DE102007061987A1

DE102007061987A1 - Vorrichtung und Verfahren zum Nachweisen von Molekülen im Auge

Info

Publication number: DE102007061987A1
Application number: DE102007061987A
Authority: DE
Inventors: Manfred Dr. Dick; Christoph Dr. Russmann; Mathias Dr. Reich
Original assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Current assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2009-06-25
Also published as: WO2009083159A1

Abstract

Vorrichtung zum Nachweisen von Molekülen (10) im Auge (20), umfassend einen Laserscanner (30), einen Strahlteiler (50) und einen Detektor (60), wobei der Laserscanner (30) einen Laser (32) und ein Scanmodul (34) aufweist, der Laser (32) eingerichtet ist, einen Laserstrahl (31) zu emittieren, der Laserstrahl eine Wellenlänge lambda1 aufweist, das Scanmodul (34) eingerichtet ist, den Laserstrahl (31) in einem zu untersuchenden Bereich des Auges (20) zu positionieren und der Detektor (60) eingerichtet ist, von den Molekülen (10) abgegebenes Fluoreszenzlicht mit einer Wellenlänge lambda2 zu ermitteln.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweisen von Molekülen im Auge. Im Stand der Technik ist dazu Folgendes beschrieben.
In Goldstein LE et al. „Cytosolic β-amyloid deposition and supranuclear cataracts in lenses from people with Alzheimer's disease", Lancet 36: 1258–65 ist beschrieben, dass sich β-Amyloid in Form von Plaques in Linsen von Menschen, die an Morbus Alzheimer erkrankt sind, ablagert. Zudem ist bekannt, dass sich β-Amyloid auch in der Retina von Morbus Alzheimer Patienten befindet.
In Skoch J. et al. „Preclinical characterization of amyloid imaging grobes with multiphoton microscopy", Journal of Alzheimer's Disease 9/3 Supplement, 401–7 wird der Einsatz der Multiphotonenmikroskopie zur trans-cranialen Bildgebung von β-Amyloid im Gehirn von transgenen Mäusen beschrieben.
In Tal DR et al., „UV light-induced autofluorescence of full lense Abeta-Protein deposits in the human brain", Clin. Neuropathol. 2002 Januar bis Februar, 21(1): 35–40 ist beschrieben, dass β-Amyloid enthaltende Plaques eine Autofluoreszenz im blauen Spektralbereich zeigen.
Zur Bestimmung von β-Amyloid setzt Goldstein Elektrospray-Ionisation Massenspectrometry, LCQ-DECA Ionenfallen-Massenspektrometry und konventionelle Fluoreszenzmikroskopie ein.
Nachteilig dabei ist, dass eine Differentialdiagnose mit dem Katarakt bei diesen Verfahren nicht möglich ist. Bei einem positiven Befund muss die Diagnose mittels eines in das Auge applizierten molekularen Markers und eines konventionellen Fluoreszenzkamerasystems verifiziert werden. Es ist nicht möglich mit der damit erzielten räumlichen Auflösung kleine β-Amyloid-Plaques in frühen Phasen der Krankheit zu detektieren.
Daraus ergibt sich die Aufgabe, eine Vorrichtung oder ein Verfahren vorzusehen, mit dem Morbus Alzheimer durch ein optisches Verfahren diagnostiziert werden kann.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass eine Vorrichtung zum Nachweisen von Molekülen im Auge vorgesehen wird, umfassend einen Laserscanner, einen Strahlteiler und einen Detektor, wobei der Laserscanner einen Laser und ein Scanmodul aufweist, der Laser eingerichtet ist, einen Laserstrahl zu emittieren, der Laserstrahl eine Wellenlänge λ₁ aufweist, das Scanmodul eingerichtet ist, den Laserstrahl in einem zu untersuchenden Bereich des Auges zu positionieren und der Detektor eingerichtet ist, von den Molekülen abgegebenes Fluoreszenzlicht mit einer Wellenlänge λ₂ zu ermitteln.
Moleküle sind vorzugsweise Teilchen, die aus zwei oder mehreren zusammenhängenden Atomen bestehen, welche durch kovalente Bindungen verbunden sind. Vorzugsweise sind die Moleküle

• Thiofavin S und deren Derivate, wie z. B. Pittsburgh Compound B;
• Thioflavin T und deren Derivate;
• Methosy-S04 und deren Derivate;
• Kongo rot und deren Derivate;
• Moleküle, welche aus einer Erkennungssubstanz, z. B. Antikörper, Antikörperfragmente, Aptamere oder Peptide und einem Fluoreszenzfarbstoff bestehen.

Vorzugsweise werden Katarakt-spezifische Moleküle, besonders bevorzugt Advanced Glycation Endproduct-Moleküle, Phenylanin, Tryptophan und/oder β-Amyloid durch intrinsische Fluoreszenz (Autofluoreszenz) nachgewiesen.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem abgegebenen Fluoreszenzlicht um intrinsische Fluoreszenz (Autofluoreszenz), besonders bevorzugt handelt es sich bei dem abgegebenen Fluoreszenzlicht um extern eingebrachte Fluoreszenz.
Vorzugsweise wird intrinsische Fluoreszenz (Autofluoreszenz), besonders bevorzugt werden künstlich eingebrachte Marker, welche vorzugsweise selbst, besonders bevorzugt durch einen Fluoreszenzfarbstoff fluoreszieren, eingesetzt.
Für das Autofluoreszenzverfahren werden vorzugsweise Advanced Glycation Endproducts, Phenylanin und/oder Tryptophan zur Diagnose von Katarakten, besonders bevorzugt wird β-Amyloid zur Diagnose von Morbus Alzheimer eingesetzt.
Für die markergebundene Fluoreszenz werden vorzugsweise Farbstoffgruppen und deren Derivate wie Kongo Rot, Methosy-S04, Thioflavin S und/oder Thioflavin T eingesetzt. Besonders bevorzugt werden diese Farbstoffgruppen und deren Derivate für die Alzheimer-Diagnose eingesetzt. Vorzugsweise binden sich Farbstoffe dieser Farbstoffgruppen spezifisch an β-Amyloid. Vorzugsweise werden Moleküle eingesetzt, die an eine körpereigene Zielsubstanz bindbar sind.
Ein Auge ist vorzugsweise ein Sinnesorgan eines Tieres, besonders bevorzugt eines Menschen, das zur Wahrnehmung von elektromagnetischer Strahlung, vorzugsweise zur abbildenden Wahrnehmung von elektromagnetischer Strahlung dient.
Ein Laserscanner ist vorzugsweise ein Gerät, das eingerichtet ist, vorzugsweise Volumina, Oberflächen oder Körper vorzugsweise zeilen- oder rasterartig mit einem Laserstrahl zu überstreichen, um diese vorzugsweise zu vermessen und/oder zu bearbeiten oder besonders bevorzugt, um ein Bild zu erzeugen. Vorzugsweise ist ein Laserscanner eingerichtet, den Fokuspunkt eines Laserstrahles im Raum zu positionieren. Vorzugsweise ist die Genauigkeit des Laserscanners im 100 μm-Bereich, besonders bevorzugt im 10 bzw. 1 μm-Bereich eingerichtet.
Vorzugsweise ist ein Laserscanner ein variabler Expander, ein Piezo-Scanner oder ein Polygon-Scanner, besonders bevorzugt ist ein Laserscanner ein Galvoscanner.
Vorzugsweise ist dem Fokuspunkt ein in einer konfokalen Ebene angeordneter konfokaler Detektor zugeordnet. Dadurch ist vorzugsweise das aus der Fokusebene rückgestreute oder reflektierte Licht detektierbar.
Ein Strahlenteiler ist vorzugsweise ein optisches Bauelement, das einen einzelnen Lichtstrahl in vorzugsweise zwei Teilstrahlen trennt. Vorzugsweise ist der Strahlenteiler eingerichtet, Anregungs- und Fluoreszenzlicht räumlich zu trennen. Besonders bevorzugt ist ein Strahlenteiler eingerichtet, Anregungs- und Fluoreszenzlicht zu trennen. Vorzugsweise weist ein Strahlenteiler eine Prismenanordnung, eine polarisationsoptische Anordnung, eine Blendenanordnung und/oder eine Glasplatte auf. Besonders bevorzugt ist als Strahlenteiler ein Spiegel mit dichroitischer Beschichtung.
Ein Detektor ist vorzugsweise eine technische Einrichtung zum Nachweis von Objekten, vorzugsweise von Licht. Vorzugsweise liegt die zeitliche Auflösung des Detektors im μs-Bereich, besonders bevorzugt im ns- und ps-Bereich. Die spektrale Auflösung des Detektors liegt im Bereich von 10 nm, bevorzugt im Bereich von 1 nm, besonders bevorzugt im Bereich von < 1 nm. Vorzugsweise ist die räumliche Auflösung durch die Positioniergenauigkeit des Laser-Scansystem vorgebbar.
Vorzugsweise ist jeder Scanposition ein Detektorsignal zum jeweiligen Zeitpunkt zugewiesen. Vorzugsweise wird dadurch eine räumlich aufgelöste Detektion mit einem Einzeldetektor ermöglicht. Ein Einzeldetektor ist vorzugsweise ein einfacher Empfänger mit einem Detektorchip. Die räumliche Auflösung des Laser Scan Systems im Auge ist vorzugsweise ca. 100 μm, besonders bevorzugt < 10 μm oder kontinuierlich bei resonanten oder Zeilenscannern innerhalb einer Zeile. Vorzugsweise wird statt des Laserscanners mit einfachem Detektor ein aufgeweiteter kontinuierlicher, gepulster oder kurz- bzw. ultrakurz gepulster Laserstrahl eingesetzt. Dadurch wird vorzugsweise das zu untersuchende Areal im Auge gleichzeitig ausgeleuchtet. Die räumliche Auflösung eines molekülspezifischen Antwortsignals wird vorzugsweise durch die dem Antwortsignal entsprechende spektral selektive Abbildung des Areals auf einen Kamerachip erzielt. Der Kamerachip ist vorzugsweise ein CMOS-Chip, besonders bevorzugt ein CCD-Chip. Vorzugsweise ist die spektrale Selektion durch geeignete Filter, besonders bevorzugt durch dielektrische Schichtsysteme erreichbar. Vorzugsweise werden hohe zeitliche Auflösungen des molekülspezifischen Antwortsignals durch Einsatz eines speziellen Kamerachips mit hoher zeitlicher Auflösung im μs-Bereich, besonders bevorzugt im ns-Bereich oder noch kürzer erreicht. Vorzugsweise wird ein schnell schaltbarer „Intensifier", besonders bevorzugt eine „Multichannel plate" vor dem CCD-Chip eingesetzt. Vorzugsweise wird dieser Kamerachip oder der Intensifier für lifetime-imaging verwendet. Vorzugsweise werden bei dieser Ausführungsform keine beweglichen Teile eingesetzt. Vorzugsweise wird eine höhere Laserleistung, besonders bevorzugt eine höhere Pulsenergie eingesetzt als bei der Verwendung eines Scanners. Vorzugsweise wird in kurzer Zeit eine 2-dimensionale Information erhalten. Besonders bevorzugt werden mit geringer Schärfentiefe der zugehörigen Abbildung schichtweise Aufnahmen erzeugt. Vorzugsweise werden dadurch 3-dimensionale Informationen erzeugt. Besonders bevorzugt sind 3-dimensionale Auflösungen im Laser-Scannerbetrieb erzeugbar, indem in unterschiedlichen Tiefen der Fokus des Laserstrahls 2-dimensional gerastert gescannt wird, also ein zusätzlicher z-Scan erfolgt.
Laser sind vorzugsweise Strahlungsquellen, die Strahlung durch induzierte Emission erzeugen. Vorzugsweise werden abstimmbare Laser, d. h. Laser mit veränderbarer Wellenlänge eingesetzt. Bevorzugt werden Femtosekunden-Laserstrahlquellen, besonders bevorzugt Femtosekunden-Oszillatoren eingesetzt. Femtosekunden-Laserstrahlquellen sind vorzugsweise Baugruppen zur Erzeugung von urigedämpften elektrischen Schwingungen mit einer Schwingungsdauer im Femtosekundenbereich. Vorzugsweise weist der Femtosekundenlaser die Lasermaterialien Titan:Saphir auf. Vorzugsweise weist der Femtosekundenoszillator einen Abstimmbereich von 690 nm bis 1020 nm auf. Besonders bevorzugt werden als Laser Femto- oder Pikosekunden-Lasersysteme eingesetzt, die einen Femtosekunden- oder Pikosekunden-Oszillator und mindestens eine Verstärkereinheit aufweisen. Besonders bevorzugt umfasst das Femto- oder Pikosenkundenlasersystem einen cavity dumped Femtosekunden- oder Pikosekunden-Oszillator. Dadurch ist es möglich, bei unzureichender Fokussierbarkeit innerhalb von in vivo Anwendungen die erforderliche Leistungs- bzw. Energiedichte zu erreichen.
Ein Scanmodul ist vorzugsweise eine Vorrichtung zur Ablenkung von Laserstrahlen um vorzugsweise Konturen oder Flächen besonders bevorzugt dreidimensionale Strukturen "abzufahren". Vorzugsweise ist der Laserfokus mithilfe des Scanmoduls in allen drei Raumpositionen positionierbar. Besonders bevorzugt ist das Scanmodul eingerichtet, das gesamte Volumen der Augenlinse abzurastern. Vorzugsweise besteht das Scanmodul aus zwei Galvoscannern und einem variablen Expander. Vorzugsweise werden die beiden Galvoscanner und der variable Expander mittels geeigneter optischer Systeme in den Laserstrahlengang integriert.
Durch Verwenden ultrakurzer Laserpulse mit Pulslängen zwischen 1 fs und 10 ps mit einer sehr hohen Intensität ist es möglich, durch infrarote Photonen mit Wellenlängen von 700–1300 nm über Mehrphotonenprozesse Fluoreszenz bzw. Autofluoreszenz in Zielmolekülen anzuregen, welche üblicherweise mit UV-Photonen angeregt werden. Vorteilhafterweise werden dabei Pulsenergien kleiner als 10 μJ, besonders vorteilhaft < 1 μJ und höchst vorteilhaft < 100 nJ eingesetzt.
Eine Laserwellenlänge ist vorzugsweise eine Wellenlänge, die durch einen Laseroszillator zur Emission gebracht wird. Vorzugsweise ist wahlweise eine bestimmte Bandbreite von Wellenlängen wahlweise zur Emission bringbar. Dies ist vorzugsweise durch den Einsatz eines durchstimmbaren Lasers erreichbar. Vorzugsweise ist die Wellenlänge an ein zu detektierendes Zielmolekül anpassbar.
Eine Anregungswellenlänge ist vorzugsweise eine Wellenlänge, die ein zu detektierendes Molekül zur Fluoreszenz anregt.
Ein zu untersuchender Bereich des Auges ist vorzugsweise ein Bereich, der bestimmt ist, auf das Vorhandensein von bestimmten Molekülen untersucht zu werden, vorzugsweise die Retina, die Makula, die Photorezeptorschicht, die Ganglienzellen, das retinale Pigmentepithel und/oder das Trabekelwerk, der Glaskörper, das Vorderkammerwasser, der Ziliarkörper, die Cornea, die Sklera, besonders bevorzugt die Linse und/oder das vaskuläre System des Auges mit seinen Arterien, Venen oder Kapillaren.
Vorzugsweise ist ein gebundener zu einem ungebundenen Zustand eines markerbasierten Fluoreszenzmoleküls unterscheidbar. Ein gebundener Zustand eines markerbasierten Fluoreszenzmoleküls ist vorzugsweise das klinisch relevante Signal zum Vorhandensein des interessierenden Moleküls. Vorzugsweise ist ein gebundener zu einem ungebundenen Zustand eines markerbasierten Fluoreszenzmoleküls durch eine Fluoreszenz-Lifetime-Untersuchung unterscheidbar. Ungebundene Fluorophore zeigen vorzugsweise eine längere Fluoreszenzlebensdauer als gebundene.
Vorzugsweise erlaubt der Zeitpunkt der Detektion eines Fluoreszenzsignals im vaskulären System aufgrund des Blutflusses einen Rückschluss auf die Anwesenheit eines interessierenden Moleküls, vorzugsweise eines β-Amyloid-Moleküls.
Vorzugsweise ist ein fluoreszierender Farbstoff, besonders bevorzugt Fluorescein zur Angiografie einsetzbar. Vorzugsweise zeigen sich die injizierten Fluoreszenzfarbstoffe in einem Lserscannerbild, besonders bevorzugt in einem Funduskamera-Fundusbild des Augenhintergrundes nach der Injektion in einer Frühphase des Einströmens in den Fundus bis hin zu einer Spätphase des Ausströmens aus dem Fundus. Vorzugsweise ist der fluoreszierende Farbstoff mit molekülspezifisch bindenden Antikörpern, besonders bevorzugt mit Peptiden verbunden. Dadurch werden vorzugsweise molekülspezifische Anlagerungsmöglichkeiten dieser Farbstoffe an den Gefäßwänden ermöglicht. Vorzugsweise ist bei einer Detektion eines gebundenen Fluoreszenzfarbstoffes nach der Spätphase der Injektion auf einen spezifischen Bindungsprozess des Antikörpers oder Peptides am Zielmolekül schließbar. Vorzugsweise ist dadurch die Anwesenheit von interessierenden Molekülen, besonders bevorzugt von krankheitsspezifischen Molekülen, vorzugsweise von β-Amyloid sicher nachweisbar.
Fluoreszenzlicht entsteht vorzugsweise durch die Emission von Fluoreszenzphotonen bei der Anregung eines Fluorophors.
Diese Vorrichtung ist vorzugsweise für die Detektion intrinsischer Fluoreszenzsignale (Autofluoreszenz), und/oder zur Detektion eingebrachter Fluoreszenzmarker einsetzbar.
Fluoreszenzmarker sind vorzugsweise Substanzen, welche spezifisch an ein Zielmolekül bindbar sind und selbst oder durch ein angekoppeltes Farbstoffmolekül fluoreszieren.
Diese Vorrichtung ist vorzugsweise dazu eingerichtet, die Laserwellenlänge an die Anregungswellenlänge der fluoreszierenden Moleküle anzupassen. Die Laserwellenlänge ist dabei vorzugsweise ein ganzzahliges Vielfaches der Anregungswellenlänge des Moleküls. Besonders bevorzugt ist die Laserwellenlänge doppelt so lang wie die Anregungswellenlänge des Moleküls.
Durch das Anbringen von Fluoreszenzmarkern, d. h. Substanzen, welche sich spezifisch an Strukturen binden, die vorgesehen sind, detektiert zu werden, wird vorzugsweise eine hohe Sensitivität und besonders bevorzugt eine hohe Spezifität erzeugt. Besonders bevorzugt sind Substanzen einsetzbar, welche sich spezifisch an Strukturen, besonders bevorzugt an die β-Faltblattstruktur des β-Amyloid-Plaques binden. Vorzugsweise ist der Marker eingerichtet, sich spezifisch an das Zielmolekül zu binden. Vorzugsweise ist eine Fluoreszenzanalyse durchführbar.
Durch den Einsatz ultrakurzer Laserpulse ist es möglich, durch Mehrphotonenanregung Fluoreszenzen, welche normalerweise im ultravioletten Spektralbereich liegen, durch sichtbare oder infrarote Photonen anzuregen. Dadurch wird eine Belastung des Auges mit UV-Strahlung minimiert.
Vorzugsweise wird ein konfokaler Scanner eingesetzt, der eine Auflösung hat, so dass sehr kleine β-Amyloid-Plaques vorzugsweise mit einer Größe von < 50 μm entdeckt werden können. Dadurch sind eine frühe Diagnose sowie das Überwachen einer pharmazeutischen Intervention möglich.
Mit der Vorrichtung ist vorzugsweise eine vorzeitige Detektion von Ablagerungen in der Linse vornehmbar.
Vorzugsweise sind Advanced Glucation Endprodukt-Moleküle, Tryptopha und/oder Phenylanin detektierbar. Dadurch ist vorzugsweise ein Katarakt diagnostizierbar.
Vorzugsweise sind auch andere molekulare Marker detektierbar. Vorzugsweise ist dazu eine Adaption der Wellenlänge und/oder der Optik vornehmbar.
Vorzugsweise ist, eine Strukturanalyse der Augenlinse (Zwiebelschalenstruktur) vornehmbar.
Vorzugsweise sind die Eigenschaften der Fluoreszenzmarker durch chemische Modifikation und/oder durch Verpacken in Lipidhüllen oder Lipidnanostrukturen veränderbar. Veränderbare physikalische Eigenschaften sind vorzugsweise Größe, Anregungswellenlänge und Stokesshift, veränderbare chemische Eigenschaften sind vorzugsweise Lipophilisierung, Änderung der Polarität und Affinität zum Zielmolekül, veränderbare biologische Eigenschaften sind vorzugsweise Drug Delivery, Passage zum Zielort im Auge, Toxizität und Clearance-Zeit.
Vorzugsweise unterscheidet sich die Wellenlänge des Laserstrahls λ₁ von der Wellenlänge des durch den Detektor ermittelten Fluoreszenzlichtes λ₂. Dadurch ist vorzugsweise Multiphotonenfluoreszenz, besonders bevorzugt 2-Photonen-Fluoreszenz möglich. Vorzugsweise liegt die Wellenlänge des Laserstrahls λ₁ im Infrarotbereich. Vorzugsweise liegt die Wellenlänge des durch den Detektor ermittelten Fluoreszenzlichtes λ₂ im sichtbaren Bereich.
Vorzugsweise ist der Laser ein ps- oder fs-Impulslaser und eingerichtet, um sowohl im Einzelimpulsbetrieb als auch im repetierenden Betrieb mit Pulswiederholraten im kHz bis MHz Bereich zu arbeiten.
Vorzugsweise ist der Laser eingerichtet, Impulse, mit Impulsdauern zwischen 10^–15 Sekunden und 10^–12 Sekunden, besonders bevorzugt mit Impulsdauern zwischen 10^–14 Sekunden und 10^–13 Sekunden abzugeben.
Vorzugsweise ist der Laser eingerichtet, im Einzelimpulsbetrieb einzelne Impulse abzugeben.
Besonders bevorzugt ist der Laser eingerichtet, im repetierenden Betrieb zwischen 1.000 und 100.000 Impulse pro Sekunde abzugeben. Besonders bevorzugt ist der Laser eingerichtet, im repetierenden Betrieb zwischen 30.000 und 70.000 Impulse pro Minute abzugeben.
Vorzugsweise umfasst der Laserscanner einen Leistungsmodulator, der eingerichtet ist, die Leistung des Laserstrahls an den Nachweisprozess anzupassen.
Ein Leistungsmodulator ist vorzugsweise eine Einrichtung durch die vorzugsweise die Amplitude einer physikalischen Größe, besonders bevorzugt eines Laserstrahls modulierbar ist. Dadurch ist es möglich, die Laserleistung an den Messprozess anzupassen, sodass eine ausreichend starke Mehrphotonenabsorption der Zielmoleküle stattfindet und gleichzeitig die Schwelle für eine dauerhafte Schädigung des Gewebes unterschritten wird.
Besonders bevorzugt sind Moleküle β-Amyloid-Moleküle, Moleküle welche an β-Amyloid-Moleküle binden, vorzugsweise Thioflavin S, Thioflavin T, Kongo rot, Methoxy 04 und deren Derivate. Dadurch ist es möglich, Alzheimer nachzuweisen.
Vorzugsweise sind Moleküle Fluoreszenzfarbstoffmoleküle vorzugsweise aus der Gruppe der Thioflavine, besonders bevorzugt Kongo rot, die an Antikörper, Antikörperfragmente, Aptamere oder Peptide bindbar sind, wobei die Antikörper, Antikörperfragmente, Aptamere oder Peptide an Zielmoleküle bindbar sind. Dadurch ist es möglich, auch Moleküle nachzuweisen, die keine Autofluoreszenz aufweisen. Außerdem wird dadurch eine weitere Möglichkeit bereitgestellt, Moleküle nachzuweisen, die eine Autofluoreszenz aufweisen.
Vorzugsweise sind Moleküle Advanced Glycation Endproducts, Phenylalanin oder Tryptophan.
Vorzugsweise ist der Laser eingerichtet, eine Laserwellenlänge zu bilden, die an die Absorption der Moleküle angepasst ist.
Vorzugsweise ist der Laser eingerichtet, eine Laserwellenlänge von 800 bis 950 nm zu bilden. Besonders bevorzugt ist der direkte Nachweis von β-Amyloid-Molekülen durch Autofluoreszenz. Vorzugsweise ist der Laser eingerichtet, eine Laserwellenlänge von 720 bis 740 nm zu bilden. Dadurch ist es möglich, β-Amyloid-Moleküle zur Autofluoreszenz anzuregen. Durch Detektion der Autofluoreszenz ist Alzheimer nachweisbar.
Vorzugsweise ist das Scannmodul eingerichtet, den Laserstrahl in einer Retina, besonders bevorzugt in einer Linse des Auges zu positionieren. Dadurch sind vorzugsweise Moleküle in der Linse des Auges detektierbar. Vorzugsweise ist Autofluoreszenz des β-Amyloid detektierbar, besonders bevorzugt ist die Fluoreszenz von Fluoreszenzmarkern detektierbar. Da β-Amyloid-Moleküle in der Linse und der Retina von mit Alzheimer erkrankten Personen nachgewiesen wurden, ist es auf diese Weise möglich, Alzheimer nachzuweisen.
Vorzugsweise ist der Detektor ein Photomultiplier oder eine Avalanche-Photodiode. Dadurch ist es möglich, auch vergleichsweise schwaches Licht zu detektieren. Die Detektoren weisen vorzugsweise eine ausreichende Schnelligkeit auf, die es erlaubt, Fluoreszenzlebensdaueruntersuchungen durchzuführen. Fluoreszenzlebensdaueruntersuchungen werden vorzugsweise als Kontrastverfahren eingesetzt.
Ein Photomultiplier ist vorzugsweise eine spezielle Elektronenröhre, um schwache Lichtsignale zu detektieren und in ein elektrisches Signal umzuwandeln. Vorzugsweise weist ein Photomultiplier eine Photokathode und einen nachgeschalteten Sekundärelektronenvervielfacher auf.
Avalanche-Photodioden oder Lawinenfotodioden sind vorzugsweise hochempfindliche und schnelle Fotodioden, die den Lawinen-Durchbruch (Avalanche-Effekt) nutzen.
Vorzugsweise weist der Detektor eine Zeitauflösung im Nanosekunden-, Picosekundenbereich oder darunter auf. Dadurch, dass der Detektor eine Zeitauflösung im Nanosekundenbereich aufweist, ist der Detektor besonders geeignet, Fluoreszenzlebensdauermessungen durchzuführen.
Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung eine Detektorblende. Dadurch ist es möglich, unerwünschte Streulichtanteile zu unterdrücken. Vorzugsweise ist die Detektorblende konfokal derart angeordnet, dass der Fokus des Laserstrahls in dem zu untersuchenden Bereich des Auges konfokal zu der Detektorblende ist. Vorzugsweise befindet sich diese Detektorblende vor dem Detektor.
Eine Detektorblende ist vorzugsweise eine Vorrichtung zur Begrenzung des Querschnitts von Strahlenbündeln bzw. der Verringerung von Streulicht, die, bzw. das in einen Detektor eintritt.
Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung einen optischen Kurzpassfilter. Dadurch ist es möglich, Reste des Anregungslichtes zu unterdrücken.
Ein optischer Kurzpassfilter ist vorzugsweise ein Filter, der kurzwellige Spektralanteile hindurch lässt. Vorzugsweise umfasst der optische Kurzpassfilter ein Farbglas und/oder einen dichroitischen Spiegel.
Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung einen Verstärker. Dadurch ist es möglich, das Signal zu Rauschverhältnis bei der Detektion zu erhöhen. Vorzugsweise ist der Verstärker geeignet eingerichtet, das Signal des Detektors aufzubereiten.
Ein Verstärker ist vorzugsweise ein Gerät zur Verstärkung von Signalen, vorzugsweise zur Verstärkung von optischen Signalen. Vorzugsweise ist ein Verstärker phasenempfindlich. D. h., dass ein Verstärker eingerichtet ist, eine Welle abhängig vom Schwingungszustand der Welle an einer bestimmten Stelle und zu einem bestimmten Zeitpunkt zu verstärken. Besonders bevorzugt arbeitet der Verstärker nach dem Lock-In oder Box-Car Prinzip.
Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung eine Transferoptik. Dadurch ist es möglich, das rückgestreute Fluoreszenzlicht auf einem Detektor zu bündeln. Die Fokussieroptik ermöglicht es vorzugsweise, den zu untersuchenden Bereich des Auges mit einer hohen Auflösung abzurastern. Dadurch ist es möglich, Fluoreszenz- bzw. Autofluoreszenzbilder des zu untersuchenden Bereichs des Auges zu erzeugen.
Eine Transferoptik ist vorzugsweise eine Optik, die geeignet ist, Strahlung weiterzuleiten. Vorzugsweise umfasst eine Transferoptik Lichtleitfaserbündel, besonders bevorzugt mindestens einen Spiegel, einen Hohlspiegel oder eine Linse.
Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung eine Fokussieroptik.
Eine Fokussieroptik ist vorzugsweise eine Optik, die geeignet ist, Strahlung zu fokussieren. Vorzugsweise umfasst eine Fokussieroptik eine Linse, besonders bevorzugt ein Linsensystem, eine refraktive und/oder diffraktive Optik, eine Spiegeloptik, einen Hohlspiegel, ein Spiegelkontaktglas, eine Schwarzschild-Optik oder eine adaptive Optik. Die Verwendung eines Spiegelkontaktglases ist für Untersuchungen von Randbereichen der Linse oder des Trabekelwerkes vorteilhaft. Die Verwendung einer adaptiven Optik ermöglicht vorzugsweise die Kompensation von Abbildungsfehlern des menschlichen Auges. Vorzugsweise ermöglicht die Verwendung einer adaptiven Optik eine Erhöhung der Auflösung.
Vorzugsweise enthält der Detektor ein Element zur spektralen Aufteilung des Fluoreszenzlichtes. Dadurch ist es vorzugsweise möglich, Moleküle oder deren Zustand anhand des Spektrums des Fluoreszenzlichtes zu identifizieren.
Die Aufgabe wird auch gelöst durch ein Verfahren zum Nachweisen von Molekülen im Auge, wobei ein Laser einen Laserstrahl emittiert, ein Leistungsmodulator den Laserstrahl an eine Anregungswellenlänge der Moleküle anpasst, ein Scannmodul den Laserstrahl auf zu untersuchende Bereiche des Auges richtet und Fluoreszenzlicht, das von den Molekülen abgegeben wird, zu einem Detektor gelenkt wird.
Vorzugsweise ist der Detektor eingerichtet, die Fluoreszenzlebensdauer zu bestimmen. Dadurch ist es möglich, ein weiteres Kontrastverfahren vorzusehen.
Die Fluoreszenzlebensdauer ist vorzugsweise die Zeit, die der angeregte Fluorophor im angeregten Zustand verbleibt.
Vorzugsweise werden Moleküle im vaskulären System des Auges detektiert, indem Fluoreszenzfarbstoffmoleküle, die an Antikörper oder Peptide bindbar sind, in das Auge eingebracht werden, und nach einer Spätphase des Blutflusses eine Detektion der Fluoreszenzfarbstoffmoleküle am Augenhintergrund vorgenommen wird. Dadurch wird eine einfache Möglichkeit bereitgestellt, Moleküle im vaskulären System des Auges zu detektieren. Besonders bevorzugt wird bei einer markerbezogenen Fluoreszenz die spezifische Anlagerung an ein Zielmolekül nachgewiesen, indem nach der Spätphase des Blutflusses mit dem Marker-Fluoreszenzfarbstoff am Augenhintergrund eine Detektion vorgenommen wird, die dann lediglich spezifisch gebundene Zielmoleküle offenbart.
Vorzugsweise ist das Auge während der Emission des Laserstrahls mittels eines Saug-Kontaktglases fixierbar. Dadurch ist das Auge auf einfache Weise fixierbar.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
1 ein Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zum Nachweisen von Molekülen,
2 ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zum Nachweisen von Molekülen und
1 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zum Nachweisen von Molekülen 10 in einem Auge 20. Die Vorrichtung umfasst einen Laserscanner 30 einen Spiegel mit dichroitischer Beschichtung 50 und einen Photomultiplier 60. Der Laserscanner 30 weist einen Femtosekundenoszillator 32, ein Scannmodul 34, das aus zwei Galvoscannern und einem variablen Expander gebildet wird und einen weiteren Modulator 36 auf.
Der Photomultiplier 60 ist dem Auge 20 gegenüber angeordnet. Der Spiegel mit dichroitischer Beschichtung 50 ist zwischen dem Auge 20 und dem Photomultiplier 60 angeordnet und in einem 45°-Winkel zu einer Verbindungslinie zwischen dem Auge 20 und dem Photomultiplier 60 ausgerichtet. Der Laserscanner 30 ist von dem Spiegel mit dichroitischer Beschichtung 50 beabstandet angeordnet, derart, dass eine Verbindungslinie zwischen dem Spiegel mit dichroitischer Beschichtung 50 und dem Laserscanner 30 einen Winkel von 135° mit dem Spiegel mit dichroitscher Beschichtung 50 bildet.
Der Femtosekundenoszillator 32 erzeugt einen Laserstrahl 31, der durch die beiden Galvoscanner und den variablen Expander ausgerichtet wird und dessen Wellenlänge durch den Leistungsmodulator 36 auf 360–370 nm eingestellt wird. Der Laserstrahl 31 trifft auf den Spiegel mit dichroitischer Beschichtung 50 und wird teilweise auf die Linse 32 des Auges 20 gelenkt. Durch den Laserstrahl 31 werden β-Amyloid-Moleküle 10 in der Linse 23 zur Autofluoreszenz angeregt. Dabei geben sie Licht mit einer Wellenlänge von mehr als 420 nm ab. Dieses Licht bildet einen Lichtstrahl 29. Der Lichtstrahl 29 tritt teilweise durch den Spiegel mit dichroitischer Beschichtung 50 durch und trifft auf den Photomultiplier 60. Der Photomultiplier 60 detektiert das von den β-Amyloid-Molekülen 10 abgegebene Fluoreszenzlicht.
Dadurch kann auf einfache Weise festgestellt werden, ob in einer Linse 23 eines Auges 20 β-Amyloid-Moleküle 10 vorhanden sind. β-Amyloid-Moleküle sind Hauptbestandteile der Amyloid-Plaques im Gehirn und in der Linse 23 von Morbus Alzheimer-Patienten.
Morbus Alzheimer kann daher mit dieser Vorrichtung durch den Nachweis von β-Amyloid-Molekülen 10 in der Linse 23 diagnostiziert werden.
Die Absorptionspektren der Zielmoleküle sind in der Regel relativ breit, so dass je nach Ausführungsform eine Variation der Laserwellenlängen von 20 nm möglich ist. Die Pulslänge kann im Femtosekundenbereich breit variiert werden. Die Intensität kann über der Schwelle relativ breit variiert werden.
2 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zum Nachweisen von Molekülen. Dieses Ausführungsbeispiel basiert auf dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel. Es wurden weitere Bauteile hinzugefügt. Die hinzugefügten Bauteile sind ein Login-Verstärker 80, eine Detektorblende 62, ein Farbglas 70, eine Transferlinse 90 und eine Fokussierlinse 100.
Die Fokussierlinse 100 ist zwischen dem Auge 20 und dem Spiegel mit dichroitischer Beschichtung 50 im Bereich des Laserstrahls 31 angeordnet. Die Transferlinse 90, das Farbglas 70 und die Detektorblende 62 sind zwischen dem Photomultiplier 60 und dem Spiegel mit dichroitischer Beschichtung 50 im Bereich des Lichtstrahls 29 angeordnet.
Der Login-Verstärker 80 ist mit dem Photomultiplier 60 verbunden.
Durch die Fokussierlinse 100 wird der Laserstrahl 31 fokussiert, so dass er im Bereich der Linse 23 einen sehr kleinen Querschnitt aufweist. Durch die Transferlinse 90 wird der Lichtstrahl 29 fokussiert. Durch das Farbglas 70 werden Bestandteile des Lichtstrahls 29, die nicht von einem β-Amyloid-Molekül abgegeben worden sind, ausgefiltert. Die Detektorblende 62 unterdrückt unerwünschte Streulichtanteile. Der Login-Verstärker 80 bereitet das Signal des Detektors so auf, dass das Signal:Rauschverhältnis bei der Detektion erhöht wird.
Durch das Vorsehen der Fokussieroptik 100 ist es möglich, die Linse 23 mit einer hohen Auflösung abzurastern. Die Auflösung kann dabei so hoch gewählt werden, dass Autofluoreszenzbilder der Linse 23 erzeugbar sind. Durch das Vorsehen des Farbglases 70 und der Detektorblende 62 werden unerwünschte Anteile aus dem Lichtstrahl 29 herausgefiltert bzw. ausgeblendet. Dadurch, dass der Lichtstrahl 29 durch die Transferlinse fokussiert wird, wird eine höhere Energiedichte in dem Fokus des Lichtstrahls 29 erreicht. Dadurch wird eine Detektion des Lichtstrahls 29 erleichtert. Durch das Vorsehen des Login-Verstärkers 80 wird das Signal des Detektors so aufbereitet, dass es deutlicher ist.
Im Folgenden werden beispielhaft Fluoreszenzmarker und Moleküle mit Autofluoreszenz beschrieben.
Die Tabelle zeigt im Auge nachweisbare Moleküle. In der ersten Spalte sind die Bezeichnungen nachweisbarer Moleküle, welche entweder Fluoreszenzmarker oder autofluoreszierende Moleküle sind, aufgeführt, in der zweiten Spalte die Anregungswellenlänge eines Lasers, durch die die Moleküle angeregt werden, Licht abzugeben. Bei der Anregungswellenlänge handelt es sich um die ursprüngliche Wellenlänge. Bei der 2-Photonenanregung verdoppelt sich die Anregungswellenlänge. In der dritten Spalte ist die Wellenlänge der Lichtstrahlung angegeben, die von den jeweiligen Molekülen abgegeben wird, wenn diese angeregt werden. Beide Wellenlängen sind exemplarisch und können in einem Bereich von +/–50 nm variiert werden.
In dem oberen Abschnitt der Tabelle sind diejenigen Moleküle aufgeführt, die bei Anregung selbst fluoreszieren (Autofluoreszenz) und in einem Auge 20 detektiert werden können. Bei Autofluoreszenz sind der Fluoreszenzmarker und das Zielmolekül identisch. Im zweiten Bereich der Tabelle sind Moleküle aufgeführt, die bei Anregung fluoreszieren können und dazu geeignet sind, sich an Moleküle zu binden, die in einem Auge 20 detektiert werden können.
Das β-Amyloid-Molekül, das bei Morbus Alzheimer-Patienten in der Linse 23 und der Retina vorhanden ist, kann durch eine Wellenlänge von 360–370 nm, oder 720–740 bei 2-Photonenanregung zur Autofluoreszenz angeregt werden. Die Wellenlänge der von β-Amyloid-Molekülen abgegebenen Lichtstrahlen ist größer als 420 nm. Advanced Glucation Endproducts-Moleküle können Ablagerungen in einer Linse 23 bilden, die einen Katarakt verursachen. Die Anregungswellenlänge für Advanced Glucation Endproducts liegt ebenfalls bei 360–370 nm oder 720–740 nm bei 2-Photonenanregung. Die Wellenlänge des von den Advanced Glucation Endproducts Molekülen abgegebenen Lichts liegt zwischen 500 und 550 nm. Das Tryptophan-Molekül kann ebenfalls Ablagerungen in der Linse 23 bilden, die einen Katarakt bilden. Die Anregungswellenlänge des Tryptophan-Moleküls liegt zwischen 260 und 290 nm oder 520–580 nm bei 2-Photonenanregung. Das von Tryptophan-Molekülen abgegebene Licht hat eine Wellenlänge von 320–400 nm. Phenylalanin-Moleküle können ebenfalls Ablagerungen in einer Linse 23 bilden und einen Katarakt verursachen. Die Anregungswellenlänge des Phenylalanin-Moleküls liegt bei 240 nm oder 480 nm bei 2-Photonenanregung. Das von dem Phenylalanin-Molekül abgegebene Licht hat eine Wellenlänge von über 260 nm.
Thioflavin S und deren Derivate, z. B. Pittsburgh Compound B sind dazu geeignet, sich an β-Amyloid-Moleküle zu binden. Die Anregungswellenlänge von Thioflavin S und deren Derivaten liegt bei ca. 430 nm oder 860 nm bei 2-Photonenanregung. Das abgegebene Licht hat eine Wellenlänge von ca. 550 nm.
Thioflavin T (IUPAC: 4-(3,6-dimethyl-1,3-benzothiazol-3-ium-2-yl)-N,N-dimethylaniline chloride) und deren Derivate sind ebenfalls dazu geeignet, sich an β-Amyloid-Moleküle zu binden. IUPAC ist hier die Nomenklatur für chemische Compounds nach International Union of Pure and Applied Chemistry. Die Anregungswellenlänge liegt, wenn es an β-Amyloid gebunden ist, bei ca. 442 nm oder 884 nm bei 2-Photonenanregung. Das von Thioflavin T-Molekülen und deren Derivaten abgegebene Licht hat wenn es an β-Amyloid gebunden ist, eine Wellenlänge von ca. 482 nm. Wenn Thioflavin T-Moleküle nicht an β-Amyloid gebunden ist, liegt die Anregungswellenlänge bei ca. 342 nm oder 684 nm bei 2-Photonenanregung. Das abgegebene Licht hat in dem Fall eine Wellenlänge von ca. 482 nm.
Weitere Moleküle, die geeignet sind, an β-Amyloid zu binden sind Kongo rot und dessen Derivate (z. B. Methoxy-X04 und Methoxy-X34) (IUPAC: 3,3'-4,4'Biphenyldiylbisazo)bis-(4-amino-1-naphtalinsulfonsäure)-Dinatriumsalz).
Methoxy-X04 ist ebenfalls geeignet, an β-Amyloid zu binden. Die Anregungswellenlänge liegt bei ca. 368 nm, das von Methoxy-X04 abgegebene Licht hat eine Wellenlänge von ca. 450 nm.

10: Molekül
20: Auge
23: Linse
29: Lichtstrahl
30: Laserscanner
31: Laserstrahl
32: Femtosekundenoszillator
34: Scannmodul
36: Modulator
50: Spiegel mit dichroitischer Beschichtung
60: Fotomultiplier
62: Detektorblende
70: Farbglas
80: Login-Verstärker
90: Transferlinse
100: Fokussierlinse

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Goldstein LE et al. „Cytosolic β-amyloid deposition and supranuclear cataracts in lenses from people with Alzheimer's disease", Lancet 36: 1258–65 [0002]
- Skoch J. et al. „Preclinical characterization of amyloid imaging grobes with multiphoton microscopy", Journal of Alzheimer's Disease 9/3 Supplement, 401–7 [0003]
- Tal DR et al., „UV light-induced autofluorescence of full lense Abeta-Protein deposits in the human brain", Clin. Neuropathol. 2002 Januar bis Februar, 21(1): 35–40 [0004]

Claims

Vorrichtung zum Nachweisen von Molekülen (10) im Auge (20) umfassend einen Laserscanner (30), einen Strahlteiler (50) und einen Detektor (60), wobei der Laserscanner (30) einen Laser (32) und ein Scanmodul (34) aufweist, der Laser (32) eingerichtet ist, einen Laserstrahl (31) zu emittieren, der Laserstrahl eine Wellenlänge λ₁ aufweist, das Scanmodul (34) eingerichtet ist, den Laserstrahl (31) in einem zu untersuchenden Bereich des Auges (20) zu positionieren und der Detektor (60) eingerichtet ist, von den Molekülen (10) abgegebenes Fluoreszenzlicht mit einer Wellenlänge λ₂ zu ermitteln.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Laser ein ps- oder fs-Impulslaser ist und eingerichtet ist, um im Einzelimpulsbetrieb und/oder im repetierenden Betrieb mit Pulswiederholraten im kHz bis MHz Bereich zu arbeiten.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Laserscanner (30) einen Leistungsmodulator (36) umfasst und der Leistungsmodulator (36) eingerichtet ist, die Leistung des Laserstrahls an den Nachweisprozess anzupassen.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Moleküle (10) β-Amyloid-Moleküle sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Moleküle (10) Fluoreszenzfarbstoffmoleküle vorzugsweise aus der Gruppe der Thioflavine, besonders bevorzugt Kongo rot sind, die an Antikörper, Antikörperfragmente, Aptamere oder Peptide bindbar sind, wobei die Antikörper, Antikörperfragmente, Aptamere oder Peptide an Zielmoleküle bindbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Moleküle Advanced Glycation Endproducts, Phenylalanin oder Tryptophan sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Laser (32) eingerichtet ist, eine Laserwellenlänge zu bilden, die an die Absorption der Moleküle angepasst ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Scannmodul eingerichtet ist, den Laserstrahl (31) in einer Linse (23) des Auges (20) zu positionieren.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Detektor (60) ein Photomultiplier oder eine Avalanche Photodiode ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Detektor (60) eine Zeitauflösung im Nanosekunden-, Picosekundenbereich oder darunter aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine Detektorblende (62).
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend einen optischen Kurzpassfilter (70).
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend einen Verstärker (80).
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine Transferoptik (90).
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine Fokussieroptik (100).
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Detektor (60) ein Element zur spektralen Aufteilung des Fluoreszenzlichtes enthält.
Verfahren zum Nachweisen von Molekülen (10) im Auge (20), wobei ein Laser (32) einen Laserstrahl (31) emittiert, ein Leistungsmodulator (36) den Laserstrahl (31) an eine Anregungswellenlänge der Moleküle (10) anpasst, ein Scannmodul (34) den Laserstrahl (31) auf zu untersuchende Bereiche des Auges (20) richtet und Fluoreszenzlicht, das von den Molekülen (20) abgegeben wird, zu einem Detektor (60) gelenkt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Detektor (60) die Fluoreszenzlebensdauer bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei Moleküle (10) im vaskulären System des Auges (20) detektiert werden, indem Fluoreszenzfarbstoffmoleküle, die an Antikörper oder Peptide bindbar sind, in das Auge (20) eingebracht werden und nach einer Spätphase des Blutflusses eine Detektion der Fluoreszenzfarbstoffmoleküle am Augenhintergrund vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 17, 18 oder 19, wobei das Auge (20) während der Emission des Laserstrahls (31) mittels eines Saug-Kontaktglases fixiert wird.