DE102007017433A1

DE102007017433A1 - PIKfyve als pharmakologisches Target zur Behandlung von glucosestoffwechselassoziierten Krankheiten

Info

Publication number: DE102007017433A1
Application number: DE102007017433A
Authority: DE
Inventors: Florian Prof. Dr. Lang; Guiscard Friedrich Aldous Seebohm; Nathalie Andrea Evelyn Strutz-Seebohm
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2007-04-03
Filing date: 2007-04-03
Publication date: 2008-10-09

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit geeigneten Substanz, ein Verfahren zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften einer derart identifizierten Substanz, eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit, ein Verfahren zur Diagnose einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit oder einer Veranlagung hierfür sowie ein Verfahren zur Behandlung eines Lebewesens, das von einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit betroffen ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer zur Behandlung und oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit geeigneten Substanz, ein Verfahren zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften einer derart identifizierten Substanz, eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit, ein Verfahren zur Diagnose einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit oder einer Veranlagung hierfür sowie ein Verfahren zur Behandlung eines Lebewesens, das von einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit betroffen ist.
Die Behandlung von glucosestoffwechselassoziierten Krankheiten, wie beispielsweise der Hyperglykämie, Diabetes mellitus oder Adipositas, stellt eine der größten Herausforderungen an die moderne Medizin dar. Diabetes mellitus oder auch Zuckerkrankheit steht in der Fachsprache als Sammelbegriff für verschiedene heterogene Störungen des Stoffwechsels, deren Leitbefund eine Überzuckerung des Blutes ist. Dieses Phänomen, das allgemein durch einen über dem Normalwert liegenden Blutzuckerwert charakterisiert ist, wird auch als Hyperglykämie bezeichnet. Hyperglykämie kann deshalb ein Symptom der Diabetes darstellen, wobei nicht-diabetische Hyperglykämien bekannt sind, die beispielsweise im Zusammenhang mit dem Krankheitsbild der Bulimia nervosa auftreten. Ferner ist die Entstehung von Hyperglykämie als Folge von bestimmten Medikationen beschrieben worden, wie beispielsweise nach der Verabreichung von Betablockern, Thiazid-Diuretika, Corticosteroide, Niacin, Pentamidin, Proteaseinhibitoren, L-Asparaginase und einigen Psychopharmaka.
Diabetes mellitus Typ 1 sowie insulinabhängige Hyperglykämie wird durch die Zufuhr von Antidiabetika in Form von Insulinpräparaten behandelt.
Insbesondere bei nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus Typ 2 sowie nicht-insulinabhängiger Hyperglykämie kommen weitere Antidiabetika zum Einsatz, die nicht auf Insulin basieren. Ein Beispiel für ein solches Antidiabetikum ist Metformin, das die Glucoseneubildung in der Leber hemmt. Metformin hat jedoch den Nachteil, dass es nicht bei Niereninsuffizienz, Leberversagen, Alkoholismus oder solchen Begleitumständen eingesetzt werden darf, die eine Übersäuerung durch Milchsäure begünstigen können. Häufig treten als Nebenwirkung gastrointestinale Beschwerden auf.
Weitere wichtige Antidiabetika sind die Sulfonylharnstoffe, die bei mittelgradigem Diabetes mellitus Typ 2 eingesetzt werden. Sie stimulieren die Freisetzung von Insulin durch die Blockade von Kaliumkanälen in den B-Zellen des Pankreas. Sulfonylharnstoffe können jedoch zu einer Unterzuckerung führen, eventuell auch zu gastrointestinalen Beschwerden. Gelegentlich kommt es ferner zu Störungen des Blutbildes oder zur hepatischen Cholestase.
Weitere wichtige Antidiabetika sind die sogenannten Glinide. Glinide bewirken eine schnelle und kurzzeitige Insulinfreisetzung. Die Verabreichung von Gliniden kann jedoch zur starken Gewichtszunahme der behandelten Personen sowie zur Entwicklung einer Hypoglykämie führen.
α-Glucosidaseinhibitoren hemmen die α-Glucosidase, ein Enzym, welches im Darm die Hydrolyse von Oligotri- und Disacchariden zu Glucose und anderen Monosacchariden katalysiert. Dadurch wird ein Anstieg der Blutzuckerwerte nach den Mahlzeiten vermindert. Die Verabreichung α-Glucosidaseinhibitoren führt jedoch häufig zur Entstehung von Blähungen, Darmgeräuschen, Durchfall, Bauchschmerzen und Übelkeit.
Thiazolidindione sind sogenannte Insulin-Sensitizer. Diese Gruppe von Wirkstoffen erhöhen die Empfindlichkeit verschiedener Gewebe, wie Muskel-, Fett- und Lebergewebe gegenüber Insulin. In Fachkreisen gibt es rege Diskussionen über Nutzen und Vorteile von Insulin-Sensitizern gegenüber anderen antidiabetischen Wirkstoffen, zumal der erste Wirkstoff dieser Gruppe, das Troglitazon, aufgrund leberschädigender Wirkungen in einigen Ländern bereits wieder vom Markt genommen bzw. in Deutschland nie zugelassen wurde.
Ein Überblick über die momentanen Behandlungsstrategien von Hyperglykämie und Diabetes findet sich beispielsweise in Nathan et al.: „Management of Hyperglycemia in Type 2 Diabetes: A Consensus Algorithm for the Initiation and Adjustment of Therapy", Diabetes Care 2006, 29: 1963–1972. Die dortigen Autoren ziehen das Fazit, dass nach wie vor Strategien fehlen, um von Diabetes betroffene Personen optimal zu behandeln.
Ein gestörter Glucosestoffwechsel kann häufig auch zur sogenannten Adipositas bzw. Fettleibigkeit oder Fettsucht führen. Adipositas erhöht auch das Risiko der Entwicklung von Diabetes mellitus.
Die vorstehend beschriebenen Probleme, die bei der Verabreichung der momentan zur Verfügung stehenden Antidiabetika auftreten, führten zu Bemühungen, neue zelluläre Zielstrukturen, die in die Pathologie von glucosestoffwechselassoziierten Krankheiten involviert sind, zu identifizieren und therapeutisch bzw. pharmakologisch zu nutzen. Eine solche Zielstruktur ist bspw. der Na⁺/Glucose-Cotransporter SGLT1 (SLC5A1). Dieser Na⁺/Glucose-Cotransporter sitzt in der luminalen Membran der Dünndarmepitelzellen und transportiert D-Glucose zusammen mit Natrium in die Zellen. SGLT1 kommt auch im proximalen Tubulus der Niere vor, wo er für die Rückresorption von D-Glucose aus dem Primärharn verantwortlich ist. Eine erhöhte Aktivität bzw. Expression von SGLT1 kann zur Hyperglykämie (Fujita et al. „Increased Intestinal Glucose Absorption and Postprandial Hyperglycaemia at the Early Step of Glucose Intolerance in Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty rats", Diabetologia 1998, 41(12), Seiten 1459–1466), Diabetes (Wagman und Nuss: "Current Therapies and Emerging Targets for the Treatment of Diabetes", Current Pharmaceutical Design, 2001, 7, Seiten 417–450) oder zur Adipositas führen (Osswald et al. "Mice without the Regulator Gene Rsc1A1 Exhibit Increased Na+-D-Glucose Cotransport in Small Intestine and Develop Obesity", Molecular and Cellular Biology, Jan. 2005, Seiten 78–87).
Bei Phlorizin handelt es sich um einen Inhibitor von SGLT1. Weitere Inhibitoren von SGLT1 sind 4-ASD, Diacetoxyscirpenol und 15-Acetoxyscirpendiol; vgl. Yoo et al.: „4-Acetoxyscirpendiol of Paecilomyces tenuipes Inhibits Na+/D-Glucose Cotransporter Expressed in Xenopus laevis Oocytes", Journal of Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 38, Nr. 2, März 2005, Seiten 211–217. Die genannten SGLT1-Inhibitoren werden bislang jedoch ausschließlich zu Forschungszwecken verwendet und haben sich zur Behandlung von glucosestoffwechselassoziierten Krankheiten nicht bewährt.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, mit dem eine solche Substanz identifiziert werden kann, die zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit geeignet ist und vorzugsweise nicht die unerwünschten Nebenwirkungen der im Stand der Technik bekannten Substanzen aufweist. Insbesondere soll eine solche Substanz identifizierbar sein, die zu einer Inhibition von SGLT1 führt.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das folgende Schritte aufweist: (a) Inkontaktbringen eines sich von FYVE finger-containing phosphoinositide kinase (PIKfyve) ableitenden (Poly)peptids und/oder eines hierfür codierenden (Poly)nucleotids mit zumindest einer Testsubstanz unter Bedingungen, die die Bindung an das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid und/oder das hierfür codierende (Poly)nucleotid erlauben, und (b) Bestimmung, ob die zumindest eine Testsubstanz die Aktivität des (Poly)peptides und/oder die Expression des hierfür codierende (Poly)nucleotid inhibiert.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird ferner durch die Verwendung eines sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptids oder eines hierfür codierenden (Poly)nucleotides zur Identifizierung einer zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit geeigneten Substanz gelöst.
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass PIKfyve den Na⁺/D-Glucose-Cotransporter SGLT1 aktiviert und die Hemmung von PIKfyve eine wirksame Strategie zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit darstellt. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde das erfindungsgemäße Verfahren entwickelt.
Bei der FYVE finger-containing phosphoinositide kinase (PIKfyve) handelt es sich um eine zelluläre Kinase, deren humane Variante eine Länge von 2098 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von 237 kDa aufweist. Die Aminosäuresequenz findet sich in der NCBI-Datenbank unter der Zugriffsnummer Q9Y2I7, die Nucleotidsequenz der codierenden mRNA unter der Zugriffsnummer NM_015040; die Sequenzen sind durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Die Aminosäuresequenz von PIKfyve ist ferner im beiliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID-Nr. 1, die Nucleotidsequenz der codierenden mRNA unter SEQ ID-Nr. 2 gelistet.
Die Erkenntnisse der Erfinder waren insbesondere deshalb so überraschend, da PIKfyve bislang nicht im Zusammenhang mit glucosestoffwechselassoziierten Krank heiten beschrieben wurde. So beschreiben Rutherford et al.: „The Mammalian Phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase (PIKfyve) Regulates Endosome-to-TGN Retrograde Transport", J. Cell. Sci. 2006, 119, Seiten 3944–3957, dass PIKfyve den endosomalen Transport reguliert. Welsh et al. beschreiben, dass PIKfyve eine kritische Rolle in der Regulation der GLUT4-Translokation spielt: „Role of Protein Kinase B in Insulin-regulated Glucose Uptake", Biochem. Soc. Trans. 2005; 33: Seiten 346–349. Seebohm et al. beschreiben eine regulatorische Funktion von PIKfyve in dem endozytischen Recyclen der KCNQ1-KCNE1-Kaliumkanäle: „Regulation in Endocytic Recycling of KCNQ1/KCNE1 Potassium Channels", Circ. Res. 2007, im Druck. Ferner wird beschrieben, dass PIKfyve eine Rolle bei der Bildung von 3,5-PIP₂ während der Zellschrumpfung spielt: Sbrissa und Shisheva: „Acquisition of Unprecedented Phosphatidylinositol 3,5-bisphophate Rise in Hyperosmotically Stressed 3T3-L1 Adiopocytes, Mediated by ArPIKfyve-PIKfyve Pathway", J. Biol. Chem. 2005; 280, Seiten 7883–7889.
Unter einem sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptid wird erfindungsgemäß ein solches Protein oder Peptid verstanden, das die biologische Aktivität, vorzugsweise Kinaseaktivität, von PIKfyve aufweist. Bei dem sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptid kann es sich um PIKfyve als solches handeln. Es kann sich jedoch auch um einen Abschnitt von PIKfyve handeln, der lediglich das katalytische Zentrum aufweist, das für die biologische Aktivität verantwortlich ist. Denkbar ist auch, dass das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid die gesamte Aminosäuresequenz von PIKfyve aufweist, N- und/oder C-terminal jedoch weitere Aminosäuren angebracht sind, ohne dass dadurch die biologische Aktivität von PIKfyve aufgehoben wird.
Unter einem (Poly)nucleotid, das für das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid codiert, wird erfindungsgemäß ein Nukleinsäuremolekül verstanden, das die Codierungssequenz des (Poly)peptides aufweist. Bei dem (Poly)nucleotid kann es sich um DNA, cDNA aber auch um mRNA handeln.
Bei der Testsubstanz kann es sich um ein Molekül beliebiger Natur und Struktur handeln, beispielsweise um eine organische Verbindung, eine anorganische Verbin dung, wobei bevorzugte Testsubstanzen niedermolekulare Substanzen, Peptide, Gegensinn-Konstrukte, siRNA-Moleküle, Aptamere, Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon sind.
Erfindungsgemäß wird das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid bzw. das hierfür codierende (Poly)nucleotid mit der Testsubstanz in Kontakt gebracht. Dies erfolgt unter solchen Bedingungen, die sicherstellen, dass die Testsubstanz und das (Poly)peptid bzw. (Poly)nucleotid in unmittelbare Nähe zueinander gelangen. Solche Bedingungen werden beispielsweise durch ein übliches Puffersystem bereitgestellt, mit dem die physiologische bzw. zelluläre Umgebung des (Poly)peptids bzw. (Poly)nucleotids imitiert wird und Letztere aktiv sein bzw. exprimiert werden können.
Eine Testsubstanz ist dann zur Behandlung oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit geeignet, wenn diese die Aktivität des (Poly)peptides bzw. die Expression des hierfür codierenden (Poly)nucleotides inhibiert. Mittels einer solchen Substanz lässt sich die häufig bei glucosestoffwechselassoziierten Krankheiten beobachtete Überaktivität bzw. Überexpression von PIKfyve hemmen und damit die Krankheit wirksam bekämpfen.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung wird das erfindungsgemäße Verfahren derart realisiert, dass Schritt (a) folgende Schritte umfasst: a1) Bereitstellung des sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptids und/oder des hierfür codierenden (Poly)nucleotids in einem geeigneten System; (a2) Bestimmung der Aktivität des sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptids zum Erhalt eines Wertes A1, und/oder des Expressionsniveaus des für das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid codierenden (Poly)nucleotids zum Erhalt eines Wertes E1, (a3) Zugabe der zumindest einen Testsubstanz zu dem System und (a4) Coinkubation des sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptids und/oder des hierfür codierenden (Poly)nucleotids mit der zumindest einen Testsubstanz.
Diese Ausgestaltung hat den Vorteil, dass Parameter A1 und A2 bzw. E1 und E2 herangezogen werden, anhand derer die Eignung einer Substanz zur Behandlung oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit unproblematisch und zielgerichtet bestimmt werden kann.
Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Aktivität des sich von PIKfyve ableitenden Polypeptids über dessen Fähigkeit zur Stimulierung des Na⁺/Glucose-Cotransporters SGLT1 bestimmt.
Wie die Erfinder überraschenderweise herausgefunden haben, handelt es sich bei PIKfyve um einen Aktivator von SGLT1. Die Aktivität von SGLT1 ist damit ein indirektes Maß für die inhibitorischen Eigenschaften der Testsubstanz auf die Aktivität des sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptids. Die Aktivität von SGLT1 wiederum lässt sich mittels im Stand der Technik bekannter Methoden einfach und zuverlässig messen. Je weniger das sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptid zur Stimulierung von SGLT1 fähig ist, desto besser ist die Testsubstanz als eine solche Substanz geeignet, mit der glucosestoffwechselassoziierte Krankheiten behandelt werden können.
Bei dem geeigneten System handelt es sich vorzugsweise um ein System, bei dem PIKfyve in mammalischen Zellen oder Xenopus-Oocyten exprimiert wird.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein solches in-vitro-System bereitgestellt wird, mit dem das erfindungsgemäße Verfahren zuverlässig realisiert werden kann. In Xenopus-Oocyten lassen sich die Codierungssequenzen für SGLT1 und für das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid codierende (Poly)nucleotid injizieren. In den Xenopus-Oocyten kommt es zur Expression und Synthese der codierten Peptide, wobei ein voll funktionsfähiger SGLT1-Transporter in die die Oocyten umgebende Membran inkorporiert wird. Mittels elektrophysiologischer Messungen lässt sich dann der Na⁺/Glucose-Cotransport und damit die Stimulierung von SGLT1 durch das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid in Abhängigkeit der Testsubstanz bestimmen.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein Hochdurchsatzverfahren.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße Verfahren derart angepasst wird, dass auf industrieller Ebene eine Vielzahl von Testsubstanzen innerhalb kürzester Zeit auf deren Fähigkeit hin untersucht werden können, ob diese zur Behandlung oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit geeignet sind.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise eine solche Substanz identifiziert, die für die Behandlung oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit geeignet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Diabetes mellitus, Hyperglykämie, Adipositas aber auch Tumoren, die ihren gesteigerten Energiebedarf durch gesteigerte SGLT1 Aktivität decken.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung solcher Substanzen führt, die zur Behandlung der wichtigsten glucosestoffwechselassoziierten Krankheiten geeignet sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften der nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren identifizierten Substanz, das folgende Schritte aufweist: (a) Identifizieren der Bindungsstelle der Substanz an das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid und/oder an das hierfür codierende (Poly)nucleotid; (b) Modifizieren der Bindungsstelle durch molekulares Modellieren derart, dass die Bindungsspezifität und/oder Bindungsaffinität und/oder Bindungsavidität der Substanz an das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid und/oder an das hierfür codierende (Poly)nucleotid erhöht wird.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die pharmakologischen Eigenschaften der identifizierten Substanz verbessert werden. Die Identifizierung der Bindungsstelle der Substanz an das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid oder an das hierfür codierende (Poly)nucleotid sowie das Modifizieren der Bindungsstelle durch molekulares Modellieren erfolgt mittels im Stand der Technik in Zusammenhang mit molekularem Arzneimitteldesign bekannter Methoden. Ein Überblick über diese Methoden wird auf der von Synergix Ltd. betriebenen Website „Drug Design Resources" gegeben; http://www.drugdesign.org. Der Inhalt der vorstehend genannten Website ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Bindungsstelle in Schritt (a) durch stellenspezifische Mutagenese ermittelt wird.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine solche molekularbiologische Methode zum Einsatz kommt, mittels derer die Bindungsstelle der Substanz an das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid oder das hierfür codierende (Poly)nucleotid zielgerichtet identifiziert werden kann; vgl. Sambrook und Russell, „Molecular Cloning – A Laboratory Manual", 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001, der Inhalt dieser Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit, die einen Inhibitor von PIKfyve, vorzugsweise einen Kinaseinhibitor, weiter vorzugsweise die nach dem zuvor beschriebenen Verfahren identifizierte Substanz sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Die Erfinder stellen damit auf vorteilhafte Art und Weise erstmals eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, mit der über die Inhibition von PIKfyve zielgerichtet eine glucosestoffwechselassoziierte Krankheit behandelt bzw. dieser vorgebeugt werden kann. Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik umfas send beschrieben; vgl. Bauer et al.: „Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie", 6. Auflage, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, 1999; Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5. Auflage, Pharmaceutical Press and American Pharmacists Assoc. 2006. Der Inhalt der vorstehend genannten Publikationen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit oder einer Veranlagung hierfür bei einem zu untersuchenden Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellung einer ersten biologischen Probe des zu untersuchenden Lebewesens, (b) Isolierung von PIKfyve oder eines hierfür codierenden (Poly)nucleotids aus der ersten biologischen Probe, (c) Bestimmung der Aktivität des aus der ersten Probe stammenden PIKfyve zum Erhalt eines Wertes A1 und/oder des Expressionsniveaus des für das PIKfyve codierenden (Poly)nucleotids zum Erhalt eines Wertes E1, (d) Bereitstellung einer zweiten biologischen Probe eines gesunden Referenzlebewesens, (e) Isolierung von PIKfyve oder eines hierfür codierenden (Poly)nucleotids aus der zweiten biologischen Probe, (f) Bestimmung der Aktivität des aus der zweiten Probe stammenden PIKfyve zum Erhalt eines Wertes A2 und/oder des Expressionsniveaus des für das PIKfyve codierenden (Poly)nucleotids zum Erhalt eines Wertes E2, (g) Erstellung einer positiven Diagnose, wenn A1 > A2 und/oder E1 > E2.
Die Erfinder stellen hiermit ein Verfahren bereit, mit dem zuverlässig und zielgerichtet auf molekularer Ebene eine glucosestoffwechselassoziierte Krankheit bzw. eine Veranlagung hierfür diagnostiziert werden kann.
Die biologische Probe enthält erfindungsgemäß aus dem zu untersuchenden Lebewesen stammendes Material, das PIKfyve bzw. hierfür codierende Nukleinsäuremoleküle enthält, wie beispielsweise biologische Zellen oder biologisches Gewebe, vorzugsweise Epitelgewebe, weiter bevorzugt Dünndarmepitelgewebe. Es kann sich deshalb um eine Blut-, Speichel, Haarprobe, einen Abstrich etc. handeln.
PIKfyve bzw. das hierfür codierende (Poly)nucleotid lässt sich mittels im Stand der Technik bekannter Methoden einfach aus der biologischen Probe isolieren; vgl. Sambrook und Russell, a.a.O. Der Inhalt der vorstehenden Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
Die Aktivität von PIKfyve wird vorzugsweise über dessen Fähigkeit zur Stimulierung des Na⁺/Glucose-Cotransporters SGLT1 bestimmt, weiter bevorzugt unter Verwendung eines Xenopus-Oocyten-Expressionssystems.
Über die Vorteile und Merkmale dieser besonderen Ausführungsformen wird auf die vorherigen Ausführungen im Zusammenhang mit dem Verfahren zur Identifizierung einer zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit geeigneten Substanz verwiesen, die hier entsprechend gelten.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt vorzugsweise die Diagnose einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Diabetes mellitus, Hyperglykämie, Adipositas, Tumore.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße Verfahren nun zur Diagnose der wichtigsten glucosestoffwechselassoziierten Krankheiten angepasst ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung eines Lebewesens, das von einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit betroffen ist, das folgende Schritte aufweist: (a) Inhibition von PIKfyve oder eines hierfür codierenden (Poly)nucleotids in dem Lebewesen, und ggf. (b) Wiederholung von Schritt (a), wobei Schritt (a) vorzugsweise durch Applikation der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erfolgt.
Es versteht sich, dass die Menge, Konzentration und Häufigkeit der Applikation von dem zu behandelnden Lebewesen abhängt, insbesondere von der Schwere der Krankheit, jedoch auch von dem Alter, Geschlecht und weiteren Parametern des Lebewesens, die von einem Kliniker im Einzelfall jeweils bestimmt und entsprechend berücksichtigt werden.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn die Inhibition von PIKfyve durch Erzeugung einer Mutation, vorzugsweise in PIKfyve oder des hierfür codierenden (Poly)nucleotids, erfolgt, die zum Verlust oder einer Reduzierung der Aktivität von PIKfyve in dem Lebewesen führt.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass die Aktivität von PIKfyve durch zielgerichtete Mutation reduziert werden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei der Mutation um eine solche, die in PIKfyve an der Aminosäureposition 318 zu einem Austausch von Serin gegen Alanin (S318A) führt. Bei dieser Stelle handelt es sich um eine Konsensussequenz, die von der serum- und glucocorticoid-induzierbaren Kinase (SGK), vorzugsweise SGK1, phosphoryliert wird. Die Aufhebung dieser Phosphorylierungsstelle durch den Austausch des Serinmoleküls gegen ein Alaninmolekül führt zur Aufhebung der Konsensussequenz und dazu, dass SGK1 nicht mehr in der Lage ist PIKfyve durch Phosphorylierung zu aktivieren. PIKfyve wiederum ist dann nicht in der Lage SGLT1 zu aktivieren, wodurch wirksam eine glucosestoffwechselassoziierte Krankheit behandelt werden kann.
Alternativ oder zusätzlich ist es möglich, die Mutation in SGK1 oder des hierfür codierenden (Poly)nucleotids vorzunehmen, wobei es sich vorzugsweise um die Mutation ^K127NSGK1 handelt.
Die vorstehend genannte Mutation führt zur Aufhebung der Aktivität von SGK1, das dann nicht mehr in der Lage ist, PIKfyve zu aktivieren, welches wiederum nicht mehr in der Lage ist, SGLT1 zu stimulieren.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die die Erfindung nicht einschränken, aus denen sich jedoch weitere Merkmale und Vorteile ergeben. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
1: Die Co-Expression von PIKfyve stimuliert den elektrogenen Glucosetransport in SGLT1-exprimierenden Xenopus-Oocyten. Arithmetische Mittel ± SEM von Glucose (5 mM) induzierten Strömen (I_glc) in Xenopus-Oocyten, injiziert mit Wasser (grauer Balken, n = 7), die SGLT1 ohne (weißer Balken, n = 15) oder mit (schwarzer Balken, n = 14) zusätzlicher Co-Expression von PIKfyve, oder PIKfyve alleine (schraffierter Balken, n = 15) exprimieren. * zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied gegenüber Xenopus-Oocyten an, die SGLT1 allein exprimieren.
2: Der Effekt von PIKfyve wird durch SGK1 vergrößert. Arithmetische Mittel ± SEM von I_glc in Xenopus-Oocyten, injiziert mit Wasser allein (grauer Balken, n = 3) oder welche SGLT1 ohne (unausgefüllte Balken) und mit (ausgefüllte Balken) PIKfyve exprimieren. Die Ströme wurden ohne (linke Balken, n = 13 bzw. 21) oder mit zusätzlicher Expression von konstitutiv aktivem ^S422DSGK1 (rechte Balken, n = 3 bzw. 5) bestimmt. * zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied gegenüber Xenopus-Oocyten an, die SGLT1 allein exprimieren, # zeigt einen signifikanten Unterschied gegenüber den jeweiligen Werten ohne zusätzliche Expression von ^S422DSGK1 an.
3: Der Effekt von PIKfyve wird durch inaktives ^K127NSGK1 aufgehoben. Arithmetische Mittel ± SEM von I_glc in Xenopus-Oocyten, die SGLT1 ohne (unausgefüllte Balken) und mit (ausgefüllte Balken) PIKfyve exprimieren. Die Ströme wurden ohne (linke Balken, n = 11 bzw. 13) oder mit (rechte Balken, jeweils n = 4) zusätzlicher Expression von inaktivem mutiertem ^K127NSGK1 bestimmt. * zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied gegenüber Xenopus-Oocyten an, die SGLT1 allein exprimieren, # zeigt einen signifikanten Unterschied gegenüber den jeweiligen Werten ohne zusätzliche Expression von ^K127NSGK1 an.
4: Der Austausch von Serin 318 durch Alanin hebt den stimulierenden Effekt von PIKfyve bzw. SGK1 auf SGLT1 auf. Arithmetische Mittel ± SEM von I_glc in Xenopus-Oocyten, die SGLT1 exprimieren, ohne (weiße Balken) oder mit zusätzlicher Expression von Wildtyp PIKfyve (schwarze Balken) oder mutiertem ^S318APIKfyve (graue Balken). Die Ströme wurden ohne (linke Balken, n = 7,4 bzw. 7) oder mit (graue Balken, jeweils 7) zusätzlicher Expression von Wildtyp SGK1 bestimmt. * zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied gegenüber Xenopus-Oocyten an, die SGLT1 allein exprimieren, # zeigt einen signifikanten Unterschied gegenüber dem jeweiligen Wert in Xenopus-Oocyten an, die Wildtyp-PIKfyve exprimieren.
Ausführungsbeispiele
1. Material und Methoden
1.1 Konstrukte
Zur Herstellung von cRNA wurden Konstrukte verwendet, die für folgende Proteine codieren: humanes Wildtyp-SGLT1 (SLC5A1) (Dieter et al. „Regulation of Glucose Transporter SGLT1 by Ubiquitin Ligase Nedd4-2 and Kinases SGK1, SGK3, and PKB", Obes. Res. 2005; 12, Seiten 862–870), Wildtyp-PIKfyve (Seebohm et al. „Regulation of KCNQ4 Potassium Channel Prepulse Dependence and Current Amplitude by SGK1 in Xenopus Oocytes", Cell. Physiol. Biochem. 2005; 15, Seiten 255–262), mutiertes ^S318APIKfyve, welchem die SGK-Phosphorylierungskonsensussequenz fehlt (Seebohm et al. a.a.O.), humanes Wildtyp-SGK1 (Waldegger et al., „Cloning and Characterization of a Putative Human Serine/Threonine Protein Kinase Transcriptionally Modified During Anisotonic and Isotonic Alterations of Cell Volume", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997; 94, Seiten 4440–4445), humanes Wildtyp-^S422DSGK1 (Kobayashi et al.: „Characterization of the Structure and Regulation of Two Novel Isoforms of Serum- and Glucocorticoid-induced Protein Kinase", Biochem. J. 1999; 344: Seiten 189–197), inaktives humanes ^K127NSGK1(Kobayashi et al.), und zwar wie zuvor beschrieben in Böhmer et al.: „Regulation of the Excitatory Amino Acid Transporter EAAT5 by the Serum and Glucocorticoid Dependent Kinases SGK1 and SGK3", Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 329, Seiten 738–742 und Wagner et al. „The Use of Xenopus laevis Oocytes for the Functional Characterization of Heterologously Expressed Membrane Proteins", Cell. Physiol. Biochem. 2000; 10, Seiten 1–12).
1.2 Elektrophysiologie
Xenopus-Oocyten wurden hergestellt, wie zuvor beschrieben in Wagner et al., a.a.O. 5 ng von cRNA, die für Wildtyp oder mutiertes PIKfyve codierte, wurden am ersten Tag nach der Präparation der Xenopus-Oocyten und 15 ng cRNA, die für SGLT1 (SLC5A1) codierte, am zweiten Tag nach der Präparation der Xenopus-Oocyten in letztere injiziert. Sofern angegeben, wurden 7,5 ng cRNA, die für SGK1, ^S422DSGK1 oder ^K127NSGK1 codierte, separat oder zusammen mit PIKfyve injiziert. Sämtliche Experimente wurden 5 bis 6 Tage nach der zweiten Injektion bei Raumtemperatur durchgeführt. Es wurden 2-Elektroden-Voltage-Clamp-Recordings bei einem Haltepotential von –60 mV durchgeführt. Die Daten wurden bei 10 Hz gefiltert und mit einem Digidata A/D-D/A-Konverter und Chart V.4.2.-Software zur Datenerhebung und Analyse (Axon Instruments) aufgezeichnet. Die Kontrolllösung (Superfusat/ND96) enthielt 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ und 5 mM HEPES, pH 7,4. Glucose wurde in den angegebenen Konzentrationen den Lösungen zugegeben. Die Endlösungen wurden unter Verwendung von NaOH auf pH 7,4 titriert. Die Durchflussrate der Superfusion betrug 20 ml/min und ein vollständiger Austausch der Badlösung wurde innerhalb etwa 10 sek. erreicht.
1.3 Statistische Analyse
Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM dargestellt, n stellt die Anzahl der untersuchten Oocyten dar. Sämtliche Experimente wurden mit zumindest drei Präparationen von Oocyten wiederholt; in sämtlichen Wiederholungen wurden sich qualitativ entsprechende Daten gewonnen. Die Daten wurden unter Verwendung von ANOVA auf Signifikanz getestet, und Ergebnisse mit P < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
2. Ergebnisse
2.1 PIKfyve stimuliert den durch SGLT1 (SLC5A1) vermittelten elektrogenen Glucosetransport
Der elektrogene Glucosetransport war in nicht-injizierten oder wasser-injizierten Xenopus-Oocyten minimal; 1. In Xenopus-Oocyten, die SGLT1 (SLC5A1) exprimierten, induzierte Glucose (5 mM) jedoch einen Einwärtsstrom (I_glc), was einem elektrogenen Eintritt von Na⁺ und Glucose entspricht. I_glc wurde durch zusätzliche Expression von PIKfyve signifikant verstärkt; 1. Daraus ergibt sich, dass PIKfyve die Aktivität von SGLT1 (SLC5A1) stimuliert.
2.2 Der Effekt von PIKfyve wird durch Wildtyp- und aktives SGK1 verstärkt
I_glc wurde in Xenopus-Oocyten, die SGLT1 (SLC5A1) exprimierten, durch die Co-Expression von konstitutiv aktiver mutierter ^S422DSGK1 weiter stimuliert; 2. Die Co-Expression von ^S422DSGK1 zusätzlich zu SGLT1 (SLC5A1) und PIKfyve führt zu einem weiteren signifikanten Anstieg von I_glc.
2.3 Der Effekt von PIKfyve wird durch inaktive ^K127NSGK1 aufgehoben
Im Gegensatz zu Wildtyp- und konstitutiv aktiver SGK1 führt die inaktive ^K127NSGK1-Mutante nicht zu einer signifikanten Stimulierung von I_glc in Xenopus-Oocyten, die SGLT1 (SLC5A1) exprimieren. Ferner hebt die Co-Expression von ^K127NSGK1 den stimulierenden Effekt von PIKfyve auf I_glc in SGLT1 (SLC5A1) exprimierenden Xenopus-Oocyten auf; 3.
2.4 Der Effekt von PIKfyve erfordert eine intakte SGK1-Phosphorylierungskonsensussequenz
Der Austausch von Serin 318 in der einzigen SGK1-Phophorylierungskonsensussequenz in dem PIKfyve-Protein gegen Alanin (^S318APIKfyve) hebt den stimulierenden Effekt auf den elektrogenen Glucosetransport auf. I_glc war nicht signifikant unterschiedlich zwischen Xenopus-Oocyten, die SGLT1 (SLC5A1) allein exprimierten und Xenopus-Oocyten, die SGLT1 (SLC5A1) zusammen mit ^S318APIKfyve exprimierten; 4. Ferner schwächt die Co-Expression von ^S318APIKfyve den stimulierenden Effekt von SGK1 auf I_glc signifikant ab; 4.
3. Screeningverfahren
Es werden cRNA-Moleküle hergestellt, die für ein sich von PYKfyve-ableitendes Polypetid und für SGLT1 (SLC5A1) codieren. Diese cRNA-Moleküle werden in Xenopus-Oocyten injiziert, und es werden Reaktionsbedingungen etabliert, wie diese oben unter 1.2 beschrieben sind.
In Abhängigkeit der Gegenwart verschiedener Testsubstanzen in dem Reaktionsansatz, die in Form einer Substanzbibliothek bereitgestellt werden, wird die stimulierende Aktivität von PYKfyve auf SGLT1 (SLC5A1) durch Messung des Einwärtsstroms (I_glc) in die Xenopus-Oocyten bestimmt, was einem elektrogenen Eintritt von Na⁺ und Glucose entspricht.
Substanzen, die eine stark inhibierende Wirkung auf PIKfyve ausüben und zu einem reduzierten I_glc führen, werden als zur Behandlung von glucosestoffwechselassoziierten Krankheiten geeignet ausgewählt.
4. Diagnoseverfahren
Einem zu untersuchenden Patienten wird eine biologische Probe entnommen, bspw. in Form von Epithelgewebe. Aus der Probe wird PIKfyve (Protein, DNA oder RNA) isoliert und in einem hierfür geeigneten System wird dessen Aktivität im Vergleich zu einem gesunden Referenzpatienten bestimmt.
Bei Feststellung einer erhöhten Aktivität von aus dem zu untersuchenden Patienten stammenden PIKfyve erfolgt eine positive Diagnose einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit.
5. Zusammenschau
Die Erfinder haben erkannt, dass es sich bei PIKfyve um ein Molekül handelt, das eine Schlüsselrolle in der Pathologie von glucosestoffwechselassoziierten Krankheiten spielt. Basierend auf dieser Erkenntnis konnten die Erfinder ein Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, mit der glucosestoffwechselassoziierte Krankheiten behandelt werden können und ein Verfahren zur Diagnose einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit oder Veranlagung hierfür bereitstellen.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Identifizierung einer zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit geeigneten Substanz, das folgende Schritte aufweist: (a) Inkontaktbringen eines sich von FYVE finger-containing phosphoinositide kinase (PIKfyve) ableitenden (Poly)peptids und/oder eines hierfür codierenden (Poly)nucleotids mit zumindest einer Testsubstanz unter Bedingungen, die die Bindung an das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid und/oder das hierfür codierende (Poly)nucleotid erlauben, und (b) Bestimmung, ob die zumindest eine Testsubstanz die Aktivität des (Poly)peptides und/oder die Expression des hierfür codierenden (Poly)nucleotids inhibiert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (a) folgende Schritte umfasst: (a1) Bereitstellung des sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptids und/oder des hierfür codierenden (Poly)nucleotids in einem geeigneten System, (a2) Bestimmung der Aktivität des sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptids zum Erhalt eines Wertes A1, und/oder des Expressionsniveaus des für das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid codierenden (Poly)nucleotids zum Erhalt eines Wertes E1, (a3) Zugabe der zumindest einen Testsubstanz zu dem System, (a4) Coinkubation des sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptids und/oder des hierfür codierenden (Poly)nucleotids mit der zumindest einen Testsubstanz, und Schritt (b) folgende Schritte umfasst: (b1) Bestimmung der Aktivität des sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptids zum Erhalt eines Wertes A2, und/oder des Expressionsniveaus des für das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid codierenden (Poly)nucleotids zum Erhalt eines Wertes E2, und (b2) Identifizierung der zumindest einen Testsubstanz als zur Behandlung und/oder Prophylaxe von glucosestoffwechselassoziierten Erkrankungen geeignete Substanz, wenn A2 < A1 und/oder E2 < E1.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität des sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptids über dessen Fähigkeit zur Stimulierung des Na⁺/Glucose-Cotransporters SGLT1 bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das geeignete System ein Xenopus-Oocyten-Expressionssystem oder ein System ist, bei dem PIKfyve in mammalischen Zellen exprimiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Testsubstanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: niedermolekulare Substanzen, Peptide, Gegensinn-Konstrukte, siRNA-Moleküle, Aptamere, Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, das es ein Hochdurchsatzverfahren ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die glucosestoffwechselassoziierte Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Diabetes mellitus, Hyperglykämie, Adipositas, Tumore.
Verfahren zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften der nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 identifizierten Substanz, das folgende Schritte aufweist: (a) Identifizieren der Bindungsstelle der Substanz an das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid und/oder an das hierfür codierende (Poly)nucleotid; (b) Modifizieren der Bindungsstelle durch molekulares Modellieren derart, dass die Bindungsspezifität und/oder Bindungsaffinität und/oder Bindungsavidität der Substanz an das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid und/oder an das hierfür codierende (Poly)nucleotid erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungsstelle in Schritt (a) durch stellenspezifische Mutagenese ermittelt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit, die einen Inhibitor von PIKfyve sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor ein Kinaseinhibitor ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor die nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 identifizierte Substanz ist.
Verwendung eines sich von PIKfyve ableitenden (Poly)peptids oder eines hierfür codierenden (Poly)nucleotids zur Herstellung einer zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit geeigneten Substanz.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das sich von PIKfyve ableitende (Poly)peptid ^S318APIKfyve ist.
Verfahren zur Diagnose einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit oder einer Veranlagung hierfür bei einem zu untersuchenden Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellung einer ersten biologischen Probe des zu untersuchenden Lebewesens, (b) Isolierung von PIKfyve oder eines hierfür codierenden (Poly)nucleotids aus der ersten biologischen Probe, (c) Bestimmung der Aktivität des aus der ersten Probe stammenden PIKfyve zum Erhalt eines Wertes A1 und/oder des Expressionsniveaus des für das PIKfyve codierenden (Poly)nucleotids zum Erhalt eines Wertes E1, (d) Bereitstellung einer zweiten biologischen Probe eines gesunden Referenzlebewesens, (e) Isolierung von PIKfyve oder eines hierfür codierenden (Poly)nucleotids aus der zweiten biologischen Probe, (f) Bestimmung der Aktivität des aus der zweiten Probe stammenden PIKfyve zum Erhalt eines Wertes A2 und/oder des Expressionsniveaus des für das PIKfyve codierenden (Poly)nucleotids zum Erhalt eines Wertes E2, (g) Erstellung einer positiven Diagnose, wenn A1 > A2 und/oder E1 > E2.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität von PIKfyve über dessen Fähigkeit zur Stimulierung des Na⁺/Glucose-Cotransporters SGLT1 bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Stimulierung von SLC5A1 in einem Xenopus-Oocyten-Expressionssystem oder einem System, bei dem PIKfyve in mammalischen Zellen exprimiert wird, bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die glucosestoffwechselassoziierte Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Diabetes mellitus, Hyperglykämie, Adipositas, Tumore.
Verfahren zur Behandlung eines Lebewesens, das von einer glucosestoffwechselassoziierten Krankheit betroffen ist, das folgende Schritte aufweist: (a) Inhibition von PIKfyve oder eines hierfür codierenden (Poly)nucleotids in dem Lebewesen, und ggf. (b) Wiederholung von Schritt (a).
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (a) durch Applikation der pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 12 erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (a) durch Erzeugung einer Mutation erfolgt, die zum Verlust oder einer Reduzierung der Aktivität von PIKfyve in dem Lebewesen führt.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation in PIKfyve oder des hierfür codierenden (Poly)nucleotids erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Mutation um ^S318APIKfyve handelt.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation in der serum- und glucocorticoid-induzierbaren Kinase 1 (SGK1) oder des hierfür codierenden (Poly)nucleotids erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Mutation um ^K127NSGK1 handelt.