technik bekannten Vorrichtungen den Vorteil,
dass es damit zum ersten Mal möglich ist, mit einem CLSM
auf Parabolspiegelbasis mit beugungsbegrenzter Auflösung
abzubilden, die Probe einfach und reproduzierbar mit einer sehr hohen
Genauigkeit in den Fokus zu bringen. Außerdem erlaubt das
erfindungsgemäße Mikroskop, einen interessanten
Probenbereich einfach auswählen und untersuchen zu können.
Mit der erfindungsgemäßen Anordnung sind somit
die oben beschriebenen Probleme der bekannten Vorrichtungen gelöst.
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Weitere
Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung
werden nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele mit
Bezug auf die Zeichnungen beschrieben. Die Zeichnungen zeigen:
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1:
Schema der Strahlführung des erfindungsgemäßen
konfokalen Parabolspiegelmikroskops im Bereich des Parabolspiegels
mit Probe; gezeigt ist das Beispiel des Parabolspiegels mit einer Öffnung
in der Mitte, die Einblick von oben auf die Probenoberfläche
gewährt; 1 Parabolspiegel, 2 Halterung
auf optischer Grundplatte, 3 Kamera zur Weitfeldbeobachtung
der Probe, 4 selbstjustierende Auflagepunkte, 5 Probe, 6 Probenhalterung
mit Rastermechanik, 7 Orientierung der elektrischen Feldkoponente
des eingehenden Laserstrahls, 8 Richtung des eingehenden
Laserstrahls.
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2:
Detail der selbstjustierenden Spiegelhalterung am Beispiel der drei
Auflagepunkte; 1 Parabolspiegel; 2 Zentrale Öffnung
im Parabolspiegel, 3 Optische Achse (= Achse des Parabolspiegels), 4a–4b Selbstjustierende
Auflagepunkte (Dreipunktlagerung), 4a Kugel in Konus, 4b Kugel
in Kerbe, 4c Kugel auf glatter Oberfläche.
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3:
Konfokale Aufnahme einer lithographisch hergestellten Probe mit
vier Feldern von Goldkonen (Höhe und Durchmesser der Basis
etwa 100 nm) auf einer Silizium-Oberfläche, die schachbrettartig
mit Abständen von 1 μm oder 2 μm angeordnet sind.
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Ausführungsbeispiel
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Die
vorliegende Erfindung wurde am Beispiel des Parabolspiegelmikroskops
realisiert, welches ähnlich aufgebaut ist wie ein invertiertes
konfokales Mikroskop, bei dem die Probe gerastert wird. Der Parabolspiegel
hat einen Durchmesser von rund 20 mm und ist aus Aluminium gefertigt.
Der mechanische Aufbau besteht aus rostfreiem Stahl und zeichnet sich
durch eine hohe Festigkeit und geringe Empfindlichkeit gegenüber
Temperaturschwankungen aus. Die drei Auflagen des Spiegels bestehen
mikroskopseitig aus einem Saphir-Ring einer Saphir-Kerbe und einem
Saphirplättchen, die mit einer festen Grundplatte des optischen
Aufbaus verbunden sind. An der Spiegelhalterung sind sie durch Rubinkugeln
mit einem Durchmesser von 1,5 mm realisiert.
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Es
hat sich gezeigt, dass dieser Aufbau sich besonders gut eignet,
um Nanostrukturen (Nanopartikel und Fluorescent Beads mit Durchmessern
von 40 nm und weniger) bis hin zu einzelnen fluoreszierenden Molekülen
beugungsbegrenzt abzubilden. 3 zeigt z.
B. eine mit dem beschriebenen Aufbau gemachte konfokale Aufnahme
einer lithographisch hergestellten Probe mit vier Feldern von Goldkonen
(Höhe und Durchmesser der Basis etwa 100 nm) auf einer
Silizium-Oberfläche, die schachbrettartig mit Abständen
von 1 μm oder 2 μm angeordnet sind.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - J. Stadler,
C. Stanciu, C. Stupperich and A. J. Meixner, Optics Letters, zur
Begutachtung eingereicht am 11. 12. 2007 [0004]
- - M. A. Lieb and A. J. Meixner, Optics Express 8 (2001) 458–474 [0004]
- - P. Varga and P. Török, J. Opt. Soc. Am.
A17 (2000) 2081–2095 [0004]
- - N. Davidson, N. Bokor, Optics Letters 29 (2004) 1318–1320 [0004]
- - Lieb et al. [0005]
- - M. A. Lieb Diss. Universität Siegen, 2001, eDiss: www.ub.uni-siegen.de/epub/diss/lieb.htm [0006]
- - T. Ruckstuhl, S. Seeger, Appl. Opt. 42 (2003) 3277–3283 [0006]