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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur verbesserten
mikrofluidischen Versorgung der Messprobe und oder der Messsonde
für Rastersondenmikroskopische
Untersuchungen, mit dem Ziel einer deutlich verringerten mechanischen Belastung
des Cantilevers bzw. der Messsonde für eine erhöhten Einsatzzeit bzw. -häufigkeit
der Messsonde beim Probenwechsel.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Rastersondenmikroskopie (SPM – „scanning
probe microscopy")
ist eine Mess- und Analysetechnik, bei der eine Messsonde über eine Probe
eines zu untersuchenden Messmediums gerastert wird und bei der über eine
abstandsabhängige Wechselwirkung
zwischen der Messsonde und der Probe eine Topographie der Probe
ermittelt wird. Es können
aber auch Materialkonstanten oder andere Probeninformationen gewonnen
werden. Die prominentesten Vertreter dieser Technik sind das Rasterkraftmikroskop
(AFM – „atomic
force microscope") und
das Rastertunnelmikroskop (STM – „scanning tunneling
microscope"). Weitere
Vertreter dieser Technologie sind insbesondere das Rasternahfeldmikroskop
(SNOM – „scanning
near field microscope") und
das Rasterphotonenmikroskop (SPFM – „scanning photonic force microscope").
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Zum
Messen der abstandsabhängigen Wechselwirkung
zwischen Messsonde und Probe wird bei der Abstandsspektroskopie
die Messsonde relativ zur Oberfläche
der Probe verlagert, beispielsweise in einer zur Probenoberfläche vertikalen
Richtung, und die Wechselwirkung zwischen Messsonde und Probe wird
gemessen. Alternativ kann auch die Probe bewegt werden. Es kann
auch eine Relativbewegung zwischen Messsonde und Probe vorgesehen
sein, bei der sowohl die Messsonde als auch die Probe bewegt werden.
Bei der Rastersondenmikroskopie wird diese Abstandsspektroskopie
zum Messen der Wechselwirkung zwischen Messsonde und Probe beispielsweise
dazu genutzt, Kräfte
zwischen Molekülen
zu messen, indem ein Molekül
an die Messsonde bindet und ein weiteres Molekül an die Probe.
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Es
kann dann die Wechselwirkung zwischen den beiden gebundenen Molekülen gemessen
werden. Es können
aber auch intramolekulare Kräfte
gemessen werden, indem beispielsweise die Messsonde auf die Probe
abgesenkt und hierbei auf eine Bindung gewartet wird. Danach kann
die Messsonde wieder von der Probe entfernt werden, wobei hierbei auf
die Messsonde wirkende Kräfte
aufgezeichnet werden. Darüber
hinaus sind weitere Messungen möglich,
bei denen eine Wechselwirkung gemessen wird, die mit einem zugeordneten
Abstand zu zwei oder mehreren Orten korreliert.
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Als
Messsonde wird bei der Rasterkraftmikroskopie üblicherweise ein Bauteil verwendet,
welches auch als Cantilever – bestehend
aus einem Biegebalken und oder wahlweise versehen mit einer pyramidenförmigen Spitze – bezeichnet
wird. Ohne Einschränkung
der Allgemeinheit, wird in den nachfolgenden Erläuterungen auf einen Cantilever
Bezug genommen. Die Ausführungen
gelten entsprechend für
andere Formen von Messsonden in der Rastersondenmikroskopie.
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Es
ist bekannt, für
die Abstandsspektroskopie sowohl unbehandelte als auch vorbehandelte Cantilever
zu verwenden. Im Fall eines unbehandelten Cantilevers ist eine Bindung
der Probe bei der Messung unspezifisch. Beispielsweise geht es hierbei
darum, Moleküle
mittels Bindung an den Cantilever aus ihrem Umgebungsmedium zu ziehen,
um die Wechselwirkung der Moleküle
mit dem Umgebungsmedium zu messen. Hierbei können aber auch die Moleküle genauer
charakterisiert werden, an denen gezogen wird. So zeigen zum Beispiel
DNA-Moleküle eine
spezifische Spektroskopiekurve aufgrund einer internen Konformationsumwandlung.
Ein anderes Einsatzgebiet ist die Viskoelastizitätsmessung an deformierbaren
Materialen wie Biopolymeren und lebenden biologischen Zellen, um
die sogenannte Steifigkeit „stiffness" zu ermittelt.
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Mit
einem vorbehandelten Cantilever können insbesondere spezifische
Bindungen untersucht werden. Eine solche Untersuchung kann vorteilhaft
sein, wenn das Ausbilden von ungewünschten Bindungen, die danach
unter Umständen
kaum noch voneinander getrennt werden können, bei der Messung verhindert
werden soll. So ist es gängige
Praxis, ein oder mehrere Moleküle
an die als Cantilever ausgeführte Messsonde
zu binden, welche dann mit dem oder den gebundenen Molekül(en) ein
Rezeptor-Ligand-System bildet. Es ist auch bekannt, Zellen an eine
als Cantilever gebildete Messsonde zu binden und dieses System in
Wechselwirkung mit einer Probe, beispielsweise einem Biomaterial,
oder mit anderen Zellen zu bringen. Vor behandlungen von Messsonden,
insbesondere von Cantilever, sind in verschiedenen Ausführungsformen
bekannt, beispielsweise in Form des Hydrophobisierens der Messsonde.
Eine weitere Beschichtung des Cantilevers kann das Ankleben von
artifiziellen Partikeln wie z. B. Glaskugeln und Polystyrene Kugeln
sein, die dann ihrerseits wieder mit Zellen oder anderen Beschichtungen
ummantelt sein können.
Durch den Einsatz von Kleber ist die Bindung der Kugeln an den Cantilever sehr
stark und deutlich höher
als die Bindung von Partikeln an den Cantilever über das Rezeptor-Ligand-System.
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Bekannte
Möglichkeiten
zur Vorbehandlung des Cantilevers führen allgemein zu einer Beschichtung
der Messsonde, zumindest in Teilbereichen. So beschichtet eine an
dem Cantilever angebrachte Zelle einen Teilbereich der Oberfläche des
Cantilevers. Es kann hierbei vorgesehen sein, den Cantilever im Rahmen
der Vorbehandlung zunächst
mit einer Beschichtung zu versehen, insbesondere einer haftvermittelnden
Beschichtung, auf der dann eine zu messende Substanz aufgebracht
wird. Allgemein wird im folgenden das im Rahmen der Vorbehandlung
auf die Messsonde, insbesondere den Cantilever, aufgebrachte Material
als Sondensubstanz bezeichnet, sei es ein einzelnes Material oder
eine Kombination von mehreren Materialien, die beispielsweise eine
haftvermittelnde Basis und eine hierauf angeordnete und zu untersuchende
Substanz umfasst. Eine im Rahmen der Vorbehandlung aufgebrachte
und von der Sondensubstanz umfasste (Basis-)Beschichtung wird auch
als Sondenbeschichtung bezeichnet.
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Ein
wesentliches Einsatzgebiet der Rastersondenmikroskopie ist der Life
Sciences Bereich – die
Untersuchung von biologischen Proben vorzugsweise in wässrigen
Flüssigkeiten.
Aufgrund der relativ hohen Oberflächenspannung dieser Flüssigkeiten wirken
deutliche Kräfte
auf den Cantilever und angehängte
partikuläre
Beschichtungen, wenn die Sonde eintaucht oder aus der Flüssigkeit
genommen wird. Dies kann bis zur irreversiblen Deformation des Cantilevers
selbst führen.
Nur wenn ein Partikel durch z. B. Kleber sehr fest an dem Cantilever
fixiert ist, kann häufig
Verlustfrei der Probenraum gewechselt werden. Dabei wird der Begriff
Partikel sehr allgemein verwendet – es handelt sich um künstliche,
biologische oder biogene Objekte im Bereich von Submikrometer bis
Submillimeter. Diese können
sphärisch oder
unregelmäßig geformt
sein. Häufig
eingesetzte Partikel sind z. B. Glaskugeln, Silikakugeln, Polymerkugeln
und biologische Zellen bzw. Zellhaufen.
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In
den bisher bestehenden Ausführungen
eines Cantileverhalters wird ein Mikropartikel, das nur moderat
an der Spitze z. B. über
Biotin/Streptavidin Bindungen fixiert ist, abgerissen, wenn die
Einheit aus einer Fluidikkammer herausgehoben wird bzw. wieder eintaucht.
Damit ist die mehrmalige Verwendung einer Messsonde in verschiedenen
Messkammern deutlich erschwert. Soll die Messsonde nach der sondenmikroskopischen
Messung für
andere Untersuchungen weiter verwendet werden, so ist dies auch
nahezu unmöglich.
Für die
Ausführung
weiterer Messungen an unterschiedlichen Proben mit einer Messsonde
wäre es
sehr hilfreich, die durch die Oberfächenspannungen induzierten
Kräfte
auf die Messsonde gering zu halten. Bisher wurde nur der Cantilever
durch Beschichtungen in seinen chemischen Oberflächeneigenschaften verändert, um
eine Ankopplung von Molekülen
und Partikeln zu verbessern oder zu verhindern. Zusätzlich zur
verringerten mechanischen Belastung des Cantilevers wäre es wichtig
die Gefahr der Denaturierung klein zu halten, dies bedeutet z. B.
Verdunstung zu vermeiden und bedarf auch ggf. einer Temperaturkontrolle.
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Da
auch lebende Systeme beobachtet werden sollen, ist eine gezielte
Veränderung
der Oberflächenspannungseigenschaften
der Flüssigkeiten
nur eingeschränkt
möglich.
Aus diesem Grund wird eine geeignete geometrische Vorrichtung mit
korrespondierendem Verfahren vorgeschlagen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Aufgabe
der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren und Vorrichtung
zu finden, mit dem die physikalische Belastung einer Messsonde für die rastensondenmikroskopische
Untersuchung in Flüssigkeiten
bei Ein- und Austritt aus dem Probenraum reduziert wird. Dadurch
erhöht
sich die Einsatzzeit der Messsonde und ermöglicht einen erhöhten Probendurchsatz.
Die Erfindung verringert nicht nur die Belastung der Messsonde,
sondern ermöglicht
auch eine separate Ablage der Messsonde für nachfolgende Untersuchungen.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe durch ein Verfahren und eine Vorrichtung gelöst, die
eine verbesserte mikrofluidischen Versorgung der Messprobe und oder
der Messsonde für
rastersondenmikroskopische Untersuchungen gestatten, mit dem Ziel einer
deutlich verringerten mechanischen Belastung des Cantilevers bzw.
der Messsonde für
eine erhöhte Einsatzzeit
bzw. -häufigkeit
der Messsonde. Es wird eine i) Einrichtung/Beschichtung zum Erhalt
einer Flüssigkeitsglocke
um den Cantilever vorgeschlagen, die mit ii) einer Oberflächentopografie des
Probensubstrates korrespondiert und iii) durch eine geeignete Geometrie,
Vervielfachung und Anordnung einzelner Messkammern den Wechsel der
Rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung von einer Messkammer
zur anderen erleichtert und vorteilhaft für die Automatisierung der Probencharakterisierung eingesetzt
werden kann.
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Die
Erfindung umfasst den Gedanken, dass eine geeignet ausgeführte Manschette
an der Unterseite eines Cantileverhalters beim Austritt des Cantilevers
mit der Messsonde aus der mit Flüssigkeit
versetzten Messkammer den Flüssigkeitsabriss
so schonend gestaltet, dass die physikalisch mechanische Belastung
des Cantilevers und insbesondere der Messsonde so gering ist, dass
eine mehrmalige Verwendung möglich
wird.
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Typischerweise
geht die Manschette über die
Abmessung des Cantilevers und der Messsonde hinaus. Um dennoch ein
Beprobung mit der AFM-Spitze auszuführen umfasst die Erfindung
ferner den Gedanken, dass der Boden der Messkammer eine zur Manschette
korrespondierende Topografie z. B. Trapez oder einen Kegelstumpf
aufweist, um den Kontakt zwischen Cantilever und Probe zu verringern.
Diese Topografie kann durch Verfahren wie Spritzguss oder durch
Abformtechniken erzeugt werden. Alternativ ist es auch möglich, dass
im einfachsten Fall nur ein geeignetes Podest durch Einsatz z. B.
eines planaren Objektgläschen
erzeugt wird.
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Die
Erfindung umfasst ferner den Gedanken, dass die topografische Ausgestaltung
der Messkammer optisch durchsichtig ist, die mikroskopische Beobachtung
der Probe und der Messsonde erlaubt und bioverträgliche Eigenschaften aufweist.
Dies ist für den
Einsatz im Life Science Bereich sehr wichtig.
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Die
Manschette selbst kann aus flexiblem oder weniger flexiblem Material
bestehen. Ein flexibles Material kann dabei ermöglichen, dass beim Aufsetzen
auf dem Boden der Messkammer eine Kompression erfolgt, so dass der
Cantilever mit der Messsonde die Probe zur Messung kontaktieren
kann. Damit kann die Abmessung der topografischen Erhöhung auch
reduziert werden oder es kann ganz darauf verzichtet werden. Ebenfalls
ist es möglich,
dass die Manschette eine heterogene Zusammensetzung aufweist. Dies
bezieht sich nicht nur auf die vertikale bzw. horizontale Struktur,
sondern auch auf die Anzahl der Manschetten-Lippen. So ist es möglich, dass sich
eine äußere Manschette
in Komposition und Geometrie von einer zweiten inneren Manschette
unterscheidet. Dabei kann die äußere Manschette
verstärkt
für die
fluidische Abdichtung eingesetzt sein, während die innere Manschette
eher für
den Erhalt einer wässrigen
Umgebung um den Cantilever während
der Umsetzung dient.
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Der
Erfindung liegt auch der Gedanke zu Grunde, dass sowohl das Material
der Manschette selbst, als auch der Unterboden des Cantileverhalters
so chemisch modifiziert werden, dass die Ausbildung und Stabilität einer
Flüssigkeitsglocke
um die Messsonde verbessert ist. Thermoreversible Polymere (NiPAM)
auch als Hydrogele bezeichnet, zeichnen sich dadurch aus, dass sie
bei bestimmten Temperaturkennlinien einen Umschlag von Hydrophob
zu Hydrophil aufweisen. Damit kann temperaturabhängig die Anheftung von Zellen
gesteuert werden. Weiterhin kann auch eine temperaturabhängige Volumenänderung
erfolgen, beispielsweise schrumpft das Hydrogel der Firma GeSiM
bei einer Temperaturerhöhung
um 5°C um
90%, begleitet von einer mechanischen Verfestigung. Der Erfindung
liegt deshalb der Gedanke zu Grunde, durch Einsatz von Hydrogelen
im Manschettenmaterial und oder im Bereich der Unterseite des Cantileverhalters
deren chemisch physikalische Eigenschaften wie Volumen, Festigkeit,
Hydrophobizität
steuerbar zu machen. Dabei ist es auch möglich, dass sich die Manschette
bzw. die Hydrogelbedeckung nicht nur cantileverseitig befindet,
sondern auch auf der Ebene des Probensubstrates sich ein manschetteförmiges Konstrukt
befindet und ggf. die Topografische Struktur umsäumt.
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Der
Erfindung liegt ferner der Gedanke zu Grunde, dass eine Manschette
einen Glockeneffekt hervorruft. Dies kann dazu führen, dass beim Eintauchen
des Cantileverhalters in die Flüssigkeit
sich Luftblasen oberhalb der Messsonde fangen und die Rastensondenmessung
als auch die optische Beobachtung stören wenn nicht unmöglich machen.
Aus diesem Grund wird eine fluidische Zuführung am Cantileverhalter vorgeschlagen,
die es zunächst
erlaubt die sich bildende Luftblase abzusaugen. Anschliessend kann
durch diese Zuleitung auch eine Flüssigkeit zugeführt oder
abgesaugt werden. Dabei ist es als eine Ausführungsform auch möglich durch eine
geeignete Ausformung an der Unterseite des Cantileverhalters die
sich bildende Luftblase seitlich so abzuleiten, dass keine Pumpe
dafür eingesetzt werden
muss. Darüber
hinaus kann es auch mehrere unabhängige Kanäle dieser Zuleitung geben.
Vorteilhaft ist zudem, wenn durch mindestens einen Kanal auch Partikel
z. B. als Messsonde eingeführt
werden.
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Eine
weitere Ausführungsform
beschreibt den Gedanken, dass unabhängig von der genanten Zuleitung
im Cantileverhalter eine weitere Fluidzuführung in die Messkammer eingeführt wird.
Dies ist besonders für
eine separate Zell- und Wirkstoffzugabe vorteilhaft. Dabei wird
z. B. vorgeschlagen, dass sich diese Fluidikzuführung in mindestens 2 unabhängige Zuleitungen
und eine Abführung
untergliedert. Typischerweise eingesetzte Micropartikel als Messsonden
oder Targetproben haben häufig
eine Größe von 2–50 μm. Damit
sedimentieren sie relativ schnell auch innerhalb der fluidischen
Zuleitungen und sind dann nur aufwendig mit viel Spülvolumen
zu entfernen, wenn nach der Partikelzugabe z. B. eine Spülrountine
oder Wirkstoffzugabe notwendig ist. Mit der bezeichneten Ausführung wird
der Nachteil bestehender Fluidzellen für den AFM-Betrieb umgangen,
die keine getrennte Zuführung
von Mikropartikeln und reinen Flüssigkeiten
vorsehen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung besteht darin, dass die benannten
Eigenschaften des Messraumes wie mehrkanalige Zuführung und
topografische Struktur nicht nur für eine solitäre Messkammer gilt,
sondern auch ein Kammernverbund vorgestellt wird. In einer Ausführungsform
wird beispielhaft vorgeschlagen, dass die Zwischenwände der
Kammern flachere Zwischenwände
haben als die Aussenwände.
Die getrennten Messkammern können
fluidisch separat befüllt
werden, übersteigt
der Pegel aber die Höhe
der Zwischenwände,
so befinden sich diese in einem sogenannten fluidischen Kontinuum.
Auf diese Weise kann die Messsonde auch von einer Messkammer zur
nächsten
bewegt werden, ohne dass es zu einer ausgeprägten mechanischen Belastung
besonders der Messsonde kommt. Es ist in einer Ausführungsform
dieser korrespondierenden Messkammern auch möglich, dass nicht alle Einheiten
der Multikammer miteinander fluidisch kommunizieren. In einem konkreten
Ausführungsbeipiel
wird vorgeschlagen, dass eine Kammer aus z. B. drei Untereinheiten mit
einer Kammer für
die Probenpartikel und für
die Sondenpartikel sowie einem Bereich für die Ablage von abgetrennten
Cantilever-Messsonden bzw. den Abfall besteht. Dabei kann diese
Dreier-Einheit auch so gestaltet sein, dass ein einheitlicher Messraum durch
Zwischenwände
so strukturiert ist, dass die Bereiche nebeneinander oder kreissegmentartig
angeordnet sind. Der Vorteil einer räumlichen Separierung von Partikel
für die
Messsonde und für
die AFM-Beprobung ist, das eine vorhergehende Interaktion beider
Typen unterbunden wird und eine Inkubation mit einem Wirkstoff nicht
zwangsweise auf beide Typen einwirkt. Durch die Einführung eines
dritten Bereiches für
die Ablage von abgetrennten Cantilevern oder sonst wie deponierten
Sondenpartikeln wird es möglich,
diese leichter wiederzufinden, um daran befindliche Objekte für nachfolgende
Untersuchungen weiter zu benutzen. Besonders für lebende Zellen ist so eine
nachfolgende Kultivierung möglich.
Ist eine Zelle oder ein Zellhaufen als Messsonde angebracht, so
beginnt bei Inkubation in einem Kultivierungsmedium und den geeigneten äußeren Bedingungen
wie Temperatur (z. B. 37°C)
und Begasung (z. B. 5% CO2) eine Zellteilung.
Adhärent
wachsende Zellen sind typischerweise motil mit Bewegungsgeschwindigkeiten
im Bereich μm/s,
so dass bei geeigneter Beschichtung des Plattensubstrates die Zellen
von allein sich von dem Cantilever bzw. dessen Teile bewegen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist, dass die Zellaufnahme eine arrayartige
Substrukturierung aufweist. Damit wird die eher zufällige Verteilung
der Zellen aus Probe bzw. der Partikel für die Messsonde aufgehoben
und in eine geordnete Ablage überführt. Damit
sind das Auffinden der Objekte und die automatische Beprobung erleichtert.
Beispielsweise kann die Probenaufnahme eine zeilen- und spaltenweise Anordnung
von Poren mit einem Durchmesser kleiner als die Abmessung der Einzelprobe
aufweisen. Durch Anlegen eines Unterdruckes werden die suspendierten
Objekte auf die Poren gesaugt und festgehalten, wie es aus der Technik
des planaren Patch-Clamps bekannt ist. Objekte außerhalb
der Poren können
durch eine Querströmung
weggespült werden.
Die Positionierung kann auch durch Überdruck erfolgen. Typischerweise
werden für
die Druckerzeugung Pumpen eingesetzt.
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Die
Arrayartige Positionierung der Objekte kann alternativ auch durch
Mikro-Spotting der Objekte mittels eines Dispensers erfolgen. Diese
Methode ist besonders attraktiv, wenn die topografische Aufnahme
mit einer arrayartigen Matrix von Substanzen belegt ist, die die
Anlagerung von Mikrobjekten, insbesondere Zellen fördern (z.
B. Polylysin) bzw. hemmen (z. B. polyHEMA – poly-hydroxyethyl methacrylate).
Solche eine Matrix wird standardmäßig mittels Spotting oder Kontaktprinting
(z. B. Nano- oder Mikroimprinting) hergestellt.
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Bei
der Überführung des
Cantilevers von einem Messraum zum anderen, kann die Relativbewegung
sowohl durch Bewegung des Cantileverhalters als auch durch Veränderung
der Position des Messraumes oder durch eine gegenseitige Bewegung ausgeführt werden.
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Für die Langzeitstabilität der Untersuchung ist
es wichtig, dass die Verdunstung möglichst gering ist. Um dies
zu ermöglichen
wird vorgeschlagen, dass ein Verdunstungsschutz die Messkammern während der
Messung abdeckt. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, dass sich
ein Ring um den Cantileverhalter befindet und die unmittelbar genutzte
Messkammer und einige Flächen
darum abdichtet. Wenn größere Bereiche
abgedeckt werden sollen, wird eine Platte vorgeschlagen. Die kann
sich z. B. durch Federvorrichtung über die nicht genutzten Bereiche
schieben.
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Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele
der Erfindung
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Die
Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme
auf Figuren einer Zeichnung näher
erläutert.
Hierbei zeigen:
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1a Vorrichtung
zur Erzeugung einer Flüssigkeitsglocke
um eine Messsonde und korrespondierender Probenraum im Querschnitt
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1b Vielzahl von Messkammer/Probenräumen mit
abgesenkten inneren Trennelementen im Querschnitt
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1c Array
von Messkammern mit unterschiedlichen Kompartimenten für Probe,
Messsonde und Sondenablage in Draufsicht
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2a Prinzip der Ausbildung der Flüssigkeitsglocke
in der Ausgangslage,
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2b Meniskusausbildung in der Überführungsposition
aus der ersten Messkammer
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2c Meniskusausbildung in der Eintauchposition
der zweiten Messkammer
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3a Array von Messkammern mit unterschiedlichen
Kompartimenten für
Probe, Messsonde und Sondenablage in Draufsicht
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3b Prinzip der weiteren Unterteilung des Probenraumes
mittels Arraybildung
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3c Multicantilever und Arrayformation mit
korrespondierender Geometrie
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4a–d
beschreiben ein Ausführungsbeispiel
einer Messsondenüberführung ohne
Manschette mit abgestimmtem Flüssigkeitswechsel
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1 zeigt
in
a) Das Ende eines Cantileverhalters ist ein optisch durchsichtiges
Material 1 an dessen Unterseite der Cantilever 2 (mit
Biegebalken und Spitze) angebracht sind. Die Spitze ist bereits
mit einem Messsondenpartikel 3 beladen. Die Auslenkung
eines Laserstrahls 4 wird detektiert und charakterisiert
die xyz-Position des vorderen Teils des Cantilevers. Eine fluidische
Zuleitung 5 erlaubt es, Flüssigkeit 7 in die Umgebung
des Cantilevers zu bringen bzw. abzusaugen. Gleichzeitig kann diese
Zuleitung auch genutzt werden, um sich an der Unterseite des Cantileverhalters
befindliche störende
Luftblase abzunehmen. Durch einen Manschettenaufbau 6 kann
der Cantilever so auch bei einer Position oberhalb des Flüssigkeitsstandes 9 der
Messzelle 8 flüssigkeitsumgeben
sein. Dabei bildet sich eigener Meniskus 10 aus. Vorteilhaft
ist es, wenn durch Oberflächenbeschichtung
des Cantileverhalters und insbesondere der Manschette 6 sich
eine großvolumige Flüssigkeitsansammlung
bilden kann. Die Messkammer 8 ist mit separaten fluidischen
Zuleitungen 12 (z. B. vorteilsweise 2) und einem
Abfluß 11 versehen, sodass
unabhängig
von der Zuleitung 5 Flüssigkeit ausgetauscht
und der Pegel 9 verändert
werden kann. Damit der Kontakt des Cantilevers zu den Probenzellen 13 nicht
durch die Höhe
der Manschette 6 gestört
wird, ist der Boden der Kammer podestartig 14 ausgeführt. Vorzugsweise
ist die Messkammer in Kunststoff ausgeführt, so dass eine derartige
Strukturierung technisch leicht umgesetzt werden kann.
Wenn
die Manschette aus einem flexiblen Material besteht kann auf eine
Podeststrukturierung auch verzichtet werden.
b) beschreibt
im Querschnitt eine Vielzahl von Messkammern aus 1a).
Dabei ist in einer bevorzugten Ausführung der Aussenrand 15 der
Messkammer deutlich höher
als die Zwischenwände 16,
um den z-Hub des Cantilevers klein zu halten.
c) beschreibt
eine Arrayartige Anordnung 17 von Messkammern aus 1a in
der Draufsicht mit schematisierten Fluidikkontakten 18.
Die Trapezartige Innenform 19 symbolisiert die Podestanordnung. Vorgeschlagen
wird eine Ausführung
in der eine Reihe mit Probenzellen 20, eine Reihe mit Sondenzellen 21 und
die Mittelreihe als Ablage 22 fungiert. Dabei kann ein
solcher Dreierverbund bzw. Subunit (Spalten) zueinander mit reduzierten
Zwischenwänden ausgebildet
sein, während
in Abgrenzung zu einem weiteren Verbund die Abgrenzungswände höher als die
Zwischenwände
der Subeinheiten sind. Soll ein Cantilever abgetrennt werden oder
aber die Messsonde ausgetauscht werden, so kann dies in 22 erfolgen.
Die einzelnen Messkammern können
zusätzlich durch
fluidische Verbindungen 23 miteinander in Verbindung stehen.
Diese Verbindung muss nicht durchgehend ausgebildet sein, sondern
kann auch nur z. B. je 2 benachbarte Kammern verbinden. Auch eine Kontrolle
durch miniaturisierte Ventile ist möglich. Die Reihenfolge der Ausführung mit
Kammern für
die Probe, für
die Sonde und die Ablage kann auch in einer anderen Kombination
ausgeführt
sein, wie z. B. Ablage, Probe und Sonde.
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In 2a ist schematisch dargestellt, wie eine
belastungsarme Überführung von
einem Messraum in einen anderen ausgeführt werden kann. Eine Messkette
besteht in diesem Beispiel aus zwei Messkammern 9, die
durch eine Trennwand 16 separiert sind, wobei die 16 niedriger
ist als die Außenwand 15.
Der Cantileverhalter 1 mit einer Fluidikkapillare 5 und
dem Cantilever 2 ist von einer Manschette 6 umgeben,
deren Bemessung kürzer
oder länger
als die Cantileverspitze mit der Sonde sein kann. Die Sonde befindet
sich oberhalb der Probe 13. Das System ist gefüllt bis
zu einem Flüssigkeitsstand 24,
der für
die separaten Messkammern auch unterschiedlich sein kann. Eine gedachte
virtuelle Linie 25 bezeichnet die Grenze oberhalb der die
Messsonde einschließlich der
Manschette kontaktfrei an der Zwischenwand 16 vorbeigeführt werden
kann.
In 2b ist gezeigt, dass 1 aus
der Messkammer bewegt wurde (Pfeil). Dies kann durch die Motorisierung
des Cantileverhalters selbst erfolgen, mit einem üblichen
Motorisierungsweg von < 200 μm oder durch
eingesetzte Servomotoren. Einfacher kann ein z-Hub aber durch einen
Excenterhub umgesetzt werden, wenn die Flüssigkeitsstände und damit die Hubbewegung
nicht in inkrementen Schritten verändert werden muss.
Dabei
bildet sich ein Meniskus 26 zwischen der Flüssigkeit
der Messkammer und im Bereich um die Messsonde. Der Hub muss so
groß sein,
dass die Cantileverspitze mit der Manschette über der Linie 25 hinausgeht.
Ist der Hub zu hoch kann der Meniskus abreißen. Um dies zu vermeiden,
wird zudem die Hubbewegung mit einer Erhöhung des Flüssigkeitsspiegels 27 in
der Messkammer verbunden. Dies kann unabhängig vom Füllstand der zweiten Messkammer
erfolgen.
In 2c ist gezeigt,
dass die Messsonde in die zweite Messkammer überführt ist (Pfeil). Dies wird
z. B. durch Bewegung des Probenhalters umgesetzt. Nähert sich
bei dieser Bewegung die Messsonde dabei der Trennwand 16 so
wird der Flüssigkeitsstand in
der Messkammer 1 abgesenkt auf 24 und zunächst der
Flüssigkeitsstand
der zweiten Kammer erhöht 28. Parallel
zum Absenken der Messsonde auf die Probe 13 wird auch der
Flüssigkeitsstand
der zweiten Kammer wieder auf 24 abgesenkt.
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3 beschreibt
einen Entwurf, um das Auffinden von Partikeln für die Messsonde und für die Beprobung
(Probenzellen) zu erleichtern. Alternativ kann die Porenformation
auch zur Regulation des Flüssigkeitsstandes
benutzt werden:
3a) beschreibt
eine zur 1c adäquate Abbildung mit arrayartige
Anordung 17 von Messkammern in der Draufsicht mit schematisierten
Fluidikkontakten 18. Die Trapezartige Innenform 19 symbolisiert die
Podestanordnung. Vorgeschlagen wird eine Ausführung in der eine Reihe mit
Probenzellen 20, eine Reihe mit Sondenzellen 21 und
die Mittelreihe als Ablage 22 fungiert. Soll ein Cantilever
abgetrennt werden oder aber die Messsonde ausgetauscht werden, so
kann dies in 22 erfolgen. Die einzelnen Messkammern können zusätzlich durch
fluidische Verbindungen 23 miteinander in Verbindung stehen.
Diese Verbindung muss nicht durchgehend ausgebildet sein, sondern
kann auch nur z. B. je 2 benachbarte Kammern verbinden. Auch eine
Kontrolle durch miniaturisierte Ventile ist möglich.
3b zeigt,
dass in beispielhafte Ausführung
des Trapezförmigen
Innenraumes 19. In einer Messkammer 30 befinden
sich in einem definierten Abstand von einander Poren 31,
die ein Array bilden. Die Messkammer ist so fluidisch angeschlossen,
dass über
eine Kombination aus Ventilen und Pumpen (34) ein Ansaugdruck über die
Poren induziert werden kann. Die Zugabe von Partikeln (29)
saugt die Partikeln auf die freien Porenplätze, im Ergebnis entstehen
array-artig angeordnete Partikel (33) Alternativ kann auch über einen Überdruck
eine Platzierung erzeugt werden, bzw. dass Poren-Array gereinigt
werden. Weiterhin werden ggf. überschüssige Partikel (32)
auf Zwischenflächen
abgelagert. Diese können durch
danach weggespült
werden, während
die platzierten Objekte (33) mittels Druck lokalstabil
bleiben.
Vorzugsweise ist die fluidische Kontaktierung so ausgelegt,
dass ein Zeilen- bzw. Spaltenweise Belegung ermöglicht wird.
3c beschreibt eine AFM-Messsonde bestehend typischerweise
aus Grundkörper
(35) und Cantilever (36) mit einem zusätzlich aufgebrachten
Piezo-stellelement (37). Bevorzugt sollte bei einem Multicantilever
der Biegebalkenabstand 38 genauso gross sein wie der korrespondieren
Arrayabstand.
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4 zeigt
in
a), dass eine Messkammer 9 unterteilt ist in 2 Teilbereiche,
die durch eine Zwischenwand 16 getrennt sind. Jeder dieser
Teilbereich weist zumindest eine fluidische Zuführung 12, 12a auf,
die unabhängig
von einander betrieben werden kann und sowohl saugt und pumpt. Die
Teilbereich sind bis zu einer Flüssigkeitshöhe 24 gefüllt, wobei
in der Präparationslösung 40 sich
Partikel 39 für
den Einsatz als Messsonde befinden, während in der Messlösung 41 sich
Probenobjekte 13 befinden. Die Linie 25 kennzeichnet
die Höhe,
die der Cantilever mit der Messsonde die Zwischenwand 16 passieren
muss, um nicht in gegenseitigen Kontakt zu kommen.
In 4b erfolgt eine Ankopplung eines Partikels 39 an
den Cantilever, damit wird dieses Objekt zu einer Messsonde 3.
Danach wird werden die beide Teilbereiche gespült, so dass in 41 und 42 im
Wesentlichen ein identisches Fluid enthalten ist.
In 4c erfolgt eine Flutung der Messkammer 9 über die
Höhe der
Zwischenwand 16 hinaus bis zu einem Flüssigkeitsstand 43.
Begleitend zur Erhöhung des
Pegels wird der Abstand zwischen Cantileverhalter und Partikel 39 vergrößert. Im
Anschluß wird
der Cantilever über
dem zweiten Teilbereich positioniert (Pfeil).
In 4d erfolgt eine Absenkung des Flüssigkeitspegels 43 auf
den ursprünglichen
Stand 24, begleitet von einer Absenkung des Cantileverhalters
mit der Messsonde auf eine Arbeitsposition in der Nähe der Probenpartikel.
Zusätzlich
erfolgt ein Austausch der Flüssigkeit,
so dass in den zwei Teilbereichen wieder individuelle Lösungen 44, 45 vorliegen.
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Die
in der vorstehenden Beschreibungen und Zeichnungen offenbarten Merkmale
der Erfindung können
sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung
der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen von Bedeutung
sein.