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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bereitstellen einer
Messsonde für eine sondenmikroskopische Untersuchung einer
Probe in einem Sondenmikroskop, insbesondere einem Rastersondenmikroskop,
sowie eine Anordnung mit einem Sondenmikroskop zum sondenmikroskopischen
Untersuchen einer Probe.
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Hintergrund der Erfindung
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Eine
Mess- und Analysetechnik der Sondenmikroskopie ist die Rastersondenmikroskopie
(SPM – „scanning probe microscopy"), bei der eine
Messsonde über eine Probe eines zu untersuchenden Messmediums
gerastert wird und über eine abstandsabhängige
Wechselwirkung zwischen der Messsonde und der Probe eine Topographie
der Probe ermittelt wird. Es können auch Materialkonstanten oder
andere Probeninformationen gewonnen werden. Prominente Vertreter
dieser Technik sind das Rasterkraftmikroskop (AFM – „atomic
force microscope") und das Rastertunnelmikroskop (STM – „scanning
tunneling microscope"). Weitere Vertreter sind insbesondere das
Rasternahfeldmikroskop (SNOM – „scanning near
field microscope") und das Rasterphotonenmikroskop (SPhM – „scanning
photone force microscope").
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Zum
Messen der abstandsabhängigen Wechselwirkung zwischen Messsonde
und Probe wird bei der Abstandsspektroskopie die Messsonde relativ
zur Oberfläche der Probe verlagert, beispielsweise in einer
zur Probenoberfläche vertikalen Richtung, und die Wechselwirkung
zwischen Messsonde und Probe wird gemessen. Alternativ kann auch
die Probe bewegt werden. Es kann auch eine Relativbewegung zwischen
Messsonde und Probe vorgesehen sein, bei der sowohl die Messsonde
als auch die Probe bewegt werden. Bei der Rastersondenmikroskopie
wird diese Abstandsspektroskopie zum Messen der Wechselwirkung zwischen
Messsonde und Probe beispielsweise dazu genutzt, Kräfte
zwischen Molekülen zu messen, indem ein Molekül
an die Messsonde bindet und ein weiteres Molekül an die Probe.
Dies wird auch als Kraftspektroskopie bezeichnet.
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Als
Messsonde wird üblicherweise ein Bauteil verwendet, bei
dem ein Basisteil – auch Chip genannt – und eine
dünne Messsondenverlängerung, die auch als Cantilever
bezeichnet wird, gebildet sind. Der Cantilever kann zum Beispiel
balkenförmig ausgeführt sein oder ein Dreieck
mit zwei Seitenschenkeln bilden. Das vom Basisteil (Chip) entfernte Ende
des Cantilevers kann eine zusätzliche Spitze (Tip) aufweisen.
Weiterhin gibt es auch Ausführungen mit mehreren Verlängerungen
am Basisteil – so genannte Multicantilever. Cantilever
können nicht nur hauptsächlich aus Silizium oder
Siliziumnitrid mit und ohne Metallisierung bestehen, sondern auch
aus Kunststoffen oder Polymeren wie zum Beispiel SU-8. Im allgemeinen
Sprachgebrauch wird verbreitet nicht zwischen Chip und Cantilever
unterschieden, sondern die gesamte Einheit als Cantilever zu bezeichnen.
Ohne Einschränkung der Allgemeinheit wird in den nachfolgenden
Erläuterungen auf eine Messsonde Bezug genommen. Die Ausführungen
gelten entsprechend für andere Formen von Messsonden in der
Sondenmikroskopie.
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Es
ist für die Abstandsspektroskopie bekannt, sowohl unbehandelte
als auch vorbehandelte Cantilever zu verwenden. Mit einem vorbehandelten Cantilever
können insbesondere spezifische Bindungen untersucht werden.
Es ist Standard, Moleküle an die als Cantilever ausgeführte
Messsonde zu binden, welche dann mit dem oder den gebundenen Molekül(en)
beispielsweise ein Rezeptor-Ligand-System bilden. Es ist auch bekannt,
ganze Zellen oder Mikropartikel an eine als Cantilever gebildete
Messsonde zu binden und dieses System in Wechselwirkung mit einer
Probe, beispielsweise einem Biomaterial, oder mit anderen Zellen
zu bringen. Sowohl die Beschichtung eines vorbehandelten Cantilevers
als auch die daran haftenden Objekte wie Zellen oder Mikropartikel
werden im Folgenden als Sondensubstanz bezeichnet.
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Bei
der sondenmikroskopischen Untersuchung kann sich aufgrund des Kontaktes
mit der Probe die Sondensubstanz verändern und unter Umständen
altern. Dies kann sowohl die Beschichtung selbst betreffen als auch
den Zustand der Zellen, zum Beispiel bezüglich Stoffwechsel,
Physiologie und Aktivierung. Darüber hinaus wird es im
Rahmen des weiteren Einsatzes der Sondenmikroskopie in der zellbiologischen
und biomedizinischen Forschung wichtig werden, die Sondensubstanz,
die im Kontakt mit der Probe war, weiter zu untersuchen. Besonders
vorteilhaft ist es bei der Handhabung von biologischen Proben, wenn
diese keimfrei beziehungsweise keimarm (steril) und schonend weiterverwendet
werden könnten. Gegenwärtig muss der Cantilever
nach der Messung ausgebaut werden. Dafür muss das System aus
dem Probenbehältnis mit der umgebenden Flüssigkeit
genommen werden. Diese Vorgehensweise birgt insbesondere die Gefahr,
dass 1) die angehefteten Objekte durch die Oberflächenspannungen
abgerissen werden, 2) es beim Ausbau des Cantilevers zu Verunreinigungen kommt
und 3) eine Schädigung der Objekte durch einen erhöhten
Zeitaufwand eintritt.
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Aus
dem Stand der Technik ist bekannt, wie lebende Zellen als Messsonde
an einen einzelnen Cantilever gebracht werden können (vgl.
zum Beispiel Taubenberger A. et al.: Revealing early steps
of α2β1 integrin-mediated adhesions to collagen
type I using single-cell force spectroscopy, Molecular Biology of
the Cell (2007) 18, 1634–1644). Hierbei wird ein Cantilever
zum Beispiel biochemisch so mit Concavalin A modifiziert, dass eine
starke Bindung der Zelle an dessen Oberfläche erfolgt,
nachdem der Cantilever direkt an die Zelle gebracht wurde und eine
Kontaktzeit abgewartet wurde. Dann ist die Zelle fest gebunden.
Es bedarf sehr großer Kräfte (typischerweise > 5nN), um diese Zelle
wieder abzubekommen. Weiterhin ist auch die Oberfläche
nach der Zellablösung so verändert, dass keine
weitere Zelle neu angekoppelt werden kann.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Aufgabe
der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Bereitstellen einer Messsonde
für eine sondenmikroskopische Untersuchung einer Probe
in einem Sondenmikroskop sowie eine Anordnung mit einem Sondenmikroskop
zu schaffen, die einen nutzerfreundlichen und effizienteren Umgang
mit der Messsonde ermöglichen.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren
zum Bereitstellen einer Messsonde für eine sondenmikroskopische
Untersuchung einer Probe in einem Sondenmikroskop nach dem unabhängigen
Anspruch 1 sowie eine Anordnung mit einem Sondenmikroskop zum sondenmikroskopischen
Untersuchen nach dem unabhängigen Anspruch 14 gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand von abhängigen
Unteransprüchen.
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Die
Erfindung umfasst den Gedanken eines Verfahrens zum Bereitstellen
einer Messsonde für eine sondenmikroskopische Untersuchung
einer Probe in einem Sondenmikroskop, insbesondere einem Rastersondenmikroskop,
bei dem die Messsonde, welche eine Sondenbasis und eine hieran gebildete Sondenverlängerung
aufweist, an einer Trageeinrichtung gehalten wird und die Messsonde
vor oder nach einer Messung bearbeitet wird, indem ein Abschnitt der
Sondenverlängerung abgetrennt wird.
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Nach
einem weiteren Aspekt der Erfindung ist eine Anordnung mit einem
Sondenmikroskop zum sondenmikroskopischen Untersuchen einer Probe, insbesondere
Rastersondenmikroskop, geschaffen, bei dem eine Messsonde, welche
eine Sondenbasis und eine hieran gebildete Sondenverlängerung
aufweist, an einer Trageeinrichtung gehalten ist, und einer Trenneinrichtung
vorgesehen, welche konfiguriert ist, die Messsonde vor oder nach
einer Messung zu bearbeiten, indem ein Abschnitt der Sondenverlängerung
abgetrennt wird.
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Mit
Hilfe der Erfindung ist es ermöglicht, Abschnitte der Sondenverlängerung
der Messsonde vor oder nach einer sondenmikroskopischen Untersuchung
abzutrennen. Auf diese Weise kann beispielsweise ein verbrauchter
Abschnitt der Sondenverlängerung von der Messsonde abgetrennt
werden, so dass diese anschließend erneut für
eine sondenmikroskopische Untersuchung benutzt werden kann. Es ist
aber auch ermöglicht, dass von der Messsonde ein Abschnitt
abgetrennt wird, welcher später für eine weitere
Untersuchung genutzt werden soll. Das Abtrennen des Abschnitts der
Sondenverlängerung kann auch dazu führen, dass
ein Teil der Sondenbasis mit abgetrennt wird. In einer anderen Ausgestaltung
betrifft das Abtrennen eines Abschnitts der Sondenverlängerung
das teilweise oder vollständige Abtragen einer Beschichtung.
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Vorteilhaft
lässt sich die Erfindung in Verbindung mit einer als Cantilever
ausgeführten Messsonde anwenden. Nicht nur bei Cantilevern
sondern bei beliebigen Messsonden kann das Abtrennen eines Abschnitts
der Sondenverlängerung mehrmals ausgeführt werden,
zum Beispiel nach oder vor mehreren Teilmessungen. Ist eine weitere
Verwendung der Messsonde nach dem Abtrennen des Abschnitts der Sondenverlängerung
geplant, so wird das Abtrennen für die Messsonde funktionserhaltend
ausgeführt.
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Eine
bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass das Abtrennen
des Abschnitts der Sondenverlängerung einen lichtoptischen
Trennschritt umfasst. Die lichtoptische Trennung kann beispielsweise
mittels der Nutzung von Laserlicht ausgeführt werden. Alternativ
kann von einer Nicht-Laserlichtquelle bereitgestelltes Licht für
die Abtrennung fokussiert werden. Es kann ein über ein
Mikroskopobjektiv getrennt eingekoppelter Stickstofflaser be nutzt
werden, um die Abtrennung zu bewirken. Die genutzte Lichtenergie
kann lokal so dosiert werden, dass auftretende Erwärmungen
und Vibrationen nicht oder kaum zu einer Beeinflussung umliegender Bereiche
führen. Mittels eines fokussierten Laserstrahls können
so beispielsweise Abschnitte der Sondenverlängerung abgetrennt
werden, welche eine Sondensubstanz tragen. Für eine weitere
Verringerung nichtgewollter Beeinflussung wird die Trennung nicht
in unmittelbarer Nachbarschaft zum Zielobjekt ausgeführt,
sondern um mehrere Fokusradien versetzt. In einem typischen Kraftspektroskopieexperiment
mit einem Sondenmikroskop kann es notwendig sein, eine auf der Sondenverlängerung
befindliche Zelle, welche auch als partikulare Sondensubstanz bezeichnet
wird, in geeigneter Art und Weise zu entfernen, um sie im lebenden
Zustand für eine weitere Untersuchung einzusetzen.
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Bei
einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung
kann vorgesehen sein, dass das Abtrennen des Abschnitts der Sondenverlängerung
einen mechanischen Trennschritt umfasst. In einer Ausgestaltung
wird der mechanische Trennschritt mittels mechanischer Krafteinwirkung
ausgeführt, beispielsweise indem die Messsonde gegen einen
zum Beispiel eine Kante aufweisenden Gegenstand gedrückt oder
gestoßen wird. Hierbei kann vorgesehen sein, dass der Gegenstand
seinerseits positionierbar ist, um für den Abtrennschritt
in eine geeignete Stellung gebracht zu werden. Auf diese Weise kann
der Gegenstand bei Nichtnutzung wahlweise aus dem Bereich der Messsonde
verlagert werden. Es kann auch vorgesehen sein, dass der abgetrennte
Abschnitt der Sondenverlängerung an einer Haftfläche
haften bleibt. Bei Verlagerbarkeit des Gegenstandes ist so die Möglichkeit
geschaffen, den abgetrennten Abschnitt selbst zu verlagern. Die
mechanische Abtrennung kann in einer Ausgestaltung mittels einer
Vorrichtung vergleichbar einer einschenkligen mechanischen Pinzette
erfolgen, die an den Cantilever heranfahrt und gegen ihn drückt
bis ein Teil abgetrennt ist. Hierbei verfolgt eine weitere Idee
der Erfindung den Gedanken, dass eine Abtrenneinheit ihrerseits
wieder eine Pinzettenfunktion hat und den abgetrennten Cantileverteil
aufnimmt und in diesem gleichen Behältnis positioniert
oder ihn in eine andere Kammer überführt.
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Eine
zu große mechanische Belastung einer Sondensubstanz, zum
Beispiel biologischen Zellen, kann zu deren irreversiblen Schädigung
führen. Deshalb ist es wichtig zu vermeiden, dass eine
unnötig große Druckkraft auf die gewünschten
Abschnitte der Sondensubstanz wirkt, wie es beim bloßen
Abbrechen des Cantilever an einem Substratboden der Fall sein kann.
Hierbei kann sowohl der Druck an einer Abbruchkante schädigen
als auch der Umstand, dass der ab getrennte Teil der Sondenverlängerung auf
den Boden fällt und hierbei eine Druckkraft entsteht, die
das Sondensubstrat schädigt.
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Eine
vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass
der Abschnitt der Sondenverlängerung entlang einer vorgegebenen
Trennlinie abgetrennt wird. Die vorgegebene Trennlinie kann in Form einer
Trennmarkierung oder einer Sollbruchstelle ausgeführt sein.
Letzteres ermöglicht eine sichere und schnelle Abtrennung.
Eine oder mehrere Sollbruchstellen können zum Beispiel
mittels angeätzter Querstrukturen oder Querstreifen aus
Metall oder Lack ausgeführt sein, welche besonders gut
Laserlicht absorbieren und somit insbesondere für die Laserbearbeitung
geeignet sind.
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Bevorzugt
sieht eine Fortbildung der Erfindung vor, dass als Abschnitt der
Sondenverlängerung ein mit einer Sondensubstanz beladener
Abschnitt abgetrennt wird. Beispielsweise kann die Sondenverlängerung
mit einer oder mehreren Zellen beladen sein. Auch eine chemische
Beschichtung kann wenigstens abschnittsweise gebildet sein. Bei
dieser Ausgestaltung kann zum Beispiel das Laserlicht genutzt werden,
um die chemische Beschichtung abzutragen oder zu modifizieren, so
dass eine Ankopplung nur im Bereich einer Spitze stattfindet und
eine Zelle nicht fortwandern kann. Alternativ kann auch mit dem
Laser die Oberfläche der Sondenverlängerung aktiviert
werden, so dass nur in einem aktivierten Bereich eine oder mehrere
Zellen als Sondensubstanz ankoppeln. Wenn die Sondensubstanz im
Rahmen einer sondenmikroskopischen Untersuchung verbraucht ist,
kann mit dem Abtrennen solche verbrauchte Sondensubstanz von der
Messsonde getrennt werden. Es kann aber auch vorgesehen sein, dass
ein Abschnitt mit einer noch funktionsfähigen Sondensubstanz
abgetrennt wird, um diesen Abschnitt der Messsonde, welcher wahlweise
auch einen Abschnitt der Sondenbasis umfassen kann, in einer späteren
Untersuchung erstmals oder erneut zu verwenden.
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Bei
einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen
sein, dass der abgetrennte Abschnitt der Sonderverlängerung
in einem Ablagebereich aufgenommen wird. Der Ablagebereich kann mit
einer Flüssigkeit gefüllt sein, in welche der
abgetrennte Abschnitt der Sondenverlängerung gelangt. Beispielsweise
kann so eine Sondensubstanz auf dem abgetrennten Abschnitt in einer
Flüssigkeitsumgebung gehalten werden, die funktionserhaltend wirkt.
Beispielsweise kann der abgetrennte Abschnitt auf diese Weise steril
weiterkultiviert werden. Der Ablagebereich kann in eine für
die sondenmikroskopische Untersuchung genutz te Messzelle integriert oder
getrennt hiervon gebildet sein. Er kann in einem Kulturgefäß oder
einem Abfallbehälter bereitgestellt werden. Auch kann der
Ablagebereich in einer zweckmäßigen Ausgestaltung
in eine Arrayanordnung integriert sein.
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In
einer beispielhaften Ausführung wird vorgeschlagen, dass
ein Probenbehältnis oder eine Probenkammer eine Unterteilung
in mindestens zwei Kammern aufweist. In einer Teilkammer befindet
sich die zu untersuchende Probe, in einer weiteren Teilkammer werden
die Cantileverteile abgetrennt. Beide Teilkammern sind mittels einer
Zwischenwand voneinander getrennt. Nach erfolgter Messung verfährt der
Cantilever in den Raumrichtungen zunächst so, dass er oberhalb
der Zwischenwand positioniert ist. Dann wird der Cantilever langsam
auf die Zwischenwand abgesenkt, derart, dass der abzutrennende Teil der
Sondenverlängerung sich im Bereich der Abtrennteilkammer
befindet. Mit Hilfe einer Lagekontrolle ist die Position des Cantilevers
relativ zur Zwischenwand bekannt. Der Cantilever wird herunter gefahren
bis er abbricht. Vorteilhaft ist es, wenn die Verbiegung des Cantilevers
zur Kontrolle der Annährung an die Zwischenwand benutzt
wird, um sicher und schonend den Cantilever oder Teile hiervon abzutrennen.
Hierbei kann der Abbruch auch an einer Kante stattfinden, die nicht
gleichzeitig die Zwischenwand darstellt. Dies wäre zum
Beispiel bei einer weiteren Unterteilung in einer der Teilkammern
schon gegeben.
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Beispielsweise
befindet sich in der Probenkammer ein Bereich mit einer Anordnung
von Mulden. Diese Anordnung kann beispielsweise in Silizium, verschiedenen
Kunstoffen wie Polycarbonat oder in PDMS (Polydimethylsiloxane)
muldenförmig strukturiert sein. Der Cantilever wird über
einer Mulde positioniert und so an eine Muldenkante gefahren, dass
der Cantilever abbricht und in der Mulde verbleibt. Besonders vorteilhaft
ist es bei einer arrayartigen Anordnung, dass die Abtrennbewegung
leicht automatisiert werden kann und beispielsweise die Verbiegung
einer AFM-Spitze zur Kontrolle des Abbrechdruckes benutzt wird.
Mittels der arrayartigen Anordnung ist es auch ermöglicht,
eine individuelle Zuordnung der abgetrennten Cantileverteile zur
jeweiligen Arraymulde zu treffen. Die Abtrennung des Cantilevers
muss bei der arrayartigen Anordnung nicht notwendig mittels eines
mechanischen Elementes erfolgen. Es ist auch möglich, dass
die Abtrennung mit Hilfe von Laserlicht erfolgt.
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Eine
Weiterbildung der Erfindung kann vorsehen, dass der abgetrennte
Abschnitt der Sondenverlängerung unter keimfreien oder
sterilen Umgebungsbedingungen gelagert wird. In einer Ausführung
können hierzu die vorgenannten Mulden genutzt werden.
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Eine
bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass mit dem Abtrennen
des Abschnitts der Sonderverlängerung eine Federkonstante
der Messsonde eingestellt wird. Das Einstellen der Federkonstante
kann ausgeführt werden, indem die Sondenverlängerung
auf verschiedene Art und Weise verändert wird. Hierzu gehören
beispielsweise eine Verkürzung und eine Dickenbearbeitung.
Letzteres kann in einer Ausgestaltung mittels Abtragen einer Beschichtung
ausgeführt werden. Aber auch eine gezielte Änderung
der Form der Sondenverlängerung kann vorgesehen sein, beispielsweise
die Ausbildung einer Verjüngung zur Spitze der Sondenverlängerung
hin. Alternativ oder ergänzend können Bereiche
aus der Sondenverlängerung herausgeschnitten werden, wahlweise
dadurch, dass Durchbrüche erzeugt werden. Die Länge
der Sondenverlängerung, welche auch als Cantileverbalken
bezeichnet wird, beeinflusst maßgeblich die Federkonstante.
Werden gezielt stets gleichgroße Abschnitte abgetrennt,
so kann auf einfache Art und Weise die Federkonstante modifiziert
werden, ohne dass am experimentellen Aufbau selbst etwas geändert
werden muss. Dieses kann für eine verbesserte hoch auflösende
Messung genutzt werden. Alternativ ist es auch möglich,
mit dem sich verkürzenden Cantilever separate Experimente
auszuführen, wobei die Federkonstante dann jedes Mal neu
bestimmt wird. Wird immer ein gleichlanges Stück des Cantilevers
abgetrennt, so kann nach einer vorherigen Eichung auch mit feststehenden
Materialeigenschaften gearbeitet werden.
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Bei
einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung
kann vorgesehen sein, dass mit dem Abtrennen des Abschnitts der
Sonderverlängerung eine Oberflächenausbildung
der Messsonde verändert wird. Die Oberflächenausbildung
kann zum Beispiel dadurch verändert werden, dass Abschnitte
einer chemischen Beschichtung abgelöst werden, die auf der
Sondenverlängerung gebildet sind.
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Eine
vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass
die Messsonde als eine Anordnung von mehreren Einzelmesssonden gebildet
ist und mittels des Abtrennens des Abschnitts der Sondenverlängerung
wenigstens eine der Teilmesssonden abgetrennt wird. Die Anordnung
von mehreren Einzelmesssonden wird auch als Array bezeichnet.
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Bevorzugt
sieht eine Fortbildung der Erfindung vor, dass der Abschnitt der
Sondenverlängerung mittels einer automatischen Trenneinrichtung abgetrennt
wird. Die automatische Trenneinrichtung kann zum Beispiel als optische
oder mechanische Trenneinrichtung ausgeführt sein. Sie
kann von dem Sondenmikroskop umfasst sein oder getrennt hiervon
gebildet werden. Die automatische Trenneinrichtung kann an ein optisches
Bilderkennungssystem gekoppelt sein, welches insbesondere den Bereich der
Messsonde bildtechnisch erfasst, um so Bildinformationen für
den Betrieb der automatischen Trenneinrichtung beim Abtrennen des
Abschnitts der Sondenverlängerung zur Verfügung
zu stellen. In diesem Zusammenhang kann vorzugsweise eine Bildauswertungssoftware
genutzt werden, um Steuersignale für die automatische Trenneinrichtung
abzuleiten.
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Bei
einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen
sein, dass die Messsonde zum Bearbeiten mit der automatischen Trenneinrichtung
mittels einer Bildaufnahmeeinrichtung aufgenommen wird. Die Bildaufnahmeeinrichtung
kann integriert mit der Trenneinrichtung oder dem Sondenmikroskop
gebildet sein.
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Eine
Weiterbildung der Erfindung kann vorsehen, dass der Abschnitt der
Sondenverlängerung während und/oder nach dem Abtrennen
mittels einer Aufnahmeeinrichtung gehalten wird. Die Aufnahmeeinrichtung
kann zum Beispiel als eine Pinzetteneinrichtung ausgeführt
sein. Auch eine Pipetteneinrichtung kann genutzt werden. Die Aufnahmeeinrichtung kann
in verschiedenen Ausführungsformen integriert mit oder
getrennt von der Trenneinrichtung oder dem Sondenmikroskop gebildet
werden.
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In
Verbindung mit vorteilhaften Ausgestaltungen der Anordnung mit einem
Sondenmikroskop zum sondenmikroskopischen Untersuchen einer Probe gelten
die im Zusammenhang mit korrespondierenden Ausführungen
des Verfahrens genannten Erläuterungen entsprechend.
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Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
der Erfindung
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Die
Erfindung wird im folgenden anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen
unter Bezugnahme auf Figuren einer Zeichnung näher erläutert. Hierbei
zeigen:
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1 eine
schematische Darstellung eines Aufbaus, mit dem eine Abtrennung
eines Abschnitts einer Sondenverlängerung einer Messsonde
mittels Laserlicht ausführbar ist,
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2A eine
schematische Darstellung zum Abtrennen eines Abschnitts einer Sondenverlängerung
einer Messsonde, welche eine Goldbeschichtung aufweist,
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2B eine
schematische Darstellung zum Abtrennen eines Abschnitts einer Sondenverlängerung
einer Messsonde, welche nicht metallisiert ist,
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3A–3C eine
schematische Darstellung für ein mechanisches Verfahren
zum Abtrennen eines Abschnitts einer Sondenverlängerung
einer Messsonde, und
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4 eine
schematische Darstellung mit einer Arrayanordnung.
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1 zeigt
eine schematische Darstellung eines Aufbaus, mit dem eine Laserabtrennung
eines Abschnitts einer Sondenverlängerung einer Messsonde 1 ausführbar
ist. Die Bearbeitung der als Cantilever ausgeführten Messsonde 1 erfolgt
mittels UV-Laserlicht. Die Messsonde 1 weist einen Cantilever-Chip
auf, welcher aus einer festen Basis 1a besteht, an dessen
Ende eine dünne, flexible Verlängerung (Sondenverlängerung 2)
gebildet ist, die auch als Cantilever bezeichnet wird. Am Ende der
Sondenverlängerung 2 ist eine pyramidenförmige
Spitze 3 gebildet. In dem dargestellten Ausführungsbeispiel ist
weiterhin eine Sondenbeschichtung mit einer Molekülbeschichtung 4a sowie
einer partikulären Beschichtung 4b mit einer Zelle
dargestellt. Die Messsonde 1 ist an einer Einheit 55 befestigt, über
diese in der Höhe einstellbar oder sogar in alle drei Raumrichtungen
verstellbar. Die Messsonde 1 mit Cantilever-Chip 1a und
Sondenverlängerung 2 befinden sich über
einem Träger 5, der beispielsweise als ein Objektträger
oder eine Petrischale ausgeführt ist. Über ein
Objektiv 6 kann eine mikroskopische Beobachtung erfolgen.
Hierbei symbolisiert das Objektiv 6 allgemein einen gesamten
optischen Aufbau zur mikroskopischen Beobachtung. In einem Schnittpunkt 7 eines
Strahlenganges liegt der optische Bildfokus. Über ein Stellelement 8 kann
das UV-Laserlicht von einem UV-Laser 10 eingekoppelt und
bewegt werden. Darüber hinaus ist ein IR-Laser 11 mit
einem korrespondierenden Stellelement 9 vorgesehen, welcher
ebenfalls Laserlicht für die laseroptische Bearbeitung
der Messsonde bereitstellen kann.
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2A zeigt
eine schematische Darstellung zum Abtrennen eines Abschnitts einer
Sondenverlängerung einer Messsonde, welche eine Goldbeschichtung
aufweist.
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Es
können verschiedene Arten von Cantilever zum Einsatz kommen.
Im Folgenden werden Ausführungsbeispiele in Verbindung
mit drei verschiedenen Typen erläutert: Typ 1: V-förmiger
Cantilever mit Pyramide und Goldbeschichtung; Typ 2: drei einzelne
stabförmige Cantilever aus SiN, Typ 3: ein einzelner stabförmiger
Cantilever aus Si (hydrophob).
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Als
Bearbeitungssystem wurden ein Lasersystem mit einem IX 70 Olympus
Umkehrmikroskop und ein N2-Laser (337 nm,
UV-Licht) zum Abtrennen verwendet. Die Laserlichtenergie konnte
zwischen Relativeinheiten von 1 bis 1000 (min-max Wert) eingestellt
werden. Zur Experimentausführung wurden die Cantilever
wie in 1 skizziert spitzenseitig (Pyramidenspitze in
Richtung Glasboden und Objektiv) in eine Petrischale mit einem Dünnglasboden
platziert und mit destilliertem Wasser überschichtet.
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2A zeigt
in vier Schritten I bis IV die Manipulation eines mit Gold beschichteten
Cantileverarms vom Typ 1. Im Schritt I werden der optische Fokus
und der Fokus des N2-Lasers auf das Objekt
eingestellt. In Schritt II konnten sehr leicht und mit geringem
Energieeinsatz (mittlere Energieeinstellung) kreisförmige
Materialstücken 20 aus dem Cantilever ausgelöst
werden. Im Durchlicht erscheinen diese Gebiete hell durchsichtig.
Aufgrund der Goldbeschichtung mit darunter liegender Chrombasis
ist die Ablationseffektivität sehr hoch. Gleichzeitig verhindert
die Metallisierung, dass sich Teile des Cantilevers frühzeitig
voneinander lösen. Im Schritt III erfolgt die Trennung
erst nach dem letzten Laserlichtbeschuss, der das Material vollständig
abtrug (im Durchlicht durchgängiger heller Schnitt, skizziert
als Linie 21). Im Schritt IV liegen ein abgetrennter Teil des
Cantilevers 30b vor, der die Sondensubstanz trägt
oder zumindest einen interessierenden Anteil, und ein gekürzter
Cantilever 30a mit veränderter Federkonstante.
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2B zeigt
eine schematische Darstellung zum Abtrennen eines Abschnitts einer
Sondenverlängerung einer Messsonde, welche nicht metallisiert ist.
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Ein
SiN Cantilever vom Typ 2 konnte mit einem Energieeinsatz, welcher
etwas höher ist als für Typ 1, abgetrennt werden.
Die Trennung ergibt keinen im Durchlicht durchgehend hellen Schnitt,
sondern verzeichnet eine dunkel gefärbte Ablagerung 22.
Eine gezieltere Fokussierung des Lasers ermöglichte dann
auch einen vollständigen Materialabtrag 20. Die
Durchtrennung 20 mittels Laser muss aber nicht vollständig
sein, schon nach der Hälfte der so bear beiteten Abschnitte
springt der Cantileverteil 30a Teil förmlich ab.
Dabei ergibt die Schnittfläche 23 bei Typ 2 und
Typ 3 eine relativ glatte Kante mit einigen dunklen Bearbeitsauflagerungen.
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Im
Experiment konnte der Si Cantileverarm vom Typ 3 mit mittlerem Energieeinsatz
abgetrennt werden. Die Trennung verlief ähnlich dem Typ
2, wobei die Abtrennung deutlich glatter und schlagartiger erfolgte,
ohne dass ein vollständiger Materialabtrag ausgeführt
wurde.
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Die
AFM-Spitzen selbst waren nach dem jeweiligen Experiment optisch
unbeschädigt.
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3A bis 3B zeigen
eine schematische Darstellung für ein mechanisches Verfahren zum
Abtrennen eines Abschnitts einer Sondenverlängerung einer
Messsonde.
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In 3A ist
ein Cantilever 1 gezeigt, bestehend aus einem dünnen,
flexiblen Balken 2, welcher an der Cantilever-Basis 1a (Cantilver-Chip)
gebildet ist. Auf einem geeigneten Träger 5 ist
die Messkammer mittels einer Trennwand 62 in zwei Bereiche
unterteilt. Die Wände der Messkammer sind hier nicht gezeigt.
In einem Bereich 61 wird eine SPM-Messung ausgeführt
zur Untersuchung der Wechselwirkung einer Sondensubstanz 53 mit
einem funktionalisierten Substrat 63 in einer geeigneten
wässrigen Lösung. Der Cantilever 1 ist über
eine Einheit 55 befestigt und in alle drei Raumrichtungen
bewegbar. In einem zweiten Bereich der Messkammer befindet sich
der Bereich 60, in dem der Cantilever oder Teile hiervon
abgelegt werden. Alternativ kann auch die Messkammer relativ zum
Cantilever 1 bewegt werden.
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In 3B ist
der Cantileverkomplex 1, 3, 53, 55 über
der Zwischenwand 62 so positioniert, dass der abzutrennende
Teil des Cantilevers mit der Sondensubstanz 53 im Abschnitt
des zweiten Kammerbereichs 60 liegt. Nun erfolgt eine Relativbewegung des
Cantilevers auf die Kante der Zwischenwand zu, was durch den Pfeil 64 illustriert
wird. Dabei kann sich sowohl der Cantilever über die Einheit 55 als auch
der Probenträger bewegen. Ist der Scherdruck ausreichend
groß wird ein Teil des Cantilevers abgetrennt. Hier könnte
natürlich auch zum Beispiel die Methode aus der 2 zur Abtrennung benutzt werden. Entscheidend
ist, dass der abgetrennte Cantilever in einem separaten Bereich
abgelegt wird.
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In 3C befindet
sich der abgetrennte Teil 30b im zweiten Abschnitt 60,
während der an der Aufnahme und Verfahreinheit 55 verbliebene
Teil des Cantilevers 30a benutzt wird, um erneut ein Mikropartikel
aufzunehmen und eine Messung auszuführen. Da sich die Eigenschaften
des verbleibenden Cantilevers 30a geändert haben,
wird davor eine neue Kalibrierung ausgeführt.
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4 zeigt
eine schematische Darstellung mit einer Arrayanordnung.
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Eine
arrayförmige Anordnung 70 weist einzelne Mulden 71 auf,
die für die Abtrennung und die Aufnahme von Teilen des
Cantilevers 30b geeignet sind. Das Material für
die arrayförmige Anordnung 70 kann beispielsweise
Silizium oder ein Kunststoff sein. Eine Schicht 72 ist
so auf der Oberseite der arrayförmige Anordnung 70 angebracht,
dass eine erhöhte Klebefähigkeit für
das Cantilevermaterial besteht. Werden der Cantilever 1 und
die Sondensubstanz 53 mit Hilfe der Einheit 55 über
einer Arraymulde platziert, kann ein Druck (symbolisiert mittels
Pfeil 73) oder Zug ausgeführt werden. Dabei trennt
sich ein Teil des Cantilevers 30b ab, während
er durch die Haft- oder Klebeeigenschaften der Schicht 72 am Rand
der Mulde haften bleibt. Entscheidend für die Abtrennung
ist auch hier eine Relativbewegung der arrayförmigen Anordnung 70 zum
Cantilever 1, um das Abbrechen durch Druck oder Zug zu
erreichen.
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Die
in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und der
Zeichnung offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl
einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung
der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen von
Bedeutung sein.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Taubenberger
A. et al.: Revealing early steps of α2β1 integrin-mediated
adhesions to collagen type I using single-cell force spectroscopy,
Molecular Biology of the Cell (2007) 18, 1634–1644 [0007]